JPH0548238B2

JPH0548238B2 -

Info

Publication number: JPH0548238B2
Application number: JP61288287A
Authority: JP
Inventors: Susumu Maruyama; Hideoki Tanaka; Noboru Tomizuka; Hideo Suzuki; Ryuji Sugai; Kazuyoshi Morita; Taira Takemoto
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1986-12-03
Filing date: 1986-12-03
Publication date: 1993-07-20
Also published as: JPS63141998A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は新規な活性ペプチドに関するものであ
り、詳しくはアンジオテンシン転換酵素阻害活性
を有し、高血圧症の治療もしくは予防に用いて有
用性の期待できる新規なペプチドに関する。（従来の技術）高血圧症の発症にレニン−アンジオテンシン系
が深いかかわりを持つていることはよく知られて
いる。このレニン・アンジオテンシン系には血圧
調節に与るアンジオテンシン転換酵素が存在し、
該酵素は、アンジオテンシンを強い血管壁平滑
筋収縮作用を有するアンジオテンシンに転換せ
しめることを通じて血圧上昇に関与している。従
つて、この酵素活性を抑制することによつて血圧
上昇を防ぐこと（降圧）が可能である。アンジオテンシン転換酵素の活性阻害物質とし
て、既に種々の物質が見い出されており、例えば
合成物についてはＤ−２−メチル−３−メルカプ
トプロパノイル−Ｌ−プロリン（一般名カプトプ
リル）がその高い阻害活性からして、現に経口降
圧剤として実用に供されている。また、天然物あ
るいは天然物由来の阻害物質としては、蛇毒ペプ
チドおよびその類縁体、あるいは牛由来カゼイン
をトリプシン分解して得られるペプチド等が知ら
れている。それらのうち、天然物あるいは天然物由来の阻
害物質は、合成物が毒性や副作用の点でなお問題
を残しているのに対し、より安全性にすぐれた降
圧剤となることが期待でき、なかでもカゼイン由
来の阻害ペプチドは、安全性、有効性に加えて、
コスト面でも有利と見込まれるところからその降
圧剤としての実用化が検討されている。（発明の目的）本発明者等は、上記のカゼイン由来の阻害ペプ
チドの有用性に鑑み、その類縁ペプチドないしは
部分構造物の中から、有効なアンジオテンシン転
換酵素阻害活性を有するものを検索し、以て該ペ
プチド群の降圧剤への適用に際しての選択の巾を
拡げ、その実用化可能性をより高めるべく鋭意研
究を行つた結果、後述のペプチドがかゝる目的を
満足することを見い出し、本発明を完成するに至
つた。（発明の構成）即ち、本発明は、新規な活性ペプチドであるＬ
−アラニル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−チ
ロシル−Ｌ−プロリンおよびその酸付加塩であ
る。こゝで酸付加塩としては、製薬上許容される
塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、コハク酸塩、クエン
酸塩、酒石酸塩などが好ましいものとして挙げら
れる。本発明のペプチドは、牛カゼインの部分構造物
であり、該蛋白の酵素加水分解によつても得るこ
とができるが、より有利には有機化学的な合成手
法を用い、アミノ酸を段階的に導入する方法によ
つて製造される。また、加水分解酵素の逆反応を
