JPS63141997A - 新規活性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な活性ペプチドに関するものであり、詳し
くはアンジオテンシン転換酵素阻害活性を有し、高血圧
症の治療もしくは予防に用いて有用性の期待できる新規
なペプチドに関する。

（従来の技術） 高血圧症の発症にレニン−アンジオテンシン系が深いか
かわりを持っていることはよく知られている。このレニ
ン・アンジオテンシン系には血圧調節に与るアンジオテ
ンシン転ＩＱ酵素が存在し、該酵素は、アンジオテンシ
ンＩを強い血管壁平滑筋収縮作用を有するアンジオテン
シン■に転換せ上昇を防ぐこと（降圧）が可能である。

アンジオテンシン転換酵素の活性阻害物質として、既に
種々の物質が見い出されており、例えば合成物について
はＤ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル−し−
プロリン（−船名カブトプリル）がその高い阻害活性か
らして、現に経口降圧剤として実用に供されている。ま
た、天然物あるいは天然物由来の阻害物質としては、蛇
毒ペプチドおよびその類縁体、あるいは牛山来カゼイン
をトリプシン分解して得られるペプチド等が知られてい
る。

それらのうち、天然物あるいは天然物由来の阻害物質は
、合成物が毒性や副作用の点でなお問題を残しているの
に対し、より安全性にすぐれた降圧剤となることが期待
でき、なかでもカゼイン由来の阻害ペプチドは、安全性
、有効性に加えて、：２スト面でも有利と見込まれると
ころ°からその降圧剤としての実用化が検討されている
。

チドの有用性、有効性に鑑み、その部分構造物あるいは
類縁体の中から、アンジオテンシン転換酵素阻害活性を
有し降圧剤としての実用化が期待し得る新規なペプチド
を見い出すぺ＜Ｒ意研究を行った結果、カゼイン由来阻
害ペプチドの部分構造物に相当する新規ペプチドのし一
フェニルアラニルーＬ−バリルーＬ−アラニル−し−プ
ロリンがアンジオテンシン転換酵素に対して強い阻害活
性を示し有用な降圧剤となり得ることを知り、さらにか
＼る知見に基づいて探索を進めた結果、該新規ペプチド
の立体異性体であるＤ−フェニルアラニル−Ｌ−バリル
−Ｌ−アラニル−し−プロリンが同様の阻害活性を有し
、かつ低毒性であることをも知得し、それら事実に基づ
いて本発明を完成するに至った。

（発明の構成） 即ち、本発明は新規な活性ペプチドであるＬ−またはＤ
−フェニルアラニル−Ｌ−バリル−Ｌ−アラニル−Ｌニ
ブロリン（以下、アミノ酸を慣用表記であるＰｈｅ等で
表すと共に、Ｌ体については特に０体と区別する必要の
ある場合以外はＬの表示を省略する。例えば本発明ペプ
チドはＨ−Ｌ−またはＤ−Ｐｈｅ−Ｖａ　Ｉ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−ＯＨのように表示する）およびその酸付加塩で
ある。

こ−で酸付加塩としては製薬上許容される塩、例えば塩
酸塩、硫酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩など
が好ましいものとして挙げられる。

本発明のペプチドは、有利には、有機化学的な合成手法
を用いアミノ酸を段階的に導入する方法によって製造さ
れる。また、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド
合成法を用いることもできる０本発明のペプチドのうら
Ｈ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ（以下
、これをＬ−Ｐｈｅ体といい、ＤＰｈｅｉｆｆ換誘導体
をＤ−Ｐｈｅ体ということがある）は、牛カゼインの部
分構造物に相当するので、該蛋白の加水分解によっても
これを調製することができるが、この場合もアミノ酸の
保護基は次の略号で表す。

ターシャリーープチルオキシカルボニル（ｔｒｅｔ−Ｂ
ｕＬｙｌｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ）　　基　：Ｂｏｃ
ヘンシル（Ｂｅｎｚｙｌ）　４　：　Ｂ　２１ヘンシル
オキシカルボニル（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙ
ｌ）基：Ｚ まず、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯｌｌとＨ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ
を縮合反応させてＢｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒ。

