JPH0541997A - 変性ヒトｐａｉ―２に特異的なモノクローナル抗体及びそれを使つた免疫学的ｐａｉ―２測定系 - Google Patents
変性ヒトｐａｉ―２に特異的なモノクローナル抗体及びそれを使つた免疫学的ｐａｉ―２測定系Info
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- JPH0541997A JPH0541997A JP22641591A JP22641591A JPH0541997A JP H0541997 A JPH0541997 A JP H0541997A JP 22641591 A JP22641591 A JP 22641591A JP 22641591 A JP22641591 A JP 22641591A JP H0541997 A JPH0541997 A JP H0541997A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 総合的ＰＡＩ―２が測定できる、変性ＰＡＩ
―２に特異的なモノクローナル抗体およびそれを使った
測定系の提供。 【構成】 酸またはＮａＳＣＮで変性したＰＡＩ―２に
特異的なモノクローナル抗体、およびそれを用いたサン
ドイッチＥＬＩＳＡ。
―２に特異的なモノクローナル抗体およびそれを使った
測定系の提供。 【構成】 酸またはＮａＳＣＮで変性したＰＡＩ―２に
特異的なモノクローナル抗体、およびそれを用いたサン
ドイッチＥＬＩＳＡ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、変性したヒトプラスミ
ノーゲンアクチベータインヒビタ―２（以下、変性ＰＡ
Ｉ―２と呼ぶ）を選択的に認識するモノクローナル抗
体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いた
ＰＡＩ―２の測定法に関するものであり、これにより総
括的にＰＡＩ―２を評価することを可能とするものであ
る。
ノーゲンアクチベータインヒビタ―２（以下、変性ＰＡ
Ｉ―２と呼ぶ）を選択的に認識するモノクローナル抗
体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いた
ＰＡＩ―２の測定法に関するものであり、これにより総
括的にＰＡＩ―２を評価することを可能とするものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】ヒトプラスミノーゲンアクチベータイン
ヒビタとしては、現在までに３種類が報告されている。
ヒビタとしては、現在までに３種類が報告されている。
【０００３】第１は、血液中の凝固・線溶系の因子であ
るプラスミノーゲンアクチベータインヒビタ―１（ＰＡ
Ｉ―１）である。ＰＡＩ―１は、組織型プラスミノーゲ
ンアクチベータ（ｔ―ＰＡ）およびウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ）に対するインヒビタであり、近年、ガン細胞の組織
への浸潤にも関係していることが報告された。
るプラスミノーゲンアクチベータインヒビタ―１（ＰＡ
Ｉ―１）である。ＰＡＩ―１は、組織型プラスミノーゲ
ンアクチベータ（ｔ―ＰＡ）およびウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ）に対するインヒビタであり、近年、ガン細胞の組織
への浸潤にも関係していることが報告された。
【０００４】第２は、ＰＡＩ―２であり、ＰＡＩ―１と
同様にＵＫと２本鎖ｔ―ＰＡを阻害する。詳しくは、後
で述べる。
同様にＵＫと２本鎖ｔ―ＰＡを阻害する。詳しくは、後
で述べる。
【０００５】第３は、プラスミノーゲンアクチベータイ
ンヒビタ―３（ＰＡＩ―３）である。ＰＡＩ―３は、す
でにプロテインＣインヒビタ（ＰＣＩ）として報告され
ているものと同一物質であった。
ンヒビタ―３（ＰＡＩ―３）である。ＰＡＩ―３は、す
でにプロテインＣインヒビタ（ＰＣＩ）として報告され
ているものと同一物質であった。
【０００６】ＰＡＩ―２は、妊婦の血漿・胎盤やＵ９３
７株化細胞の培養上清において検出されており、分子量
は糖鎖をもつ６０，０００のものと、糖鎖のない４８，
０００の２つがある。両者ともプラスミノーゲンアクチ
ベータの阻害活性を有しており、アクチベータと複合体
を形成する。また、ＰＡＩ―２のｃＤＮＡ、ｇｅｎｏｍ
ｉｃＤＮＡも解析されている。
７株化細胞の培養上清において検出されており、分子量
は糖鎖をもつ６０，０００のものと、糖鎖のない４８，
０００の２つがある。両者ともプラスミノーゲンアクチ
ベータの阻害活性を有しており、アクチベータと複合体
を形成する。また、ＰＡＩ―２のｃＤＮＡ、ｇｅｎｏｍ
ｉｃＤＮＡも解析されている。
【０００７】しかし、ＰＡＩ―２はヒト体内中での主な
作用についてはまだ確定していない。この原因として、
体内での存在形態がはっきりしていないことがあげられ
ると思われる。Tze-Chein Wun et. al. ［Tze-Chein Wu
n and E. Reich, T.B.C., ２６２，No. ８，pp３６４６
−３６５３（１９８７）］によれば、ＰＡＩ―２を含む
胎盤抽出溶液をゲル濾過後、ＵＫとの複合体形成により
ＰＡＩ―２の分子量分布を調べると、分子量１０4 〜１
０5 までの範囲に広く分布していた。また、一部のＰＡ
Ｉ―２は、ヴィトロネクチン（Vitronectin ）との複合
体として体内に存在しているとの報告もある［Klaus-P.
