JPH05501855A - 哺乳動物における血栓症の治療に関する方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物における血栓症の治療に関する方法及び組成物。

発明の分野 本発明は一般的に治療方法及び医薬組成物、更に詳しくは格別限定されないが血 栓症の治療に関する組成物及び方法に関する。

発明の要旨 本発明の一面によれば、哺乳動物への非経口注入に適した多数のマイクロカプセ ルからなり、各々がプラスミノーゲンアクチベーター含有コア及びそのコアを包 囲する生体適合層からなり、その層が半透過性であって、哺乳動物の心血管系内 に少なくとも一部のコアプラスミノーゲンアクチベーターを制御的に放出でき、 哺乳動物における血管の再潅流に要する時間の量を遊離プラスミノーゲンアクチ ベーター含有組成物が哺乳動物に投与された場合の血管再潅流時間よりも約２０ ％以下−約５０％減少させることができる医薬組成物が提供される。

本発明は、哺乳動物に治療有効量の医薬組成物を非経口注入することからなる、 血栓症をかかる治療の必要な哺乳動物において治療する方法にも関する。その組 成物は■乳動物への非経口注入に適した多数のマイクロカプセルからなり、各々 がプラスミノーゲンアクチベーター含有水性コア及びそのコアを包囲する生体適 合層からなる。その層は半透過性であって、哺乳動物の心血管系内に少なくとも 一部のコアプラスミノーゲンアクチベーターを制御的に放出できる。

本発明は哺乳動物における血栓含有動脈の再潅流に要する時間をプラスミノーゲ ンアクチベーター含有組成物が哺乳動物に投与された場合の動脈再潅流時間より も約２０％以下−約５０％減少させる方法にも関するが、その場合において各々 がプラスミノーゲンアクチベーター含をコア及びそのコアを包囲する生体適合層 からなり、その層が半透過性であって、哺乳動物の心血管系内に少なくとも一部 のコアプラスミノーゲンアクチベーターを制御的に放出できる哺乳動物への非経 口注入に適した多数のマイクロカプセルからなる治療有効量の医薬組成物を哺乳 動物に非経口注入する。

本発明は更にかかる治療のＺ要な哺乳動物を治療有効量のプラスミノーゲンアク チベーターで治療する方法に関するが、その場合にプラスミノーゲンアクチベー ターの量は哺乳動物の最少標準投与要求量よりも標準投与要求量の約２０％〜約 ５０％で減少される。哺乳動物は哺乳動物への非経口注入に適した多数のマイク ロカプセルからなる治療有効量の医薬組成物で非経口注入される。

マイクロカプセルはプラスミノーゲンアクチベーター含の層は半透過性であって 、哺乳動物の心血管系内に少なくとも一部のコアプラスミノーゲンアクチベータ ーを制御的に放出できる。

図面の簡単な説明 図ＩＡは血小板欠乏血漿（Ｐ　Ｐ　Ｐ）の濾過中にモニターされた圧力低下の時 間依存性について示す。

図ＩＢは血餅閉塞膜によるストレプトキナーゼ及び血小板欠乏血漿混合液（ＳＫ ／ＰＰＰ）の濾過中にモニターされた圧力低下の時間依存性について示す。

図２は膜結合血栓の血餅溶解時間を増加させるＰＰＰ中におけるストレプトキナ ーゼ（ＳＫ）及びリポソームカプセル化ストレプトキナーゼ（ＬＥＳＫ）のイン キュベートについて示す。

好ましい態様の具体的な説明 管内における閉塞血栓の形成はその管内の血流で通常栄養供給される組織にダメ ージを与えうる。閉塞血栓がアテローム性硬化冠状動脈内で形成された場合、患 者に致死的な急性心筋梗塞がおきることがある。できるだけ早くいかなる血栓症 も治療することが望まれるが、心筋梗塞患者が速やかに、即ち発症開始後数時間 以内に治療された場合には死亡率が著しく減少し、心室機能及び治療後の健康状 態に関して改善がみられる。時間は２つの理由から急性心筋梗塞患者にとり非常 に重要である。第一に心筋Ｍｉ織が助かる程度は時間と共に減少し、第二に再疎 通率は血栓溶解有効性が低下するため時間と共に減少する。

一般に、血栓溶解療法は６時間以内の心筋回復にとり有益と考えられる。しかし ながら、ストレプ］・キナーゼの積極的な静脈内投与は、痛み開始後１．５〜４ 時間で処置された患者と比較して１．５時間以内に処置された患者の場合に統計 学上有意に異なる放出分画（心機能の程度）を示した。

プラスミノーゲンアクチベーターのストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ及びｔＰ Ａによる急性心筋梗塞の慣用的血栓溶解療法では流れを再確立させるため３０分 間〜１時間又はそれ以上を要するか、これは治療期間中及びそれ以後の著しい組 織損失を意味する。したがって、プラスミノーゲンアクチベーターの血栓溶解活 性に関する促進は心筋梗塞患者を治療する上で有益であろう。この促進は本発明 によって得られる。

生命脅威未制御出血のような重篤な副作用の可能性がプラスミノーゲンアクチベ ーターの使用に伴う。プラスミノーゲンアクチベーターの投与量減少はこれらの 有害な副作用に関する可能性を減少でき、血栓溶解に関してヒトのような哺乳動 物で要求されるプラスミノーゲンアクチベーターの最少有効量のこの減少は本発 明によって得られる。

本発明の組成物はヒトのような哺乳動物への非経口注入に適した多数のマイクロ カプセルからなる。そのマイクロカプセルはプラスミノーゲンアクナベ−ター含 有水性コア、好ましくはストレプトキナーゼ含有コアとそのコアを包囲する生体 適合層からなる。その層は半透過性又は分解性であって、哺乳動物の心血管系内 に少なくとも一部のコアストレプトキナーゼを制御的に放出できる。

