JPH0547558B2

JPH0547558B2 -

Info

Publication number: JPH0547558B2
Application number: JP63266112A
Authority: JP
Inventors: Susumu Maruyama; Hideoki Tanaka; Noboru Tomizuka; Shinsuke Mitsuyoshi; Fumio Fukui
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Showa Sangyo Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Showa Sangyo Co Ltd
Priority date: 1988-10-24
Filing date: 1988-10-24
Publication date: 1993-07-19
Also published as: JPH02115198A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はベンジルオキシカルボニル−Ｌ−Glu
−Ｌ−Leu−Ｌ−Ala−Gly及びその塩基との塩、
及びそれらを有効成分とする動物コラゲナーゼ阻
害剤に関し、コラゲナーゼが関連する疾病である
リウマチ性関節炎、歯根膜炎、腫瘍細胞の浸潤な
どの治療または予防に有用であると期待される。

〔従来の技術〕

高等動物の蛋白質の30％を占めるコラーゲン
は、３本のα鎖からなる右巻の３重らせん構造を
形成している。α鎖はおよそ1000個のアミノ酸残
基からなるポリペプチド鎖であり、３本鎖ヘリツ
クス構造は生理的条件では安定で、普通のプロテ
アーゼに対しては抵抗性を示し、α鎖のGly−Ｘ
−Ｙの配列を認識して切断する細菌性コラゲナー
ゼ、あるいはコラーゲン分子を３：１に切断する
動物コラゲナーゼによつてのみ分解される。

動物コラゲナーゼは、まず1962年にオタマジヤ
クシ尾ヒレの組織培養液から発見され、その後、
両性類のみならず、哺乳類の皮膚、骨をはじめと
した各種組織に分布することが明らかとなつた。
また、発生分化、成長に伴う組織、器官の組み換
え時、および腫瘍、リウマチ患者関節液に高いコ
ラゲナーゼ活性が認められ、本酵素は生理的条件
下ならびに病態時の結合組織の代謝と密接な関係
があると考えられるに至つている。

従つて、近年、リウマチ性関節炎、歯根膜病、
腫瘍細胞の浸潤などの治療を目的としたコラゲナ
ーゼ阻害剤が合成された（特開昭57−212157、バ
イオケミストリー26、1962（1987）。

また、天然物由来のコラゲナーゼ阻害剤として
は大豆蛋白質由来のポリペプチドが発見されてい
る（特開昭57−7490）。

しかし、現在までに知られているコラゲナーゼ
阻害剤は、その阻害活性がそれ程高くないのが実
情である。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記状況よりリウマチ性関節炎などの治療及び
予防を目的としたコラゲナーゼ阻害剤が広く求め
られる現今である。従つて、本発明は優れたコラ
ゲナーゼ阻害作用を有するペプチド及びその塩基
との塩、及びかかるペプチドまたはその塩基との
塩を有効成分とするコラゲナーゼ阻害剤を提供す
ることを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

動物コラゲナーゼは活性中心に亜鉛を有する金
属プロテアーゼであり、微生物由来の金属プロテ
アーゼであるサーモライシンに若干類似した点が
ある。本発明者らはこの点に着目し、まず新規サ
ーモライシン阻害剤を天然物中に求め、ついでサ
ーモライシン阻害剤を基本に新規コラゲナーゼ阻
害剤を合成することを試みた。なお、特に断らな
い限り以下のアミノ酸はＬ体とする。すなわち、
卵白アルブミンのキモトリプシン加水分解物中に
サーモライシン阻害活性を有するペプチドGln−
Thr−Ala−Ala−Asp−Gln−Ala−Arg−Glu−
Leuを発見し、そのカルボキシル未端付近がその
活性に重要であると推定した。そこでこのGlu−
Leu部分に種々のアミノ酸を結合させることを試
みた結果、本発明のベンジルオキシカルボニル−
Glu−Leu−Ala−Glyが動物コラゲナーゼを阻害
することを発見した。すなわち本発明は、新規な
コラゲナーゼ阻害ペプチドであるベンジルオキシ
カルボニル−Glu−Leu−Ala−Gly及びその塩基
との塩、及びベンジルオキシカルボニル−Glu−
Leu−Ala−Glyまたはその塩基との塩を有効成
分として含有する動物コラゲナーゼ阻害剤に関す
る。