Radtke et. al., Boil. Chem. Hoppe-Seyler, ３７１，
pp１１１９−１１２７，（１９９０）］。これらの事実
よりＰＡＩ―２は、体内で多様な形態で存在している可
能性がある。
作用についてはまだ確定していない。この原因として、
体内での存在形態がはっきりしていないことがあげられ
ると思われる。Tze-Chein Wun et. al. ［Tze-Chein Wu
n and E. Reich, T.B.C., ２６２，No. ８，pp３６４６
−３６５３（１９８７）］によれば、ＰＡＩ―２を含む
胎盤抽出溶液をゲル濾過後、ＵＫとの複合体形成により
ＰＡＩ―２の分子量分布を調べると、分子量１０4 〜１
０5 までの範囲に広く分布していた。また、一部のＰＡ
Ｉ―２は、ヴィトロネクチン（Vitronectin ）との複合
体として体内に存在しているとの報告もある［Klaus-P.
Radtke et. al., Boil. Chem. Hoppe-Seyler, ３７１，
pp１１１９−１１２７，（１９９０）］。これらの事実
よりＰＡＩ―２は、体内で多様な形態で存在している可
能性がある。
【０００８】ＰＡＩ―２に対するモノクローナル抗体と
ＰＡＩ―２測定キットについては、Biopool-Interhaema
tol Inc.により市販されているものが有名である。この
抗体は、分子量４８，０００と６０，０００のＰＡＩ―
２両者と反応し、ＰＡＩ―２測定キットも、この両者の
濃度を測定している。しかし、体内で多様な存在形態を
している可能性のある全てのＰＡＩ―２を測定している
かは定かでない。
ＰＡＩ―２測定キットについては、Biopool-Interhaema
tol Inc.により市販されているものが有名である。この
抗体は、分子量４８，０００と６０，０００のＰＡＩ―
２両者と反応し、ＰＡＩ―２測定キットも、この両者の
濃度を測定している。しかし、体内で多様な存在形態を
している可能性のある全てのＰＡＩ―２を測定している
かは定かでない。
【０００９】この多様な存在形態をしている可能性のあ
る全てのＰＡＩ―２を全て等しく測定できれば、基礎医
学・臨床医学の領域において非常に重要な意味を持つと
考えられる。
る全てのＰＡＩ―２を全て等しく測定できれば、基礎医
学・臨床医学の領域において非常に重要な意味を持つと
考えられる。
【００１０】
【発明の目的】本発明者は、変性剤でＰＡＩ―２を処理
することでその存在形態が一様化する可能性があること
［Tze-Chein Wun et. al., J.B.C.,２６２，No. ８，pp
３６４６−３６５３（１９８７）］に着目し、変性ＰＡ
Ｉ―２を免疫学的に測定できる系を創作する目的で研究
を重ねた。その結果、変性ＰＡＩ―２に対するモノクロ
ーナル抗体を創製し、そのモノクローナル抗体を用いる
ことにより、ＰＡＩ―２を簡便・正確に測定できる系を
見い出し本発明を完成するに至った。
することでその存在形態が一様化する可能性があること
［Tze-Chein Wun et. al., J.B.C.,２６２，No. ８，pp
３６４６−３６５３（１９８７）］に着目し、変性ＰＡ
Ｉ―２を免疫学的に測定できる系を創作する目的で研究
を重ねた。その結果、変性ＰＡＩ―２に対するモノクロ
ーナル抗体を創製し、そのモノクローナル抗体を用いる
ことにより、ＰＡＩ―２を簡便・正確に測定できる系を
見い出し本発明を完成するに至った。
【００１１】
【発明の構成】すなわち、本発明は、酸またはＮａＳＣ
Ｎで変性されたヒトＰＡＩ―２すなわち変性ＰＡＩ―２
に対して結合するモノクローナル抗体、該抗体を産生す
るハイブリドーマおよび該抗体を標識抗体および不溶性
担体結合抗体の少なくとも、いずれか一方に用いたＰＡ
Ｉ―２のサンドイッチ法免疫学的測定キットである。
Ｎで変性されたヒトＰＡＩ―２すなわち変性ＰＡＩ―２
に対して結合するモノクローナル抗体、該抗体を産生す
るハイブリドーマおよび該抗体を標識抗体および不溶性
担体結合抗体の少なくとも、いずれか一方に用いたＰＡ
Ｉ―２のサンドイッチ法免疫学的測定キットである。
【００１２】以下、本発明のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマの製造法についてさらに詳しく述べ
る。
するハイブリドーマの製造法についてさらに詳しく述べ
る。
【００１３】（Ａ）抗原の単離・精製 抗原およびスクリーニングに用いる変性ＰＡＩ―２は、
Tze-Chein Wun らの方法を修飾して、ヒト胎盤より精製
した。まず、ヒト胎盤を洗浄した後、生理食塩水を加
え、ブレンダーで粉砕した。これを、２７，０００×ｇ
で４５分間遠心した。その上清に、終濃度７０％になる
ように硫酸アンモニウムを加え、４℃で２時間かき混ぜ
た。その後１６，３００×ｇで６０分間遠心した。その
沈殿物を１０ｍＭ ＮａＰＯ4 （ｐＨ６．８）に溶解
し、同一バッファーに対して十分に透析して、ＣＭ−５
２イオン交換セルロースにかけた。そのカラムの素通り
に、再度、終濃度７０％になるように硫酸アンモニウム
を加え、４℃で２時間かき混ぜた。１６，３００×ｇで
６０分間遠心した後、沈殿物を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、同一バッファーに対して
十分に透析した。この溶液に、終濃度０．１Ｍになるよ
うに粉末ジチオスライトール（ＤＴＴ）を加え、３７℃
で４５分間還元処理を行った。これを、０．０５％β―
メルカプトエタノール／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）で３倍に希釈した後、遠心（３５，００
０×ｇ、６０分間）した。その上清を０．０５％β―メ
ルカプトエタノール／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ―Sepharose ＣＬ−６