本発明で用いられるプラスミノーゲンアクチベーターとしてはストレプトキナー ゼ、ウロキナーゼ及びｔＰＡがある。ここで記載される“ストレプトキナーゼ１ 、“ウロキナーゼ′及び“ｔＰＡ“にはアシル化プラスミノーゲンストレプトキ ナ−ゼアクチベーター複合体を含めてストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ又はｔ ＰＡの血栓溶解活性の少なくとも一部を留めたその誘導体、複合体、類縁体又は ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼもしくはｔＰＡについてコードする遺伝子の 少なくとも一部において遺伝的に変更された物質を含む。本発明で用いられるプ ラスミノーゲンアクチベーターにはストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ及び／又 はｔＰＡのあらゆる組合せも含む。

本発明のマイクロカプセルの層は“生体適合性”であって、好ましい投与経路に 生理学上適合していることを意味する。静脈内注入の場合、組成物のオスモル濃 度及びｐＨは注入に適した範囲内であり、マイクロカプセルはできるだけ非抗原 性となるよう充分に精製される。

本発明の組成物の層は半透過性であって、プラスミノーゲンアクチベーターがヒ トのような哺乳動物の心血管系内で血栓に関して血栓溶解活性を発揮するように 少なくとも実質的部分のプラスミノーゲンアクチベーター含有コアが層を通過す るか又は層が哺乳動物の心血管系における接触で充分に分解することを意味する 。層のこの半透過性は少なくとも一部のコアプラスミノーゲンアクチベーターを 制御的に放出させる。

注入されると、マイクロカプセルは哺乳動物の心血管系内を循環するが、好まし いことにそこの血栓に部位特異的である。好ましくは、層は血中成分によるコア 成分の分解を防ぎかつ免疫反応を減少させるように実質的な一時的バリアを形成 する。少なくとも一部のコアは哺乳動物の心血管系における血栓の少なくとも一 部を溶解するために半透過層を介してマイクロカプセルから放出される。更に好 ましくは、コアは血栓溶解を高めるため血栓部位で又はその近くで放出される。

本発明のマイクロカプセルは静脈内注入用に適しかつプラスミノーゲンアクチベ ーター含有コアを有することができればいかなるサイズであってもよい。好まし くは、マイクロカプセルは約２５０人〜約１０μｌである。

本発明の組成物の層はリン脂質からなり、更に好ましくはリポソームからなる。

リポソームは通常疎水性尾部及び親水性頭部を有するリン脂質からなる微視的に 閉鎖された液体充填小胞であって、静電気的に荷電しているか又は中性である。

リポソームは２つの標準形、即ちいくつかの脂質二層からなる多重ラメラ小胞（ ＭＬＶ）及び液体コア包囲単一二層からなる単ラメラ小胞（Ｕ　Ｌ　Ｖ）を有す る。単ラメラ小胞は小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）及び大きな単ラメラ小胞（Ｌ ＵＶ）として特徴付けられる。

ＬＵＶか本発明で好ましいが、ここで規定される適切な特性を有するマイクロカ プセルであればいずれも利用してよい。様々なリポソームが望ましい特性に関し て選択でき又は望ましい特性を生じるように操作される。例えば、リポソームに よる溶質保持及び循環中におけるそれらの半減期はリポソーム膜流動性及び組成 の適切な操作で制御できる。コレステロールの非存在下において、リポソームは 静脈内導入された場合に実質上漏出するであろう。これは血漿タンパク質との相 互作用及びリポタンパク質との脂質交換に基づくと考えられるが、コレステロー ルの存在で大部分抑制できる。コレステロールは様々な透過性及び脆性を生じる ようにリポソームのリン脂質二層の機械的及び構造的性質を変える。

部位選択性は様々な脆性及び／又は透過性特性を有するリポソームを選択するこ とにより限定された程度で制御できる１部分的閉塞管を通過することで生じる応 力は影響を受けやすいリポソームを開け、それによりストレプトキナーゼを血栓 部位に選択的に運搬することかできる。

リポソームはそれらの組成のせいで血栓に部位特異的であり、したかってプラス ミノーゲンアクチヘーターをそれに選択的に運搬すると考えられる。リポソーム は血液成分によるプラスミノーゲンアクチベーターの分解を防ぎ、それによりそ の早期不活性化を妨げる一時的バリアを形成するとも考えられる。これは必要な 要求投与量を低下させる。リポソームによる一時的バリアは免疫反応及び内出血 の副作用も減少又は消失させる。しかしながら、リポソーム中へのプラスミノー ゲンアクチベーターのカプセル化はプラスミノーゲンアクチベーターを制御的に 放出でき、非カプセル化プラスミノーゲンアクチベーターと比較して哺乳動物に おいて血栓溶解の著しい促進を予想外に導くことが下記実験かられかる。

血栓溶解活性の促進は血栓を溶解するために必要な時間の量〔下記例１における 血餅溶解時間（ＣＤＴ）］の減少又は再潅流に要する時間の量の減少のようない くつかのファクターで示される。下記残留血餅サイズデータを用いて、血栓５０ ０ｍｇに関する血栓溶解速度は６　Ｂ／ｗｉｎ　（ａｌｌｔｌＥストレプトキナ ーゼ、即ち非カプセル化ストレプトキナーゼを用いた場合）から１５■ｇ／ｗｉ ｎ　（カプセル化ストレプトキナーゼを用いた場合）に加速できる。

例２において、イヌモデルの再潅流時間は虚血で誘導される心電図変化の解析、 左回旋動脈流の回復及び左回旋冠状動脈分布内におけるチアノーゼの消失により 決定された。

血栓溶解の促進は血栓で閉塞された動脈を再潅流させる上で要する時間の量を減 少させる。本発明の促進速度は非カプセル化プラスミノーゲンアクチベーター含 有組成物か哺乳動物に投与された場合の血栓溶解速度よりも約５〜約６０９０ｓ 更に好ましくは約１０〜約５５％、最も好ましくは約２０〜約５０％速い。

