JPH05507419A

JPH05507419A - オリゴマーのための改善された非ヌクレオチド系リンカー試薬

Info

Publication number: JPH05507419A
Application number: JP92502337A
Authority: JP
Inventors: レイノルズ，マーク・エイ; バゲフィー，モーテザ・エム; アーノルド，ライル・ジェイ，ジュニア
Original assignee: ジンタ・インコーポレイテッド
Priority date: 1990-08-09
Filing date: 1991-08-09
Publication date: 1993-10-28
Also published as: IL99068A0; NZ239250A; IE912805A1; AU9071091A; EP0542928A4; EP0542928A1; AU664542B2; WO1992002532A1; IL99068A; CA2089087A1; KR930701468A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴマーのための改善された非ヌクレオチド系リンカ−試薬発明の背景オリゴヌクレオチドをラベル（標１ｋ）化するための非ヌクレオチド系連結試薬は、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の正常な塩基対形成に有害な影響を与えない点並びにオリゴヌクレオチド内あるいはその末端のいずれの位置における連結をも可能にする点で、ヌクレオチド系試薬に対して明瞭な利点を有する。既にいくつかの非ヌクレオチド系連結試薬の、標準的な（即ちホスホジエステル基本骨格を有する）オリゴデオキシリボヌクレオチドをラベル化する際の使用について記述されている（ライル・ジェイ・アーノルド、ジュニアら、“ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド連結試薬（原題Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｌｉｎｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｆ。

ｒ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｒｏｂｅｓ）”、ジエン−プローブ、インコーホレイテッドに譲渡されたＰＣＴ　Ｗｏ　８９０２４３９）。しかし、これらの非ヌクレオチド試薬は混合されたキラリティーを有するものであった。これらの試薬は上記文献中に開示されている化学合成によってホスホジエステル基本骨格中に連結される。

最近、他の非ヌクレオチド系連結試薬が記述されている。例えば上記ジエン−プローブ特許出願で特に言及されている試薬の１つについてはボウル・ニス・ネルソンら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１９８９．第１７巻、　７１７９頁）によっても記述されている。

非同位体ラベルを連結する際に使用されるポリアミド−オリゴヌクレオチドプローブの合成についてもジエイ・ハラランビデイスら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１９９０゜第１８巻、５０１頁）によって記述されている。

発明の要約本発明はその一側面として、ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを製造するのに適した非ヌクレオチド試薬であって、ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーに組み込まれた時にキラリティーが純粋なままである非ヌクレオチド骨格を提供する。これらの非ヌクレオチド試薬は、鏡像異性（またはキラリティー）が純粋な非ヌクレオチド骨格と、その骨格に連結されたリガンド（配位子）部分羞びに第１および第２の連結基とを有する非ヌクレオチドモノマー単位からなる。第１の連結基は上記骨格を第１の追加モノマー単位に連結する能力を有し、その間、第２の連結基は実質上連結する能力を有さないように不活化されたままであるが、第２の連結基はその後上記骨格を第２の追加モノマー単位に連結するために有害でない条件下で活性化され得、ここに、該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーは少なくとも１つのヌクレオチドモノマー単位を含有する。

もう１つの側面として、本発明は、モノマー単位間にアルキル−またはアリール −ホスホネートジエステル結合を有するヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを製造する際に有用な非ヌクレオチド試薬を提供する。上記非ヌクレオチド試薬は、非ヌクレチド骨格と、その骨格に連結されたリガンド部分並びに第１および第２の連結とを有する非ヌクレオチドモノマー単位からなり、ここに第１の連結基は第１の追加モノマー単位と上記骨格との間にアルキル−またはアリール−ホスホネート結合を形成させる能力を有し、その間、第２の連結基は実質上連結する能力を有さないように不活化されたままであるが、第２の連結基はその後上記骨格を第２の追加モノマー単位に連結するために有害でない条件下で活性化され得、ここに該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーは少なくとも１つのヌクレオチドモノマー単位を含有する。

本発明の好ましい一側面として、モノマー単位間アルキル−またはアリールホスホネート結合を有するヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを製造する際に有用な新規非ヌクレオチド系試薬が提供される。これら非ヌクレオチド試薬は、鏡像異性（またはキラリティー）が純粋な非ヌクレオチド骨格と、その骨格に連結されたリガンド部分並びに第１および第２の連結基とを有する鏡像異性が純粋な非ヌクレオチドモノマー単位からなり、ここに第１の連結基は鏡像異性が純粋な上記骨格と第１の追加モノマー単位との間にアルキル−またはアリール−ホスホネート結合を形成させる能力を有し、その間、第２の連結基は実質上連結する能力を有さないように不活化されたままであるが、第２の連結基はその後キラリティーが特殊な上記骨格を第２の追加モノマー単位に結合させるために有害でない条件下で活性化され得、ここに該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーは少なくとも１つのヌクレオチドモノマー単位を含有する。

上記リガンド部分は、活性化または脱保護時に結合反応に関与し得るリンカ−アーム（連結腕）基、ポリマーの合成開始に先立って検出可能な化学物質部分またはラベルが連結されているサイドアーム（側腕）または検出可能な化学物質部分からなってもよい。好適な化学物質部分には検出可能なラベル、キレート剤、触媒、核酸分解性部分、薬物担体、ホルモン受容体、細胞によるオリゴマー吸収を促進する物質、ホルモン受容体のためのハプテンなどが含まれる。好適な化学物質部分にはプソラレンおよびその類縁体、アクリジンおよびその類縁体、ポルフィリンおよびポルフィリン類縁体、環状キレート剤などが含まれる。

定義本明細書で使用される場合、特にことわらない限り、以下の用語は以下の意味を有する。

用語「ヌクレオチド」は、リン酸基、５炭糖および窒素含有塩基から構成される核酸のサブユニットを意味する。上記５炭糖はＲＮＡにおいてはリボースであり、ＤＮＡにおいては２−デオキシリボースである。この用語は上記サブユニットの類縁体をも包含する。

用語「ヌクレオチド多量体（マルチマー）」はホスホジエステル結合またはその類似物によって連結されたヌクレオチドの鎖を意味する。

「オリゴヌクレオチド」は一般に約１０ないし約１００ヌクレオチド長のヌクレオチド多量体であるが、１００ヌクレオチド長以上であってもよい。これらは一般にヌクレオチドモノマーから合成されるものと考えられるが、酵素法によって得られるものであってもよい。

「デオキシリポオリゴヌクレオチド」はデオキシリボヌクレオチドモノマーから構成されるオリゴヌクレオチドである。

「ポリヌクレオチド」とは一般に約１００ヌクレオチド長またはそれ以上のヌクレオチド多量体をいう。これらは一般に生物学的起源を有するか、あるいは酵素法によって得られる。

「ヌクレオチド多量体プローブ」は、第２のヌクレオチド多量体（通常、ポリヌクレオチド）内に含有される標的ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチド多量体である。通常このプローブは標的配列中の対応塩基に対して完全に相補的になるよう選択される。しかし場合により、プローブ中の１またはそれ以上のヌクレオチドが標的配列中の対応する塩基に対して相補的でなくても妥当であるか、あるいはむしろそれが望ましい場合もある。

「非ヌクレオチドモノマー単位」とはポリマーのハイブリッド形成に有意な関与をしないモノマー単位を意味する。このようなモノマー単位は例えばヌクレオチドとの有意な水素結合に関与してはならず、５種のヌクレオチド塩基の１つまたはその類縁体をその構成成分とするモノマー単位はこの定義から除外される。

「ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー」とはヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマー単位からなるポリマーを意味する。

「オリゴヌクレオチド／非ヌクレオチド多量体」とは、１００ヌクレオチド未鵬の一般に合成起源の多量体であって１またはそれ以上の非ヌクレオチドモノマー単位を含有するものをいうが、２００を越えるヌクレオチドを含有するものであってもよい。

「モノマー単位コとは、ポリマーの一因子となる本発明の非ヌクレオチド試薬またはヌクレオチド試薬の一単位をいう。

「ハイブリッド」とは、相補的塩基間のワトソンークリック塩基対形成によって２つのヌクレオチド多量体間に形成される錯体をいう。

用語「オリゴマー」は、オリゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオシドアルキル−およびアリール−ホスホネート類縁体、オリゴヌクレチドのホスホロチオエート類縁体、オリゴヌクレオチドのホスホルアミデート類縁体、ホスホトリエステルなど天然のリン酸エステルオリゴヌクレオチド類縁体、並びに他のオリゴヌクレオチド類縁体および修飾オリゴヌクレオチドを意味し、この用語はヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーをも包含する。またこの用語は、モノマー単位間の１またはそれ以上のリン（■）基結合がホルムアセタール結合やカルバメート結合などの非リン（ＩＩＩ）基結合によって置換されているヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーをも包含する。

用語「アルキル−またはアリール−ホスホネートオリゴマー」は、ヌクレオシド間（またはモノマー間）リン基結合を有するヌクレオチドオリゴマー（またはヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー）であって、少なくとも１つのアルキル− またはアリール−ホスホネート結合によってホスホジエステル結合が置換されているものを意味する。

用語「メチルホスホネートオリゴマー」（またはｒＭＰ−オリゴマー」）は、ヌクレオシド間（またはモノマー間）リン基結合を有するヌクレオチドオリゴマー（またはヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー）であって、少なくとも１つのメチルホスホネートヌクレオシド間結合によってリン酸ジエステルヌクレオシド間結合が置換されているものを意味する。

用語「ヌクレオシド」はヌクレオシジル単位を包含し、これと交換可能な用語として使用される。

本明細書に掲載する種々のオリゴマー配列のいくつかにおいて、例えばＡｐＡＡＴＣ中のＡはへの３°−炭素とＴの５゛−炭素との間のリン酸ジエステル結合を示し、Ａ　ＴＣまたは　ＡＴＣ中のＡはＡの３°−炭素とＴまたは　Ｔ　の５° −炭素との間のメチルホスホネート結合を示す。

用語「有害でない条件」は、ポリマー骨格とその糖、塩基、リンカ−アームおよびラベル成分、並びにモノマー試薬に実質上有害な影響を与えない（反応もしくは合成の）条件を表す。当業者であれば、これらの規準に合致する官能性、連結（カップリング）法、脱保護法および切断条件を容品に同定することができる。

