JPH0547557B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は新規な活性ペプチドに関するものであ
り、詳しくはアンジオテンシン転換酵素阻害活性
を有し、高血圧症の治療もしくは予防に用いて有
用性の期待できる新規なペプチドに関する。 （従来の技術） 高血圧症の発症にレニン−アンジオテンシン系
が深いかかわりを持つていることはよく知られて
いる。このレニン・アンジオテンシン系には血圧
調節に与るアンジオテンシン転換酵素が存在し、
該酵素は、アンジオテンシンを強い血管壁平滑
筋収縮作用を有するアンジオテンシンに転換せ
しめることを通じて血圧上昇に関与している。従
つて、この酵素活性を抑制することによつて血圧
上昇を防ぐこと（降圧）が可能である。 アンジオテンシン転換酵素の活性阻害物質とし
て、既に種々の物質が見い出されており、例えば
合成物についてはＤ−２−メチル−３−メルカプ
トプロパノイル−Ｌ−プロリン（一般名カプトプ
リル）がその高い阻害活性からして、現に経口降
圧剤として実用に供されている。また、天然物あ
るいは天然物由来の阻害物質としては、蛇毒ペプ
チドおよびその類縁体、あるいは牛由来カゼイン
をトリプシン分解して得られるペプチド等が知ら
れている。 それらのうち、天然物あるいは天然物由来の阻
害物質は、合成物が毒性や副作用の点でなお問題
を残しているのに対し、より安全性にすぐれた降
圧剤となることが期待でき、なかでもカゼイン由
来の阻害ペプチドは、安全性、有効性に加えて、
コスト面でも有利と見込まれるところからその降
圧剤としての実用化が検討されている。 （発明の目的） 本発明者等は、上記のカゼイン由来の阻害ペプ
チドの有用性に鑑み、その類縁ペプチドないしは
部分構造物の中から、有効なアンジオテンシン転
換酵素阻害活性を有するものを検索し、以て該ペ
プチド群の降圧剤への適用に際しての選択の巾を
拡げ、その実用化可能性をより高めるべく鋭意研
究を行つた結果、後述のトリペプチドがかゝる目
的を満足することを見い出し、本発明を完成する
に至つた。 （発明の構成） 即ち、本発明は、新規な活性ペプチドであるＬ
−プロリル−Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリンおよび
その酸付加塩である。 こゝで酸付加塩としては、製薬上許容される
塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、コハク酸塩、クエン
酸塩、酒石酸塩などが好ましいものとして挙げら
れる。 本発明のペプチドは、牛カゼインの部分構造物
であり、該蛋白の酵素加水分解によつても得るこ
とができるが、より有利には有機化学的な合成手
法を用い、アミノ酸を段階的に導入する方法によ
つて製造される。 以下に合成法の一例を示すが、こゝに於いてア
ミノ酸はすべてＬ体を意味し、またアミノ酸の保
護基の略号はそれぞれ次の残基を表す。 Boc：ターシヤリー−ブチルオキシカルボニル
（tret−Butyloxy−carbonyl）基 Bzl：ベンジル（Benzyl）基 (1) Boc−Tyr（Bzl）−OHとＨ−Pro−OBzlを縮
合反応させてBoc−Tyr（Bzl）−Pro−OBzlを
合成し、その脱保護基反応によりＨ−Tyr
（Bzl）−Pro−OBzlを得る。次に、このＨ−
Tyr（Bzl）−Pro−OBzlをBoc−Pro−OHと縮
合反応させてBoc−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−
OBzlを合成し、同じく脱保護基反応により目
的のＨ−Pro−Tyr−Proを得る。 以上の反応に於いて、反応条件等は通常のペプ
チド合成の場合と同様のものを採用することがで
きる。 本発明のペプチドは、アンジオテンシン転換酵
素に対して強い阻害作用を示し、また低毒性であ
つて、血圧降下を目的として医薬あるいは健康食