本発明の組成物は更に哺乳動物への静脈内注入のような非経口注入用に適したマ イクロカプセルが懸濁される液体媒体にも関する。キャリアは無菌で、主体での 注入用に適した浸透性及びｐＨ範囲を有しかつ比較的不活性であるべき、即ち少 なくとも一部の血栓溶解活性を組成物に留めることができるべきである。適切な キャリアの一部の例は無菌標準塩水、水中５％無菌デキストロース及びそれらの 混合液である。

組成物の濃度は標準投与要求量、即ちプラスミノーゲンアクチベーター製造業者 又は研究者により規定された投与量に従う。例えば、心筋梗塞の場合、溶液中１ ．５百万単位用量のストレプトキナーゼが１時間にわたり又は３０単位のアシル 化プラスミノーゲンーストレプトキナーゼーアクチベーター複合体（ＡＰＳＡＣ ）が３〜５分間にわたり注入される。

しかしながら、プラスミノーゲンアクチベーターのカプセル化は血栓で閉塞され た動脈を再潅流させる上で要するプラスミノーゲンアクチベーターの最少治療有 効量を遊離プラスミノーゲンアクチベーター、即ちカプセル化されていないプラ スミノーゲンアクチベーターの最少有効量よりも約５〜約６０％、更に好ましく は約１０〜約５５％、最も好ましくは約２０〜約５０％の範囲で減少させる。前 記のように、プラスミノーゲンアクチベーター用量の減少は有害な副作用のリス クを減少させることができる。加えて、プラスミノーゲンアクチベーターのコス トも患者にとって低下する。

下記例は本発明の実施について示す。

例１ この例においては、膜結合血栓が調製され、しかる後ストレプトキナーゼ（ＳＫ ）及びリポソームカプセル化ストレプトキナーゼ（ＬＥＳＫ）作用を流れ濾過研 究で分析するために用られるインビトロ研究か行われた。第一ステップはマイク ロカプセルが濾過試験を妨げないことを確認することであった。したがって、定 常状態圧力低下をブランク−ＬＵＶ／ＰＰＰ及びＰＰＰ　（血小板欠乏血漿）に ついてそれらの閉塞膜濾過に関して測定した。

２つの系の圧力低下は同等であって、このことはたとえ一部のリポソーム又はそ れらの溶解膜が孔閉塞血栓に付着したとしても小リポソームが血栓の流れに対す る抵抗を変えなかったことを示す。加えて、その結果はＰＰＰにおける残留血小 板か閉塞孔の更なる遮断に有意には関与しないことも示した。

ＳＫを血漿タンパク質とブレインキュベートしなかった場合には、ＬＥＳＫ／Ｐ ＰＰの血餅溶解時間はＳＫ／ＰＰＰの場合に匹敵した（図２）。この結果は捕捉 ＳＫか初期に非捕捉ＳＫの場合と同様のフィブリン溶解能力を有することを示す 。最も重要なことには、これらのデータはリポソームが閉塞孔を通過する際に標 的部位でＳＫを放出できることを示した。ＳＫを放出するメカニズムは不明であ るが、おそらくリポソームとそれらの環境との化学的及び物理的相互作用による のであろう。

この例は、血漿タンパク質含有溶液中でＳＫ及びＬＥＳＫをインキュベートして インビトロ血栓溶解の結果を比較することで示されるように、リポソーム中にお けるＳＫカプセル化が血漿タンパク質による分解からＳＫを保護できることも証 明している。

物質及び方法 物質、オクチルグルコシド（ＯＧ）（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド ）はカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　（う・ジヨウ、ＣＡ）から購入し 、トリス緩衝塩水［ＴＢＳ；２０ｍＭトリスＨＣ１（ｐＨ７，５）、１００ＩＩ １００ＩＩ］に溶解した。１−バルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコ リン（Ｐ　Ｃ）はアバンチ・ポラ−・リビッズ（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ−Ｌ ｉｐｊｄｓ）　（バーミンガム、ＡＬ）から購入して更に精製せずに用いたが、 一方放射性同位元素標識Ｌ−１−バルミトイル−２−オレン（、（１４Ｃ）　Ｐ 　Ｃ）は二ニー・イんグランド・ヌクレア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ ｅａｒ）　（ボストン、ＭＡ）製であった。

トリトンＸ−１００はリサーチ・プロダクツ・インターナショナル（Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｊｏｎａｌ）（マウント・プロス ペクト、ＩＬ）から得て、クエン酸三ナトリウムはＪ、Ｔ、ベーカー・ケミカル （Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ）　（フィリップスバーブ、ＮＪ） がら得た。ストレプトキナーゼ（ＳＫ）［シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ）、セントルイス、Ｍｏ〕溶液はＴＢＳｌｍｌに凍結乾燥粉末１０ ，０ＯＯＩＵ　（１バイアル）を溶解することで新鮮に調製した。透析管（分子 量カットオフ１２，０００〜１４，０００）はスペクトラム・メディカル・イン ダストリーズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌｌｎｄｕｓｔｒｊｅｓ）　（ ｏサンゼルス、ＣＡ）から得て、セファロースＣＬ−６ＢはファルマシアＬＫＢ バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｖａｃｊａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ）　（ビスカットアウェイ、ＮＪ）から購入した。親水性ポリカーボネート膜 〔ヌクレポア社（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、）　、　プレザントン。

ＣＡ）は製造業者の資料によると２×１０６／ｃ■２の密度で３μｍ径円筒形孔 を有していた。

リポソーム形成及びストレプトキナーゼカプセル化界面活性剤除去法による大き な単ラメラ脂質（ＬＵＶ）小胞の形成操作は詳細に文献記載されている。大きな 単ラメラ小胞（ＬＵＶ）はこの研究の目的のため下記のように製造した。１０１ パイレツクス試験管内のクロロホルム／メタノール（１：　１　ｖ／ｖ）２　ｍ ｌ中ＰＣ（１０ｍｇ）を窒素流下で蒸発させ、−夜かけて凍結乾燥させた。管の 底を覆う乾燥ＰＣの薄いフィルムを頻繁な攪拌下３７℃で２時間加温することに よりＴＢＳ中０．４Ｍ０Ｇ２５０μｐに再懸濁した。ＰＣが完全に溶解した後、 （’Ｃ３ＰＣ（０，１＠ＣＤ　１．５μｇを加えたが、その場合に脂質及び界面 活性剤のこの溶液をｐｃ−ｏｃ溶液と呼んだ。ＬＥＳＫ製造の残りは冷室中４℃ で行った。