−０Ｂｚｌを合成し、その脱保護基反応によりＩ（−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　ｌを得る０次に、コノＨ−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　ｌをＢｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨと縮合
反応させてＢｏｃ−Ｖａ　Ｉ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＢｚ
ｌを得、同じく脱保護基反応によりＨ−Ｖａ　Ｉ−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−０［３ｚ　ｌとした後、これにＢｏＣ−Ｌ
−Ｐｈｅ−ＯＨまたはＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨを縮合
させ、生成したＢｏｃ−Ｌ−またはＤ−Ｐｈｅ−Ｖａ　
１−Ａｌａ　−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌを脱保護基して目的の
Ｈ−Ｌ−またはＤ　−Ｐ　ｈ’、’、ｊ：←’Ｖａ　１
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−０以上の反応に於いて、反応条件等
は通常のペプチド合成の場合と同様のものを採用するこ
とができる。

本発明のペプチドは、アンジオテンシン転換酵素に対し
て強い阻害作用を示し、また低毒性であって高血圧症の
治療もしくは予防のための医薬あるいは健康食品等とし
て有用性が期待できる。

以下に、本発明のペプチドの有用性を示す活性試験の結
果を挙げる。

〔アンジオテンシン転換酵素阻害活性〕（１）供試々料 （イ）後記の実施例１で得られたＨ　−Ｄ　−Ｐ　ｈａ
−Ｖａ　Ｉ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ（本発明ペプチドり （ロ）後記の実施例２で得られたＨ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｖａ
　Ｉ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ（本発明ペプチド■） （ハ）カプトプリル（対照） （２）試験方法 （ｉ）アンジオテンシン転換靜素液（ＡＣＥ液）の調製 ５ｇのラビットラングアセトンパウダー（シグマ社製）
を５９ｍ１の０．１　Ｍホウ酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，３）
に溶解し、４０．０００ｘｇ。

４０分の条件下で遠心処理し、その上清液をさらに、上
記緩衝液で５倍に希釈し、アンジオテンシン転換酵素液
を得た。

（ｉｉ）活性の測定 試料を試験管に０．０３ｍ１入れ、上記酵素液をＱ、　
ｌ　ｍ　Ｉ添加し、３７℃で１０分間保温後、これに基
質として、２５０μ■のヒブリルーし一ヒスチジルーし
一ロイシン〔アルドリッヒ　ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ　Ｃｈｅｓ、Ｃｏ、）製１．最終濃度５ｍＭ、Ｎａｃ
ｌ　　３００ｍＭを含む、）を添加し、３７℃で３０分
間反応させた。その後、ＩＮ塩酸０．２５ｍ１を添加し
て反応を停止させた後、１．５　ｍ　ｌの酢酸エチルを
加え、１５秒間激しく撹拌した。その後、３　＋　５０
０７’ｐ−Ｐ！＋１５分間遠心して、酢、−１・′・−
１ 酸エチル層Ｉｎ’＋’ｌを採取した。その酢酸エチル層
を１２０℃で３０分間加熱し、溶離を瞼去した。溶媒除
去後、蒸溜水２ｍｌを゛添加し、抽出されたヒブリル酸
の吸収（２２８ｎｍの吸光度）を測定し、これを酵素活
性とした。

なお、この条件で阻害剤を含まない場合の２２８ｎｍの
吸光度は、ｏ、ｓｏｏである。

阻害率は、次式より算出した。

阻害率−Ａ−Ｂ／ＡＸ　１００％ Ａ：阻害剤を含まない場合の２２８ｎｍの吸光度（０，
５００） Ｂ：阻害剤添加の場合の２２８ｎｍの吸光度そして、阻
害率５０％の時の阻害濃度をＩＤ５０とする。

（ハ）試験結果 第１表 上記の結果から明らかな通り、本発明のペプチドはアン
ジオテンシン転換酵素に対して阻害作用を有し、生体内
に於いてを効な降圧作用を発揮することが期待できる。

また、本発明のペプチドは、Ｌ−Ｐｈｅ体、Ｄ−Ｐｈｅ
体のいずれも、マウス経口投与時の急性毒性値（ＬＤ５
０）が３ｇ／ｋｇ以上と極めて低毒性である。従って、
本発明のペプチドは、高血圧症の治療もしくは予防のた
めの医薬あるいは健康食品等に適用して有用性が期待で
きる。

なお、本発明ペプチドのうちＤ−Ｐｈｅ体はＬ−Ｐｈｅ
体より生体内酵素による分解を受は難いとの特長を有し
ており、例えば経口投与した場合にも消化管壁の酵素７
等による活性低下が少なく、−７７・、“ また活性の持続性°の点でもすぐれている。