用語「脱遮断条件」は、リボースまたはデオキシリボース基の５−〇Ｈ基から遮断（または保護）基を除去するために使用される条件を表す。

用語「脱保護条件」は、ヌクレオシド塩基がら保護基を除去するために使用される条件を表す。

図面の簡単な説明図ＩＡ、ＩＢおよびＩＣは、Ｆｍｏｃ保護リンカ−アームを有する本発明の非ヌクレオチド試薬の構造式を表す。

図２は、Ｃ２、Ｃ４およびＣ６リンカ−アームを有する本発明の非ヌクレオチド試薬を製造するための合成経路を表す。

図３は、Ｃ８、Ｃ１０およびＣ１２リンカ−アームを有する本発明の非ヌクレオチド試薬を製造するための合成経路を表す。

図４は、本発明の非ヌクレオチド試薬の１つのリンカ−アームとプソラレン複合体を形成し得るブンラレン試薬の合成経路を表す。

発明の詳細な説明本発明者らは本発明に従って、オリゴマー（特にアルキル−またはアリール−ホスホネートオリゴマー）中に架橋剤などのリガンドを組み込む際に特に有用な新規非ヌクレオチド系連結試薬をいくつか創案した。これらの試薬は、ヌクレオチド系ホスホンアミダイトモノマーを連結するために使用される自動化された連結化学を用いてオリゴマー中に連結することができる。得られた修飾オリゴマー（アルキル−またはアリール−ホスホネートオリゴマーを含む）は核性１級アミンを含有しており、これを介して、当該技術分野で既に知られている標準的な水性化学によって種々の二次化合物を連結することができる。二次化合物の例には、挿入剤、アルキル化剤、プソラレンなどの光活性化反応性部分、キレート剤などが含まれる。このような化学を適用することにより、治療剤としてのメチルホスホネートオリゴマーの効力を増大させ得るであろうと信じる。

本発明の好ましい側面では、上記非ヌクレオチド系連結試薬をキラリティーが純粋な形態で製造する。さらにこれら非ヌクレオチド試薬は、オリゴマー（非ヌクレオチド／ヌクレオチドポリマー）中に組み込まれた時にもキラリティーが純粋なままである。この利点は、オリゴマーを対応する標的核酸にハイブリッド形成させる時にラベルを特定の位置に向かわせることが望まれるか、もしくはそれが望ましい場合に重要であり得る。特に好ましい側面では、これらの試薬の炭化水素骨格はスレオニンの還元産物からなる。スレオニンの４つの鏡像異性体は市販されているので、スレオニンの４つの立体異性体のいずれか１つから誘導されるキラリティーが純粋な骨格を有する非ヌクレオチド試薬を製造することができる。

キラリティーが純粋な骨格をこれらの試薬に与えるためにスレオニンを出発物質として選択することには別の利点もある。第１に、オリゴマーのリン基本骨格への挿入に、伝統的なデオキシリボース基の３炭素の空間配置によく似た３つの炭素骨格を利用することができる。第２に、還元されたスレオニンは１級水酸基と２級水酸基を有し、これは以降の保護、脱保護、遮断、脱遮断段階並びに誘導体化段階が改善された収率で進行することを可能にする。

本発明者らは本発明の一側面に従って、これら非ヌクレオチド試薬をオリゴマーのリン基本骨格中に挿入する際にアルキル−またはアリール−ホスホネートジエステル結合が生じるように、これら非ヌクレオチド試薬を官能化した。このような試薬はヌクレオチドまたは他の非ヌクレオチド試薬に高収率で連結する。さらに本研究者らは、オリゴマーに対するブソラレン類縁体の結合にこれら非ヌクレオチド試薬が使用できることを明らかにした。これらのブソラレン類縁体は新規な化学を用いて非ヌクレオチド試薬に結合される（実施例１３を参照のこと）。

非ヌクレオチド試薬の一般的性質上述のごとく、一般に本発明は、ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマー単位から構成される限定された配列のポリマーを生産するために、ヌクレオチド試薬中の特定のヌクレオチドモノマー単位と合成的に連結し得る非ヌクレオチド単位を提供する。該非ヌクレオチド試薬は、リンカ−アームが脱保護された時に結合反応に関与し得るリンカ−アーム部分からなるリガンド部分か、あるいはポリマーに非ヌクレオチド試薬を組み込む前に有用な所望の化学物質部分が結合しである側腕からなるリガンド部分を保持してもよい。一般に、リンカ−アームになんらかの部分を連結するための技術はタンパク質上の基にラベルを連結するための技術と類似したものであり得る。しかし、そのような技術の改良が必要な場合もあろう。有用な化学の例には活性イミン、ハロゲン化アリール、イソチオシアネートまたは活性エステルとアルキルアミンとの反応、およびマレイミド、ハロアセチルなどとチオールとの反応が含まれる（さらに考え得る技術についてはンー・エム・ミーンズおよびアール・イー・フィーニイ、“タンパク質の化学修飾（原題Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）”　、ホールデンーデイ、インコーポレイテッド：アール・イー・フィーニイ、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　、第２９巻、１９８７、１４５〜１６１頁を参照のこと）。ポリマー形成の間リンカーアーム官能基を保護するために使用することができる好適な保護基もまたタンパク質化学で使用されるものと類似する（例えば“ペプチド：分析と合成、生物学（原題Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　：　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ）”　、第３巻、イー・グロスおよびジエイ・メイエンホファー編、アカデミツクプレス、　１９７１を参照のこと）。非ヌクレオチド試薬の化学的な性質ゆえに、これはヌクレオチドモノマー配列内のどのような所望の位置にも置くことができる。これにより、ヌクレオチドモノマーを含有するポリマー中に広範囲にわたる様々な性質を設計することが可能になる。これらには次のものが含まれる。（１）ポリマー内のあらゆる所望の位置における特殊な化学物質部分の結合。該化学物質部分は検出可能なラベル、挿入剤、キレート剤、薬物、ホルモン、タンパク質、ペプチド、ハブテン、遊離基生成剤、核酸分解剤、タンパク質加水分解剤、触媒、受容体結合物質、および生物学的興味のある他の結合物質、および生物学的障壁（膜など）を横切るＤＮＡ輸送を改変する物質、およびヌクレオチド多量体の溶解度を変化させる物質などを包含する（ただしこれらに限定されない）。これは、いずれの所望のヌクレオチドの近傍にもこのようなラベルおよび挿入剤を位置させ得るということを意味する；（２）例えばヌクレオチド親和性支持体を構築するために、固体支持体の化学物質部分に結合させるためのリンカ−アームを用いて限定された配列を該固体支持体に固定化し得ること：（３）複数の非ヌクレオチドモノマー単位をポリマー中に組み込むことによってリンカ−アームを介してポリマーに複数の化学物質部分を結合させ得ること；（４）ポリヌクレオチドに作用する酵素およびタンパク質に対する活性が変化している点で天然に存在するポリヌクレオチドとは異なるポリマーを構築し得ること。例えば、それ自体は純粋なポリヌクレオチドの３°末端に非ヌクレオチドモノマー単位を設置すると、蛇毒ホスホジェステラーゼによる分解に対する耐性が付与される。このような非ヌクレオチドモノマー単位により他のヌクレアーゼに関する特異的切断部位を作成することもできる。；（５）ハイブリッド形成可能なヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマー単位を散在させることによりハイブリッド形成プローブを構築し得ること。例えば、ヌクレオチドモノマーの限定された配列を合成した後、１またはそれ以上の非ヌクレオチドモノマー単位を伸長し、その後に限定された配列のヌクレオチドモノマーからなる第２のブロックをつなぐという、ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマーの混合ブロック合成を行い得る。；（６）１またはそれ以上の塩基対が異なる標的ヌクレオチド多量体を同時に検出する合成プローブを構築し得ること。これは、本明細書に記述する非ヌクレオチド試薬を用いて、種々の標的ヌクレオチド多量体のヌクレオチドｒ列中で相違が起こっている場所で、プローブ中のヌクレオチドを非ヌクレオチドモノマー単位で置換することによって達成される。

本発明の好ましい形態として、ラベル化したオリゴマーをヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマーからなる限定された配列で構築する。本発明のもう１つの好ましい形態として、非ヌクレオチドモノマー単位を用いて２またはそれ以上の限定された配列のヌクレオチド多量体を連結し、架橋反応に使用するべくその非ヌクレオチドモノマー単位を化学的にラベル化する。

さらにもう１つの好ましい態様として、現在のＤＮＡ合成法の１つを用いて混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを製造するために、段階的な様式で付加し得るような様式で非ヌクレオチド試薬を構築する。このようなヌクレオチドおよび非ヌクレオチド試薬は通常段階的な様式で付加して、固体支持体に共有結合によって固定化された成長しつつあるオリゴマー鎖に、対応するモノマー単位を結合させる。典型的には、合成の開始に先立って第１のヌクレオチドを切断可能なエステル結合を介して支持体に結合させる。オリゴマー鎖の段階的伸長は通常３′から５′への方向に行われる。標準的なりＮＡおよびＲＮＡ合成法については、例えば”ＤＮＡおよびＲＮＡの合成と応用（原題５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉ。

ｎｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｉ？ＮＡ）”　、ニス・エイ・ナラング編、アカデミツクプレス、　１９８７およびエム・ジェイ・ガイド“オリゴヌクレオチド合成（原題○ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉＳ）”、ＩＲＬブレス、米国ワシントンＤ、　Ｃ，、１９８４を参照のこと。合成が完結した時、上述のエステル結合を加水分解することによってポリマーを支持体から切り放すと、もともと支持体に結合していたヌクレオチドが得られたオリゴマーの３゛末端になる。これから類推すれば、非ヌクレオチドモノマー単位を導入するための別法はＤＮＡ合成の開始に先立ってそれをＤＮＡ合成支持体に同様に結合させることである。好ましい態様として、非ヌクレオチドモノマーの遊離アルコール型を用いて形成されるエステル結合を介してＤＮＡ合成支持体に非ヌクレオチドモノマー単位を結合させる。

したがって本発明は、ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマー単位の混合物を含有するポリマーを製造するための非ヌクレオチド試薬を提供する。該非ヌクレオチドモノマーは］またはそれ以上の保護されたリンカ−アームもしくはラベル、架橋剤または挿入剤など所望の化学物質部分に結合した１またはそれ以上のリンカ−アームをさらに含有してもよい。