透析のため、サンプルは１１当たりＰＣ−ＯＧ溶液５０μｌ、ＴＢＳ中０．４Ｍ ０Ｇ溶液４５０μｇ及びＴＢＳ５００μΩ中５Ｋ５０００Ｕを含有していた。無 タンパクＷＬＵＶブランクサンプル（ブランク＝ＬＵＶ）を製造するため、ＴＢ ＳをＳＫ溶液の代わりに加えた。次いでこの混合液をＴＢＳＩＮに対して合計４ ８時間透析したが、但し透析物は８及び２４時間後に交換した。透析されたサン プル（１１以下）は非カプセル化ＳＫからＬＥＳＫを分離するためセファロース ＣＬ−６Ｂ　（１５ｃ＋ａＸ　１０ｍ内径、ＴＢＳで前平衡化）にてＩｇｌ／） ｉｎでゲル濾過した。カラムからのＬＥＳＫ及びＳＫの溶出は２８Ｏｒ＋ｍ（Ａ 　）で吸光度（及び光散乱）をモニターすることにより検出した。小胞は典型的 にはプールされた２つの０．　５ｍ１分画内の放出容量内で溶出し、これをＬＥ ＳＫサンプルと呼んだ。これらのリポソームを４℃で貯蔵し、４８時間内に利用 した。小胞中におけるリン脂質の回収率はプールされた小胞分画中における〔１ ４Ｃ〕ＰＣの回収率（典型的には３０％）と直接比例しているクル・アナライザ ー（ＣＯＵＬＴＥＲ（Ｒ）Ｓｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ　ＰａｒｔｉｃｌｅＡｎａｌｙ ｚｅｒ）　（モデルＮ　４　Ｍ　Ｄ　）はレーザー光散乱によりリポソームの粒 度及びサイズ分布を調べるために用いた。

測定原理はブラウン運動及び光子相関スペクトル分析の理論に基づいている。

ＳＫ活性及び濃度アッセイ、リポソームカプセル化前及び後におけるＳＫの活性 及び濃度は市販キット及びそれらの操作を用いて測定した〔活性・ヘレナ・ラボ ラトリーズ（Ｈｅｒｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ボーモント、Ｔｘ； 濃度：バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　、リッチモンド、ＣＡ）。凍結乾燥 粉末中における標１５Ｋを標準塩水で再調製して４０．０ＯＯＵ／ｍｌの全活性 とし、ＴＢＳで無菌的に希釈して２００〜１．０．　０００　Ｕ／＋ｎｌ範囲の 標準活性曲線を作成した。アッセイ前に、捕捉ＳＫは最終濃度４０ｍＭまてＯＧ を加えることでリポソームから放出させたか、０Ｇのこの濃度はＳＫ活性又は濃 度の測定に影響を与えの会合について試験するため、１０，０ＯＯＵ／ｍ１ｓＫ Ｏ，５ｗｌをブラ：／ニア　−ＬＵＶｏ、５ｉ１ｆ：加え、４℃で４時間インキ ュベート前、シかる後前記のようにゲル濾過に付した。クロマトグラフィー後、 リポソーム分画をＳＫの活性及び濃度に関して調べた。

血餅形成、すべての血液ドナー（ｎ　−１６）は健康な非喫煙男性ボランティア であって、薬物療法中でなくかつ過去１２時間絶食していた。彼らの平均年齢は ２５才であった。静脈血をトナーの腕から無菌ディスポーザブルブラスチソクン リンジに吸引し、シリコーン処理試験管内のクエン酸三ナトリウム溶液に加えた （３，８％（ｗ／ν）クエン酸塩１．１１／全血１０１）。血小板豊富血漿（Ｐ ＲＰ）をベックマン・アキュスビン（Ｂｅｃｋａ＋ａ口ＡｃｃｕＳｐ　ｉ　ｎ　 （ＴＭ））遠心機（モデルＡＣ５Ｒ−ＩＭ−３，パｏ−アルド、ＣＡ）において １１０００ｒｐ　（１４５Ｘｇ）で１０分間にわたるクエン酸血液の遠心により 得た。上澄の上部（約２．８ｍ１）を除去し、ＰＲＰと呼んだ。残部を５００Ｏ ｒｐｍ　（３４００Ｘｇ）で更に２０分間遠心して血小板欠乏血漿（Ｐ　Ｐ　Ｐ ）を得た。ＰＲＰ及びＰＰＰ中の血小板含有量はブレンチャー（Ｂｒｅｃｈｅｒ ）及びクロンカイト（Ｃｒｏｎｋｉ　ｔｅ）により記載されたように位を月差顕 微鏡観察法を用いて血球計数器で二重にρｊ定した。ＰＰＰで計数された血小板 数は１６．２５０±３，２３０血小板／■３　輸−４、Ｐ＜Ｏ’、０５’）であ った。