ここで塩基との塩は、製薬上許容される塩基
（無機塩基及び有機塩基）との塩、例えばナトリ
ウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウ
ム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩等の無機
塩基との塩、及び塩基性アミノ酸（例えばアルギ
ニン、リジン）等の有機アミンとの塩を包含す
る。

本発明のベンジルオキシカルボニル−Glu−
Leu−Ala−Glyは主として有機化学的な合成方
法によりアミノ酸を段階的に導入する方法によつ
て製造される。また、加水分解酵素の逆反応を利
用したペプチド合成法によつて製造することもで
きる。すなわち有機化学的合成法では通常個々の
アミノ酸を順次縮合させるが、この縮合は通常保
護されたα−アミノ基及び活性末端カルボキシル
基を有するアミノ酸と遊離α−アミノ基及び保護
された末端カルボキシル基を有するアミノ酸とを
適当な溶媒中反応させることにより行う。合成は
いかなる順序によつてもよいが、Ｃ−末端側から
順次アミノ酸を連結させるのが好ましい。α−ア
ミノ基の保護基はペプチド合成で使用される種々
のアミノ保護基を含有し、ターシヤリーブチルオ
キシカルボニル（Boc）等が例示される。末端カ
ルボキシル基に保護基はペプチド合成で使用され
る種々のカルボキシル保護基を包含し、メチルエ
ステル基、エチルエステル基等が例示される。グ
ルタミン酸ではγ−カルボキシル基も通常保護さ
れ、保護基としてはベンジルオキシカルボニル基
等が用いられる。末端カルボキシル基の活性化は
ペプチド合成で常用される方法で行えばよく、例
えばＮ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（HOBt）等の活性化剤を用いて行うことができ
る。DCCとHOBtは組み合わせて使用する方が好
ましい。溶媒としてはジメチルホルムアミド
（DMF）等が用いられる。縮合反応は通常０℃〜
室温で１〜30時間行う。保護基の脱離及び生産物
の精製はペプチド合成における常法で行えばよく
例えば実施例に示す方法によればよい。

本ペプチドの塩基との塩は常法により製造する
ことができる。

本ペプチドは動物コラゲナーゼ阻害作用を有
し、ヒトをはじめとする哺乳動物のリウマチ性関
節炎、歯根膜病、腫瘍細胞の浸潤などの治療また
は予防に有用であると期待される。

本ペプチド及びその塩基との塩はそのまま、ま
たは通常少なくとも１つの製薬補助剤と混合した
製薬組成物にして使用する。本ペプチド及びその
塩基との塩は非経口的（すなわち、静脈注射、直
接塗布）または経口的に投与し、各投与方法に適
した形態に製剤することができる。

注射剤としての製剤形態は、通常滅菌水水溶液
を含有する。上記形態の製剤はまた緩衝剤・PH調
節剤（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等
張化剤（塩化ナトリウム、グルコース等）、保存
剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロ
キシ安息香酸プロピル等）等の水以外の他の製薬
補助剤を含有することができる。該製剤は細菌保
持フイルターを通す濾過、組成物への殺菌剤の混
入、組成物の照射や加熱によつて滅菌することが
できる。該製剤はまた殺菌固体組成物として製造
し、用時滅菌水等に溶解して使用することもでき
る。

経口投与剤は胃腸器官による吸収に適した形に
製剤する。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、
粉末剤は通常の製薬補助剤、例えば結合剤（シロ
ツプ、アルビアゴム、ゼラチン、ソルビツト、ト
ラガカント、ポニビニルピロリドン、ヒドロキシ
プロピルセルロース等）、賦形剤（ラクトース、
スクロース、コーンスターチ、ポテトスターチ、
ソルビツト、結晶セルロース等）、滑沢剤（ステ
アリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレング
リコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、
カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウ
リル硫酸ナトリウム等）を包含することができ
る。錠剤は常法によりコーテイングすることがで
きる。経口液剤は水溶液等にしたり、ドライプロ
ダクトにすることができる。そのような経口液剤
は常用の添加剤例えば保存剤（ｐ−ヒドロキシ安
息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン酸等）
を包含していてもよい。

