DK164261B

DK164261B - Fremgangsmaade til rensning af biologisk aktive substanser ved biospecifik adsorption, fremgangsmaade til fremstilling af det hertil anvendte uorganiske ligandmateriale samt saadant materiale

Info

Publication number: DK164261B
Application number: DK064087A
Authority: DK
Inventors: Michel Schneider; Christian Guillot; Bernard Lamy
Original assignee: Battelle Memorial Institute
Priority date: 1985-06-10
Filing date: 1987-02-09
Publication date: 1992-06-01
Also published as: DK64087A; US4925818A; CH663728A5; WO1986007281A1; US4824578A; JPH0574344B2; CA1269653A; ES8800620A1; DE3662026D1; EP0220293A1; DK64087D0; DK164261C; JPS63500002A; JPH0638756A; ES555864A0; EP0220293B1; ATE40651T1

Description

DK 164261 B

i

Den'foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til rensning af biologisk aktive substanser ved biospecifik adsorption, en fremgangsmåde til fremstilling af det hertil anvendte uorganiske ligandmateriale samt selve dette 5 materiale. Opfindelsen angår således generelt rensning af biologisk aktive materialer ved biospecifik adsorption.

Den foreliggende opfindelse angår nærmere bestemt (a) en fremgangsmåde til separation ved hjælp af adsorption i vandfase af en biologisk aktiv substans, på et uorganisk 10 bæremedium, hvor substansen fikseres ved dannelse af et stabilt og specifikt, reversibelt kompleks på en given ligand, hvorved man som adsorberende bæremedium anvender et fint fordelt uorganisk materiale, som er modificeret med siloxan-substituenter, som bærer disse ligander, samt 15 (b) en fremgangsmåde til fremstilling af dette adsorbe rende bæremateriale.

Man ved, at man for at rense biologiske substanser (proteiner, enzymer, heparin, hormoner, lectiner, antigener, 20 antistoffer og andre polypeptider) ved affinitetschroma-tografi udvælger et materiale til bæremedium for chroma-tografien, på hvilket man poder kemiske molekyler (ligander), som udviser en kraftig og specifik affinitet for den pågældende substans, der skal renses. Når disse i 25 sammenblanding med andre substanser, fra hvilke man ønsker at separerer dem, bringes i nærvær af dette materiale på partikelform, binder de sig til den pågældende ligand gennem en specifik reaktion (som i almindelighed senere er reversibel), f. eks. ved kompleksdannelse som ved 30 antigen-antistof-reaktionerne, medens de andre substanser forbliver i opløsning. Senere hen udluder man den substans, der skal renses, idet man placerer bæremediets materiale under sådanne betingelser og i et sådant medium, at komplekset opløses, hvorfra man på den ene side kan 35 indvinde den ønskede substans og på den anden side det chromatografiske bæremedium, som lader sig recirkulere til en påfølgende ekstraktion (se f.eks. US patentskrift

DK 164261 B

2 nr. "A 4 066 505). En sår an udludnings-behandling foregår i almindelighed i en chromatograferingssøjle ved hjælp af et opløsningsmiddel eller en blanding af opløsningsmidler til eluering.

5

Man kan blandt de bærematerialer, der i almindelighed anvendes til det ovennævnte formål, nævne organiske og uorganiske geler, såsom dem, der er identificeret ved deres handelsnavne "Sephadex"®, "Sephacryl"®, "Spherosil"®, 10 "Ultrogel"®, "Affi-Gel"® osv.

Disse materialer består i almindelighed af porøse partikler af sfæroidform eller anden form, hvis dimensioner er i størrelsesordenen fra nogle am til flere hundrede am, 15 og hvori porerne er i størrelsesordenen fra 10 til 300 nm.

Som forbindelsesmidler, som gør det muligt at binde en bestemt ligand til overfladen af chromatografi-bærestof-20 fet, lader man indgå molekyler, som på den ene side indeholder en funktionsdygtig gruppe, der er i stand til at reagere på covalent måde (eller på anden måde) med den pågældende ligand, og som på den anden side indeholder en funktionsdygtig gruppe, der gør det muligt for denne li-25 gand at fiksere sig (kemisk eller ved adsorption) til bæremediets overflade. Med hensyn til de uorganiske bærestoffer, såsom partiklerne af siliciumoxid (Spherosil) eller porøse glasarter (CPG glas) anvender man fælles reaktionsdygtige silaner, såsom trialkoxy-alkyl-silaner, 30 hvori alkylgruppen indeholder funktionsdygtige grupper, som er reaktionsdygtige over for de ligander, der skal fikseres, såsom -OH, -CHO, -N^, -NCO, oxiran osv.

K. Roy et al., "Affinity Chromatography and Biological 35 Recognition", redaktør I. M. Chaiken et al., Academic Press 1983, side. 257, beskriver således anvendelsen af et bærestof af siliciumoxidgel silaniseret med r-glyci-

DK 164261 B

3 dyloxypropyl-trimethoxy-silan. P.O. Larsson et al., i "Some New Techniques Related to Affinity Chromatography", kolloquierne INSERM: Chromatographie d'affinité et interactions moléculaires, redaktør J.M. Egli (1979), 5 side 91, beskriver silaniseringen af en siliciumoxidgel (partikler på 10 wm, porer på 6 nm) med glyceropropyl-trialkoxy-silan (alkyl-substituenten er en gruppe HOCI^-CEbjOH-CI^O-CgHg-), idet glycol-gruppen derpå omdannes til en aldehydgruppe ved anvendelse af i sig selv kendt tek-10 nik, hvilket til sidst tjener til at fiksere en biologisk aktiv ligand (f. eks. et antistof) ved en såkaldt SCHIFF-reaktion med en aminogruppe fra sidstnævnte og reduktion af bindingen N=C.

15 I US patentskrift nr. 3 652 761 omtales koblingen af biologisk aktive molekyler (såsom antigener eller antistoffer) på uorganiske bærestoffer, såsom glas, siliciumoxidgel, kolloidt siliciumoxid, benzonit, wollastonit, osv) ved hjælp af alkylerede alkoxysilaner, hvori alkylgruppen 20 indeholder funktionsdygtige grupper såsom amino, nitroso, carbonyl, carboxy, isocyanat, diazo, isothiocyanat, sulf-hydryl og halogencarbonyl.

I den internationale patentansøgning W0-A-82/02818 omta-25 les en fremgangsmåde og en anordning til at separere im-munoglobuliner fra mælk ved at lade disse passere over en søjle fyldt med et leje af partikler, især af silaniseret porøst glas, ved de sædvanlige midler, som er nævnt ovenfor, og som er bærer af de monoklonale antistoffer, der 30 er specifikke over for den ene eller den anden af de im-munoglobuliner, der skal renses.

Andre skrifter såsom EP-A-56977 og EP-A-88818 behandler tilsvarende emner.