３μｍ孔径の親水性ヌクレポア膜を孔閉塞で用いた。

濾過前におけるそれらの特徴及び調製操作は他の箇所で記載されている。膜内の 孔を閉塞させるため、ＰＲＰ４１を室温て３０１プラスチツクンリンンにいれた 。

０．１２５Ｍ　ＣａＣ１つ（シグマ・ケミカル社）８２．５μｇをシリンジ内の 血漿１ｍｌ毎に加え、ゼロ時間で直ちに記録した。ンリンンを手でわずかに攪拌 して血漿内のＣａ＋＋をよく混ぜた。膜中１　、　１５　ｍｌ／ｍｉｎの一定容 量流速はセージ（Ｓａｇｅ）　−３５１注入ポンプで維持した。圧力低下（ΔＰ ）はグールドＤＣ増幅器／フィルター（モデル１ｌ−４１１３−０３）に接続さ れたグールド・スタソタム（Ｃｏｕｌｄ　Ｓｔａｔｈａｍ）圧力変換器（モデル Ｐ２３１Ｄ）で依存変数としてモニターし、チャートレコーダーで記録した。Δ Ｐが１２０　■）Ｉｇに達したとき濾過プロセスを停止し、しかる後閉塞フィル ターをフィルターホルダーから取り外した。パスツールピペットを用いた軽い吸 引によって余分ゲル様血餅が分離する前にフィルターホルダーにつまった余分ゲ ル様血餅を除去した。

次いで閉塞膜を標準塩水溶？＆Ｃ０，９％（１／／Ｖ）　Ｎａ　Ｃ１）で２回洗 浄した後、次ステツプの実験のため乾燥した清潔なフィルターホルダーに取り付 けた。

閉塞膜濾過、ＳＫ又はＬＥＳＫを２５Ｃ）Ｕ／１の最終活性までＰＰＰ’５ｍｌ に加えた。閉塞膜結合血栓でのＳＫ／ＰＰＰ又はＬＥＳＫ／ＰＰＰの濾過は前記 のように行った。コントロール濾過のため、閉塞膜をＰＰＰ又はブランク−ＬＵ Ｖ／ＰＰＰのいずれかで濾過した。閉塞膜をＰＰ’Ｐ、ブランク−ＬＵＶ／ＰＰ Ｐ、ＳＫ／ＰＰＰ又はＬＥＳＫ／ＰＰＰで濾過した後、残留血餅及び膜の形態を 顕微鏡〔オリンパス・リサーチ・モデルＢＨＴＵ（Ｏｌｙｍｐｕｓ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　Ｍｏｄｅｌ　Ｂｌ（ＴＩＪ）　）下で調べた。

ＳＫ及びＬＥＳＫのインキュヘート、ＳＫ活性に関する血漿タンパク質とのイン キュベート効果を調べるため、同活性の非カプセル化ＳＫ及びＬＥＳＫを同ＰＰ Ｐ調製物５１含有シリコーン処理ガラス管内に別々に注入した。

各管の内容物を３７℃でインキュベート前にヘマトロジーミキサー（Ｈｅｍａｔ ｏｌｏｇｙ　Ｍｉｘｅｒ）　Ｃフィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈ ｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｒｊｃ）、ピッツバーグ、ＰＡ〕で穏やかに１分間混ぜ、 しかる後管を５分間隔で３回ゆっくりと反転させた。１５分間又は３０分間のい ずれかの後、混合液を前記のように閉塞膜での濾過に付した。

データ分析、すべての統計学的比較はスチューデントを検定で分析した。統計学 的有意差は確率が０．０５以下である場合のみ許容された。他に指摘のないかぎ り、結果は平均±ＳＤとして表示した。

結果 リポソームのカプセル化効率、ここで開発された操作によって、我々はそのプロ セスの開始時にサンプルに加えられた全ＳＫの３０％をカプセル化することがで きた（表１）。放射能測定ではＰＣの原量の約１／３がリポソームに変換された ことを示す（表１）。ＳＫ活性及び濃度の測定では、少量のＳＫ（約２％）のみ かブランク−ＬＵＶに吸着され又はその表面を浸透したことも示した（表１）。

このため、ＬＥＳＫ調製物中ＳＫの９０〜９５９ｂ以上が小胞内にカプセル化さ れる。

小胞サイズ及び分布１粒度分析では、溶液中における小胞の８２（±３）％（ｎ −５）が１７８（±４０）ｒ＋ＩＩＩ（ｎ−５）の粒径サイズを有することを示 す。

濾過中の圧力低下、濾過中における圧力の時間依存性変化では、孔か再石灰化ク エン酸処理ＰＲＰで濾過中に閉塞されるか又はＳＫ／ＰＰＰもしくはＬ　Ｅ　Ｓ 　Ｋ／Ｐ　ＰＰて濾過中に再開口される程度を示す。閉塞膜によるＰＰＰ又はブ ランク−ＬＵＶ／ＰＰＰ７１！過の１５分間後に得られたΔＰはΔＰの定常状態 として考えられた（図１−ａ）。ブランク−ＬＵＶ／ＰＰＰ濾過における定常状 態ΔＰはＰＰＰに関して得られた場合と匹敵した〔即ち、各々３７．０土７．７ ａｏａ）Ｉｇ　（ｎ　−１２）　ｖｓ、　３５．６±８、　６＋ｎｍＨｇ　（ｎ 　−１２）　〕、逆に、ゼロ又はベースライン圧力は、これらの溶液が閉塞膜の ケースと同様の流速を用いて非閉塞膜で濾過された場合に観察された。この結果 は流れ抵抗か血栓の圧力によるものであってＬＵＶで有意に影響されないことを 明らかに示した。