Ｂにかけた後、ＮａＣｌの濃度勾配により、カラムから
ＰＡＩ―２を溶出した。このＰＡＩ―２を０．０１％
Ｔｗｅｅｎ ８０／ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に透析後、抗
ＰＡＩ―２抗体の結合したSepharose ４Ｂにかけた後、
３Ｍ ＮａＳＣＮでカラムより変性溶出した。この溶出
したＰＡＩ―２を０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０／ＴＢ
Ｓ（ｐＨ７．４）または０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０／
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に十分透析した。この透析後のＰ
ＡＩ―２を変性ＰＡＩ―２サンプルとして、マウスの免
疫やハイブリドーマのスクリーニングに使用した。
Tze-Chein Wun らの方法を修飾して、ヒト胎盤より精製
した。まず、ヒト胎盤を洗浄した後、生理食塩水を加
え、ブレンダーで粉砕した。これを、２７，０００×ｇ
で４５分間遠心した。その上清に、終濃度７０％になる
ように硫酸アンモニウムを加え、４℃で２時間かき混ぜ
た。その後１６，３００×ｇで６０分間遠心した。その
沈殿物を１０ｍＭ ＮａＰＯ4 （ｐＨ６．８）に溶解
し、同一バッファーに対して十分に透析して、ＣＭ−５
２イオン交換セルロースにかけた。そのカラムの素通り
に、再度、終濃度７０％になるように硫酸アンモニウム
を加え、４℃で２時間かき混ぜた。１６，３００×ｇで
６０分間遠心した後、沈殿物を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、同一バッファーに対して
十分に透析した。この溶液に、終濃度０．１Ｍになるよ
うに粉末ジチオスライトール（ＤＴＴ）を加え、３７℃
で４５分間還元処理を行った。これを、０．０５％β―
メルカプトエタノール／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）で３倍に希釈した後、遠心（３５，００
０×ｇ、６０分間）した。その上清を０．０５％β―メ
ルカプトエタノール／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ―Sepharose ＣＬ−６
Ｂにかけた後、ＮａＣｌの濃度勾配により、カラムから
ＰＡＩ―２を溶出した。このＰＡＩ―２を０．０１％
Ｔｗｅｅｎ ８０／ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に透析後、抗
ＰＡＩ―２抗体の結合したSepharose ４Ｂにかけた後、
３Ｍ ＮａＳＣＮでカラムより変性溶出した。この溶出
したＰＡＩ―２を０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０／ＴＢ
Ｓ（ｐＨ７．４）または０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０／
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に十分透析した。この透析後のＰ
ＡＩ―２を変性ＰＡＩ―２サンプルとして、マウスの免
疫やハイブリドーマのスクリーニングに使用した。
【００１４】（Ｂ）変性ＰＡＩ―２による哺乳動物の免
疫：免疫に使用する動物としては特に制限はなく、各種
の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウ
サギ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等を使用することがで
きるが、取扱の容易さ等の理由から一般に雌Ｂａｌｂ／
ｃマウスが用いられるが、他の系（strains ）のマウス
を使用することもできる。その際、免疫計画および免疫
に用いる変性ＰＡＩ―２の濃度は十分な量の抗原刺激を
受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきである。
例えばマウスに少量の変性ＰＡＩ―２である間隔で腹腔
に数回免疫の後、さらに数回静脈に投与して抗体力価を
上げる。より具体的には、例えばマウスに５０μｇの変
性ＰＡＩ―２を２週間間隔で腹腔に３回免疫した後、さ
らに３０μｇを静脈内に投与する。
疫：免疫に使用する動物としては特に制限はなく、各種
の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウ
サギ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等を使用することがで
きるが、取扱の容易さ等の理由から一般に雌Ｂａｌｂ／
ｃマウスが用いられるが、他の系（strains ）のマウス
を使用することもできる。その際、免疫計画および免疫
に用いる変性ＰＡＩ―２の濃度は十分な量の抗原刺激を
受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきである。
例えばマウスに少量の変性ＰＡＩ―２である間隔で腹腔
に数回免疫の後、さらに数回静脈に投与して抗体力価を
上げる。より具体的には、例えばマウスに５０μｇの変
性ＰＡＩ―２を２週間間隔で腹腔に３回免疫した後、さ
らに３０μｇを静脈内に投与する。
【００１５】最終免疫の数日後に融合のために、免疫し
た動物から抗体産生細胞、例えば、リンパ球、好ましく
は脾臓細胞を取り出す。以下、抗体産生細胞として脾臓
細胞を用いた場合について説明するが、脾臓細胞以外の
抗体産生細胞も同様に細胞融合に使用しうることを理解
すべきである。
た動物から抗体産生細胞、例えば、リンパ球、好ましく