本発明のペプチドを高血圧症の治療あるいは予防のため
の医薬として用いる場合、該ペプチドは、薬学的に許容
される担体（賦形剤、滑沢剤、結合剤、着色剤、矯味剤
、賦香剤等）と共に常法に従って、経口投与用の製剤の
形態、例えば錠剤、カプセル剤、トローチ剤、粉末剤、
細粒剤、顆粒剤等とした上経口投与されるか、もしくは
注射剤の形で静脈内投与される。特に、Ｌ−Ｐｈｅ体の
場合は静脈内投与が望ましい。

一方、健康食品として用いる場合には、上記と同様の経
口投与用製剤の形態とするか、もしくは固型あるいは液
状の食品ないしは嗜好品（例えば菓子類、粉末茶、アル
コール飲料、スポーツ飲料等）の形態とすればよい。

用鼠は、一般に成人男子１日当りＤ−Ｐｈｅ体で１〜２
００ｍｇ／ｋｇ体重、またＬ−Ｐｈｅ体で２〜３５０ｍ
ｇ／ｋｇ体重の範囲であり、か＼る範囲から投与（摂食
）目的等に応じて適宜の量が選訳される。

次に、実施例によって本発明を説明する。

実施・例ＩＤ−Ｐｈａ体の合成 （１）Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＢＺ　１の合成Ｈ−Ｐｒ
ｏ−ＯＢｚ　１１１ｃＩ　　２．４２ｇ　　　”（１０
ｍ５ｏｌ）　、Ｂ・ｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ１，８９ｇ（ｌ
　Ｏｓｍｏｌ）およびｌ−ハイドロキシベンゾトリアゾ
ール（ＨＯＢ　ｔ）　１．３５　ｇ　（１０ｓｓｏｌ）
をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌに溶解し、
この溶液に、０℃水冷下、トリエチルアミン１．４　ｍ
　ｌとジシクロへキシルカーポジイミド２．０６．を加
え、次いで５℃に保持しっ一一夜撹拌した。

生成した、ジシクロへキシルウレアを濾別し、濾液を濃
縮乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶解した。この溶液
を、１０％クエン酸水溶液、水、４％炭酸水素ナトリウ
ム水溶液、次いで水で充分に洗浄し、無水硫酸ナトリウ
ムで脱水乾燥した。無水硫酸ナトリウムを濾別後、濾液
を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルで結晶化した。

この結晶（１”１１＞：ＣＡ　Ｉ　ａ　　Ｐ　ｒ　ＯＯ
Ｂ　２ＪＪ　ｉ １）を、トリ屈、ルオロ酢ｅｌｌ　２５　ｍ　ｌとアニ
ソール１ｍｌの混液に溶解し、室温に２０分間放置した
０次に、反応混合液を減圧濃縮し、残渣をエーテルで２
回洗浄した後、エーテルを留去し、Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−ＯＨ２１をトリフルオロ酢酸塩として得た（収量２．
０　ｇ　、（５＊ｍｏｌ）　。

性状；白色粉末）。

（２）Ｈ−Ｖａ　Ｉ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　ｌの合
成Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　Ｉ　・）リフルオロ酢
酸塩１．９５　ｇ　（５ｓｓｏｌ）　％　Ｂ　ｏ　ｃ−
Ｖａ　１−ＯＨ１，０９ｇ　（５ｓ＋ｍｏｌ）およびＨ
ＯＩ３ｔ０．６８　ｇ　（５−ｍｏｌ）をＤＭＦ５ｍｌ
に溶解し、この溶液に、０℃水冷下、トリエチルアミン
０．７　ｍｌとジシクロへキシルカーポジイミド１．０
３　ｇを加え、次いで５℃に保持しつ一一夜撹拌した。

生成したジシクロへキシルウレアを濾別し、濾液を濃縮
乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶解した。この溶液を
、１０％クエン酸水溶液、水、４％炭酸水素ナトリウム
水溶液、次いで水減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルで結晶
化した。

この結晶（Ｂｏｃ−Ｖａ　Ｉ−Ａｌａ−Ｐｒ。

−０Ｂｚｌ）を、トリフルオロ酢ｆｉ２５ｍｌとアニソ
ール０．５　ｍ　ｌの混液に溶解し、室温に２０分間放
置した０次に、反応混合液を減圧濃縮し、残渣をエーテ
ルで２回洗浄した後、エーテルを留去し、Ｈ−Ｖａ　１
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌをトリフルオロ酢酸塩とし
て得た〔収量１．４２　ｇ、　　（３ｓｓｏｌ）　、性
状：白色粉末〕。