本コラゲナーゼ阻害剤中の本ペプチドまたはそ
の塩基との塩の量は種々かえることができるが、
通常５〜100％（ｗ／ｗ）、特に10〜60％（ｗ／
ｗ）が適当である。本コラゲナーゼ阻害剤の投与
量は有効成分として10〜200mg／Kg／dayが適当
である。

〔実施例〕

次に本発明を実施例により説明する。

実施例ベンジルオキシカルボニル−Glu−Leu−Ala
−Glyの合成とコラゲナーゼ阻害活性 (A) ベンジルオキシカルボニル−Glu−Leu−
Ala−Glyの合成 (1) Ｈ−Ala−Gly−OEtの合成Ｈ−Gly−OEt−Hcl（グリシンエチルエス
テル塩酸塩）1.4ｇ（10ミリモル）、Boc−
Ala−OH1.9ｇ（10ミリモル）および１−ハ
イドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）
1.35ｇ（10ミリモル）をジメチルホルムアミ
ド（DMF）10mlに溶解し、この溶液に０℃
氷冷下トリエチルアミン1.4mlとジシクロヘ
キシルカルボジイミド（DCC）2.06ｇを加
え、ついで５℃に保持しつつ一夜撹拌した。

生成したジシクロヘキシルウレアを濾別
し、濾液を濃縮乾固した後、残渣を酢酸エチ
ルに溶解した。この溶液を10％クエン酸水溶
液、水、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、つ
いで水で充分に洗浄し減圧乾固した。この物
質をトリフルオロ酢酸25mlとアニソール１ml
の混液に溶解し、室温に20分間放置した。次
に反応混合液を減圧濃縮し、残渣をエーテル
で３回洗浄した後エーテルを留去し、Ｈ−
Ala−Gly−OEtをトリフルオロ酢酸塩とし
て得た（収量３ミリモル）。

(2) Ｈ−Leu−Ala−Gly−OEtの合成Ｈ−Ala−Gly−OEtトリフルオロ酢酸塩
（３ミリモル）、Boc−Leu・H₂O0.75ｇ（３
ミリモル）およびHOBt0.41ｇ（３ミリモ
ル）をDMF5mlに溶解し、この溶液に０℃氷
冷下トリエチルアミンを加えて中和後、
DCC0.62ｇを加え、ついで５℃に保持しつつ
一夜撹拌した。生成したジシクロヘキシルウ
レアを濾別し、濾液を濃縮乾固した後、残渣
を酢酸エチルに溶解した。この溶液を10％ク
エン酸水溶液、水、４％炭酸水素ナトリウム
水溶液、ついで水で充分に洗浄し、減圧乾固
した。この物質をトリフルオロ酢酸25mlとア
ニソール0.5mlの混液に溶解し、室温に20分
間放置した。次に反応混合液を減圧濃縮し、
残渣をエーテルで２回洗浄した後エーテルを
留去し、Ｈ−Leu−Ala−Gly−OEtをトリフ
ルオロ酢酸塩として得た（収量0.5ミリモ
ル）。

(3) ベンジルオキシカルボニル−Glu−Leu−
Ala−Glyの合成Ｈ−Leu−Ala−Gly−OEt−トリフルオロ
酢酸塩（0.5ミリモル）、ベンジルオキシカル
ボニル−Glu（OBzl）（γベンジルエステル）
0.19ｇ（0.5ミリモル）およびHOBt0.068ｇ
（0.5ミリモル）をDMF2mlに溶解し、この溶
液に０℃氷冷下トリエチルアミンを加えて中
和後、DCC0.10ｇを加え、ついで５℃に保持
しつつ一夜撹拌した。