このような非ヌクレオチドモノマーはさらに、ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマー単位のポリマー中に段階的に組み込むことができるよう、２つの連結基を保持する。該連結基の第１の基は成長しつつあるモノマー単位の鎖の末端に効率よく連結することができるという性質を有する。該連結基の第２の基は成長しつつある混合したヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマーの鎖を段階的な様式てさらに伸長することができる。これには、第１の連結基が連結している間、実質上同時に連結しないように第２の連結基が不活化されている必要があるが、その後非ヌクレオチドモノマー単位を連結するために活性化し得ることが必要である。この「不活化」は、第２連結基を「活性化」するために除去することができる、第２連結基の遮断基を用いて達成することが好ましい。しかし、このような「不活化」と「活性化」が単に反応条件を変えること（ｐＨ，温度、反応系中のなにか他の成分の濃度を変化させること）によって、そのような技術による不活化および活性化を助けるのに適した化学構造を有する第２連結基の場合には、達成されるかもしれないということも本発明の範囲に包含される。該連結基はヌクレオチドモノマー単位または非ヌクレオチドモノマー単位の隣接する結合を可能にする。好ましい態様では、該連結基が、標準的なりＮＡ合成法の１つに適合し得る連結および脱遮断および脱保護段階を通して作動する。

このような方法は、合成が非指向的に起こること並びにすべての連結切断および脱遮断または脱保護段階が「有害でない」条件下で起こること、即ち、それらがポリマー骨格とその糖、塩基、リンカ−アームおよびラベル成分並びにモノマー試薬に実質上有害な影響を与えないことを必要とする。当業者であれば、これらの規準に合致する官能性、連結法、脱遮断および脱保護操作、および切断条件を容易に同定することができる（例えば上記ガイドの文献を参照のこと）。

非ヌクレオチドモノマーは、その末端に連結基が連結されている骨格を有することが好ましい。この骨格は非環状の１〜２０原子鎖であることが好ましく、工ないし２０炭素原子の非環状炭化水素鎖であることが好ましい。

好ましい非ヌクレオチド試薬好ましい非ヌクレオチド試薬は、その骨格が約２ないし約１０炭素原子の基本骨格を有する非ヌクレオチドモノマー単位からなり、該基本骨格はヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー中に連結された時にキラリティーが純粋なままである少なくとも１つの不斉炭素を含有する。約３炭素の基本骨格を有する骨格がいくぶん好ましい。これはこのような基本骨格がデオキシリボース基の３炭素空間配置に似ているからである。

本発明の好ましい一側面は、オリゴマー中に組み込まれた時に次式。

［式中、５ＫＥＬはキラリティーが純粋な約１ないし約２０炭素原子の非ヌクレオチド骨格からなり、−ＮＨＬ、ＹおよびＺは５ＫＥＬの炭素原子に共有結合で連結されており、Ｌはりガントを表し、Ｙは−ＣＨ，−１−０−１−３−または −ＮＨ−を表し、Ｚは−０−１−８−または−ＮＨ−を表す］で示されるキラリティーが純粋な非ヌクレオチドモノマー単位を構成するキラリティーが純粋な非ヌクレオチド試薬に向けられる。好ましくは、５ＫＥＬがさらにＹとＺを隔てる約１ないし約１０炭素原子の基本骨格からなる。これら好ましい５ＫＥＬ基を組み込む非ヌクレオチドモノマー単位の例には、次に挙げるものが含まれる口式中、Ｘ、基は水素またはアルキルから独立に選択され、同一であっても異なってもよく、ｑとｒはＯないし１０の整数から独立に選択される］。

したがって、−態様として、これらの好ましい非ヌクレオチド試薬は次の一般式で表すことができる。

［式中、　Ｙ　−Ｃｐ　１は第１連結基を表し、−Ｚ＝Ｃｐ、は遮断された第２連結基を表し、ＬＳＹおよびＺは前記と同意義であり、（ａ）第１連結基−ＹＣｐ、は次式：（式中、Ｘｌはハロゲンまたは置換されたアミノを表し、Ｘ２はハロゲン、アミ人または置換されたアミ人または０−を表し、Ｒ３はアルキル、置換されていてもよいアルコキシまたは置換されていてもよいアリールオキシを表し、Ｒ６はアルキル、置換されていてもよいアルコキシまたは置換されていてもよいアリールオキシを表すか、あるいはＸ２がＯ−を表す場合には水素を表してもよ（、Ｕは酸素、硫黄またはイミノを表し、Ｗはアルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、５−１Ｏ＼アミノまたは置換されたアミノを表し、■はアルコキシ、アルキルチオ、アミノまたは置換されたアミノを表す）から選択される。

（ｂ）遮断された第２連結基−ＺＣｐ、においてＣｐ２は、第２連結基−ＺＨを回収するために脱遮断条件下で切断し得る遮断基であり、ここにＺは一〇−１− ＮＨ−または−Ｓ−を表す］。

アルキル−またはアリール−ホスホネート（特にメチルホスホネート）ジエステル結合をモノマー単位間に形成することができる非ヌクレオチド試薬が好ましいので、特に好ましい非ヌクレオチド試薬には第１連結基−ｙｃｐ、が：［式中、Ｘ、はクロロまたは２級アミンを表し、Ｒ５はアルキルを表し、Ｘｌは置換されたアミノ、ハロゲンまたは０−を表し、Ｒ６はアルキルを表す］から選択されるものが含まれる。

リガンド部分りは好ましくは、（有害でない条件下で）官能性部分と連結することが可能になるように有害でない条件下で脱保護され得る保護された連結腕（リンキングアーム）または官能性部分から選択される。

本発明の好ましい一側面では、Ｌが、プソラレンなどの架橋剤や薬物担体分子を含む官能性部分と連結することが可能になるように有害でない条件下で脱保護され得る保護されたリンカ−アームまたは保護基Ｐｒからなる。好ましいリンカ− アームには次式の１つを有するものが含まれる。

［式中、ｎおよびｍは独立に１ないし１５（好ましくは工ないし５）の整数を表し、Ｐｒは有害でない条件下で除去し得る保護基を表すコ特に好ましい非ヌクレオチド試薬の一群はアミノ酸スレオニンから誘導される骨格を有する。これらの好ましい試薬は２つの不斉炭素を有する３炭素基本骨格からなり、その不斉炭素のそれぞれはヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー中に組み込まれた時にそのキラリティーが純粋なままである。さらに、スレオニン誘導基本骨格を有するこれらの試薬は１級水酸基と２級水酸基を有し、これらはその反応性が異なるので、以降の保護、脱保護、遮断、脱遮断および誘導体化段階における選択性と高収率を可能にする。本発明の好ましい一態様では、第１連結基が２級水酸基に伴い、第２連結基が１級水酸基に伴う。

したがって、本発明の特に好ましい側面によれば、上記スレオニン系非ヌクレオチド試薬は次式で示される。

Ｏｐ。

［式中、★Ｃはキラリティーが純粋な不斉炭素を表し、Ｒ１とＲ２のうち一方は水素を表し、他方は−ＮＨ−Ｌ（ここにＬは後に定義するリンガント部分である）を表し、Ｒ５とＲ４のうち一方は水素を表し、他方は約１ないし約１０炭素原子の低級アルキルを表し、−Ｙ−Ｃｐ＋ＨＡ第１連結基を表し、−ＺＣｐ２は遮断された第２連結基を表し、（ａ）Ｙが−ＣＨ２−ｌ−５−１−ＮＨ−１または一〇−を表す第１連結基−ＹＣｐＩは次式。

［式中、Ｘｌはハロゲンまたは置換されたアミノを表し、Ｘ２はハロゲン、アミノ、または置換されたアミノ、または○−を表し、Ｒ５はアルキル、置換されていてもよいアルコキシまたは置換されていてもよいアリールオキシを表し、Ｒ６はアルキル、置換されていてもよいアルコキシまたは置換されていてもよい了り −ルオキシを表すか、あるいはＸ２が０〜を表す場合には水素を表してもよく、Ｕは酸素または硫黄を表し、Ｗはアルキル、アリール、アルコキシ、了り−ルオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、５−１Ｏ＼アミノまたは置換されたアミンを表し、■はアルコキン、アルキルチオ、アミンまたは置換されたアミノを表すコから選択され、（ｂ）遮断された第２連結基−ＺＣｐ２においてＣＩ）２は第２連結基−ＺＨを回収するために脱遮断条件下で切断し得る遮断基であり、ここにＺは一〇−１− ＫＨ−または−８−を表す］。

リガンド部分りは好ましくは官能性部分と（有害でない条件下で）連結することが可能になるように有害でない条件下で脱保護され得る保護されたリンカ−アームまたは官能性部分から選択される。

アルキル−またはアリール−ホスホネート（特にメチルホスホネート）ジエステル結合をモノマー単位間に形成することができる非ヌクレオチド試薬が好ましいので、特に好ましい非ヌクレオチド試薬には、第１連結基−Ｙ　Ｃｐ　１が次式：［式中、Ｘｌはクロロまたは２級アミノを表し、Ｒ５はアルキルを表し、Ｘ２は置換されたアミノ、ハロゲンまたはＯ゛を表し、Ｒｏはアルキルを表す］から選択されるものが含まれる。

本発明の好ましい一側面では、Ｌが、ブソラレンなどの架橋剤や薬物担体分子を含む官能性部分と連結することが可能になるように有害でない条件下で脱保護され得る保護されたリンカ−アームまたは保護基Ｐｒからなる。好ましいリンカ− アームには次式のうちの１つを有するものが含まれる。

［式中、ｎおよびｍは独立に１ないし１５（好ましくは工ないし５）の整数を表し、Ｐｒは有害でない条件下で除去することができる保護基を表す］好適な保護基Ｐｒには９−フルオレニル−メトキシカルボニル（「Ｆｍｏｃｌ）、ｌ・リフルオロアセチル、フェノキシアセチルなどが含まれる。例えばグリーン１セオドール・ダブリュ、“プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセンス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、′）ヨン番ウィリー・アンド１サン、ニューヨーク、１９８１の第７章を参照のこと。これらのリンカ−アームは図２および３と本明細書の実施例に概略を記す反応経路に従って都合よく製造することこれらの非ヌクレオチド試薬は、標的核酸とのハイブリッド形成に関係する正常な塩基対形成に有害な影響を与えることなくオリゴマーに結合したりガント部分を有するオリゴマーを製造する際に有用である。これらのりガント部分は、後に（オリゴヌクレオチドの合成後に）脱保護されてラベル化試薬と反応することによりリンカ−アーム−ラベル化試薬複合体を与え得る保護されたリンカ−アームまたは官能基からなり得る。特に有用な官能基には検出可能なラベル、標的核酸と反応する物質（架橋剤など）、標的核酸を切断する物質、細胞または皮膚へのオリゴマーの吸収を増大させる物質、および身体からのオリゴマーの排出を遅延させる物質が含まれ得る。

これらの非ヌクレオチド試薬がモノマー単位間にアルキル−またはアリール−ホスホネート結合を有するオリゴマー中に組み込まれるい（つかの場合には、修飾されたリボシル部分を有するヌクレオチドモノマー単位を組み込むことが有利であり得る。２′−〇−アルキルー（特に２′−〇−メチルー）リボシル部分を有するヌクレオチド単位をアルキル−またはアリール−ホスホネートオリゴマー中に有利に組み込むことにより、そのオリゴマーの相補標的配列に対するハイブリッド形成が改善され得る。