De indtil i dag kendte fremgangsmåder, som betjener sig af de ovennævnte beskrevne tekniske fremgangsmåder, udvi- 35

DK 164261 B

4 ser visse ulemper, som er knyttet til arten af de anvendte porøse bærestoffer, til dimensionen af disse porer og til den kendsgerning, at partiklerne i disse bærestoffer bør udvise en quasi-sfærisk form og ensartede dimensioner 5 for at undgå fænomener med dannelse af rævegange (chanel-ling), når de anbringes i søjlerne. Eftersom langt den største del af den aktive overflade af disse materialer befinder sig i det indre af porene, og eftersom disse udviser dimensioner, der hyppigt er af samme størrelsesor-10 den som de molekyler, der skal fikseres, dif funderer molekylerne langsomt til det indre af disse porer, og under udludningen deraf diffunderer de vanskeligt mod det ydre. Derudover udviser de substanser, der skal renses, og som hyppigst er makromolekyler, i sig selv kun svage diffu-15 sionshastigheder. Eftersom middeldistancen, som skal gennemløbes af disse makromolekyler for at nå den pågældende ligand, er relativt stor, når det drejer sig om adsorbe-rende partikler på nogle snese urn, er det klart, at processerne, såvel adsorptionen som desorptionen af de sub-20 stanser, der skal renses, er langsomme og kun lidt effektive. Porer af små dimensioner vil ikke være tilgængelige for store molekyler, og de ligander, der forefindes i disse porer, vil således være ude af stand til at fiksere den substans, der skal renses.

25

De ovenfor anførte årsager forklarer, at anvendelsen af porøse biospecifikke adsorbanter frembyder talrige ulemper, idet de vigtigste er deres lave fikseringskapacitet og langsomheden knyttet til adsorbtionstrinnene og de-30 sorptionstrinnene. Med hensyn til fikseringskapaciteten angives f. eks. i US patentskrift nr. 3 652 761, at man med en podningsgrad på 14-18 mg antigen (ligand) per gram porøst glas kun fikserer ca. 5 mg antistof (humant r-globulin) per g af bærestoffet. Det skal ligeledes anføres, 35 at prisen for perler af porøst materiale og af ensartede dimensioner er meget høj og kun dårligt lader sig forene med en industriel anvendelse i stor målestok.

DK 164261 B

5

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, således som den er beskrevet i krav l's indledende del, og som er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte, afhjælper de ovenfor nævnte ulemper og gør det 5 muligt i betydelig grad at hæve det specifikke udbytte af ekstraktionerne. Derudover forhøjes fikseringshastigheden for de produkter, der skal ekstraheres, på bæremediet, hvilket gør fremgangsmåden mere økonomisk i anvendelse. Endelig anvendes den foreliggende fremgangsmåde uden pro-10 blemer ved behandlingen af relativt store mængder af substanser, der skal ekstraheres, i størrelsesordenen fra snesevis til flere hundrede tons per år, hvilket ikke er tilfældet med den kendte teknik. Man vil kunne tilføje, at prisen på ikke-porøst sub-mikroniseret siliciumoxid er 15 lavere end prisen på bærestoffer med regulerede porer, som i almindelighed anvendes til rensning ved adsorption 3 i et størrelsesforhold på 10 . løvrigt frasepareres de ikke-porøse sub-mikroniske partikler, som anvendes ifølge opfindelsen, let ved filtrering, efter at være blevet po-20 det med en ligand, i modsætning til hvad man kunne forvente.

Fremgangsmåden til fremstilling af det "uorganiske ligand" bæremedium, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge 25 krav 1, er af den i krav 3's indledning angivne art og er ejendommelig ved det i krav 3's kendetegnende del angivne.

Det "uorganiske ligand" bæremedium til anvendelse ved 30 fremgangsmåden ifølge krav 1 er ejendommeligt ved det i krav 10's kendetegnende del angivne.

Blandt de uorganiske bærestoffer, som man foretrækker at anvende ved den foreliggende opfindelse, kan man nævne 35 udfældet eller pyrogent siliciumoxid, hvori de primære (ikke-agglomererede) partikler har en størrelse på ca. 0,01-0,1 um afhængig af typen, og hvori de har en stor

DK 164261B

6 specifik overflade. Med hensyn til A^Og, TiC^ og ZrC^ anvender man pulvere, hvori partiklerne i almindelighed er på mellem 0,02 og 1 am. I det efterfølgende vil man især betragte siliciumoxid, idet det er underforstået, at 5 den anførte information ligesåvel angår aluminiumoxid som T1O2 og Zr02» Man kan ligeledes anvende de silicat-holdi-ge bærestoffer, som er omtalt i US patentskrift nr.

3 652 761. Med hensyn til disse bærestoffer bemærker man, at der foreligger følgende dokumenter: 10 I US patentskrift nr. 4 190 425 omtales polymere materialer baseret på sub-mikronisk siliciumoxid til fyldning af kolonner til gaschromatografi. I eksempel 4 og de efterfølgende eksempler omtales således en teknik til pod-15 ning af organiske grupper på siliciumoxid-partikler og disses senere copolymerisation med monomere på en sådan måde, at der tilvejebringes et i stor udstrækning porøst medium (se sammendraget linie 16). Et sådant materiale vil således ikke egne sig til de anvendelser, som er til-20 stræbt med den foreliggende opfindelse. løvrigt omtaler dette dokument silyleringen med henblik på deaktivering (med hexamethyldisilazan) af det chromatografiske bærestof og ikke silaneringen af siliciumoxid-partiklerne med henblik på podning, således som det er tilfældet ved op-25 findelsen.

1 FR-patentskrift nr. 2 020 527 omtales immobilisering af biologisk aktive molekyler (f. eks. enzymer) på uorganiske bærestoffer ved hjælp af silaner som koblingsmidler.

30 Man nævner som uorganiske bærestoffer porøst glas, sili-ciumoxidgel, benzonit, aluminiumoxid, hydroxyapatit og kolloidt siliciumoxid. I denne sammenhæng skal det fremhæves, at det tilstræbte formål med FR-patentskrift nr.

2 020 527, nemlig fremstillingen af recirkulerbare biolo- 35 gisk aktive uorganiske bærestoffer, adskiller sig fra formålet med den foreliggende opfindelse. Immobiliserede enzymer er faktisk katalysatorer og ikke biospecifikke

DK 164261 B

7 adsOrbanter, hvis virkemåde er fuldstændig anderledes. Derudover foregår podningen af silanerne, således som det er beskrevet i referencen, i vandfrit medium (xylen, benzen) og ikke i vandigt medium, som det er tilfældet ved 5 den foreliggende opfindelse.

FR-patentskrift nr. 2 083 067 angår ligeledes in-solubi-1iserede enzymer, især silicium-holdige stoffer, der er bærer af et genanvendeligt enzym, som er fikseret ved 10 hjælp af en polymer eller af en organosilan (se side 4 linie 9-17). På grund af tilstedeværelsen af den mellemliggende polymer ligger det heri indeholdte ligeledes fjernt fra indholdet i den foreliggende opfindelse.