品等に適用して有用性が期待できる。 以下に、本発明のペプチドの有用性を示す活性
試験の結果を挙げる。 〔アンジオテンシン転換酵素阻害活性〕 (1) 供試々料 (イ) 後記の実施例で得られたＨ−Pro−Tyr−
Pro−OH（本発明ペプチド） (ロ) カプトプリル（対照） (2) 試験方法 (i) アンジオテンシン転換酵素液（ACE液）
の調製 ５ｇのラビツトラングアセトンパウダー
（シグマ社製）を50mlの0.1Mホウ酸緩衝液
（PH8.3）に溶解し、40000xg、40分の条件下
で遠心処理し、その上清液をさらに、上記緩
衝液で、５倍に希釈し、アンジオテンシン転
換酵素液を得た。 (ii) 活性の測定 試料を試験管に0.03ml入れ、上記酵素液を
0.1ml添加し、37℃で10分間保温後、これに
基質として、250μのヒプリル−Ｌ−ヒス
チジル−Ｌ−ロイシン〔アルドリツヒ ケミ
カル社（Aldrich Chem.Co.）製．、最終濃度
５ｍＭ、Nac1300ｍＭを含む。〕を添加し、
37℃で30分間反応させた。その後、1N塩酸
0.25mlを添加して反応を停止させた後、1.5
mlの酢酸エチルを加え、15秒間激しく攪拌し
た。その後、3500rpmで15分間遠心して、酢
酸エチル層１mlを採取した。その酢酸エチル
層を120℃で30分間加熱し、溶媒を除去した。
溶媒除去後、蒸溜水２mlを添加し、抽出され
たヒプリル酸の吸収（228nｍの吸光度）を
測定し、これを酵素活性とした。なお、この
条件で阻害剤を含まない場合の228nｍの吸
光度は、0.500である。 阻害率は、次式より算出した。 阻害率＝Ａ−Ｂ／AX100％ Ａ：阻害剤を含まない場合の228nｍの吸光
度（0.500） Ｂ：阻害剤添加の場合の228nｍの吸光度そ
して、阻害率50％の時の阻害濃度をID50
とする。 (ハ) 試験結果 試験結果を第１表に示す。

【表】 上記の結果から明らかな通り、本発明のペ
プチドはアンジオテンシン転換酵素に対して
阻害作用を有し、生体内に於いて有効な降圧
作用を発揮することが期待できる。また、本
発明のペプチドは、マウス経口投与時の急性
毒性値（LD50）が３ｇ／Kg以上と極めて低
毒性である。従つて、本発明のペプチドは、
高血圧症の治療もしくは予防のための医薬あ
るいは健康食品等に適用して有用性が期待で
きる。 本発明のペプチドを高血圧症の治療あるいは予
防のための医薬として用いる場合、該ペプチド
は、薬学的に許容される担体（賦形剤、滑沢剤、
結合剤、着色剤、矯味剤、賦香剤等）と共に常法
に従つて、経口投与用の製剤の形態、例えば錠
剤、カプセル剤、トローチ剤、粉末剤、細粒剤、
顆粒剤等とした上経口投与されるか、もしくは注
射剤の形で静脈内投与される。 一方、健康食品として用いる場合には、上記と
同様の経口投与用製剤の形態とするか、もしくは
固型あるいは液状の食品ないしは嗜好品（例えば
菓子類、粉末茶、アルコール飲料、スポーツ飲料
等）の形態とすればよい。用量は、一般に成人男
子１日当り80mg〜４ｇ／Kg体重の範囲であり、
かゝる範囲から投与（摂食）目的等に応じて適宜
の量が選択される。 次に、実施例によつて本発明を説明する。 実施例 １ (1) Ｈ−Tyr（Bzl）−Pro−OBzlの合成 Ｈ−Pro−OBzl・HCl 2.42ｇ（10ｍmol）、
Boc−Tyr（Bzl）−OH3.71ｇ（10ｍmol）およ
び１−ハイドロキシベンゾトリアゾール
（HOBt）1.35ｇ（10ｍmol）をジメチルホルム
アミド（DMF）10mlに溶解し、この溶液に、
０℃氷冷下、トリエチルアミン1.4mlとジシク
ロヘキシルカーボジイミド2.06ｇを加え、次い
で５℃に保持しつゝ一夜攪拌した。 生成したジシクロヘキシルウレアを濾別し、
濾液を濃縮乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶
解した。この溶液を、10％クエン酸水溶液、