本発明の理解を助けるために、以下に一連の実験の結果を含む実施例を記載する。本発明に関する以下の実施例は例示であって、当然のことながら、本発明を特に限定するものであると見なされるべきではない。さらに、当業者の視野内に入るであろう現在知られているもしくは後に開発される本発明の変法は後に請求する本発明の範囲内に包含されるとみなされるべきである。

Ｌ−スレオニンメチルエステルの還元Ｌ−スレオニンメチルエステル（シグマから購入）をスタンフィールドらの方法（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｔ　（１９８１）、　４６．４７９９）に従って還元した＝５００１１１ノ三ツロフラスコ中テＬ−スレオニンメチルエステル５ｇと乾燥ＴＨＦ２００ｍｌを混合し、アルゴン下で撹拌しながらＬｉＡＩＨ，の１Ｍ溶液１５０菖１を滴下した。次にこの反応混合物をＴＨＦの沸騰温度まで温め、アルゴン下で終夜還流した。この反応の完結をニンヒドリンで可視化したシリカゲルのＴＬＣによって監視した。この反応混合物を５〜１０℃に冷却し、０．２５Ｍ　ＮａＯＨ（１００ｍｌ）を滴下するコトニよッテクエンチした。この混合物からＴＨＦの９０％以上を留去し、その残渣をジメチルホルムアミド（これは濾過を容易にする）１００ｍｌで希釈した。次にこの混合物をアスピレータ−真空を用いワットマン＃１紙を通して濾過した。その濾液を蒸発乾固し、その残渣をフラッシュシリカゲルカラムで精製した。このカラムをジクロロメタンで充填し、生成物をジクロロメタン中の５０％メタノールで溶出させた。

実施例２４−ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−４−アミノ−ｎ−ラフ酸の合成Ｆｍｏｃ−アミノラク酸（Ｃ４リンカ−アーム用）を次の方法に従って製造した。

［注：他のＦＭＯＣ−アミノカルボン酸は市販されている。例えばＦｍｏｃ−アミノカプロン酸（Ｃ６リンカ−アーム用）とＦｍｏｃ−グリシン（Ｃ２リンカ− アーム用）はベイケム（Ｂａｃｈｅｍ）、インコーホレイテッド（カリフォルニア州トランス）から人手することができる。コ水／アセトン（５０・５０）３５ｍｌ中に４−アミノラフ酸１．８ｇと炭酸水素ナトリウム１．．２４ｇの混合物を調製し、Ｆｒｎｏｃ−スクシンイミジルカーボネート（Ｎ−フルオレニルメチル−スクシンイミジルカーボネート）５　ｇ（ベイケム）を加えた。

この反応混合物を室温で終夜撹拌した。この反応混合物のｐＨをＩＮＨｃＩで２に調節し、溶媒を減圧下で除去し、その残渣をエタノール２０ｍ１に溶解し、濾過した。その濾液を蒸発乾固し、その残渣をジクロロメタン中に取り出し、濾過することにより４．８ｇの純粋な生成物を得た。

’ＨＮＭＲＣＤＭＳＯ−ｄａ中）、１．６１（ＣＨ２）、２．２２（ＣＨ２）、３．０１（ＣＨ２−Ｎ）、４．３２（ＣＨｚ−ＣＩＯ）、４．２２（ＮＨ）、７．２５　７．９５（８芳香族上述のＦｍｏｃ−アミノラフ酸製造と類似の方法を用いて、還元したし一スレオニンのアミノ部分を９−フルオレニルメトキシカルボニル（ｒＦｍｏｃＪ）基と連結させた。終夜反応の後、ｐＨの調節は不要であった。溶媒を除去し、その残渣をジクロロメタン４０ｍ１に溶解し、水（２Ｘ　５０ｍ１）で抽出した。次にその有機層を乾燥し、フラッシュシリカゲルカラムで精製した。ジクロロメタン中の２％メタノールで生成物を溶出させることにより、３．８５ｇの生成物を得た。

’ＨＮＭＲ，１，２０（ＣＨｓ）、２．８５（ＮＨ）、３．２６（ＣＨ）、３．４８（ＣＨ）、３．７２（ＯＨ）、７．３−７．９　（８芳香族プロトン）。

実施例４ＦＭＯＣ−遮断リンカ−アームの製造・ＦＭＯＣ−グリシルアミドカプロン酸（Ｃ８）、ＦＭＯＣ−４−アミノブチリルアミド−カプロン酸（ＣＩＯ）およびＦＭＯＣ−カプロイルアミド−カプロン酸（Ｃ１２）上記Ｃ８、Ｃ１０およびＣ１２リンカ−アームを合成するために、Ｆｍｏｃ−グリシン、Ｆｍｏｃ−アミノラフ酸およびＦｍｏｃ−アミノカプロン酸をアミノカプロン酸に連結した。所望のＦｍｏｃ−アミノ酸（１７ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（３×３０ｍ１）との共留去によって乾燥した。次に、乾燥した物質を乾燥ジメチルホルムアミド３０ｍ１に溶解し、乾燥テトラヒドロフラン３０酎を加えた。この溶液を０℃に冷却し、１当量（１７１１１１１１０１）のＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えた。

撹拌しながら１当量の塩化トリメチルアセチルを０℃で滴下し、４５分間撹拌した。次に１．２当量の乾燥アミノカプロン酸を加え、その反応混合物を室温に温め、終夜撹拌した。この反応の進行をＴＬＣで監視した。完結後、溶媒を減圧下で留去した。その残渣を水５０ｍ１中に再構成し、ｌＮＨＣｌでｐＨを２に調節した。この混合物を酢酸エチルｌｏｏｍｌで抽出し、その有機層を水２０ｍ］で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ４）。次にこの混合物を濾過し、溶媒を減圧下で約４０ｍ１の体積まで留去した。混濁するまでこの溶液にヘキサンを滴下し、加熱によって透明にした。次に生成物を終夜結晶化させた。

二足　’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６中）、１．、３０（ＣＨｚ）、１．３９（ＣＨ２）、１゜４８（ＣＨ２）、２．２０（ＣＨ２−Ｎ）、３．０６（ＦＭＯＣ（７）ＣＨ２）、３．５８（ＣＨ２−ＣＯＯＨ）、４．２４（２ＮＨ）、４．３４（ＦＭＯＣのＣＨおよびグリシンのＣＨ２）。

７．３−７．９（８芳香族プロトン）。

、ｑｌＯ’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄａ中）、１．３０−１．７０（５ＣＨ２）、２．０７（ＣＨ２）、　２．２０（ＣＨｔ−Ｎ）、３．０−３．１（ＣＨ２−ＣＯＯＨおよびＦＭＯＣのＣＨ２）、４．２６（２ＮＨ）、４．３１（ＦＭＯＣのＣＨ）、７．３−７．９（８芳ｉ族８２　Ｎ）、２．１８（ＣＨ２−Ｎ）、２．９　３．０（２ＣＨ２−ＣＩＯ）、４．２３（２ＮＨ）、４．３１（ＦＭＯＣのＣＨ２）、７．３　７．９（８芳香族プロトン）。

実施例５還元したし一スレオニンのリンカ−アームへの連結上記実施例２または４に従って調製した所望のリンカ−アーム（１１闘ｏ１）　［Ｆｍｏｃ−グリシン（Ｃ２）、Ｆｍｏｃ−４−アミノラフ酸（Ｃ４）、Ｆｍｏｃ−カプロイック（Ｃ６）、Ｆｍｏｃ−グリシルアミド−カプロン酸（Ｃ８）、Ｆｍｏｃ−４−アミノブチリルアミド−カプロン酸（Ｃ１０）、およびＦｍｏｃ−アミノカプロイルアミドカプロン酸（Ｃ１２）］をピリジン（３Ｘ　２０ｍ１）との共留去によって乾燥した。その乾燥残渣を無水ジメチルホルムアミドと無水テトラヒドロフランの混合物（１：１）４０ｍｌに溶解した。この溶液を水浴中で冷却し、１当量のジイソプロピルエチルアミンを加えた。撹拌しながら１．１当量の塩化トリメチルアセチルを滴下し、０℃で４５分間撹拌した。還元したＬ−スレオニン（上記実施例１）１．５当量の溶液を加え、その反応混合物を室温に温め、１時間撹拌した。

ＣＨ２ＣＩ２／ＣＨｓＯＨ／ＣＨ３ＣＯ０Ｈ（ｌＯ：１・０．１）溶媒系で展開するシリカゲルのＴＬＣで反応の進行を監視した。反応の完結後、溶媒を減圧下で除去し、その残渣を酢酸エチル５Ｑｍｌと混合した。飽和重炭酸水素ナトリウム４０ｍ１での抽出により、水溶性の物質を除去した。その有機層を水２０ｍ１で洗浄し、乾燥した（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４）。

生成物を酢酸エチルから結晶化した。

Ｃ２’Ｊ　ンｈ　’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｓ中）、１．０３（１１元したＬ− スレを二ンのＣＨ３）、３．３５（ＯＨ）、３．３−３．４５（２ｃＨ）、３．９１（ＮＨ）、４．２７（他（７）ＮＨ）、４．３１（ＯＨ）、４．３４（ＣＨｚ）、４．６３（ＦＭＯＣのＣＨおよびＣＨ２）、７．３−７．９（８芳香族プロトン）Ｃ４リンカ−’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｏ中）、１．０３（還元したし一スレオニンのＣＨｓ）、１．６２（ＣＨ２）、２．１４（ＣＨ２）、２．９１（ＣＨ）、２．９７（ＣＨ２）、３．３−３．５（２ＣＨ）、３．６３（ＯＨ）、３．８４（ＯＨ）、４．２３（ＣＨ）、４゜３３（ＦＭＯＣのＣＨ２およびＣＨ）、４．６０（ＮＨ）、６．３２（ＮＨ）、７．３−７．９（８芳香族プロトン）Ｃ６リンカ−’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄａ中）、１．０３（還元したし一スレオニンのＣＨｓ）、１．３−１．７　（３ＣＨ２）、２．５２（ＣＨ２−Ｎ）、３．１２（ＣＨ−ＣＩＯ）、３．８−３．９（２０Ｈ）、４．１−４．２（２ＣＨ）、４．４１（ＦＭＯＣのＣＨ２）、５．２２（ＮＨ）、６．４８（ＮＨ）、７．３　７．９（８芳香族プロトン）Ｃ８リンカ−ＩＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｃｉａ中）主なプロトンシグナルは次の通りである＋１．０１（還元したし一スレオニンのＣＨ３）、１．２２−１．５２　（カブｏ−ｃ−ｈ（７）３ＣＨ２）、３．６２および３．８４（２０Ｈ）、５．３５（ＮＨ）、６．１８（ＮＨ）、７．３ −７．９（８芳香族プロトン）ＣＩＯリンカ−’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯｄｓ中）、１．０２（還元したし一スレオニンのＣＨａ）、１．３−１．５０（４ＧＨｚ）、３．６４（ＯＨ）、３．８２（ＯＨ）、４゜６４（ＮＨ）、６．３３（ＮＨ）、６．６２（ＮＨ）、７．３−７．９（８芳香族プロトン）グナル：１．０１（還元したＬ−スレオニンのＣＨｓ）、１．３０−１．５０　（６ＣＨ２）、３．６３（ＯＨ）、３．８２（ＯＨ）、４．６２（ＮＨ）、６．３１（ＮＨ）、６．６３（ＮＨ）、７．３−７．９（８芳香族プロトン）上記実施例３および５に従って調製した所望の非ヌクレオチド試薬（６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンとの共留去によって乾燥し、乾燥ピリジン１５ｍ１に溶解した。ＣＨＩＣＩ！／ピリジン（１：１）２０ｍｌ中の塩化ジメトキシトリチル２．２ｇの溶液を撹拌しながら滴下した。この反応を室温で４５分間続けた。反応の進行をＴＬＣで監視した。