同ＳＫ活性のＳＫ／ＰＰＰ及びＬＥＳＫ／ＰＰＰの溶液をそれらの血餅溶解能力 について比較するために閉塞膜で濾過した。非カプセル化ＳＫ及びＬＥＳＫのフ ィブリン溶解効果は、ＳＫ／ＰＰＰ又はＬＥＳＫ／ＰＰＰの溶液か閉塞膜で濾過 された場合の時間の関数としてΔＰを記録することによりモニターした（図１− ｂ）。これらの溶液に関する濾過の場合、ΔＰは最大まで増加し、しかる後ベー スライン圧力まで徐々に減少した。血餅溶解時間（ＣＤＴ）は濾過開始からΔＰ がベースラインまで戻ったときまでの時間として測定した。血漿とのブレインキ ュベートがない場合、Ｌ　Ｅ　Ｓ　Ｋ／Ｐ　Ｐ　ＰのＣ’ＤＴ［１２，４±１． ７ｍ１ｎ　（ｎ−１２）〕はＳＫ／ＰＰＰの場合［１０，７±１．９１ｎ　（ｎ −１２））よりもやや増加した（Ｐｒｏ、０５、図２ツ照）。非カプセル化ＳＫ 又はＬＥＳＫいずれかのフィブリン溶解活性に関する低下はＣＤＴを増加させ、 ＳＫ活性のこのような減少はＳＫ又はＬＥＳＫのいずれかがＰＰＰとインキュベ ートされた場合に観察された（図２におけるＣＤＴ増加に注目せよ）。１５分間 のインキュベート後、Ｓ　Ｋ／Ｐ　ＰＰのＣＤＴは１５．５±１．５ｍ１ｎ　（ ｎ−５）（Ｐく０．０５）まで増加し、一方Ｌ　Ｅ　Ｓ　Ｋ／Ｐ　Ｐ　ＰのＣＤ Ｔはそれより低いか１３．３±０．８ｍ１ｎ　（ｎ＝５）まで増加した。３０分 間のインキュベート後、ＳＫ／ｐｐｐのＣＤＴはＬＥＳＫ／ＰＰＰの場合よりも 著しく多かった（２４．１±２．５ｍ１ｎ、ｎ　−５ｖｓ、　１６．　０±１． １ｍ１ｎ、ｎ−５；　Ｐ＜０．０５）ｏこの結果は、非捕捉化ＳＫが血漿タンパ ク質とのその接触中に不活性化され、一方捕捉化ＳＫかリン脂質二層でかなり保 護される遇された後における閉塞膜の顕微鏡観察では膜内の孔が血栓形成の痕跡 から完全に清澄化されることを示したが、一方ＰＰＰ又はブランク−ＬＴＪＶ／ ＰＰＰで濾過されたときにはなお孔か大メツシュのフィブリン及び血小板凝集物 で閉塞されていることを示した。

表１　リポソームカプセル化の回収効率ネ ＳＫ活性（Ｕ／＋ｎｌ）　４９４２±４２　１３４４±２４０　２７．２±４． ８９ＳＫな（ｇＭ）ｂ＊ １３．１±０．１　４．０±０．６　３０．８±４．３９ブランク−ＬＵＶに吸 着されたＳＫの量ＳＫｌａｉ（ｇＭ）ｂ１３．１＋０．１　０．３＝０．０１” 　２．３＋ｆ１．１　５＊カプセル化前の値と比較してＰ（０，０５例２ リポソームを前記のように製造した。双極性イオン脂質１−バルミトイル−２− オレオイルホスファチジルコリンのリポソーム中で観察されたＳＫのカプセル化 効率はストレプトキナーゼ活性及び全タンパク質の測定により調べたところ約３ ０％であった。次いでリポソーム外ストレプトキナーゼはセファロースＣＬ−６ Ｂ　（ファルマシア）を用いてゲル濾過によりＬＥＳＫ調製物から除去した。最 終ＬＥＳＫ懸濁液中において９２％以上のストレプトキナーゼがリポソーム内に 残存していた。

本研究では血栓閉塞に基づく心筋梗塞の確立されたイヌモデルをわずかに修正し てインビボでリポソーム懸濁液の効能について試験した。各性別の雑種イヌを静 脈ナトリウムベンドパルビタール（３０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。

気管内チューブを挿入し、動物を一定容量レスビレーターを用いて室内空気で換 気した。左開胸を第四肋間で行い、心臓を露出させた。左回旋冠状動脈を第−鈍 角縁分枝の近くで摘出し、左回旋冠状動脈流を２０　ｍＨｚパルスドツプラー又 は電磁流プローブを用いて測定した。動脈血栓を近位及び遠位結紮左回旋冠状動 脈の５〜１０ｍｔｎ長セグメント中への１００Ｕトロンビン（シグマ）及び０、 〕１全血の注入により開始させた。１０分間後、近位結紮糸を解放した。更に５ 分間後、遠位結紮糸も解放した。一部の実験では、３回もの多くの注入か閉塞血 栓を形成させる上で必要であった（表２）。血栓をストレプトキナーゼ投与前の ３０分間で成熟させた。実験の最後に、動脈を切開し、血栓腕を重量分析で測定 した。

リポソームカプセル化ストレプトキナーゼの血栓溶解活性を遊離ストレプトキナ ーゼと直接比較した。２種の血栓溶解薬物の相対的投与量は同一であった。再疎 通まで２０００　Ｕ　／ａｋｉｎのｉ、ｖ、注入に先立ち２０，０ＯＯＵの初期 ポーラスが観察された。左前方傾斜冠状動脈に関して報告された発見と同様に、 ストレプトキナーゼ単独での再？ａ流に要する平均時間は約７８±４３分間であ った（甲均士標準偏差、表２参照）。再潅流は（１）虚血による心電図変化の解 析、（２）左回旋動脈流の回復及び（３）左回旋冠状動脈分布内におけるチアノ ーゼの消失によって明らかになった。遊離ストレプトキナーゼに関する値とは全 く逆に、リポソームカプセル化ストレプトキナーゼは血栓溶解時間を平均３２± ２８分間までかなり減少させ、一部では再潅流か１０分間で素早く生じることを 観察した。正規分布及び相当サンプル数と仮定した場合、これはＰ＜０．０５で 統計学上の有意差である。

意外ではないか、各群内の再潅流時間は安定血餅を形成する上で要するトロンビ ン注入数と相関しているらしい。

プラスミノーゲンアクチヘーターのリポソーム封入はこのイヌモデルでストレプ トキナーゼの有効性を明らかに増加させ、カプセル化物質の全投与量は血流を再 確立させる上で少なくてすむ。これらの予備的な最適でない実験において、１７ ０，５００Ｕて投与された平均全遊離ストレプトキナーゼか８１，９００ＵのＬ ＥＳＫに匹敵した。更に、摘出冠状セグメントから取り出された残留血栓のサイ ズから促進的血栓溶解を確認したが、データは不完全である（表２）。残留血餅 はＬＥＳＫの投与量及び作用時間が減少したとしてもＬＥＳＫ処置動物の方が小 さかった。最も重要なことには、ＳＫのカプセル化は再潅流に要する時間を５０ ％以上短縮させた。