15 FR-patentskrift nr. 2 078 427 behandler ligeledes et analogt felt. Således omtales f. eks. i eksempel 1 i dette skrift fikseringen af trypsin på siliciumoxid af typen Cab-O-Sil (dette navn anvendes for at betegne sub-mikro-nlsk siliciumoxid) ved hjælp af en silan og et carbodi-20 imid. Dette ligger således meget nær ved indholdet i FR-patentskrift nr. 2 020 527. Man vil bemærke som sammenligning, at trypsinet til tilvejebringelse af en sådan genanvendelig katalysator bør være kraftigt bundet til det uorganiske bærestof, hvilket overhovedet ikke er til-25 fældet ved den foreliggende opfindelse. Ifølge den foreliggende opfindelse tilstræber man faktisk dannelsen af en midlertidig og reverserbar binding, såsom den, der er resultatet af den selektive adsorption af trypsinet ved hjælp af en ligand, såsom phenylbutylamin (idet denne er 30 fikseret på de ikke-porøse uorganiske partikler), hvilken adsorption er reversibel og gør det muligt senere at udlude dette trypsin.

Til gennemførelse af trin (a) i fremgangsmåden ifølge den 35 foreliggende opfindelse, når det drejer sig om siliciumoxid, sætter man en vandig suspension af bæremediet "si-licumoxid-ligand" til et vandigt medium indeholdende den

DK 164261 B

8 biologiske aktive substans, der skal isoleres, idet denne kontaktskabelse mellem de enkelte dele bliver gennemført under optimale betingelser, som er let justerbare med hensyn til pH, ionstyrke og temperatur, hvilket i høj 5 grad fremmer udbyttet af ekstraktionen. Disse betingelser skal vælges fra tilfælde til tilfælde af fagmanden under hensyntagen til almene regler. Udbytterne af adsorptionen og af fikseringen af den tilstræbte substans er fremragende. Reaktionen er derudover meget hurtig, eftersom det 10 foreliggende bæremedium er fri for porer, i hvilket de molekyler, der skal renses, (i almindelighed voluminøse molekyler) normalt skulle trænge ind, således som det er tilfældet med sædvanlige bæremedier, og alle de reaktionsdygtige grupper er disponible på partiklernes ydre 15 overflade. Som følge heraf finder man hyppigt tider for praktisk talt fuldstændig fiksering i størrelsesordenen 5-10 minutter ved omgivelsernes temperatur. Man kan iøv-rigt arbejde ved omgivelsernes tryk, hvilket fra et økonomisk synspunkt er mere gunstigt end med porøse bæreme-20 dier, som nødvendiggør påføring af et tryk (mere eller mindre højt afhængigt af det enkelte tilfælde).

Når man anvender suspensioner af sub-mikroniske silici-umoxid-partikler ifølge opfindelsen, er i almindelighed 25 densiteten af den hydratiserede adsorbant-suspension af størrelsesordenen 0,2 (5 ml adsorbant-suspension per g Si02), og den har en biospecifik adsorptionskapacitet i størrelsesordenen fra 100-300 mg biologisk aktiv substans per g siliciumoxid. Sådanne værdier svarer til en adsorp-30 tionskapacitet per g siliciumoxid, som mindst er én størrelsesorden større end kapaciteten for sædvanlige porøse bæremedier.

Man kan for at gennemføre trin (b) i den foreliggende 35 fremgangsmåde gå frem ved filtrering under anvendelse af sædvanlige midler eller ved centrifugering. Til centrifugering egner centrifugegravitationsområder af størrelses-

DK 164261 B

9 ordenen fra 4 000 til 6 000 G sig, og de kan opnås uden vanskelighed med centrifuger med stor kapacitet, dvs. som er i stand til at behandle fra 1 til adskillige liter suspension per behandling.

5

Man kan ligeledes til denne separering anvende den fremgangsmåde, der er kendt som tangential filtrering ved hjælp af en ultrafiltreringsmembran eller en mikrofiltre-ringsmembran med fastlagt porøsitet. I overensstemmelse 10 med denne teknik bringer man den suspension, der skal filtreres, i kontakt med overfladen af membranen, og man lader den cirkulere hurtigt tangentielt i forhold til denne. Denne membrans permeabilitet er valgt på en sådan måde, at en betydelig strøm af den flydende fase passerer 15 over i permeatet, medens partiklerne i sig selv ikke kan trænge igennem membranen, hvilket fører til deres progressive fraseparering fra den flydende fase, som indeholder de ikke-adsorberede substanser. Visse kommercielle anordninger til tangential filtrering gør brug af hule 20 fibre, i hvis indre man cirkulerer suspensionen (f. eks. modulet Microdyn fra firmaet ENKA GmbH, Wuppertal, BRD; modulet CARB0SEP fra firmaet SFEC, Bollene, FR); andre anordninger gør brug af plane membraner (såkaldte Pellikon kasetter fra firmaet MILLIPORE). For at gennem-25 føre separeringen af belastede partikler fra opløste substanser, der skal fjernes, kan man desuden anvende den teknik, der betegnes som diafiltrering, ifølge hvilken man kontinuert til den suspension, der underkastes filtrering, sætter en mængde af den vandige fase, som er 30 identisk med den, som fjernes i permeatet, idet denne proces fortsættes, indtil denne vandige fase ikke længere indeholder andet end det substrat på partikelform, som er bærer af den ekstraherede substans, under udelukkelse af andre opløste produkter, som oprindeligt var tilstede i 35 den opløsning, der skulle renses.

DK 164261 B

10

Under sådanne separeringer er det på ingen måde nødvendigt at gå videre med en tørring af det således vaskede belastede silicumoxid og at isolere det fra vaskemediet, eftersom dette i almindelighed egner sig til iværksættel-5 sen af de efterfølgende operationer, dvs. af trinnet betegnet (c).

Med hensyn til den desorption, der gennemføres i trinnet (c) af den substans, der skal renses fra bærestoffet, 10 dvs. dissociationen af komplekset "ligand/substans der skal renses", går man frem under anvendelse af sædvanlige midler, dvs. ved at regulere karakteristika for den vandige fase (pH, temperatur, ionstyrke, fortynding med et egnet organisk opløsningsmiddel osv) på en måde, der eg-15 ner sig til en sådan behandlingsgennemførelse. Man vil finde eksempler på reaktionsbetingelserne for en sådan desorption i følgende reference: E.A. Hili og M.D. Hir-tenstein, Adv. i Biotechn. Process 1, 31 (1983). Man kan blandt de mest anvendte teknikker nævne dem, der angår 20 modifikationen af ionstyrken, af pH, af anvendelsen af chaotropiske midler (f. eks. KSCN), af organiske med vand blandbare opløsningsmidler (alkoholer, ethylenglycol, isopropanol osv), af såkaldte "deformerende" midler (urinstof, guanidin) og af ligander i fri tilstand. Man 25 har i visse tilfælde med fordel anvendt en 0,5 M NaCl vandig fase indeholdende ca. 20% isopropanol eller et andet tilsvarende med vand blandbart opløsningsmiddel for at gennemføre en sådan dissociation. 1 2 3 4 5 6