は脾臓細胞を取り出す。以下、抗体産生細胞として脾臓
細胞を用いた場合について説明するが、脾臓細胞以外の
抗体産生細胞も同様に細胞融合に使用しうることを理解
すべきである。
【００１６】（Ｃ）細胞融合：脾臓を無菌的に取り出
し、それから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細
胞を適当な細胞ラインからの骨髄腫細胞と適当な融合促
進剤の使用下に融合媒体中で細胞融合させる。融合に用
いる骨髄腫細胞はそのような哺乳動物からのものでもよ
いが、一般には、免疫に用いた動物と同じ種の動物に由
来するものの方が好適である。融合させる時の脾臓細胞
対骨髄腫細胞の好ましい混合比率は一般に約２０：１〜
約２：１、好ましくは１０：１〜２：１の範囲である。
約１０8 個の脾臓細胞について通常、０．５〜１．５ml
の融合媒体の使用が適当である。融合媒体としては、３
０〜７０％の濃度で融合促進剤を含んだ生理食塩水、生
理食塩水緩衝溶液、無血清培地等の使用が適当である。
し、それから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細
胞を適当な細胞ラインからの骨髄腫細胞と適当な融合促
進剤の使用下に融合媒体中で細胞融合させる。融合に用
いる骨髄腫細胞はそのような哺乳動物からのものでもよ
いが、一般には、免疫に用いた動物と同じ種の動物に由
来するものの方が好適である。融合させる時の脾臓細胞
対骨髄腫細胞の好ましい混合比率は一般に約２０：１〜
約２：１、好ましくは１０：１〜２：１の範囲である。
約１０8 個の脾臓細胞について通常、０．５〜１．５ml
の融合媒体の使用が適当である。融合媒体としては、３
０〜７０％の濃度で融合促進剤を含んだ生理食塩水、生
理食塩水緩衝溶液、無血清培地等の使用が適当である。
【００１７】細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られ
ているが、後記実施例ではＰ３―Ｘ６３―Ａｇ８―Ｕ１
細胞（以下Ｐ３―Ｕ１と略記する）［Yelton, E. E. et
al., Current Topics in Microbiology and Immunolog
y,８１，１（１９７８）参照］を用いた。これは、８―
アザグアニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒポキサン
チン―グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが欠
失しており、それゆえにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミ
ノブテリン、チミジン）培地中では生存することができ
ない。また、この細胞ラインは、それ自体抗体を分泌し
ない、いわゆる非分泌型であるので、本発明が目的とす
るハイブリドーマの製造に適している。しかし、他の骨
髄腫細胞、例えばＰ３―ＮＳ１―１―Ａｇ４―１、ＮＳ
１―Ａｇ４／１、Ｐ３―Ｘ６３―Ａｇ８、（ＭＰＣ１１
―４５，６．ＴＧ１．７）、ＳＰ２／０―Ａｇ１４、Ｆ
Ｏ、Ｘ―６３―Ａｇ８―６．５．３、２１０．ＲＣＹ
３．Ａｇ１．２．３、Ｓ１９４／５ＸＸＯ．ＢＵ．１、
ＳＫＯ―００７、ＧＭ１５００６ＴＧ―Ａ１２等も使用
可能である。
ているが、後記実施例ではＰ３―Ｘ６３―Ａｇ８―Ｕ１
細胞（以下Ｐ３―Ｕ１と略記する）［Yelton, E. E. et
al., Current Topics in Microbiology and Immunolog
y,８１，１（１９７８）参照］を用いた。これは、８―
アザグアニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒポキサン
チン―グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが欠
失しており、それゆえにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミ
ノブテリン、チミジン）培地中では生存することができ
ない。また、この細胞ラインは、それ自体抗体を分泌し
ない、いわゆる非分泌型であるので、本発明が目的とす
るハイブリドーマの製造に適している。しかし、他の骨
髄腫細胞、例えばＰ３―ＮＳ１―１―Ａｇ４―１、ＮＳ
１―Ａｇ４／１、Ｐ３―Ｘ６３―Ａｇ８、（ＭＰＣ１１
―４５，６．ＴＧ１．７）、ＳＰ２／０―Ａｇ１４、Ｆ
Ｏ、Ｘ―６３―Ａｇ８―６．５．３、２１０．ＲＣＹ
３．Ａｇ１．２．３、Ｓ１９４／５ＸＸＯ．ＢＵ．１、
ＳＫＯ―００７、ＧＭ１５００６ＴＧ―Ａ１２等も使用
可能である。
【００１８】好ましい融合促進剤としては例えば平均分
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルを有利に使用できるが、この分野で知られている他の
融合促進剤、例えばセンダイウイルス等を使用すること
もできる。後記実施例では平均分子量１，５４０のポリ
エチレングリコールを用いた。
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルを有利に使用できるが、この分野で知られている他の
融合促進剤、例えばセンダイウイルス等を使用すること
もできる。後記実施例では平均分子量１，５４０のポリ
エチレングリコールを用いた。
【００１９】（Ｄ）融合した細胞の選択：別の容器内
（例えばマイクロタイタープレート）で未融合の脾臓細
胞、未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞の混合物
を、未融合の骨髄腫細胞が生存できない選択培地で希釈
し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週
間）培養する。培地は未融合の骨髄腫細胞が生存できな