リポソームカプセル化かインビボで血栓溶解を促進するように作用するメカニズ ムは不明である。前記のように、我々はリポソーム中にストレプトキナーゼを隔 離することが（インビトロ実験でわかるように）血漿タンパク質によるその不活 性化を減少させ、全身反応のＳＫ開始も遅延させ、フィブリン分解系のキー成分 の枯渇又は不活性化を妨げるのではないかと推測している。例えば我々のグルー プによるコンピューターモデルでは、現臨床投与量がストレプトキナーゼ−プラ スミノーゲン複合体の素早い形成、活性化に利用されるプラスミノーゲンの枯渇 化、ひいてはプラスミンの低レベル化をおこすことを示唆している。モデルによ れば、リポソームからのストレプトキナーゼの緩徐的放出は複合体の濃度を低下 させる一方でプラスミンの濃度を上げるようである。フィブリン溶解成分のこの 異なる特性は溶解メカニズムを血餅結合プラスミノーゲンの活性化の１つから主 に循環プラスミンに関する役割増加の１つにシフトさせることである。他の可能 性は小胞が血栓を通過するときに流れ応力をうけてリポソームが血餅付近に集中 するか及び／又はＳＫを優先的に放出することにより血餅への又はその中へのＳ Ｋの運搬を促進させることである。表３ではストレプトキナーゼがリポソームで カプセル化ぎれた場合に必要ストレプトキナーゼ量の減少を示している。

最後に、これらの予備実験の結果は再潅流時間の最大可能減少を反映しているの ではない。例えば、ｔＰＡ及びウロキナーゼはＳＫよりも大きなフィブリンとの 結合親和性及び血餅結合プラスミノーゲンを活性化しうる高い能力を示す。その 結果、ｔＰＡ及びウロキナーゼアクチベーターは特にリポソーム内で不活性化か ら保護された場合により速い血栓溶解を示すであろう。

表２ 遊離ストレプトキナーゼ リポソームカプセル化ストレプトキナーゼ１０　３　５０　３．９ 表３ ａｍ及びカプセル化ストレプトキナーゼによるインビボ血栓溶解実験 ｉ１離ストレプトキナーゼ ゼ２０００単位、再潅流が生じるまで２０００単位／ｍ１ｎ１８．８±４．０ｋ ｇ、５匹のＬＥＳＫ処置イヌに関して２０．９±５．２ｋｇであった。