Trinnet (d) kan gennemføres i overensstemmelse med tek 2 nikker svarende til dem, der er beskrevet ovenfor i for 3 bindelse med trinnet (b). Man kan faktisk for at separere 4 substratet siliciumoxid-ligand, fra hvilken den substans, 5 der skal renses, er blevet udtaget, ligeledes anvende de 6 ovenfor nævnte teknikker vedrørende centrifugering og filtrering, idet heri er indbefattet tangential filtrering. I dette tilfælde er det selvfølgelig filtratet, der

DK 164261 B

11 udgør den mest efterspurgte fase, eftersom dette i opløsning indeholder den substans, som man ønsker at opnå i ren tilstand. For at ekstrahere denne substans derfra går man frem som sædvanlig, dvs. at man inddamper vandet ved 5 destillation, f. eks. ved almindelig tryk eller ved et reduceret tryk på en rotationsinddamper eller også ved frysetørring eller ved forstøvningstørring, indtil adskillelse eller udfældelse. Man kan ligeledes fremkalde denne udfældelse ved tilsætning af et ikke-opløsningmid-10 del eller ved saltdannelse (f. eks. tilsætning af (NH^^ S0^). Man opsamler så substansen og opbevarer den på sædvanlig måde. Det således genvundne system siliciumoxid-ligand er normalt genbrugeligt uden videre til en fornyet ekstraktions-behandling.

15

Man kan for at fremstille bæremediet af siliciumoxid, således som det anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen (siliciumoxid-ligand-systemet), gå frem enten med silanisering af det sub-mikroniske siliciumoxid ved hjælp 20 af en alkoxysilan, på hvilken man allerede forinden har fikseret en passende ligand, eller ved silanisering af dette siliciumoxid ved hjælp af en alkoxysilan, der er bærer af en gruppe, der er i stand til at fiksere denne ligand, idet denne sidstnævnte bliver tilført på et sene-25 re trin.

I det første tilfælde dispergerer man det sub-mikrone siliciumoxid, f. eks. pyrogent eller udfældet siliciumoxid, med en specifik overflade i størrelsesordenen 50-2 30 600 m /g (typerne AER0SIL-130, -200, -300 og -380 fra firmaet DEGUSSA egner sig godt, såvel som varieteterne CAB-O-SIL fra firmaet CAB0T Corp., USA) under kraftig omrøring i en væske, f. eks. et organisk opløsningsmiddel eller vand, fortrinsvis i nærvær af glaskugler, indtil 35 man opnår en væske med mælkeagtigt udseende og som er homogen. Tilstedeværelsen af kugler i blandingen under omrøring har den virkning, at den reducerer agglomeraterne

DK 164261 B

12 af partikler af SiC^, der har en tendens til at dannes (adhesion mellem partiklerne indbyrdes på grund af deres kraftige hygroskope egenskaber) under sådanne betingelser. Man kan ligeledes gennemføre dispergeringen ved 5 hjælp af en homogenisator, f. eks. et apparat af typen POLYTRON fra firmaet KINEMATICA GmbH, BRD. Med hensyn til aluminiumoxid kan man anvende de produkter, der betegnes som "Aluminium oxide-C" fra firmaet DEGUSSA og ALCAN fra firmaet CABOT. Med hensyn til ZrOj og Ti02 anvender man 10 meget fine pulvere, hvis specifikke overflade er mindst 50 ni^/g (£· eks. titaniumdioxid P 25 fra firmaet DEGUSSA). Efter en vis dispergeringstid (½ time til 1 time) ved omgivelsernes temperatur i et passende apparatur normaliserer agglomeraternes størrelse sig mellem 100 og 15 1 000 nra, fortrinsvis 200 - 300 nm (man vil bemærke, at de individuelle primære partikler af sådant siliciumoxid fra begyndelsen i sig selv kun måler nogle få nanometer).

Man kan verificere agglomeraternes dimension efter dis-pergering ved sædvanlige metoder, f. eks. under anvendel-20 se af det såkaldte Nanosizer-apparat fra firmaet COULTER.

Derudover vælger man en passende silan og lader den reagere med den ligand, der behøves til den endelige dannelse af det specifikke kompleks med den substans, der 25 skal renses. Man kan blandt sådanne ligander nævne anti-legemer af substanser, der skal renses, enzym-inhibitorer, co-faktorer, lectiner, farvestoffer såsom Cibachron bleu F3G-A eller farvestofferne PROCION (firmaet ICI), hydrofobe grupper såsom alkylgrupper, phenylgrupper, car-30 bonhydrater, heparin osv.

De silaner, som er anvendelige ved fremgangsmåden, skal vælges blandt sådanne, hvor den reaktionsdygtige gruppe, som udgør en del af alkylsubstituenten bundet til silici-35 umatomet, egner sig til fikseringen af den udvalgte ligand. Man har ovenfor set de forskellige typer af tri-alkoxysilaner, der kan egne sig, afhængig af de enkelte

DK 164261 B

13 tilfælde, og som man vælger som funktion af strukturen af de ligander, som man søger at knytte dem til og af arten af de reaktionsdygtige grupper der findes på disse. I almindelighed fikserer polypeptidiske ligander sig gennem 5 deres reaktionsdygtige grupper -OH, -N^, SH eller -COOH (som er modificeret eller ikke-modificeret ved anbringelsen af eventuelle mellemliggende reagenser), og de passende silaner indeholder fiksationsgrupper -NCO, azo, glycidoxy, -CHO, oxiran, amino- osv. I visse tilfælde er 10 det nødvendigt at tilråde anvendelse af et brodannende middel mellem silanens reaktionsdygtige gruppe og den ligand, der skal fikseres. Det er især tilfældet ved bindingen mellem en NH^-gruppe og en carboxylsyre (anvendelse af et carbodiimid) eller ved koblingsbindingen mellem 15 to amino-grupper, hvor man som brodannende middel kan anvende et dialdehyd, f. eks. glutaraldehyd. Man foretrækker ved den foreliggende opfindelse at anvende trime-thoxyaminopropyl-silan og trimethoxyglycidoxypropyl-si-lan. Andre lignende alkoxy-silaner, f. eks. de tilsvaren-20 de ethoxy-, propoxy- og butoxy-silaner, egner sig naturligvis også. For at gennemføre reaktionen mellem silanen og liganden går man frem på sædvanlig måde og under sædvanlige betingelser svarende til den påtænkte reaktion.

Disse betingelser vil være kendte for fagmanden, og der 25 skal derfor ikke nærmere beskrives detaljeret desangående. Man vil imidlertid bemærke, at man sædvanligvis arbejder i et ikke-vandigt medium, såsom THF, acetone, di-oxan og andre vandfri organiske opløsningsmidler (som dog er blandbare med vand), i hvilke siloxan-grupperne er 30 stabile. Man kan ligeledes i visse tilfælde arbejde uden opløsningsmiddel.