いもの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用される。この選
択培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。また、未
融合の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間後
（約１週間後）死滅する。これらに対して融合した細胞
は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ
持つために選択培地中で生存できる。
（例えばマイクロタイタープレート）で未融合の脾臓細
胞、未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞の混合物
を、未融合の骨髄腫細胞が生存できない選択培地で希釈
し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週
間）培養する。培地は未融合の骨髄腫細胞が生存できな
いもの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用される。この選
択培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。また、未
融合の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間後
（約１週間後）死滅する。これらに対して融合した細胞
は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ
持つために選択培地中で生存できる。
【００２０】（Ｅ）各容器中の変性ＰＡＩ―２に対する
抗体の確認：かくしてハイブリドーマ細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、変性ＰＡＩ―２に対する抗
体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immuno Sor
bentAssay）［例えば、Schuurs, A. H. W. M. and van
Weemen, B. K.: Clin. Chim. Acta, ８１，１―４０
（１９７７）参照］により確認した。
抗体の確認：かくしてハイブリドーマ細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、変性ＰＡＩ―２に対する抗
体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immuno Sor
bentAssay）［例えば、Schuurs, A. H. W. M. and van
Weemen, B. K.: Clin. Chim. Acta, ８１，１―４０
（１９７７）参照］により確認した。
【００２１】（Ｆ）目的の変性ＰＡＩ―２に対するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローン
化：目的の抗体を産生するハイブリドーマを適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化する。
クローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローン
化：目的の抗体を産生するハイブリドーマを適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化する。
【００２２】（Ｇ）本発明のモノクローナル抗体の調
製：ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体は、
クローンをＢａｌｂ／Ｃマウス腹腔内で増殖させ、その
腹水から、Protein Ａ―Sepharose ４Ｂを用いてモノク
ローナル抗体を精製する。その精製方法は以下の通りに
行う。腹水５mlにＡバッファー（３Ｍ ＮａＣｌ／１．
５Ｍグリシン（ｐＨ８．９））を５mlまぜ、３，０００
rpm 、５分間遠心する。その上清をＡバッファーで平衡
化したProtein Ａ―Sepharose ４Ｂ（５ml）にゆっくり
とかける。その後、Ａバッファーで十分洗浄し、Ｂバッ
ファー（０．１Ｍクｒン酸（ｐＨ３．０））でモノクロ
ーナル抗体を溶出する。溶出されたモノクローナル抗体
は、すぐに３Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌでｐＨ７にした後、
１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．１５Ｍ塩化ナトリウム
（ｐＨ７．４）に十分透析して、モノクローナル抗体を
精製する。
製：ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体は、
クローンをＢａｌｂ／Ｃマウス腹腔内で増殖させ、その
腹水から、Protein Ａ―Sepharose ４Ｂを用いてモノク
ローナル抗体を精製する。その精製方法は以下の通りに
行う。腹水５mlにＡバッファー（３Ｍ ＮａＣｌ／１．
５Ｍグリシン（ｐＨ８．９））を５mlまぜ、３，０００
rpm 、５分間遠心する。その上清をＡバッファーで平衡
化したProtein Ａ―Sepharose ４Ｂ（５ml）にゆっくり
とかける。その後、Ａバッファーで十分洗浄し、Ｂバッ
ファー（０．１Ｍクｒン酸（ｐＨ３．０））でモノクロ
ーナル抗体を溶出する。溶出されたモノクローナル抗体
は、すぐに３Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌでｐＨ７にした後、
１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．１５Ｍ塩化ナトリウム