利用したペプチド合成法を用いることもできる。以下に合成法の一例を示すが、こゝに於いてア
ミノ酸はすべてＬ体を意味し、またアミノ酸の保
護基の略号はそれぞれ次の残基を表す。 Boc：ターシヤリー−ブチルオキシカルボニル
（tret−Butyloxy−carbonyl）基 Bzl：ベンジル（Benzyl）基Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
（Benzyloxycarbonyl）基 (1) Boc−Val−OHとＨ−Pro−OBzlを縮合反
応させてBoc−Val−Pro−OBzlを合成し、そ
の脱保護基反応によりＨ−Val−Pro−OBzlを
得る。次に、このＨ−Val−Pro−OBzlをＺ−
Ala−OHと縮合反応させてＺ−Ala−Val−
Pro−OBzlを合成し、同じく脱護基反応によ
りＺ−Ala−Val−Pro−OHを得る。 (2) 別に、Boc−Tyr（Bzl）−OHとＨ−Pro−
OBzlを縮合反応させてBoc−Tyr（Bzl）−Pro
−OBzlを合成し、その脱保護基反応によりＨ
−Tyr（Bzl）−Pro−OBzlを得る。 (3) (1)のＺ−Ala−Val−Pro−OHと(2)のＨ−
Tyr（Bzl）−Pro−OBzlを縮合反応させてＺ−
Ala−Val−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−OBzlとし、
これを脱保護基して目的のＨ−Ala−Val−
Pro−Tyr−Pro−OHを得る。以上の反応に於いて、反応条件等は通常のペプ
チド合成の場合と同様のものを採用することがで
きる。本発明のペプチドは、アンジオテンシン転換酵
素に対して強い阻害作用を示し、また低毒性であ
つて、高血圧症の治療もしくは予防のための医薬
あるいは健康食品等として有用性が期待できる。以下に、本発明のペプチドの有用性を示す活性
試験の結果を挙げる。〔アンジオテンシン転換酵素阻害活性〕 (1) 供試々料 (イ) 後記の実施例で得られたＨ−Ala−Val−
Pro−Tyr−Pro−OH（本発明ペプチド） (ロ) カプトプリル（対照） (2) 試験方法 (i) アンジオテンシン転換酵素液（ACE液）
の調製５ｇのラビツトラングアセトンパウダー
（シグマ社製）を50mlの0.1Mホウ酸緩衝液
（PH8.3）に溶解し、40000xg、40分の条件
下で遠心処理し、その上清液をさらに、上
記緩衝液で５倍に希釈し、アンジオテンシ
ン転換酵素液を得た。 (ii) 活性の測定試料を試験管に0.03ml入れ、上記酵素液
を0.1ml添加し、37℃で10分間保温後、こ
れに基質として、250μlのヒプリル−Ｌ−
ヒスチジル−Ｌ−ロイシン〔アルドリツヒ
ケミカル社（Aldrich Chem.Co.）製．、
最終濃度５ｍＭ、Nac1300ｍＭを含む。〕
を添加し、37℃で30分間反応させた。その
後、1N塩酸0.25mlを添加して反応を停止
させた後、1.5mlの酢酸エチルを加え、15
秒間激しく攪拌した。その後、3500rpmで
15分間遠心して、酢酸エチル層１mlを採取
した。その酢酸エチル層を120℃で30分間
加熱し、溶媒を除去した。溶媒除去後、蒸
溜水２mlを添加し、抽出されたヒプリル酸
の吸収（228nmの吸光度）を測定し、これ
を酵素活性とした。なお、この条件で阻害
剤を含まない場合の228nmの吸光度は、
0.500である。阻害率は、次式より算出した。阻害率＝Ａ−Ｂ／AX100％Ａ：阻害剤を含まない場合の228nmの吸
光度（0.500）Ｂ：阻害剤添加の場合の228nmの吸光度そして、阻害率50％の時の阻害濃度を
ID50とする。 (ハ) 試験結果試験結果を第１表に示す。