反応の完結後、メタノール２ｍｌを加えて１０分間撹拌することによりクエンチした。溶媒を減圧下で除去し、その残渣をジクロロメタン５０ｍ１に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム（２Ｘ　５０ａｌｌ）で抽出し、次いで水（３０ｍｌ）で抽出した。有機層を乾燥（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４）　Ｌ、濾過した。溶媒を留去した後、その残渣をフラッノユカラムクロマトグラフィーで精製した。０．５％トリエチルアミンを含有するジクロロメタン中の２％メタノールで生成物を溶出させた。

ＣＯリンカ−’ＨＮＭＲ，ＣＤＣ］ｓ、１．１８（還元したし一スレオニンのＣＨ３）、１．６３（ＣＨ）、２８３（ＮＨ）、３．７７（ＤＭＴの２　ＣＨ３）、　３．８２　（ＦＭＯＣのＣＨ２）、５．４８（ＣＨ２０ＤＭＴ）、６，８２　７．９０（２１芳香族Ｈ３）、３．７８（ＤＭＴの２ＣＨｘ）、４．３５（ＣＨ２−０−ＤＭＴ）、５．９８（ＮＨ）、６．８０−７．７８（２１芳香族プロトン）。

Ｃ４リンカ−’ＨＮＭＲ，ＣＤＣｌ３．主なシグナル、１．１８（還元したし− スレオニンのＣＨｓ）、１．８３（ＣＨ２）、２．２８（ＣＨ２）、３．７４（ＤＭＴの２ＣＨｓ）、４．２１（ＯＨ）、４．．３８（ＦＭＯＣのＣＨ２）、５．２２および６．４２（２ＮＨ）、６．８０−７．６５（２１芳香族プロトン）。

Ｃ６リンカ−’ＨＮＭＲ，ＣＤ　Ｃｌ　ｓ、主なピーク、］、、１２（還元したし一スレオニンのＣＨ３）、１．３　１．６（３ＣＨ２）、３．７５（ＤＭＴの２ＣＨ３）、４．３８（ＦＭＯＣのＣＨ２）、６．８０−７．９０（２１芳香族プロトン）。

Ｃ８リンカ−’ＨＮＭＲ，ＣＤＣＩｓ、主な同定シグナルは次の通りである＋１．１２（還元したし一スレオニンのＣＨ３）、３．８０（ＤＭＴの２ＣＨｓ）、５．４２（ＦＭＯＣのＣＨ２）、６．１８および６．３２１（２ＮＨ）、６．８２−７．８０（２１芳香族プロトン）。

Ｃ１２リンカ−’　ＨＮＭＲ，ＣＤ　Ｃｌ　ｓ、主な同定シグナルは次の通りである：１．１．２（還元したし一スレオニンのＣＨ３）、３．７８（ＤＭＴの２ＣＨ３）、４５９（ＦＭＯＣのＣＨ２）、６．８−７．８（２１芳香族プロトン）。

ＣＩＯリンカ−ＩＨＮＭＲ，ＣＤＣｌ５．１．１８（還元したし一スレオニンのＣＨ３）、３．７８（ＤＭＴの２ＣＨ３）、４．４０（ＦＭＯＣのＣＨ２）、　６．８　７．８（２１芳香族プロトン）すべてのＣＨ２およびＣＨ（非芳香族が説明されたが、同定は行わなかった）。

実施例７非ヌクレオチド試薬の２級水酸基部分のメチルホスフィニル化上記実施例６に記述した方法に従って調製したＤＭＴ遮断リンカ−アーム（４Ｗｍｏｌ）を乾燥ピリジンとの共留去によって乾燥し、その残渣を無水ジクロロメタン２０１１１１に溶解した。閉鎖アルゴン雰囲気下で１．５当量のジイソプロピルエチルアミンを加え、１．２当量のＮ、Ｎ−ジイソプロピルメチルホスフィン酸アミド塩化物［（ＣＨ３）２ＣＨコ２ＮＰ（ＣＨ３）ＣＩを滴下した。この反応は４５分で完結した。

溶媒を減圧下で除去し、その残渣をフラツシュシリカゲルカラムで精製した。このカラムを５％トリエチルアミンの入った酢酸エチル／ヘキサン（１：）で充填し、１％トリエチルアミンの入った酢酸エチル／ヘキサンで洗浄した。次に、このカラムに上記反応混合物を充填し、１％トリエチルアミンの入った酢酸エチル／ヘキサン（１：１）で生成物を溶出させた。

他の非ヌクレオチド試薬は、実施例６に記述した方法に従って調製されるリンカ −アーム修飾試薬（リンカ−アームで修飾した試薬）と他のホスホリル化試薬（例えばＮ、Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホン酸アミド塩化物［（ＣＨ３）２ＣＨ］２ＮＰ（ＯＣＨ３）ＣＩおよび２−シアノ−エチルＮ、Ｎ−ジイソプロピルクロロ−ホスホルアミダイト［（ＣＨｓ）２ＣＨコ２　Ｎ　Ｐ　（ＣＩ　）　ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ　ナト）と（７）連結１：　ヨッテＨ造される。このような試薬はリン酸ジエステルで連結した非ヌクレオチドオリゴマーの合成において有用である。

Ｃｏ　’ＨＮＭＲ，ＣＤＣＩｇ、０．９−１．３（６ＣＨ３の１８プｏトン）、３１１（ＦＭＯＣのＣＨｚ）、３．７８（ＤＭＴの２　ＣＨｓ）、　４．４２（ＣＨ２０−ＤＭＴ）、４．９８（ＮＨ）、６．８−７．８（２１芳香族プロトン）。

Ｃ４’ＨＮＭＲ，ＣＤＣｌ３．０．９　１．２（６ＣＨ３の１８プロトン）、１゜８８（ＣＨ２）、２．２１（ＣＨｚ）、３．０８（ＦＭＯＣのＣＨ２）、３．８０（ＤＭＴの２ＣＨ３）、４．３６（ＣＨ２−〇−ＤＭＴ）、５．１６（ＮＨ）、５．７５（ＮＨ）、６゜８−７．８（２１芳香族プロトン）。

Ｃ６’ＨＮＭＲ，ＣＤＣｌ５．０．９　１．２（６ＣＨ３の１８プロトン）、１゜１８−２．２（４ＣＨｚ）、３．０７（ＦＭＯＣのＣＨ２）、３．７８（ＤＭＴ（’）２ＣＨ３）。

４．４２（ＣＨ２−０−ＤＭＴ）、５．６および６．２１（２ＮＨ）、６．８− ７．８（２１芳香族プロトン）。

実施例８Ｃ６リンカ−アームを有する非ヌクレオチド試薬の２級水酸基部分のメチルホスフィニル化Ｃ６リンカ−アームを有するジメトキシトリチル（ＤＭＴ）遮断非ヌクレオチド試薬（本明細書実施例６に記述した方法に従って製造）　４　ｍｍｏｌを乾燥ピリジンとの共留去によって乾燥した。その残渣を無水ジクロロメタン２００１１に溶解した。閉鎖アルゴン雰囲気下で１．５当量のＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えた後、１．２当量のＮ、Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホン酸アミド塩化物［（ＣＨ３）２ＣＨ）ｚＮＰ（ＣＩ）ＯＣＨｓを滴下した。次に、実施例７に記述した方法を用いてこの反応混合物の後処理を行うことにより、３．２ｍＭの標記生成物を得た。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３中）、δｐｐｍ：１　１．５（５メチルおよび１メチレン）。

１．４２（ＣＨ２）、１．７３および１．７３（２ＣＨ２）、２．２ＨＣ）（２Ｎ）、３．１５（ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ）、３．７８（ＤＭＴの２ＣＨｓ）、６．８０ −７．８５（２１芳香族プロトン）。他のプロトンシグナルも存在したが同定しなかった。

実施例９Ｃ８リンカ−アームを有するメトキシホスホルアミダイト非ヌクレオチド試薬を組み込むリン酸ジエステルオリゴマーの製造下記の配列でＣ８メトキンホスホルアミダイト非ヌクレオチド試薬を組み込んだリン酸ジエステルオリゴデオキシリポヌクレオチドを合成した：５’−ＴＴＴ−ＡＡＧ−ＣＡＧ−ＡＧＴ−ＴＣＡ− ＡＡＡ−ＧＣＣ−ＣＴＴ−ＣＡＧ−ＣＧ−（Ｃ８リンカ−）−Ｔ−３’を次の方法に従って調製した。

Ｃ８メトキシホスフォルアミダイト非ヌクレオチド試薬（１−０−ジメトキシトリチル−２−Ｎ［Ｎ’−（Ｎ”−フルオレニル−メトキシカルボニル−６−アミノヘキサノイル）−２−アミノアセチル］−３−０−［Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル −メトキシ−ホスフィニル］−２−アミノ−１，２−ジヒドロキシブタン）を乾燥アセトニトリルに１００ｍＭ濃度で溶解し、バイオサーチ・モデル８７５０・ＤＮＡ合成装置を用い、製造者の推奨するところに従って標準的なホスホルアミダイト化学（エム・エイチ・カルサースら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５４＋２８７−３１３（１９８５））によって上記オリゴヌクレオチド配列中ニ連結シタ。ケイ・エム・口ら（１９８４，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．２２８５−２２８９頁）が記述したセブーパック（Ｓｅｐ−Ｐａｋ”）　Ｃ１８カートリツジ（ミリポア／ウォータース、マサチューセッツ州ベトフォード）での精製が可能なように、合成の終了時に５°ジメトキシトリチル保護基を残しておいた。この操作の間にこのジメトキシトリチル保護基は除去された。