（ｐＨ７．４）に十分透析して、モノクローナル抗体を
精製する。
【００２３】本発明のモノクローナル抗体を用いれば、
いわゆる“サンドイッチ法”により、アッセイ試料中の
ＰＡＩ―２を直接かつ正確に免疫学的に定量し得ること
が可能である。
いわゆる“サンドイッチ法”により、アッセイ試料中の
ＰＡＩ―２を直接かつ正確に免疫学的に定量し得ること
が可能である。
【００２４】一般に抗原の２つの異なった部位に結合す
る抗体を使って抗原の有無またはその量を測定する方法
は、“サンドイッチ法”と呼ばれ、例えばワイド（Wid
e）の「放射線免疫検定法（Radioimunoassay Methods
）」１９９−２０６（１９７０）に記載されている。
る抗体を使って抗原の有無またはその量を測定する方法
は、“サンドイッチ法”と呼ばれ、例えばワイド（Wid
e）の「放射線免疫検定法（Radioimunoassay Methods
）」１９９−２０６（１９７０）に記載されている。
【００２５】本発明の免疫学的測定方法は、使用する２
種の抗体（一次抗体、二次抗体）として、変性ＰＡＩ―
２の異なる抗原認識部位を特異的に認識し、結合する抗
変性ＰＡＩ―２抗体を使用するものである。かくして本
発明によれば、試薬の品質差がなく、恒常的に精度よく
溶液状態の（例えば血漿中の）ＰＡＩ―２を測定するこ
とが可能となる。また、多様な存在形態をしていると思
われるＰＡＩ―２を変性剤で処理することで一様化し、
その変性ＰＡＩ―２を測定することにより、正確にかつ
短時間にＰＡＩ―２を測定し得る方法が提供される。
種の抗体（一次抗体、二次抗体）として、変性ＰＡＩ―
２の異なる抗原認識部位を特異的に認識し、結合する抗
変性ＰＡＩ―２抗体を使用するものである。かくして本
発明によれば、試薬の品質差がなく、恒常的に精度よく
溶液状態の（例えば血漿中の）ＰＡＩ―２を測定するこ
とが可能となる。また、多様な存在形態をしていると思
われるＰＡＩ―２を変性剤で処理することで一様化し、
その変性ＰＡＩ―２を測定することにより、正確にかつ
短時間にＰＡＩ―２を測定し得る方法が提供される。
【００２６】一次抗体の不溶性担体への固定はそれ自体
既知の方法で行うことができ、例えば、一次抗体溶液と
不溶性担体とを接触させ、放置することにより、物理的
に吸着させる方法、あるいは、抗体を構成するアミノ酸
のカルボキシル基、アミノ基、水酸基等の官能基と不溶
性担体とを化学的に結合させる方法により行うことがで
きる。このように一次抗体が固定された担体は、好まし
くは二次抗体または測定しようとする検体試料との非特
異的結合を避けるために適当な物質（例えば牛血清アル
ブミン）で不溶性担体の表面を被覆する。一次抗体を固
定するために使用される不溶性担体としては、例えばポ
リスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエス
テル、ポリアクリロニトリル、弗素樹脂、ニトロセルロ
ース、架橋デキストラン、ポリサッカライド、アガロー
スなどの高分子物質、また不溶性担体の形状としては、
例えばトレイ状、球状、繊維状、粒状、ビース状、棒
状、盤状、容器状、セル状、試験管状などの種々の形状
であることができ、具体的にはプラスチック容器、プラ
スチックビーズ、ガラスビーズ、金属粒子等が挙げられ
る。
既知の方法で行うことができ、例えば、一次抗体溶液と
不溶性担体とを接触させ、放置することにより、物理的
に吸着させる方法、あるいは、抗体を構成するアミノ酸
のカルボキシル基、アミノ基、水酸基等の官能基と不溶
性担体とを化学的に結合させる方法により行うことがで
きる。このように一次抗体が固定された担体は、好まし
くは二次抗体または測定しようとする検体試料との非特
異的結合を避けるために適当な物質（例えば牛血清アル
ブミン）で不溶性担体の表面を被覆する。一次抗体を固
定するために使用される不溶性担体としては、例えばポ
リスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエス
テル、ポリアクリロニトリル、弗素樹脂、ニトロセルロ
ース、架橋デキストラン、ポリサッカライド、アガロー
スなどの高分子物質、また不溶性担体の形状としては、
例えばトレイ状、球状、繊維状、粒状、ビース状、棒
状、盤状、容器状、セル状、試験管状などの種々の形状
であることができ、具体的にはプラスチック容器、プラ
スチックビーズ、ガラスビーズ、金属粒子等が挙げられ
る。
【００２７】一方、二次抗体は放射性物質、酵素または
蛍光物質で標識される。放射性物質としては例えば 125
Ｉ、 131Ｉ、14Ｃ、 3Ｈなどが挙げられ、酵素としては
例えば、アルカリ性フォスファターゼ、パーオキシダー
ゼ、β―Ｄ―ガラクトシダーゼなどが包含され、また蛍
光物質としてはフルオレッセインイソチオシアネート、
テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどを例示
することができるが、これらは単なる例示にすぎず、免
疫学的特定方法に使用されているものであれば、他の標
識物質も使用できる。これらの標識物質の二次抗体への
結合はそれ自体既知の方法、例えば、G. S. David; Bio
chem. Biophys.Res. Commun.,４８，４６４―４７１
（１９７２）、今川等、Anal. Lett.,１６，１５０９―
１５２３（１９８３）および西岡等、Cancer Res.,３
２，１６２―１６６（１９７２）などの文献に記載の方
法によって行うことができる。
蛍光物質で標識される。放射性物質としては例えば 125
Ｉ、 131Ｉ、14Ｃ、 3Ｈなどが挙げられ、酵素としては
例えば、アルカリ性フォスファターゼ、パーオキシダー
ゼ、β―Ｄ―ガラクトシダーゼなどが包含され、また蛍
光物質としてはフルオレッセインイソチオシアネート、
テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどを例示
することができるが、これらは単なる例示にすぎず、免
疫学的特定方法に使用されているものであれば、他の標
識物質も使用できる。これらの標識物質の二次抗体への
結合はそれ自体既知の方法、例えば、G. S. David; Bio
chem. Biophys.Res. Commun.,４８，４６４―４７１
（１９７２）、今川等、Anal. Lett.,１６，１５０９―
１５２３（１９８３）および西岡等、Cancer Res.,３
２，１６２―１６６（１９７２）などの文献に記載の方
法によって行うことができる。
【００２８】以上に述べた固定された一次抗体および標
識された二次抗体は、ＰＡＩ―２の測定を使用とする検
体試料と接触させる。接触の方法としては、固定された
一次抗体と検体試料とを先ず接触させ、次いで標識され
た二次抗体と接触させる２段階法、または一次抗体に検
体と二次抗体とを同時的に接触させる１段階法のいずれ
の方法を用いることもできるが、後者の１段階法の方が
短時間でかつ簡便にＰＡＩ―２を測定することができる
ので有利である。
識された二次抗体は、ＰＡＩ―２の測定を使用とする検
体試料と接触させる。接触の方法としては、固定された
一次抗体と検体試料とを先ず接触させ、次いで標識され
た二次抗体と接触させる２段階法、または一次抗体に検
体と二次抗体とを同時的に接触させる１段階法のいずれ
の方法を用いることもできるが、後者の１段階法の方が
短時間でかつ簡便にＰＡＩ―２を測定することができる
ので有利である。
【００２９】２段階法においては、先ず、固定された一
次抗体を検体試料と一定の時間および温度で接触させ反
応させる。この間に固定化一次抗体と検体試料中の変性
ＰＡＩ―２が結合する。次いで適当な洗浄液で洗った
後、標識された二次抗体を含む溶液（例えば水溶液）と
一定の時間および温度で接触させ二次抗体と反応させ
る。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上に
存在する二次抗体に標識された標識物質の量を測定す
る。かくしてその値を、既知濃度の変性ＰＡＩ―２を含
む検体試料を用いて作成した検量線と対比することによ
り、検体試料中のＰＡＩ―２の量を決定することができ
る。
次抗体を検体試料と一定の時間および温度で接触させ反
応させる。この間に固定化一次抗体と検体試料中の変性
ＰＡＩ―２が結合する。次いで適当な洗浄液で洗った
後、標識された二次抗体を含む溶液（例えば水溶液）と
一定の時間および温度で接触させ二次抗体と反応させ
る。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上に
存在する二次抗体に標識された標識物質の量を測定す
る。かくしてその値を、既知濃度の変性ＰＡＩ―２を含
む検体試料を用いて作成した検量線と対比することによ
り、検体試料中のＰＡＩ―２の量を決定することができ
る。
【００３０】また、１段階法においては、固定された一
次抗体を検体試料と標識された二次抗体と同時に、好ま
しくは、検体試料と標識された二次抗体の混合物と、一
定時間および一定温度で接触させ反応させる。次いで適
当な洗浄液で洗った後、不溶性担体上に存在する二次抗
体に標識された標識物質の量を上記と同様に測定するこ
とにより、検体試料中のＰＡＩ―２の量を決定すること
ができる。
次抗体を検体試料と標識された二次抗体と同時に、好ま
しくは、検体試料と標識された二次抗体の混合物と、一
定時間および一定温度で接触させ反応させる。次いで適
当な洗浄液で洗った後、不溶性担体上に存在する二次抗
体に標識された標識物質の量を上記と同様に測定するこ
とにより、検体試料中のＰＡＩ―２の量を決定すること
ができる。
【００３１】以上に述べた方法によれば、検体試料中の
ＰＡＩ―２を再現性をもって精度よく簡便に測定するこ
とができ、この方法で測定できる検体試料としては、ヒ
ト血漿、ヒト血清、細胞培養上清等が挙げられる。ま
た、上記の方法を実施するに際し、本発明によれば前述
した一次抗体が固定された不溶性担体と前述した標識さ
れた二次抗体とからなる試薬系が提供される。この試料
系は、能率よくかつ簡便に利用できるようにするため
に、これら抗体以外に種々の補助剤を含めてキットを形
成することができる。かかる補助剤としては、例えば固
体状の二次抗体を溶解させるための溶解剤、不溶化担体
を洗浄するために使用される洗浄剤、抗体の標識物質と
して酵素を使用した場合に酵素活性を測定するための基
質、その反応停止剤などの免疫学的測定試薬のキットと
して通常使用されるものが挙げられる。以下、例を掲げ
て本発明をさらに具体的に説明する。
ＰＡＩ―２を再現性をもって精度よく簡便に測定するこ
とができ、この方法で測定できる検体試料としては、ヒ
ト血漿、ヒト血清、細胞培養上清等が挙げられる。ま
た、上記の方法を実施するに際し、本発明によれば前述
した一次抗体が固定された不溶性担体と前述した標識さ
れた二次抗体とからなる試薬系が提供される。この試料
系は、能率よくかつ簡便に利用できるようにするため
に、これら抗体以外に種々の補助剤を含めてキットを形
成することができる。かかる補助剤としては、例えば固
体状の二次抗体を溶解させるための溶解剤、不溶化担体
を洗浄するために使用される洗浄剤、抗体の標識物質と
して酵素を使用した場合に酵素活性を測定するための基
質、その反応停止剤などの免疫学的測定試薬のキットと
して通常使用されるものが挙げられる。以下、例を掲げ
て本発明をさらに具体的に説明する。
【００３２】
【実施例１】 抗原の単離・精製 抗原およびスクリーニングに用いる変性ＰＡＩ―２は、
Tze-Chein Wun らの方法を修飾して、ヒト胎盤より精製
した。まず、ヒト胎盤を洗浄した後、生理食塩水を加
え、ブレンダーで粉砕した。これを２７，０００×ｇで