Når man har opnået fikseringen af liganden på silan-deri-vatet, sætter man ved omgivelsernes temperatur reaktions-35 blandingen til den vandige eller organiske suspension af det ovenfor beskrevne siliciumoxid under omrøring. Man kan ligeledes arbejde ved en højere temperatur, f. eks.

DK 164261 B

14 idet man opvarmer til mellem 20 og 80 °C igennem nogle timer (i almindelighed fra 1 til 8 timer). Man finder sig så efter afkøling i besiddelse af den ønskede suspension af substratet "siliciumoxid-ligand", som man kan anvende, 5 som det foreligger, med fremgangsmåden ifølge opfindelsen (j vf. krav 1).

Man begynder i et andet tilfælde af fremstillingen af systemet silicumoxid-ligand med at bringe trialkoxysilanen 10 i kontakt med suspensionen af siliciumoxid, fortrinsvis i vandig opløsning, idet tilførelsen af liganden først indtræffer senere; man vælger især en sådan vej, når liganden er uopløselig i de organiske opløsningsmidler eller følsom overfor tilstedeværelsen af disse (denaturering); 15 dette er f.eks. tilfældet med bacitracin eller også med et antistof eller en lectin. I dette tilfælde kan man enten sætte silaniserings-reagenset direkte til den vandige suspension af siliciumoxidet eller forinden dispergere denne silan-reagens i vand ved pH 4-10 for at fremkalde 20 en præliminær hydrolyse af alkoxygrupperne deri og derpå tilsætte denne suspension af præhydrolyseret alkoxysilan til suspensionen af siliciumoxid. I denne henseende skal det bemærkes, at varigheden af perioden, under hvilken trialkoxysilanen holdes i vandigt medium før tilsætningen 25 af det uorganiske bæremedium, indfluerer på det silanise-rede siliciumoxids egenskaber overfor den senere fiksering af den valgte ligand. Det er således muligt, idet man regulerer de eksperimentelle betingelser (opholdstid før tilsætningen af det bæremedium, der skal podes, pH 30 under podningen og temperaturen), at tilpasse det silani-serede bæremediums egenskaber som en funktion af arten af de ligander, som man ønsker at anvende, hvilket udgør en yderligere fordel ved den foreliggende fremgangsmåde. Faktisk spiller pH i det vandige medium, i hvilket man 35 gennemfører silaniseringen, såvel som temperaturen ligeledes en stor rolle. Jo højere pH er (indenfor det i betragtning kommende område) desto mere har den vandige

DK 164261 B

15 opløsning en tendens til at fortykke sig og rumfanget af bæremediet (når man separerer det fra væsken ved centrifugering) en tendens til at stige. Med hensyn til temperaturen vil man bemærke, at værdier i størrelsesordenen 5 100 °C egner sig for aminosilanerne, medens man for gly- cidoxy-forbindelsen foretrækker ikke at overskride 50 °C.

Med hensyn til fiksering af liganden på det silaniserede bæremedium gennemføres denne i vandig opløsning under 10 sædvanlige reaktionsbetingelser, i almindelighed ved at man simpelthen indhælder liganden (i vandig opløsning) i den silaniserede siliciumoxid-suspension, som er fremstillet som ovenfor beskrevet, og idet man lader reaktionskomponenterne være i kontakt i den ønskede tid, så-15 ledes at liganden binder sig til bæremediet. Man vil huske, at i visse tilfælde (se ovenfor) tilråder man på dette sted anvendelsen af brodannelses-reagenser (se eksempel 5). Man anvender derpå det således opnåede "silicium-oxid-ligand-system" i fremgangsmåden til ekstraktion som 20 tidligere beskrevet. Man ville imidlertid bemærke, at man også i visse tilfælde kan gennemføre fikseringen af liganden på det silaniserede bærestof i et organisk ikke-vandigt medium; i et sådant tilfælde sætter man et vandopløseligt organisk opløsningsmiddel til den silaniserede 25 dispersion af bæremediet. Man centrifugerer, genopløser centrifuge bundfaldet i det omtalte opløsningsmiddel og gentager behandlingen indtil fjernelse af resterende vand, hvilket til sidst fører til en suspension af silaniserede partikler i det omtalte organiske opløsnings-30 middel. Man kan som opløsningsmiddel nævne THF, dioxan og ethanol. Selve fikseringen af liganden gennemføres analogt med det ovenfor nævnte tilfælde med direkte fiksering på silanen.

35 De efterfølgende eksempler belyser opfindelsen.

DK 164261 B

16

Eksémpel 1

Man satte dråbe for dråbe ved almindelig temperatur under omrøring 23 ml (0,1 mol) glycidoxypropyl-trimethoxysilan 5 til 77 ml af en 10 mM opløsning af natriumacetat med pH

4. Efter tilsætning lod man blandingen henstå under omrøring i 30 minutter ved omgivelsernes temperatur.

Derudover dispergerede man 6 g pyrogensiliciumoxid (Ae-10 rosil 130, firmaet DEGUSSA) i 60 ml vand ved omrøring i nærvær af glaskugler (3 mm diameter) indtil opnåelse af en mælkeagtig suspension, hvori partiklerne i gennemsnit havde størrelsen 200-300 nm.

15 Derpå tilsatte man under omrøring 6 ml af silanopløsnin-gen til siliciumoxid-suspensionen (1 mmol silan/g siliciumoxid), og man lod pH stige til 8,5 ved hjælp af en 0,5 M opløsning af K^HPO^ (“ 1 ml) og nogle dråber af en IN opløsning af NaOH. Efter en nats henstand centrifuge-20 rede man suspensionen (10 minutter under 6 000 G) og centrifugebundfaldet blev genopløst og skyllet to gange med 100 ml rent vand.

Det silaniserede siliciumoxid blev bragt i suspension i 25 50 ml vand, og til en mængde af dette svarende til 5 g siliciumoxid som udgangsmateriale under omrøring satte man en opløsning af 25 g bacitracin i ca. 100 ml hydro-gencarbonatbuffer 0,2 M med pH 8,0. Derpå lod man blandingen henstå i 24 timer ved omgivelsernes temperatur og 30 pH 8. Derpå centrifugerede man for at separere det uorganiske bæremedium fra overskuddet af bacitrasin opløsning, og centrifugebundfaldet blev bragt i suspension i et overskud af en 1 M opløsning af ethanolamin ved pH 8 (50 ml) for at deaktivere de eventuelt stadigt tilstede-35 værende epoxygrupper.

DK 164261 B

17

Derpå fortsatte man med centrifugering af suspensionen (10 minutter, 6 000 G) og man vaskede centrifugebundfaldet ved fire gentagelser (hver gang med en umiddelbar påfølgende separation ved centrifugering) idet man anvendte 5 succesivt to gange med vand og to gange med 1 M natrium-chlorid-opløsning og til sidst i en Tris-buffer (10 mM) og 0,2 mM med hensyn til CaC^, pH 8.

Man anvendte derpå bæremediet "siliciumoxid-bacitracin" 10 til ekstraktion og rensning ved biospecifik adsorption af enzymet subtilisin BPN1, som danner et specifikt kompleks med bacitracin.