【表】上記の結果から明らかな通り、本発明のペプチ
ドはアンジオテンシン転換酵素に対して阻害作用
を有し、生体内に於いて有効な降圧作用を発揮す
ることが期待できる。また、本発明のペプチド
は、マウス経口投与時の急性毒性値（LD50）が
３ｇ／Kg以上と極めて低毒性である。従つて、本
発明のペプチドは、高血圧症の治療もしくは予防
のための医薬あるいは健康食品等に適用して有用
性が期待できる。本発明のペプチドを高血圧症の治療あるいは予
防のための医薬として用いる場合、該ペプチド
は、薬学的に許容される担体（賦形剤、滑沢剤、
結合剤、着色剤、矯味剤、賦香剤等）と共に常法
に従つて、経口投与用の製剤の形態、例えば錠
剤、カプセル剤、トローチ剤、粉末剤、細粒剤、
顆粒剤等とした上経口投与されるか、もしくは注
射剤の形で静脈内投与される。一方、健康食品として用いる場合には、上記と
同様の経口投与用製剤の形態とするか、もしくは
固型あるいは液状の食品ないしは嗜好品（例えば
菓子類、粉末茶、アルコール飲料、スポーツ飲料
等）の形態とすればよい。用量は、一般に成人男子１日当り１mg〜１ｇ／
Kg体重の範囲であり、かゝる範囲から投与（摂
食）目的に応じて適宜の量が選択される。次に、実施例によつて本発明を説明する。実施例 (A) Ｚ−Ala−Val−Pro−OHの合成 (1)Boc−Val−Pro−OBzlの合成Ｈ−Pro−
OBzl・HCl2.42ｇ（10ｍmol）、Boc−Val−
OH2.17ｇ（10ｍmol）および１−ハイドロ
キシベンゾトリアゾール（HOBt）1.35ｇ
（10ｍmol）をDMF10mlに溶解し、この溶液
に、０℃氷冷下、トリエチルアミン1.4mlと
ジシクロヘキシルカーボジイミド2.06ｇを加
え、次いで５℃に保持しつゝ一夜攪拌した。生成したジシクロヘキシルウレア
（DCurea）を濾別し、濾液を濃縮乾固した
後、残渣を酢酸エチルに溶解した。この溶液
を、10％クエン酸水溶液、水、４％炭酸水素
ナトリウム水溶液、次いで水で充分に洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥した。無
水硫酸ナトリウムを濾別後、濾液を減圧濃縮
し、Boc−Val−Pro−OBzlを、油状物質と
して得た（収量2.64ｇ）。 (2) Ｈ−Val−Pro−OBzlの合成 Boc−Val−Pro−OBzl2.84ｇ（７ｍmol）
を、トリフルオロ酢酸25mlとアニソール３ml
の混液に溶解し、室温に20分間放置した。次
に、反応混合液を減圧濃縮し、残渣をエーテ
ルで２回洗浄した後、エーテルを留去し、Ｈ
−Val−Pro−OBzlをトリフルオロ酢酸塩と
して得た〔収量1.965ｇ、（５ｍmol）、性
状：白色粉末〕。 (3) Ｚ−Ala−Val−Pro−OBzlの合成Ｈ−Val−Pro−OBzl・トリフルオロ酢酸
塩1.965ｇ（５ｍmol）、Ｚ−Ala−OH1.12ｇ
（５ｍmol）およびHOBt0.68ｇ（ｍmol）、
をDMF5mlに溶解し、この溶液に、０℃氷冷
下、トリエチルアミン0.7mlとジシクロヘキ
シルカーボジイミド1.03ｇ（５ｍmol）を加
え、次いで５℃に保持しつゝ一夜攪拌した。生成した、DCureaを濾別し、濾液を濃縮
乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶解した。
この溶液を、10％クエン酸水溶液、水、４％
炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで水で充分
に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥し
た。無水硫酸ナトリウムを濾別後、濾液を減
圧濃縮してＺ−Ala−Val−Pro−OBzlを油
状物質として得た〔収量1.13ｇ〕。 (4) Ｚ−Ala−Val−Pro−OHの合成Ｚ−Ala−Val−Pro−OBzl0.99ｇ（２ｍ
mol）を、メタノール48ml、ジオキサン24ml
および1NNaOH4mlの混液に溶解し、この溶
解を室温に５時間放置した後、水を加えてエ
ーテルで洗浄した。次に、陽イオン交換樹脂（BIO−
RADAG50W−X8）を用いて中和した後減
圧乾固し、Ｚ−Ala−Val−Pro−OHを白色
粉末として得た〔収量0.377ｇ、（0.9ｍ
mol）〕。 (B) Ｈ−Tyr（Bzl）−Pro−OBzlの合成 (1)Boc−Tyr（Bzl）−Pro−OBzlの合成Ｈ−Pro−OBzl・HCl4.11ｇ（17ｍmol）、
Boc−Tyr（Bzl）−OH6.31ｇ（17ｍmol）、お
よび１−ハイドロキシベンゾトリアゾール
（HOBt）2.30ｇ（17ｍmol）をジメチルホル
ムアミド（DMF）17mlに溶解し、この溶液
に、０℃氷冷下、トリエチルアミン2.3mlと、
ジシクロヘキシルカーボイジイミド3.51ｇ
（17ｍmol）を加え、次いで５℃に保持し
つゝ一夜攪拌した。生成した、DC ureaを濾別し、濾液を濃縮
乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶解した。
この溶液を、10％クエン酸水溶液、水、４％
炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで水で充分
に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥し
た。無水硫酸ナトリウムを濾別後、濾液を減
圧濃縮して、Boc−Tyr（Bzl）−Pro−OBzl
を油状物質として得た〔収量3.29ｇ、（6.65
ｍmol）、〕。 (2)Ｈ−Tyr（Bzl）−Pro−OBzlの合成 Boc−Tyr（Bzl）−Pro−OBzl2.96ｇ（６ｍ
mol）をトリフルオロ酢酸25mlとアニソール
６mlの混液に溶解し、室温に20分間放置し
た。次に、反応混合液を減圧濃縮し、残渣を
エーテルで２回洗浄した後、エーテルを留去
し、Ｈ−Tyr（Bzl）−Pro−OBzlをトリフル
オロ酢酸塩として得た〔収量0.51ｇ（１ｍ
mol）、性状：白色粉末〕。 (C) Ｈ−Ala−Val−Pro−Tyr−Pro−OHの合
成 (1)Ｚ−Ala−Val−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−
OBzlの合成 (A)で得たＺ−Ala−Val−Pro−OH0.21ｇ
（0.5ｍmol）、(B)で得たＨ−Tyr（Bzl）−Pro
−OBzl、トリフルオロ酢酸塩0.26ｇ（0.5ｍ
mol）およびHOBt0.07ｇをDMF3mlに溶解
し、この溶液に、０℃氷冷下、トリエチルア
ミン0.07mlと、ジシクロヘキシルカーボジイ
ミド0.10ｇ（0.5ｍmol）を加え、次いで５℃
に保持しつゝ一夜攪拌した。生成した、DC ureaを濾別し、濾液を濃縮
乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶解した。
この溶液を、10％クエン酸水溶液、水、４％
炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで水で充分
に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥し
た。無水硫酸ナトリウムを濾別後、濾液を減
圧濃縮し、Ｚ−Ala−Val−Pro−Tyr（Bzl）
−Pro−OBzlを油状物質として得た〔収量
0.0795ｇ（0.1ｍmol）〕。 (2)Ｚ−Ala−Val−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−OH
の合成Ｚ−Ala−Val−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−
OBzl0.318ｇ（0.4ｍmol）をメタノール12
ml、ジオキサン６mlおよび1NNaOH1mlの混
液に溶解し、室温に５時間放置した後、これ
に水を加えてエーテルで洗浄し、次いで、陽
イオン交換樹脂（BIO−RAD AG50W−
X8）で中和した。この溶液を、減圧下に濃縮乾固し、Ｚ−
Ala−Val−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−OHを淡
黄色粉末として得た〔収量0.108ｇ、（0.15ｍ
mol）〕。 (3)Ｈ−Ala−Val−Pro−Tyr−Pro−OHの合
成Ｚ−Ala−Val−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−
OH0.07ｇ（0.1ｍmol）を、臭化水素を飽和
した酢酸１mlとアニソール１mlの混液に溶解
し、これを室温に１時間放置した後、減圧濃
縮し、残渣をエーテルで洗浄した。次に、この残渣を高速液体クロマトグラフ
イー（カラム：ラジアルパツク（Radial
PAk）C₁₈、溶出液：アセトニトリル／0.1％
トリフルオロ酢酸＝60／40、溶出速度：２
ml／min）に付し、活性画分を分取、減圧乾
固して、Ｈ−Ala−Val−Pro−Tyr−Pro−
OHの精製物0.0051ｇ（0.01ｍmol）を白色粉
末として得た。こゝに得られたペプチドの物性値および分
析結果は、以下の通りであつた。 ◎比旋光度〔α〕_D ²⁵−120° （Ｃ＝0.1、H₂O） ◎アミノ酸分析 6NHClによる加水分解物のアミノ酸分析 Ala 1.02(1)、Val 1.00(1)、 Tyr 0.93(1)、Pro 1.90(2)、 ◎薄層クロマトグラフイー〔シリカゲルプレ
ート。展開液；ブタノール：酢酸：水（４：
１：５）の上層。検出；UV吸収およびニン
ヒドリン発色〕でRf値0.38に単一スポツトを
示した。

Claims

【特許請求の範囲】

１Ｌ−アラニル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−
Ｌチロシル−Ｌ−プロリンおよびその酸付加塩。