生成したジシクロヘキシルウレアを濾別
し、濾液を濃縮乾固した後、残渣を酢酸エチ
ルに溶解した。この溶液を10％クエン酸水溶
液、水、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、つ
いで水で充分に洗浄し、減圧乾固した。この
物質をメタノール48ml、ジオキサン24ml、
1N NaOH4mlの混液に溶解し、室温に５時
間放置した後、これに水を加えてエーテルで
洗浄し、ついで陽イオン交換樹脂（AG50W
−X8）でNa⁺イオンを吸着させ、溶液を酸
性にすることにより目的とするペプチド、ベ
ンジルオキシカルボニル−Glu−Leu−Ala
−Glyの白色沈澱物を得た。本試料は更にセ
フアデツクスLH−20のゲル濾過を行うこと
により単一のペプチドとして回収した。

本ペプチドはHPLC（高速液体クロマトグ
ラフイー）で溶出時間2.9分の位置に単一の
ピークを示した。HPLCの溶出条件を下記に
示す。

カラム：ウオーターズ社製ラジアルパツクカ
ートリツジC18 溶出液：燐酸緩衝液（10ｍMKH₂PO₄、50ｍ
MNa₂SO₄、PH2.5）：アセトニトリル＝
４：６流速：１ml／min 検出：210nｍの紫外部吸収次に本ペプチドの各種分析値を示す。

アミノ酸分析：Glu（0.98）、Gly（0.97）、Ala
（1.00）、Leu（0.97）（）はAlaを１としたモル比分析は6N
塩酸110℃24時間の加水分解後行つた。

比施光度：〔α〕²⁵ _D＝−60゜（Ｃ＝0.1、H₂O）質量分析：ｍ／z523（Ｍ＋Ｈ）⁺ 日本電子HX110、FAB−MSにて測定 (B) コラゲナーゼ阻害活性以上のようにして得た本ペプチドのコラゲナ
ーゼ阻害活性をR.D.Grayらの方法（Biochem.
Biophys.Res.Commun.101、1251（1981））に準
じて測定した。

すなわち、0.05Mのトリス塩酸緩衝液（PH
7.0、0.15M NaCl及び0.005M CaCl₂を含む）
に、0.5Mの基質ペプチド（DNP−Pro−Gln−
Gly−Ile−Ala−Gly−Gln−Ｄ−Arg、(株)ペプ
チド研より購入）を溶解させ、これを基質液と
する。

ついでNew England Nuclear社より購入し
たタドポール・コラゲナーゼ（２mg／ml）を上
記緩衝液で1/10に希釈し、これを酵素液とし
た。

まず10μの本発明ペプチド及び45μの基
質液を小試験管に入れ、37℃に保温した。つい
で45μの酵素液を添加し、引き続き37℃に保
温した。５、15、25分の時点で10μの反応液
を採取し、ただちにHPLC装置に注入し、基質
が分解して生じたDNP−Pro−Gln−Glyを定
量した。HPLCの条件を下記に示す。

カラム：ウオーターズ社製ラジアルパツクカー
トリツジC8 溶出液：燐酸緩衝液（10ｍＭ KH₂PO₄、50ｍ
Ｍ Na₂SO₄、PH2.5）：アセトニトリル＝
７：３流速：２ml／min 検出：375nｍの吸収このような実験を複数行い、阻害率を次の式
より算出した。

阻害率＝Ａ−Ｂ／Ａ×100（％）Ａ：阻害剤を含まない場合のDNP−Pro−Gln
−Glyの量Ｂ：阻害剤添加の場合のDNP−Pro−Gln−
Glyの量そして阻害率50％のときの本ペプチ
ドの濃度IC₅₀値を求めたところ450μｍであつ
た。

〔発明の効果〕

本ペプチド及びその塩基との塩は動物コラゲナ
ーゼ阻害活性を有し、既知の阻害剤よりも、容易
に製造できることから有用性の高いものである。

Claims

【特許請求の範囲】１ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−Glu−Ｌ−
Leu−Ｌ−Ala−Gly及びその塩基との塩。２ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−Glu−Ｌ−
Leu−Ｌ−Ala−Glyまたはその塩基との塩を有
効成分として含有する動物コラゲナーゼ阻害剤。