Til opnåelse heraf indførte man det ovenfor nævnte bære-15 medium i et fermenteringsmedium ved pH 8, som forinden var blevet gjort klar, og som indeholdt 47 mg/ml proteiner og udviste en enzymatisk aktivitet på 2 000 U/ml, i en mængde på 100 mg fast substrat per ml opløsning. Man har i det forudgående defineret enheden for subtilisin 20 BPN' som den mængde enzym, der er i stand til at hydrolysere et umol ethylester af N-acetyl-L-tyrosin per minut ved omgivelsernes temperatur og ved pH 8. Efter 30 minutters inkubering centrifugerede man (6 000 G, 10 minutter) og ved analyse af supernatantvæsken konstaterede man, at 25 dens enzymatiske aktivitet svarede til 3,7% af den oprindelige aktivitet, og at den i opløst tilstand indeholdt 74% af de oprindeligt tilstedeværende proteiner.

Centrifugebundfaldet blev bragt i suspension i en 1 M op-30 løsning af NaCl og indeholdende efter rumfang 25% isopro-panol, idet man anvendte 30 ml af denne opløsning per g af bæremediet. Efter 1 times forløb centrifugerede man påny og opnåede en flydende fraktion El. Centrifugebundfaldet blev genopløst og igen ekstraheret identisk med 35 tidligere, hvilket førte til en anden fraktion E2. Sammenblanding af fraktionerne El og E2 og analysen deraf afslørede tilstedeværelsen af 96,4% af den oprindelige

DK 164261 B

18 enzymatiske aktivitet kombineret med 23 vægt-% af mængden af proteiner tilstede i udgangsopløsningen. Oprensningsfaktoren for subtilisin var således 4,2.

5 Eksempel 2

Man benyttede det i eksempel 1 silaniserede siliciumoxid og koblede det med lectinet concanavalin A (Con A), idet man arbejde i en carbonatbuffer 0,2 M, pH 9. Man tilsatte 10 opløsning af Con A opløst i den sammen buffer (21 mg/ml) i en mængde på 247 mg Con A per g silaniseret siliciumoxid (beregnet som tørprodukt), og man lod henstå under omrøring ved omgivelsernes temperatur natten over. Derpå blokerede man de frie epoxygrupper ved tilsætning af en 1 15 M opløsning af ethanolamin pH 4 og lod henstå natten over.

Derpå fraseparerede man det faste stof ved centrifugering, og man vaskede centrifugebundfaldet (ved gensuspen-20 sion i vandigt medium efterfulgt af centrifugering) under anvendelse af de i de følgende nævnte opløsninger:

Vand to gange; 1 M NaCl i Tris-buffer 10 mM, pH 9; 1 M

NaCl i acetatbuffer 10 mM ved pH 5; og til sidst 0,05 M

25 NaCl i Tris-buffer 0,05 M ved pH 8, idet denne opløsning per liter yderligere indeholdt 2 mmol af hver af de føl- ++ ++ gende ioner: Ca , Mg , Mn .

Substratet siliciumoxid-Con-A blev derpå anvendt til 30 ekstraktion af immunoglobulin IgG konjugeret med peber-rod-peroxydase. I dette tilfælde havde man forinden ve-rifiseret fraværet af affinitet for systemet silicium-oxid-Con-A for IgG alene. Til opnåelse heraf behandlede man 10 mg humant IgG (MILES) opløst i en Tris-buffer 50 35 mM, NaCl 50 mM ved pH 8 med 100 mg siliciumoxid-Con-A.

Efter 30 minutters kontakt centrifugerede man som ovenfor beskrevet (6 000 G; 10 minutter). Centrifugebundfaldet

DK 164261 B

19 blev igen dispergeret i det samme medium, og man gennem-• førte påny en centrifugering. Supernatanterne fra de to operationer blev kombineret, og man konstaterede ved analyse tilstedeværelsen af 98% af det oprindelige indhold 5 af proteiner. Man markerede derpå med peroxydase humant IgG i opløsning i overensstemmelse med S. AVRAMEAS, Immunochemistry (1969) 6, 43, idet den således markede fraktion af IgG derpå blev ekstraheret under anvendelse af bæremediet siliciumoxid-Con-A.

10

Man behandlede opløsningen, der samtidigt indeholdt IgG i fri tilstand og IgG markeret med peroxydase, med bæremediet siliciumoxid-Con-A i en mængde på 100 mg af denne per 6 mg af proteiner i opløsningen. Mediet bestod af en 15 buffer NaCl 50 mM, Tris 50 mM, pH 8, Ca++, Mg++, Mn++ 2 mM. Efter 30 minutter ved omgivelsernes temperatur blev de faste partikler frasepareret ved centrifugering. Man konstaterede ved analyse, at supernatantvæsken kun indeholdt 8,2% af udgangsaktiviteten af peroxydase; men ca.

20 92% af den ikke-konjugerede del af IgG.

Komplekset peroxydase-IgG fikseret på bæremediet siliciumoxid-Con-A blev dissocieret som beskrevet i det følgende: Man bragte dette således belastede bæremedium i 25 suspension i en opløsning 0,1 M af α-methylglucosid i bufferopløsning: NaCl 50 mM, Tris 50 mM, pH 8, Ca++,

Mg , Mn 2 mM. Efter 30 minutters inkubering centrifugerede man (6 000 G, 10 minutter); supernatantvæsken indeholdt 86,2% af udgangsaktiviteten af peroxydase.

30

Eksempel 3

Man satte dråbe for dråbe ved 4 °C 6 mmol 4-phenylbutyl-amin (ligand) til 5 mmol glycidoxypropyl-trimethoxysilan.

35 Derpå omrørte man yderligere 1 time ved 4 °C, hvorpå man lod temperaturen stige, og man standsede omrøringen efter en samlet tid på 5 timer.

DK 164261 B

20

Derpå satte man 10 ml af en vandig opløsning af CH^COONa (10 mM, pH 4) til denne opløsning, og man lod præhydrolysen af alkoxygrupperne foregå i ca. 30 minutter ved omgivelsernes temperatur. I mellemtiden præparerede man en 5 vandig dispersion af pyrogensiliciumoxid (AEROSIL-130) som beskrevet i eksempel 1, og man satte til denne dispersion den vandige silan-opløsning opnået som beskrevet ovenfor i en mængde på 50 amol silan per g siliciumoxid.

Man regulerede pH til 8,5 og lod podningsreaktionen for-10 løbe igennem 72 timer ved omgivelsernes temperatur.