実施例１０非ヌクレオチド試薬を組み込むメチルホスホネートオリゴマーの製造（ａ）メチルホスホネートオリゴマーの製造本発明の非ヌクレオチド試薬を組み込んだメチルホスホネートオリゴマーを、メチルホスホンアミダイトモノマーと非ヌクレオチドメチルホスホンアミダイト非ヌクレオチド試薬を用いて、ビー−ニス・ミラーら（１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１１、６２２５ −６２４２頁）、エイ・イエイガ−およびジェイ・エンゲルス（１９８４，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、　、　２５．１４３７−１４４０頁）、およびエム・エイ・ドルマンら（１９８４，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、　４０．９５−１０２頁）が記述した化学法に従って合成した。バイオサーチ・モデル８７５０・ＤＮＡ合成装置を用い、製造者の推奨するところに下記の改良を加えて固相合成を行った；　「Ｇ」およびｒＣＪモノマーを１＝１アセトニトリル／ジクロロメタンに１００ｍＭ濃度で溶解した。ｒＡＪおよびｒＴＪモノマーをアセトニトリルＥ１００ｍＭ１１度で溶解した。非ヌクレオチドリンカー試薬をアセトニトリルに１．２０ｍＭ濃度で溶解した。脱遮断（ＤＥＢＬＯ（Ｊ）試薬＝２．５％ジクロロ酢酸（ジクロロメタン中）。酸化（ＯＸＩＤＩπＲ）試薬＝２５ｇ／Ｌヨウ素（２５％水、２５％２゜６−ルチジン、７２．５％テトラヒドロフラン中）。ＣＡＰ　Ａ＝１０％酢酸無水物（アセトニトリル中）。ＣＡ、Ｐ　Ｂ＝０．６２５％Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ピリノン中）。下記のオリゴマー精製を容易にするために、合成の終了時に５−ジメトキシトリチル保護基を残しておいた。

粗製の保護された非ヌクレオチド試薬を組み込んだメチルホスホネートオリゴマーを、室温で濃水酸化アンモニウムと２時間混合することによって固体支持体から切り放した。その溶液をエコノーカラム（Ｅｃｏｎｏ−Ｃｏｌｕｍｎ”）（パイオーラッド、カリフォルニア州すッチモンド）を用いて支持体から排出し、支持体を１１アセトニトリル／水で５回洗浄した。次に、溶出したオリゴマーを室温真空下で蒸発乾固した。次に、エチレンジアミン／エタノール／アセトニトリル／水（５０・２３゜５：２３．５：２．５）の溶液を用いて室温６時間の条件で、保護基を塩基から除去した。次に、得られた溶液を真空下で蒸発乾固した。

（ｂ）リンカ−修飾メチルホスホネートオリゴマーの精製セプーバック（Ｓｅｐ −Ｐａｋ”）　Ｃ１８カートリツジ（ミリポア／ウォータース、マサチューセッツ州ベトフォード）を用い、下記の要領で、５−ジメトキシトリチル（トリチル）含有オリゴマーをトリチル化されていない欠陥配列から精製した：上記カートリッツをアセトニトリル、１００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ、ｐＨ７，５）中の５０％アセトニトリル、および２５ｍＭＴＥＡＢｔ’洗浄した。次に粗型洗浄ルホスホネートオリゴマーを少量の１：１アセトニトリル／水に溶解し、次いで、２５ｍＭＴＥＡＢで最終濃度が５％アセトニトリルになるように希釈した。次にこの溶液を上記カートリッジに通した。次に、カートリッジを２５ｍＭ　ＴＥＡＢ中の１５〜２０％アセトニトリルで洗浄することにより、欠陥配列をカートリッジから溶出させた。次に、カートリッジに結合して残っているトリチル−オン（トリチル化されている）オリゴマーを、２５ｍＭ　ＴＥＡＢ。

２％トリフルオロ酢酸、および２５ｍＭ　ＴＥＡＢを用いてこの順序で洗浄することにより、脱トリチル化した。最後に、トリチル選択したオリゴマーを５０％アセトニトリル／水でカートリッジから溶出させ、室温真空下で蒸発乾固した。

上記前段階で得られたリンカ−修飾メチルホスホネートオリゴマーをさらに下記の要領で逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって精製した：過去の例に記述されているベックマン・システム・ゴールド・ＨＰＬＣをハミルトンＰＲＰ−１カラム（レノ、ＮＶ、１０μ、７市内径Ｘ３０５ｍｍ長）と共に使用した。緩衝液Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）：緩衝液８２５０％アセトニトリル（５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）中）。１００％緩衝液Ａを２゜５〜３ｍ１／分の流量で流しながら、少量の１０〜５０％アセトニトリル／水に溶解した試料をカラムに充填した。次に、０−７０％緩衝液Ｂの直線的勾配を３０〜５０分間かけて２．５〜３ｍ１７分の流量で流した。非ヌクレオチド試薬を組み込んだ完全な長さのメチルホスホネートオリゴマーを含有する分画を真空下でエバポレートし、５０％アセトニトリル／水中に再懸濁した。

実施例９のリン酸ジエステルオリゴヌクレオチド（１９マー）を０．１５Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０）１１５μｍに懸濁した。次にＮＨ３−ＬＣ−ビオチン（ピアス・ケミカル・カンパニー、イリノイ州ロックフォード）を加えた（ジメチルスルホキシド中の１００ｍＭ溶液１０μｍ）。この溶液を３７℃で３０分間加熱した。

ＮＨ３−ＬＣ−ビオチン溶液（１０μｍ）を追加し、反応を３７℃で３０分間続けた。

次に３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５，１５μｍ）と無水エタノール（５００μｍ）を添加することによって、ビオチニル化したオリゴヌクレオチドを沈殿させ、得られた溶液をドライアイス中で３０分間冷凍した。微量遠心機中４℃ で１５分間遠心分離することにより生成物を回収し、その上清を捨てた。

次に生成物を水（１００μｍ）に溶解し、下記の方法に従って逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーで精製した。ＨＰＩ、Ｃ装置は、ベックマン・システム・ゴールド・モデル１．２６・ソルベント・モジュールとＩＢＭ互換性コンピューターに接続されたモデル１６７・ディテクターから構成された。ＰＬＲＰ−Ｓカラムを用いた（ポリマー・ラボラトリーズ、８μ、３００Ａ孔径、４．５ｍｍ内径Ｘ２５０ｍｍ長）。緩衝液Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）；緩衝液８２５０％アセトニトリル（５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）中）。２０−６０％Ｂの直線的勾配を３０分間かけて１．５ｍｌ／分の流量で流した。これらの条件下では、ビオチニル化生成物オリゴヌクレオチドが１０．３分で溶出した。

［−３２Ｐ］−、へＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、下記の要領で実施例１１のビオニチル化オリゴヌクレオチドの５゛末端を３２ｐでラベル化した。５０μＣｊの［−”Ｐ］−Ａ、ＴＰを含有する５０ｍＭ）リス（ｐＨ７，８）、１０ｍＭＭｇＣｌ、、５ｍＭ　ＤＴＴ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０゜１ｍＭスペルミジンにオリゴヌクレオチド１Ｑｐａ＋ｏｌを溶解した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（４単位）を加え、その溶液を室温で９０分間インキュベートした。

ネンソーブ（ＮｅｎｓｏｒｂＴＭ）−２０カラム（二ニー・イングランド・ヌクレアー／デュポン）を用い製造者の指示に従って、放射線ラベルされた生成物を精製した。

３２ｐラベル化ビオチニル化オリゴヌクレオチド（１００００ｃｐｍ）を１．５ｍｌ微量遠心管中の５ＱｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ　ＥＤＴＡｏ、５１１１１１に溶解した。同じ成分と１ｍｇ／ｍｌビオチン（カルバイオケム・コーポレイション、カリフォルニア州すンディエゴ）を含有する対照をも調製した。次に、ストレブタビジンーアガロース（ピアス・ケミカル・カンパニー、イリノイ州ロックフォード）５０μｍを各チューブに加え、その内容物をバルテクサーで１５分間混合した。次にチューブを微量遠心機中で２分間遠心分離することによりストレブタビジンーアガロースをベレット化し、その上清を新しいチューブに移した。次にペレットを緩衝液（上記参照）０．５１１で２回洗浄し、その洗浄液を同様に遠心分離によって分離し、新しいチューブに移した。これらチューブの放射活性をシンチレーション計数器で計数した。遊離のビオチンを添加しないで調製した試料は８５％以上がストレブタビジンーアガロース支持体に結合した。

遊離のビオチンを加えて調製した試料（対照）の場合は０．５％未満が支持体に結プソラレンを伴うＣ４リンカ−非ヌクレオチドモノマーを組み込んだメチルホスホネートオリゴマーのラベル化下記の配列を有するＣ４リンカ−修飾メチルホスホネートオリゴマーを製造した：５’ＧＧＣ−ＴＴＴ−ＴＧＡ−（Ｃ４−リンカ−）−ＡＣＴ−ＣＴＧ−ＣＴＴ− ３’［ここに太字は（Ｃ４−リンカ−を含めて）メチルホスホネート結合によって連結されている塩基または非ヌクレオチドモノマーを表し、大文字はジエステル結合によって連結されている塩基を表す］。

このオリゴヌクレオチドの合成および精製法は上記実施例に記述されている。

このオリゴマーをプソラレンーＮＨＳラベル化試薬で次のようにラベルした＝（オリゴマー中に存在する）リンカ−アームに対するＮＨ３−プソラレン試薬の下記連結反応を１．５ｍｌポリプロピレン微量遠心管中で行った。オリゴマー約３゜４ｍｇ（９８０Ｄ１ａａ単位）を１：１アセトニトリル／水１００μｍに溶解した。次に下記試薬を、オリゴマーの沈殿を避けるために添加するごとにポルテックスしながら順番に加えたニジメチルスルホキシド（１７０μｍ）、水（１００μｍ）、ＩＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０Ｘ５０μｌ）、および５０ｍＭブソラレンーＮＨ５試薬（ジメチルスルホキシド中）（８０μｌ）。総体積二５００μｍ。この混合物を遮光上室温で２．５時間反応させた。次にエタノール（Ｉｌｌ）を加え、得られた溶液を一２０℃で終夜冷凍した。次にこの遠心管を微量遠心機中で５分間遠心分離し、その上清を吸引して捨てた。得られたベレットを１＝１アセトニトリル／水５００μｍに再懸濁し、０．２２μデユラボア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ？″）膜を通して濾過することにより粒状物を除去した。