水、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで水
で充分に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水乾
燥した。無水硫酸ナトリウムを濾別後、濾液を
減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルで結晶化した。 この結晶（Boc−Tyr（Bzl）−Pro−OBzl）
を、トリフルオロ酢酸16mlとアニソール４mlの
混液に溶解し、室温に20分間放置した。次に、
反応混合液を減圧濃縮し、残渣をエーテルで２
回洗浄した後、エーテルを留去し、Ｈ−Tyr
（Bzl）−Pro−OBzlをトリフルオロ酢酸塩とし
て得た〔収量0.52ｇ、（１ｍmol）、性状：淡黄
色粉末〕。 (2) Boc−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−OHの合成 Ｈ−Tyr（Bzl）−Pro−OBzl・トリフルオロ
酢酸塩0.52ｇ（１ｍmol）、Boc−Pro−OH0.22
ｇ（１ｍmol）およびHOBt0.14ｇ（１ｍmol）
をDMF4mlに溶解し、この溶液に、０℃氷冷
下、トリエチルアミン0.15mlとジシクロヘキシ
ルカーボジイミド0.21ｇを加え、次いで５℃に
保持しつゝ一夜攪拌した。 生成したジシクロヘキシルウレアを濾別し、
濾液を濃縮乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶
解した。この溶液を、10％クエン酸水溶液、
水、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで水
で充分に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水乾
燥した。無水硫酸ナトリウムを濾別後、濾液を
減圧濃縮し、残渣を得た。 この残渣（Boc−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−
OBzl）を、メタノール18ml、ジオキサン９ml
および1NNaOH1.5mlの混液に溶解し、室温に
５時間放置した後、水を加えてエーテルで洗浄
し、次いで、陽イオン交換樹脂（BIO−RAD
AG50W−X8）で中和した。 樹脂を濾過により除き、濾液を減圧下に濃縮
乾固してBoc−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−OHを
白色粉末として得た〔収量0.18ｇ（0.33ｍ
mol）〕。 (3) Ｈ−Pro−Tyr−Pro−OHの合成 Boc−Pro−Tyr（Bzl）−Pro−OH0.080ｇ
（0.15ｍmol）を、臭化水素を飽和した酢酸１
mlとアニソール１mlの混液に溶解し、これを室
温に１時間放置した後減圧濃縮し、残渣をエー
テルで洗浄した。 次に、この残渣を高速液体クロマトグラフイ
ー（カラム：ラジアルパツク（Radial PAk）
C₁₈、溶出液：アセトニトリル／0.1％トリフル
オロ酢酸＝60／40、溶出速度：２ml／min）に
付し、活性画分を分取、減圧乾固して、Ｈ−
Pro−Tyr−Pro−OHの精製物0.0027ｇ（0.008
ｍmol）を無色粉末として得た。 こゝに得られたペプチドの物性値および分析結
果は、以下の通りであつた。 ◎比旋光度 〔α〕_D ²⁵−93゜ （Ｃ＝0.1、H₂O） ◎アミノ酸分析 （6NHClにて24時間加水分解） Tyr1.00(1)、Pro1.7(2) ◎薄層クロマトグラフイー〔シリカゲルプレー
ト。展開液；プタノール：酢酸：水（４：
１：５）の上層。UV吸収及びニンヒドリン
発色〕でRf値0.29に単一スポツトを示した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｌ−プロリル−Ｌ−チロシル−Ｌ−プロリル
   および酸付加塩。