Man isolerede bæremediet af silaniseret siliciumoxid og koblede det til liganden ved de i eksempel 1 beskrevne midler, hvorpå man igen bragte i suspension i en buffer 15 CaCl2 50 mM, Tris 50 mM (pH 8), i en mængde på 40 mg fast stof per ml af den vandige fase. Derpå satte man denne suspension til et urenset pancreatisk ekstrakt i den samme buffer som ovenfor beskrevet (pH 8), idet dette ekstrakt ud over kontaminanter af pancreatisk oprindelse in-20 deholdt trypsin og chymotrypsin. Mængdeandelen af bæremedium sat til ekstraktionsopløsningen var 10 g per g tørstof i ekstraktet. Efter en kontakttid på 30 minutter fraseparerede man det faste stof som beskrevet i de forudgående eksempler, og man stillede den flydende superna-25 tant til side (SI). Man gentog denne operation efter at have bragt centrifugebundfaldet i suspension i den samme buffer i en mængde på 25 ml/g siliciumoxid, hvilket førte til en anden portion af væske (S2). Endelig gentog man en tredje gang denne gentagelse af at bringe det faste stof 30 i suspension; men denne gang i en 1 M opløsning af tetra-ethylammoniumbromid (25 ml/g fast stof), man centrifugerede, og man opnåede en tredje portion af væsken El.

Man fortsatte så med de enzymatiske analyser af de for-35 skellige indhøstede fraktioner. Disse analyser er baseret på anvendelsen af N-benzoylarginin-p-nitroanilid (ΒΑΡΝΑ) som substrat for trypsin og på glutaryl-phenylalanin-p-

DK 164261 B

21 nitroanilid (GLUPHEPA) som substrat for chymotrypsin. De anvendte teknikker er som beskrevet i det følgende.

Trypsin: Man sætter 10 al af den opløsning, der skal ana- _3 5 lyseres, til et overskud af en 10 M opløsning af ΒΑΡΝΑ i en buffer CaCl2 10 mM og Tris-HCl 50 mM, pH 8, og man måler spektrofotometrisk ved 401 nm mængden af dannet p-nitroanilin. Man definerede 1 enhed ΒΑΡΝΑ som den mængde trypsin, som var i stand til at hydrolysere 1 amol ΒΑΡΝΑ 10 per minut ved omgivelsernes temperatur under de ovenfor nævnte betingelser. Som eksempel titrerer en prøve af meget rent trypsin (oprindelse SIGMA, type IX) med et givet BAEE-aktivitet på 15 600 enheder/mg 2,35 enheder BAPNA/mg.

15

Chymotrypsin: Man sætter 10-20 al af den opløsning, der _3

skal analyseres, til et overskud af en 10 M opløsning af GLUPHEPA i en buffer CaCl2 10 mM, Tris-HCl 50 nM, pH

7,6, og man måler ved 410 nm den hydrolytiske frigivel-20 seshastighed af p-nitroanilin. Man definerede 1 enhed GLUPHEPA som den mængde trypsin, som var i stand til at frigive 1 amol p-nitroanilin/minut ved omgivelsernes temperatur under de givne betingelser. F. eks. har en stærktoprenset præparation af chymotrypsin (SIGMA type 25 II), der er angivet som havende en aktivitet på 65 enheder BTEE/mg en titer på 68 x 10“3 enheder GLUPHEPA/mg.

Man anvendte disse analysemetoder på de forskellige fraktioner i det foreliggende eksempel, hvilket førte til de 30 i det følgende viste resultat: 35 22

Prøve ΒΑΡΝΑ aktivitet GLUPHEPA aktivitet

DK 164261 B

Enheder % Enheder % 5 Udgangsekstrakt 5 450 100 816 100 51 3 690 77 62 8,5 52 490 7

El 420 7,7 626 77 10 Disse resultater viser klart, at det foreliggende system siliciumoxid-4-phenyl-butylamin selektivt fikserer chy-motrypsin i nærvær af trypsin. Det fikserede chymotrypsin er i øvrigt udludet med en opløsning af tetraethylammonium og indeholder mindre end 10% af trypsinet fra ud-15 gangsforbindelsen. Udbyttet ved oprensningen af chymotrypsin er 77%.

20 Eksempel 4

Man anvendte i dette eksempel aluminiumoxid (type C, DEGUSSA) som uorganisk bæremedium. Man dispergerede dette aluminiumoxid (5 g) i 50 ml vand ved hjælp af en homoge-25 nisator af fabrikatet Polytron. Middelpartikelstørrelsen efter dispergering, således som den kunne måles ved hjælp af et apparat af typen Nanosizer fra firmaet Coulter er 220 nm. Desuden fremstillede man en vandig opløsning af glycidoxypropyl-trimethoxysilan (1 mmol/ml), således som 30 det er beskrevet i eksempel 1.

Derpå satte man under omrøring en alikvot del af den vandige silan-opløsning til suspensionen af aluminiumoxid (1 mmol silan per g aluminiumoxid), og man regulerede pH til 35 7,5 ved tilsætning af nogle dråber vandig 1 N NaOH opløs ning. Efter en nats henstand centrifugerede man suspensionen (6 000 G, 10 minutter), man genopslæmmede centri-

DK 164261 B

23 fugébundfaldet i rent vand og centrifugerede en gang til under de samme betingelser. Derpå koblede man det silani-serede aluminiumoxid med 0,5 M m-aminophenyl-borsyre i 0,2 M hydrogencarbonatbuffer ved pH 8,0, og man lod blan-5 dingen henstå i 72 timer ved pH 8,0 og ved omgivelsernes temperatur. Partiklerne af systemet aluminiumoxid-m-ami-nophenylborsyre blev derpå vasket med 4 gentagelser ved centrifugering og påfølgende suspension igen i vand. Efter den sidste centrifugering blev bæremediet bragt i 10 suspension i en buffer Tris 10 mM, CaC^ 0,2 mM, pH 8,0.

Man anvendte derpå dette bæremedium til ekstraktion og rensning af subtilisin BPN'. Man anvendte det samme klarede fermenteringsmedium som i eksempel 1 indeholdende 47 15 mg/ml proteiner og udvisende en enzymatisk aktivitet på 2 000 U/ml, og man satte 100 mg bæremedium per ml opløsning. Efter 20 minutter ved omgivelsernes temperatur centrifugerede man (6 000 G, 10 minutter). Analysen af supernat an tvæsken viste, at den enzymatiske aktivitet af 20 denne væske svarede til 32% af den enzymatiske aktivitet fra begyndelsen. Man bragte centrifugeringsbundfaldet i suspension igen i en 0,5 M opløsning af pentaerythritol, og efter 1 times forløb centrifugerede man påny og opnåede en flydende fraktion E. Denne sidstnævnte indeholdte 25 59% af den enzymatiske aktivitet, som oprindeligt var tilstede, og 24% af mængden af proteiner, som var tilstede i udgangsopløsningen. Denne behandling havde således gjort det muligt at rense subtilisin-udgangsmaterialet med en oprensningsfaktor på 2,25.

30

Eksempel 5

Man satte dråbe for dråbe 10 mmol r-aminopropyl-trime-thoxysilan til 5 ml af en 0,02 M opløsning af natriumace-35 tat, pH 4,0, idet man overvågede at holde pH mellem 4 og 5 ved progressiv tilsætning af 4 N saltsyre. Derpå holdt man opløsningen i 30 minutter under omrøring ved omgivel-

DK 164261 B

24 semes temperatur. Derpå bragte man opløsningens volumen op på 10 ml med destilleret vand.