＋３１１１−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−
０）１の合成 Ｈ−Ｖａ　１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＢｚ　ｌ　−トリフ
ルオロ酢酸塩０．７１　ｇ　（１，５ｓｓｏｌ）　、Ｂ
　。

ｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ０，４０ｇ　　（１，５ｓｍｏｌ
）　　および＋ＩＯＢ　ｔ　Ｏ，２１ｇ　（１，５ｓｓ
ｏｌ）をＤＭＦ３ｍ　ｌに溶解し、この溶液に、０℃水
冷下、トリエチルアミン０．２１ｍ１とジシクロへキシ
ルカーポジイミド０．３１　ｇ　（１，５ｍ＋５ｏｌ）
を加え次いし、１＃、液を濃縮乾固した後、残渣を酢酸
エチルに溶解した。この溶液を、１０％クエン酸水溶液
、水、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで水で充分
に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥した。無水硫
酸ナトリウムを濾別後、濾液を減圧濃縮し、残渣を酢酸
エチルで結晶化した。

この結晶（ＢｏＣ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａ　ｌ　−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ）を、メタノール２４ｍ１．ジオキサ
ン１２ｍ１およびｌＮＮａＯＨ２ｍ１の混液に溶解し、
室温に５時間放置した後、これに水を加えてエーテルで
洗浄し、′次いで、陽イオン交換樹脂（ＡＣ；５０Ｗ−
Ｘ８）で中和した。

この溶液を減圧乾固して得られた残渣をトリフルオロ酢
酸１０ｍ１とアニソールＩ　ｍ　ｌに溶解し、室温で２
０分間放置した後、再び減圧乾固した。

ス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｌ　Ｈ２０（ｉ８出液：蒸溜
水）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、
エーテルから再結晶して目的のＨ−Ｄ　−Ｐ　ｈ　ｅ−
Ｖａ　Ｉ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨを針状結晶として得た
〔収Ｉｔ０．０３９６　ｇ　　（０，０９ｍｍｏｌ）　
）　。

こ＼に得られたペプチドの物性値ならびに分析結果は以
下の通りであった。

■融点　　　１４８〜１５０℃ ◎比旋光度　〔α）ｏ”１９ビ　（Ｃ＝０．１゜Ｈｇ　
Ｏ） ◎元素分析　（ＣｇｚＨｚｚＮ４０ｓとして）理論値　
Ｃｊ　６１．０９．　Ｈ：　７．４６．　Ｎ　：　１２
．９５実測値　ｃ　：　６１．０７．　Ｈ：　７．３１
．　Ｎ　：　１２．３９◎アミノ酸分析（６ＮＨＣ１に
て２４時間加水分解） Ａ　Ｉ　ａ　　１．ｏＯｆｌｌ、　　Ｖ　ａ　ｌ　　１
．１０＋１１゜Ｐ　ｒ　ｏ　　Ｏ，９６（１］、　　Ｐ
　ｈ　ｅ　　Ｏ，９８ｆｌｌ◎薄層クロマトグラフィー
〔シリカゲルプレート。展開液；ブタノール：酢酸：水
＝４：ｌ：に単一スポットを示した。

実施例２Ｌ−Ｐｈｅ体の合成 実施例１　（３）のＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｏｗｌに代え
てＢｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨを用いるほかは実施例１と
全く同様にしてＩｆ　−Ｌ　−Ｐ　ｈ　ｅ　−Ｖａ　Ｉ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−０１１を針状結晶として得た〔収Ｉ
ｔ０．０４１５　ｇ　（０，１ｍｍｏｌ）　］。

ここに得られたペプチドの物性値ならびに分析結果は以
下の通りであった。

■融点　　　１４２〜１４３℃ ◎比旋光度　（α）　ｏ２ｓ１２１’　　（Ｃ＝Ｏ，ｌ
。

Ｈｔ　Ｏ） ◎アミノ酸分析（６ＮＩＩＣＩにて２４時間加水分解） Ａ　Ｉ　ａ　　１．０６（１１，Ｖ　ａ　ｌ　　１．０
０（１１゜Ｐ　ｒ　ｏ　　１．０３ｆｌ）、　　Ｐ　ｈ
　ｅ　　Ｏ，９５（１１◎薄層クロマトグラフィー〔シ
リカゲルプレート。展開液；ブクノール：酢酸：水−４
：１；５の上層、ニンヒドリン発色〕でＲｆ値０．４１
同　鐘紡株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｌ−またはＤ−フェニルアラニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ア
   ラニル−Ｌ−プロリンおよびその酸付加塩。