上記の粗製ブソラレンーオリゴマー複合体溶液のＨＰＬＣ精製を次のように行った：ベツクマン・システム・ゴールド・分析ＨＰＬＣシステムをハミルトンＰＲＰ−１カラム（４，Ｉ　Ｘ　２５０ｍｍ）と共に用いた。溶出に使用した緩衝液は次の通りである　緩衝液Ａ−５ＱｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）；緩衝液Ｂ−５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）中の５０％アセトニトリル。カラムに１０％緩衝液Ｂを１．５１＋＋１／分の流量で流しながら、５００μｌの試料ループを用いて、試料を１００μｌづつに５等分して２分間隔てカラムに充填した。次に、１０−７０％緩衝液Ｂの直線的勾配を３０分間かけて流した。０．５分間隔で分画を集めた。これらの条件下では、修飾されていないオリゴマーとブソラレンで修飾されたオリゴマーがそれぞれ１７．９分と２１．７分で溶出した。ブソラレンで修飾されたオリゴマーを含有する分画を集め、エバポレートした。総酸率は１６％であった。

実施例１４相補的リン酸ジエステルオリゴマーヌクレオチド標的に対するプソラレンーラベル化メチルホスホネートオリゴマーの架橋実施例１３のメチルホスホネートオリゴマーに相補的なリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドをバイオサーチ・モデル８７５０・ＤＮＡシンセサイザーで、製造者の推奨するところに従って合成した；このオリゴヌクレオチドは下記の配列を有する：５“−ＡＡＧ−ＣＡＧ−ＡＧＴ−ＴＣＡ−ＡＡＡ−ＧＣＣ−３’　。

実施例１３の方法に従って製造されるブソラレン修飾メチルホスホネートオリゴマーを、上述のようにＵｐを用いてその５′末端でラベル化した（実施例１２を参照のこと）。１０ｍＭトリス（ｐＨ７，２）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０３％サルコシル酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　５ａｒｋｏｓｙｌａｔｅ）の入ったホウ珪酸塩ガラスバイアル中で、５ｚｐ−ラベル化プソラレン修飾オリゴマー（１０−５００００ｃｐｍ）をそのジエステルオリゴヌクレオチド標的（ｌ　ｐｍｏｌ、上記）と３７℃で３０分間ハイブリッド形成させた。、ジエステルオリゴヌクレオチド標的なしで対照反応をも行った。

次に１５ｃｍの距離に置いたモデルＢ〜１００Ａ長波長紫外光ランプ（ＵＶＰ、インコーポレイテッド、カリフォルニア州サンガブリエル）を用いて、砕氷上でバイアルを３６５ｒ＋ｍ光にさらした。この距離での光照射の強度は６０μＷ／　１００　ａｍ２と等価かそれ以上であった。３０分後、０．１％ブロモフェノールブルー、０゜１Ｍトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，２）を含有する９０％ホルムアミドを加え（５μｍ）、その試料を７Ｍ尿素を含む１５％ポリアクリルアミドゲル（０゜５ｍｍ）に充填した。このゲルを９００Ｖで２時間電気泳動した。次に湿ゲルを２枚のサランラップ（Ｓａｒａｎ　Ｗｒａｐｆ１″）の間に置き、ＸＡＲ−５フイルム（イーストマンーコダック、ニューヨーク州ロチェスター）に３０〜６０分間暴露した。得られたオートラジオグラフはジエステル標的オリゴヌクレオチドを含有する試料の上側のバンドがブソラレン修飾メチルホスホネートオリゴマー単独に対応するバンドよりゆっくり移動することを明らかにした。次に、このオートラジオグラフを鋳型として利用することにより、バンドをメスで湿ゲルから切り出し、シンチレーション計数器で計数した。この方法に基づいて、相補的なジエステル標的に対するブソラレン修飾メチルホスホネートオリゴマーの架橋が９５％より大きいことが決定された。