変更は、下記請求の範囲で規定される本発明の精神及び範囲から逸脱することな くここで記載された様々な部分、要素及びステップで行いうる。

峠／ａ７　（Ｍｔ功 ＝＝Ｉミ＝、工＝ヨ ＝＝工至＝、＝ヨ 国＠調簀報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物への非経口注入に適した多数のマイクロカプセルからなる医薬組成 物であって、各々のマイクロカプセルが； プラスミノーゲンアクチベーター含有コア；及びそのコアを包囲する生体適合層 （ただし、その層は半透過性であって、哺乳動物の心血管系内に少なくとも一部 のコアプラスミノーゲンアクチベーターを制御的に放出できる）からなり、哺乳 動物における血管の再灌流に要する時間の量を遊離プラスミノーゲンアクチベー ター含有組成物が哺乳動物に投与された場合の血管再灌流時間よりも約２０％以 下〜約５０％減少させることができる医薬組成物。 ２．少なくとも一部のマイクロカプセルが約２５０Ａ〜約１０μｍの径を有する 、請求項１に記載の組成物。 ３．組成物が哺乳動物への非経口注入に適した液体媒体を更に含み、そこにマイ クロカプセルが懸濁されている、請求項１に記載の組成物。 ４．マイクロカプセルがリン脂質からなる、請求項１に記載の組成物。 ５．マイクロカプセルがリポソームからなる、請求項１に記載の組成物。 ６．リポソームが大きな単ラメラ小胞である、請求項５に記載の組成物。 ７．治療の必要な哺乳動物における血栓症の治療方法であって、 哺乳動物への非経口注入に適した多数のマイクロカプセルからなる医薬組成物で あって、各々のマイクロカプセルがプラスミノーゲンアクチベーター含有コア及 びそのコアを包囲する生体適合層（ただし、その層は半透過性であって、哺乳動 物の心血管系内に少なくとも一部のコアプラスミノーゲンアクチベーターを制御 的に放出できる）からなり、哺乳動物における血管の再灌流に要する時間の量を 遊離プラスミノーゲンアクチベーター含有組成物が哺乳動物に投与された場合の 血管再灌流時間よりも約２０％以下〜約５０％減少させることができる医薬組成 物の治療有効量を哺乳動物に非経口注入することからなる方法。 ８．哺乳動物がヒトである、請求項７に記載の方法。 ９．マイクロカプセルがリン脂質からなる、請求項７に記載の方法。 １０．マイクロカプセルがリポソームからなる、請求項７に記載の方法。 １１．リポソームが大きな単ラメラ小胞からなる、請求項１０に記載の方法。 １２．哺乳動物における血栓含有動脈の再灌流に要する時間を遊離プラスミノー ゲンアクチベーター含有組成物が哺乳動物に投与された場合の動脈再灌流時間よ りも約２０％以下〜約５０％減少させる方法であって、哺乳動物への非経口注入 に適した多数のマイクロカプセルからなる医薬組成物であって、各々のマイクロ カプセルがプラスミノーゲンアクチベーター含有コア及びそのコアを包囲する生 体適合層（ただし、その層は半透過性であって、哺乳動物の心血管系内に少なく とも一部のコアプラスミノーゲンアクチベーターを制御的に放出できる）からな る医薬組成物の治療有効量を哺乳動物に非経口注入することからなる方法。 １３．哺乳動物がヒトである、請求項１２に記載の方法。 １４．マイクロカプセルがリン脂質からなる、請求項１２に記載の方法。 １５．マイクロカプセルがリポソームからなる、請求項１２に記載の方法。 １６．リポソームが大きな単ラメラ小胞からなる、請求項１５に記載の方法。 １７．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼからなる、請求項 １２に記載の方法。 １８．プラスミノーゲンアクチベーターがｔＰＡからなる、請求項１２に記載の 方法。 １９．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼからなる、請求項１２に 記載の方法。 ２０．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼの誘導体、類縁体 もしくは複合体又はストレプトキナーゼについてコードする少なくとも１種の遺 伝子から遺伝的に変更された物質からなる群より選択される、請求項１２に記載 の方法。 ２１．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼの誘導体、類縁体もしく は複合体又はウロキナーゼについてコードする少なくとも１種の遺伝子から遺伝 的に変更された物質からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。 ２２．プラスミノーゲンアクチベーターがｔＰＡの誘導体、類縁体もしくは複合 体又はｔＰＡについてコードする少なくとも１種の遺伝子から遺伝的に変更され た物質からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。 ２３．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ からなる、請求項１２に記載の方法。 ２４．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼ及びｔＰＡからなる、請 求項１２に記載の方法。 ２５．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼ及びｔＰＡからな る、請求項１２に記載の方法。 ２６．プラスミノーゲンアクチベーターの量が哺乳動物の最少標準投与要求量よ りも標準投与要求量の約２０％〜約５０％で減少される、治療の必要な哺乳動物 を治療有効量のプラスミノーゲンアクチベーターで治療する方法であって、 哺乳動物への非経口注入に適した多数のマイクロカプセルからなり、各々がプラ スミノーゲンアクチベーター含有コア及びそのコアを包囲する生体適合層（その 層は半透過性であって、哺乳動物の心血管系内に少なくとも一部のコアプラスミ ノーゲンアクチベーターを制御的に放出できる）からなり、哺乳動物における血 管の再灌流に要する時間の量を遊離プラスミノーゲンアクチベーター含有組成物 が哺乳動物に投与された場合の血管再灌流時間よりも約２０％以下〜約５０％減 少させることができる医薬組成物の治療有効量を哺乳動物に非経口注入すること からなる方法。 ２７．哺乳動物がヒトである、請求項２６に記載の方法。 ２８．マイクロカプセルがリン脂質からなる、請求項２６に記載の方法。 ２９．マイクロカプセルがリポソームからなる、請求項２６に記載の方法。 ３０．リポソームが大きな単ラメラ小胞からなる、請求項２９に記載の方法。 ３１．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼからなる、請求項 ２６に記載の方法。 ３２．プラスミノーゲンアクチベーターがｔＰＡからなる、請求項２６に記載の 方法。 ３３．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼからなる、請求項２６に 記載の方法。 ３４．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼの誘導体、類縁体 もしくは複合体又はストレプトキナーゼについてコードする少なくとも１種の遺 伝子から遺伝的に変更された物質からなる群より選択される、請求項２６に記載 の方法。 ３５．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼの誘導体、類縁体もしく は複合体又はウロキナーゼについてコードする少なくとも１種の遺伝子から遺伝 的に変更された物質からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。 ３６．プラスミノーゲンアクチベーターがｔＰＡの誘導体、類縁体もしくは複合 体又はｔＰＡについてコードする少なくとも１種の遺伝子から遺伝的に変更され た物質からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。 ３７．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ からなる、請求項２６に記載の方法。 ３８．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼ及びｔＰＡからなる、請 求項２６に記載の方法。 ３９．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼ及びｔＰＡからな る、請求項２６に記載の方法。 ４０．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼからなる、請求項 １に記載の組成物。 ４１．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼの誘導体、類縁体 もしくは複合体又はストレプトキナーゼについてコードする少なくとも１種の遺 伝子から遺伝的に変更された物質からなる群より選択される、請求項１に記載の 組成物。 ４２．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼからなる、請求項１に記 載の組成物。 ４３，プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼの誘導体、類縁体もしく は複合体又はウロキナーゼについてコードする少なくとも１種の遺伝子から遺伝 的に変更された物質からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。 ４４．プラスミノーゲンアクチベーターがｔＰＡからなる、請求項１に記載の組 成物。 ４５．プラスミノーゲンアクチベーターがｔＰＡの誘導体、類縁体もしくは複合 体又はｔＰＡについてコードする少なくとも１種の遺伝子から遺伝的に変更され た物質からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。 ４６．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ からなる、請求項１に記載の組成物。 ４７．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼ及びｔＰＡからなる、請 求項１に記載の組成物。 ４８．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼ及びｔＰＡからな る、請求項１に記載の組成物。 ４９．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼからなる、請求項 ７に記載の方法。 ５０．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼの誘導体、類縁体 もしくは複合体又はストレプトキナーゼについてコードする少なくとも１種の遺 伝子から遺伝的に変更された物質からなる群より選択される、請求項７に記載の 方法。 ５１．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼからなる、請求項７に記 載の方法。 ５２．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼの誘導体、類縁体もしく は複合体又はウロキナーゼについてコードする少なくとも１種の遺伝子から遺伝 的に変更された物質からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。 ５３．プラスミノーゲンアクチベーターがｔＰＡからなる、請求項７に記載の方 法。 ５４．プラスミノーゲンアクチベーターがｔＰＡの誘導体、類縁体もしくは複合 体又はｔＰＡについてコードする少なくとも１種の遺伝子から遺伝的に変更され た物質からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。 ５５．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ からなる、請求項７に記載の方法。 ５６．プラスミノーゲンアクチベーターがウロキナーゼ及びｔＰＡからなる、請 求項７に記載の方法。 ５７．プラスミノーゲンアクチベーターがストレプトキナーゼ及びｔＰＡからな る、請求項７に記載の方法。 ５８．生体適合層が中性荷電を有する、請求項１に記載の組成物。