Man dispergerede i 50 ml vand 5 g pyrogent siliciumoxid 5 (Aerosil 300) ved hjælp af en homogenisator af fabrikatet "POLYTRON". Derpå satte man til den dispergerede sili-ciumoxid-suspension den vandige opløsning af silan i en mængde på 1 mmol silan per g siliciumoxid, og man regulerede opløsningens pH til 7,0 ved tilsætning af 1 M 10 I^HPO^. Man lod suspensionen henstå under omrøring natten over ved omgivelsernes temperatur. Partiklerne blev derpå centrifugeret (10 minutter, 6 000 G), og centrifugeringsbundfaldet blev bragt i suspension i destilleret vand.

Denne behandling blev gentaget fire gange, idet partik-15 lerne succesivt blev bragt i suspension i 1 M NaCl, i destilleret vand, i en blanding af vand og alkohol (50:50) og til sidst i ren ethanol. Den sidste suspension i ethanol indeholdt ca. 50 mg siliciumoxid per ml. Man fremstillede derpå en 0,5 M opløsning af N-carbobenzoxy-L-20 phenylalanin (Z-L-Phe) i ethanol og en 0,5 M opløsning af N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydroquinolin (EEDQ). Til 100 ml af suspensionen af silaniseret siliciumoxid satte man 10 ml af opløsningen af Z-L-Phe og derpå 10 ml af opløsningen af EEDQ. Man lod henstå under omrøring i 24 ti-25 mer ved omgivelsernes temperatur.

Derpå vaskede man partiklerne ved gentagende centrifugeringer efterfulgt af tilbageførsel til suspension i ethanol først (tre gange) og derpå én gang i en blanding 30 af ethanol/vand og endelig i destilleret vand.

Man anvendte disse partikler til rensning af en opløsning indeholdende subtilisin BPN', således som det er beskrevet i eksempel 1. Man anvendte 100 mg siliciumoxid-Z-L-35 Phe per 2 000 U enzym. Under disse betingelser indeholdt supernatanten efter centrifugering (SI) mindre end 1% af den enzymatiske aktivitet fra begyndelsen. Partiklerne

DK 164261B

25 blev derpå bragt i suspension i en 1 M opløsning af NaCl indeholdende 25% isopropanol, og 1 time senere centrifugerede man denne suspension. Supernatanten El indeholdt denne gang 87% af den enzymatiske aktivitet fra udgangs-5 materialet.

10 15 20 25 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fraseparering af en biologisk aktiv 5 substans, der er i stand til specifikt og reversibelt at fikseres på en given ligand, ved adsorption på et uorganisk bæremedium i vandig fase, hvorved man som adsorbe-rende bæremedium anvender et "uorganisk-ligand"-system bestående af et materiale på partikelform valgt blandt 10 Si02' a^2°3' Ti02 op Zr02' hvilket sådanne ligander er fikseret ved hjælp af siloxan-reagenser, ved hvilken fremgangsmåde man: a) blander bæremediet med den vandige fase på en sådan 15 måde, at den biologisk aktive substans bindes til liganden, b) separerer det således belastede bæremedium fra den vandige fase ved centrifugering eller filtrering, c) dispergerer det således fraseparerede bæremedium i en 20 anden vandig fase og desorberer substansen fra bæremediet, d) separerer det således aflastede bæremedium fra den anden vandige fase indeholdende substansen i opløsning ved centrifugering eller filtrering, hvorpå man isolerer 25 den biologisk aktive substans fra opløsningen, kendetegnet ved, at de som adsorberende bæremedium anvendte uorganiske partikler er submikroniske og ikke-porøse.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man anvender et fint pulveriseret materiale, hvori partiklerne har en størrelse mindre end 1 mn og en 2 specifik overflade på 50-600 m /g, fortrinsvis er udfældet eller pyrogent siliciumoxid.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af det "uorganisk-ligand" bæremedium anvendt ved fremgangsmåden ifølge krav 35 DK 164261 B 1, dg som består af uorganiske partikler silaniserede med en trialkoxy-alkyl-silan, hvori alkylgruppen indeholder en reaktionsdygtig gruppe koblet til liganden, kendetegnet ved, at man til silaniseringen af ud-5 gangsmaterialet enten anvender en silan indeholdende denne ligand, der allerede er fikseret, eller en silan, som endnu ikke er koblet til denne ligand, idet fikseringen af sidstnævnte indtræder senere.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at man gennemfører silaniseringen af siliciumoxidet ved at dispergere dette i et flydende medium indtil opnåelse af partikel-agglomerater på 100-1 000 nm, hvorpå man under omrøring ved omgivelsernes temperatur eller ved 15 20-80 °C tilsætter trialkoxy-alkyl-silanen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den reaktionsdygtige gruppe i trialkoxy-alkyl-silanen er valgt blandt grupperne: -NCO, azo, glycidoxy,

20 -CHO, oxiran og amino, og at den anvendte trialkoxy-alkyl-silan fortrinsvis er trimethoxy-aminopropyl-silan eller trimethoxy-glycidoxypropyl-silan.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvorved man kobler li-25 ganden til silanen før silaniseringen af det uorganiske materiale på partikelform, kendetegnet ved, at man gennemfører denne kobling, idet man lader silanen reagere med liganden i nærvær af eller uden tilstedeværelsen af et organisk opløsningsmiddel. 30

7. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvorved man foretager koblingen af liganden og det uorganiske materiale efter silaniseringen af dette, kendetegnet ved, at man lader det silaniserede materiale reagere med liganden 35. et vandigt medium eller i et organisk vandfrit medium. DK 164261 B

8. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at man tilsætter trialkoxy-alkyl-silanen i form af en dispersion deraf i vand, idet dennes alkoxygrupper derpå underkastes en præhydrolyse, og idet det flydende 5 medium er et vandigt medium.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at man fremstiller denne dispersion ved at omrøre silanen i en vandig fase ved omgivelsernes temperatur i 10 fra 15 minutter til 20 timer, idet varigheden af den behandling, som trialkoxy-silanen underkastes, progressivt indvirker på det silaniserede bæremediums egenskaber med hensyn til den påfølgende fiksering af den indgående ligand. 15 10. "Uorganisk-ligand" bæremedium til anvendelse ved iværksættelse af fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det består af et ikke-porøst, submikronisk materiale på partikelform valgt blandt SXO2,

20 AI2O3, T1O2 og Zr02, hvis specifikke overflade er på 50-600 m2/g, og som især er udfældet eller pyrogent siliciumoxid, som er bragt i dispersion i vand indtil opnåelse af partikel-aggregater med en middeldimension på 100-1 000 nm, idet disse aggregater på deres overflade bærer 25 ligander, som er specifikke for en substans, der skal renses ved biospecifik adsorption, idet disse ligander er fikserede ved hjælp af en forbindelses-silan. 1 35