んＧ　２ａ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを製造するのに適したキラリティーが純粋な非ヌクレオチド試薬であって、該ポリマー中に組み込まれた時にキラリティーが純粋なままであり、キラリティーが純粋な非ヌクレオチド骨格並びにその骨格に結合したリガンド部分と第１および第２の連結基を有する非ヌクレオチドモノマー単位からなる非ヌクレオチド試薬（ここに、第１の連結基は上記骨格を第１の追加モノマー単位に連結する能力を有し、その間、第２の連結基は実質上連結する能力を有さないように不活化されたままであるが、その後上記骨格を第２の追加モノマー単位に連結するために有害でない条件下で活性化することができ、該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーは少なくとも１つのヌクレオチドモノマー単位を含有する）。２．第１および第２の追加モノマー単位のうち少なくとも１つが又クレオチドモノマー単位からなる請求の範囲第１項記載の非ヌクレオチド試薬。３．該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーがモノマー単位間に少なくとも１つのリン酸ジエステル結合を含有する請求の範囲第１項記載の非ヌクレオチド試薬。４．該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーがリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドからなる請求の範囲第３項記載の非ヌクレオチド試薬。５．該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーがモノマー単位間に、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、および中性リン酸エステル結合から選択される結合を少なくとも１つ含有する請求の範囲第１項記載の非ヌクレオチド試薬。６．該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーが次式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｕは酸素、硫黄またはイミノを表し、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｓ−、−Ｏ− または−ＮＨ−を表し、Ｚは−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、Ｗはアルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、Ｓ −、Ｏ−、アミノまたは置換されたアミノを表す］で示されるモノマー単位量結合を含有する請求の範囲第１項記載の非ヌクレオチド試薬。７．該非ヌクレオチドモノマー単位が ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＳＫＥＬはキラリティーが純粋な約１ないし約２０炭素原子の非ヌクレオチド骨格からなり、−ＮＨＬ、ＹおよびＺはＳＫＥＬの炭素原子に共有結合で連結しており、Ｌはリガンドを表し、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または− ＮＨ−を表し、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表す］からなる請求の範囲第１項記載のキラリティーが純粋な非ヌクレオチド試薬。８．ＳＫＥＬがＹとＺの間に約１ないし約１０炭素原子の基本骨格を含有する請求の範囲第７項記載の非ヌクレオチド試薬。９．しが下記から選択される保護されたリンカーアームまたは−Ｐｒからなる請求の範囲第８項記載の非ヌクレオチド試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ ［ここにｎおよびｍは独立に約１から約１５までの整数を表し、Ｐｒは有害でない条件下で除去することができる保護基を表す］１０．該非ヌクレオチドモノマー単位が▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、★Ｃのうち少なくとも１つはキラル中心を構成する炭素原子を素し、Ｒ１とＲ２のうち一方は水素を表し、他方は−ＮＨ−Ｌ（ここにＬはリガンドである）を表し、Ｒ３とＲ４のうち一方は水素を表し、他方は約１ないし約１０炭素原子の低級アルキルを表し、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表し、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−を表す］からなる請求の範囲第１項記載の非ヌクレオチド試薬。１１．Ｌが下記から選択される保護されたリンカーアームまたは−Ｐｒからなる請求の範囲第１０項記載の非ヌクレオチド試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ ［ｎおよびｍは独立に約１から約１５までの整数を表し、Ｐｒは有害でない条件下で除去することができる保護基を表す〕１２．該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーがモノマー単位間に少なくとも１つのリン酸ジエステル結合を含有する請求の範囲第１１項記載の非ヌクレオチド試薬。１３．モノマー単位間に少なくとも１つのアルキル−またはアリール−ホスホネート結合を有するヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを製造するのに適した非ヌクレオチド試薬であって、非ヌクレオチド骨格並びにその骨格に結合したリガンド部分と第１および第２の連結基を有する非ヌクレオチドモノマー単位からなる非ヌクレオチド試薬（ここに、第１の連結基は上記骨格と第１の追加モノマー単位の間にアルキル−またはアリール−ホスホネート結合を形成する能力を有し、その間、第２の連結基は実質上連結する能力を有さないように不活化されたままであるが、その後上記骨格を第２の追加モノマー単位に連結するために有害でない条件下で活性化することができ、該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーは少なくとも１つのヌクレオチドモノマー単位を含有する）。１４．第１および第２の追加モノマー単位のうち少なくとも１つがヌクレオチドモノマー単位からなる請求の範囲第１３項記載の非ヌクレオチド単位。１５．該アルキル−またはアリール−ホスホネート結合がメチルホスホネート結合からなる請求の範囲第１３項記載の非ヌクレオチド試薬。１６．該モノマー単位が ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１とＲ２のうち一方は水素を表し、他方は−ＮＨ−Ｌ（ここにしはリガンドである）を表し、Ｒ３とＲ４のうち一方は水素を表し、他方は約１ないし約１０炭素原子の低級アルキルを表し、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または −ＮＨ−を表し、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−を表す］からなる請求の範囲第１５項の非ヌクレオチド試薬。１７．Ｌが下記から選択される保護されたリンカーアームまたは−Ｐｒからなる請求の範囲第１６項記載の非ヌクレオチド試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここにｎおよびｍは独立に約１から約１５までの１数を表し、Ｐｒは有害でない条件下で除去することができる保護基を表す］１９．モノマー単位間に少なくとも１つのアルキル−またはアリール−ホスホネート結合を有するヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを製造するのに適した非ヌクレオチド試薬であって、該ポリマー中に組み込まれた時にキラリティーが純粋なままであり、キラリティーが特殊な非ヌクレオチド骨格並びにその骨格に結合したリガンド部分と第１および第２の連結基を有する非ヌクレオチドモノマー単位からなる非ヌクレオチド試薬（ここに、第１の連結基は上記キラリティーが純粋な骨格と第１の追加モノマー単位の間にアルキル−またはアリール−ホスホネート結合を形成する能力を有し、その間、第２の連結基は実質上連結する能力を有さないように不活化されたままであるが、その後上記キラリティーが純粋な骨格を第２の追加モノマー単位に連結するために有害でない条件下で活性化することができ、該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーは少なくとも１つのヌクレオチドモノマー単位を含有する）。２０．第１および第２の追加モノマー単位のうち少なくとも１つがヌクレオシド単位からなる請求の範囲第１９項記載の非ヌクレオチド試薬。２１．該アルキル−またはアリール−ホスホネート結合がメチルホスホネート結合からなる請求の範囲第１９項の非ヌクレオチド試薬。２２．該非ヌクレオチドモノマー単位が▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＳＫＥＬはキラリティーが純粋な約１ないし約２０炭素原子の非ヌクレオチド骨格からなり、−ＮＨＬ、ＹおよびＺはＳＫＥＬの炭素原子に共有結合で連結しており、Ｌはリガンドを表し、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または− ＮＨ−を表し、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表す］からなる請求の範囲第２１項記載のキラリティーが純粋な非ヌクレオチド試薬。２３．ＳＫＥＬがＹとＺの間に約１ないし約１０炭素原子の基本骨格を含有する請求の範囲第２２項の非ヌクレオチド試薬。２４．Ｌが下記から選択される保護されたリンカーアームまたは−Ｐｒからなる請求の範囲第２３項記載の非ヌクレオチド試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ ［にこにｎおよびｍは独立に約１から約１５までの整数を表し、Ｐｒは有害でない条件下で除去することができる保護基を表す］２５．該非ヌクレオチドモノマー単位が▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、★Ｃのうち少なくとも１つはキラル中心を構成する炭素を表し、Ｒ１とＲ２のうち一方は水素を表し、他方は−ＮＨ−Ｌ（ここにＬはリガンドである）を表し、Ｒ３とＲ４のうち一方は水素を表し、他方は約１ないし約１０炭素原子の低級アルキルを表し、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表し、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−を表す］からなる請求の範囲第１９項記載の非ヌクレオチド試薬。２６．Ｌが下記から選択される保護されたリンカーアームまたは−Ｐｒからなる請求の範囲第２５項記載の非ヌクレオチド試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ ［ここにｎおよびｍは独立に約１から約１５までの整数を表し、Ｐｒは有害でない条件下で除去することができる保護基を表す］２７．該アルキル−またはアリール−ホスホネート結合がメチルホスホネート結合からなる請求の範囲第２６項の非ヌクレオチド試薬。２８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＳＫＥＬはキラリティーが純粋な約１ないし約２０炭素原子の非ヌクレオチド骨格からなり、−ＮＨＬ、ＹおよびＺはＳＫＥＬの炭素原子に共有結合で連結しており、Ｌはリガンドを表し、−ＹＣＰ１は第１連結基を表し、−ＺＣｐ２は遮断された第２連結基を表し、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表し、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表す］で示されるキラリティーが純粋な非ヌクレオチド試薬。２９．第１連結基−ＹＣＰ１が下記から選択される請求の範囲第２８項記載の非ヌクレオチド試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼［式中、Ｘ１はハロゲンまたは置換されたアミノを表し、Ｘ２はハロゲン、置換されたアミノまたはＯ−を表し、Ｒ５はアルキル、置換されていてもよいアルコキシまたは置換されていてもよいアリールオキシを表し、Ｒ６はアルキル、置換されていてもよいアルコキシまたは置換されていてもよいアリールオキシを表すか、あるいはＸ２がＯ−を表す場合には水素を表してもよく、Ｕは酸素、硫黄またはイミノを表し、ＶはＯ−、Ｓ−、または置換されたアミノを表し、Ｗはアルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、Ｓ −、Ｏ−、アミノまたは置換されたアミノを表す］３０．遮断された第２連結基 −ＺＣｐ２が第２連結基−ＺＨを回収するために有害でない条件下で切断され得る保護基を有する請求の範囲第２９項記載の非ヌクレオチド試薬。３１．第１連結基が ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ５はメチルを表し、Ｘ１はジイソプロピルアミノを表す］である請求の範囲第３０項記載の非ヌクレオチド試薬。３２．該リガンドが下記から選択される保護されたリンカーアームまたは−Ｐｒである請求の範囲第３１項記載の非ヌクレオチド試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ ［ここにｎおよびｍは独立に約１から約１５までの整数を表し、Ｐｒは有害でない条件下で除表することができる保護基を表す］３３．ｎおよびｍが独立に１から５までの整数を表す請求の範囲第３２項記載の非ヌクレオチド試薬。３４．Ｚが酸素を表す請求の範囲第３３項記載の非ヌクレオチド試薬。３５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、★Ｃはキラル中心を含む炭素を表し、Ｒ１とＲ２のうち一方は水素を表し、他方は−ＮＨ−Ｌ（ここにＬはリガンド部分である）を表し、Ｒ３とＲ４のうち一方は水素を表し、他方は約１ないし約１０炭素原子の低級アルキルを表し、−ＹＣｐ１は第１連結基を表し、−ＺＣｐ２は遮断された第２連結基を表し、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表し、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表す］で示されるキラリティーが純粋な非ヌクレオチド試薬。３６．第１連結基−ＹＣｐ１が下記から選択される請求の範囲第３５項記載の非ヌクレオチド試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼および ▲数式、化学式、表等があります▼［式中、Ｘ１はハロゲンまたは置換されたアミノを表し、Ｘ２はハロゲン、置換されたアミノまたはＯ−を表し、Ｒ５はアルキル、置換されていてもよいアルコキシまたは置換されていてもよいアリールオキシを表し、Ｒ６はアルキル、置換されていてもよいアルコキシまたは置換されていてもよいアリールオキシを表すか、あるいはＸ２カＯ−を表す場合には水素を表してもよく、Ｕは酸素、硫黄またはイミノを表し、ＶはＯ−、Ｓ−、または置換されたアミノを表し、Ｗはアルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、Ｓ−、Ｏ−、アミノまたは置換されたアミノを表す］３７．遮断された第２連結基−ＺＣｐ２が第２連結基−ＺＨを回収するために有害でない脱遮断条件下で切断され得る保護基を有する請求の範囲第３６項記載の非ヌクレオチド試薬。３８．該保護基がジメトキシトリチル基である請求の範囲第３７項記載の非ヌクレオチド試薬。３９．第１連結基が ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ５はメチルを表し、Ｘ１はジイソプロピルアミノを表す］である請求の範囲第３７項記載の非ヌクレオチド試薬。４０．該リガンドが下記から選択される保護されたリンカーアームまたは−Ｐｒからなる請求の範囲第３９項記載の非ヌクレオチド試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ ［ここにｎおよびｍは独立に約１から約１５までの整数を表し、Ｐｒは有害でない条件下で除去することができる保護基を表す］４１．ｎおよびｍが独立に１から５までの整数を表す請求の範囲第４０項記載の非ヌクレオチド試薬。４２．Ｚが酸素を表す請求の範囲第４０項記載の非ヌクレオチド試薬。４３．該リガンドが下記から選択される保護されたリンカーアームまたは−Ｐｒからなる請求の範囲第３５項記載の非ヌクレオチド試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ ［ここにｎおよびｍは独立に１から１５までの整数を表し、Ｐｒは有害でない条件下で除去することができる保護基を表す］４４．ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを製造するのに適したキラリティーが純粋な非ヌクレオチド試薬であって、該ポリマー中に組み込まれた時にキラリティーが純粋なままであり、キラリティーが純粋な非ヌクレオチド骨格並びにその骨格に結合したリガンド部分と第１および第２の連結基を有する非ヌクレオチドモノマー単位からなる非ヌクレオチド試薬（ここに、該第１連結基は有害でない条件下で切断することができる結合によって該骨格を支持体に連結し、その間、該第２連結基は不活性のままであるが、その後該骨格を追加のモノマー単位に連結するために有害でない条件下で活性化することができ、該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーはヌクレオチドモノマー単位を含有するものとする）。４５．該骨格がエステル結合によって該支持体に連結される請求の範囲第４４項記載の非ヌクレオチド試薬。４６．該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーがモノマー単位間に少なくとも１つのアルキル−またはアリール−ホスホネート結合を含有する請求の範囲第４４項記載の非ヌクレオチド試薬。４７．モノマー単位間に少なくとも１つのアルキル−またはアリール−ホスホネート結合を有するヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを製造するのに適した非ヌクレオチド試薬であって、非ヌクレオチド骨格並びにその骨格に結合したリガンド部分と第１および第２の連結基を有する非ヌクレオチドモノマー単位からなり、該第１連結基は有害でない条件下で切断することができる結合によって該骨格を支持体に連結し、その間、該第２連結基は不活性のままであるが、その後該骨格を追加のモノマー単位に連結するために有害でない条件下で活性化することができる非ヌクレオチド試薬（ここに該ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーはヌクレオチドモノマー単位を含有する）。４８．該骨格がエステル結合によって該支持体に連結される請求の範囲第４７項記載の非ヌクレオチド試薬。４９．少なくとも約８モノマー単位からなるオリゴマーであって、少なくとも１つのモノマー単位が請求の範囲第１項に定義した非ヌクレオチドモノマー単位からなるオリゴマー。５０．約１から約５までの独立に選択される非ヌクレオチド単位を含有する請求の範囲第４９項のオリゴマー。５１．少なくとも約８モノマー単位からなるオリゴマーであって、少なくとも１つのモノマー単位が請求の範囲第１３項に定義した非ヌクレオチドモノマー単位からなるオリゴマー。５２．メチルホスホネートオリゴマーからなる請求の範囲第５１項記載のオリゴマー。５３．少なくとも約８モノマー単位からなるオリゴマーであって、少なくとも１つのモノマー単位が請求の範囲第１９項に定義した非ヌクレオチドモノマー単位からなるオリゴマー。５４．メチルホスホネートオリゴマーからなる請求の範囲第５３項記載のオリゴマー。５５．約１から約５までの独立に選択される非ヌクレオチドモノマー単位を含有する請求の範囲第５４項記載のオリゴマー。５６．少なくとも約８モノマー単位からなるオリゴマーであって、少なくとも１つのモノマー単位が請求の範囲第２３項記載の非ヌクレオチドモノマー単位からなるオリゴマー。５７．メチルホスホネートオリゴマーからなる請求の範囲第５６項記載のオリゴマー。５８．約１から約５までの独立に選択される非ヌクレオチドモノマー単位を含有する請求の範囲第５７項記載のオリゴマー。５９．ｎおよびｍが独立に１から５までの整数を表す請求の範囲第５８項記載のオリゴマー。６０．少なくとも約８モノマー単位からなるオリゴマーであって、少なくとも１つのモノマー単位が請求の範囲第２６項記載の非ヌクレオチドモノマー単位からなるオリゴマー。６１．メチルホスホネートオリゴマーからなる請求の範囲第６０項記載のオリゴマー。６２．約１から約５までの独立に選択される非ヌクレオチドモノマー単位を含有する請求の範囲第６１項記載のオリゴマー。６３．ｎおよびｍが独立に１から５までの整数を表す請求の範囲第６２項記載のオリゴマー。