４５分間遠心した。その上清に、終濃度７０％になるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、４℃で２時間かき混ぜ
た。その後、１６，３００×ｇで６０分間遠心した。そ
の沈殿物を１０ｍＭ ＮａＰＯ4 （ｐＨ６．８）に溶解
し、同一バッファーに対して十分に透析して、ＣＭ―５
２イオン交換セルロースにかけた。そのカラムの素通り
に、再度、終濃度７０％になるように硫酸アンモニウム
を加え、４℃で２時間かき混ぜた。１６，３００×ｇで
６０分間遠心した後、沈殿物を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、同一バッファーに対して
十分透析した。この溶液に、終濃度０．１Ｍになるよう
に粉末ジチオスライトール（ＤＴＴ）を加え、３７℃で
４５分間還元処理を行った。これを０．０５％β―メル
カプトエタノール／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）で３倍に希釈した後、遠心（３５，０００×
ｇ、６０分間）した。その上清を０．０５％β―メルカ
プトエタノール／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）で平衡化したＤＥＡＥ―Sepharpse ＣＬ―６Ｂ
にかけた後、ＮａＣｌの濃度勾配により、カラムからＰ
ＡＩ―２を溶出した。このＰＡＩ―２を０．０１％ Ｔ
ｗｅｅｎ８０／ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に透析後、抗ＰＡ
Ｉ―２抗体の結合したSepharose ４Ｂにかけた後、３Ｍ
ＮａＳＣＮでカラムより変性溶出した。この溶出したＰ
ＡＩ―２を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０／ＴＢＳ（ｐＨ
７．４）または０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０／ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）に十分透析した。この透析後のＰＡＩ―２を
変性ＰＡＩ―２サンプルとして、マウスの免疫やハイブ
リドーマのスクリーニングに使用した。
Tze-Chein Wun らの方法を修飾して、ヒト胎盤より精製
した。まず、ヒト胎盤を洗浄した後、生理食塩水を加
え、ブレンダーで粉砕した。これを２７，０００×ｇで
４５分間遠心した。その上清に、終濃度７０％になるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、４℃で２時間かき混ぜ
た。その後、１６，３００×ｇで６０分間遠心した。そ
の沈殿物を１０ｍＭ ＮａＰＯ4 （ｐＨ６．８）に溶解
し、同一バッファーに対して十分に透析して、ＣＭ―５
２イオン交換セルロースにかけた。そのカラムの素通り
に、再度、終濃度７０％になるように硫酸アンモニウム
を加え、４℃で２時間かき混ぜた。１６，３００×ｇで
６０分間遠心した後、沈殿物を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、同一バッファーに対して
十分透析した。この溶液に、終濃度０．１Ｍになるよう
に粉末ジチオスライトール（ＤＴＴ）を加え、３７℃で
４５分間還元処理を行った。これを０．０５％β―メル
カプトエタノール／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）で３倍に希釈した後、遠心（３５，０００×
ｇ、６０分間）した。その上清を０．０５％β―メルカ
プトエタノール／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）で平衡化したＤＥＡＥ―Sepharpse ＣＬ―６Ｂ
にかけた後、ＮａＣｌの濃度勾配により、カラムからＰ
ＡＩ―２を溶出した。このＰＡＩ―２を０．０１％ Ｔ
ｗｅｅｎ８０／ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に透析後、抗ＰＡ
Ｉ―２抗体の結合したSepharose ４Ｂにかけた後、３Ｍ
ＮａＳＣＮでカラムより変性溶出した。この溶出したＰ
ＡＩ―２を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０／ＴＢＳ（ｐＨ
７．４）または０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０／ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）に十分透析した。この透析後のＰＡＩ―２を
変性ＰＡＩ―２サンプルとして、マウスの免疫やハイブ
リドーマのスクリーニングに使用した。
【００３３】
【実施例２】 モノクローナル抗体の取得 実施例１で精製した変性ＰＡＩ―２を雌のＢａｌｂ／Ｃ
マウス（４週齢）８匹に対して１４日間隔で５回免疫し
た。初回の免疫は０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０／ＰＢＳ
（ｐＨ７．４）に溶解した３０μｇの変性ＰＡＩ―２を
当量のフロイントの完全アジュバント（Freund's Compl
ete adjuvant）と混合し、そのエマルジョンを腹腔内に
投与した（０．５ml／head）。２〜４回目は、３０μｇ
の変性ＰＡＩ―２をフロイントの不完全アジュバント
（Freund's incomplete adjuvant）と混合し、同じく腹
腔内投与した。最終免疫は、１０μｇを０．０１％Ｔｗ
ｅｅｎ８０／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５０μｌに溶解
しマウス尾静脈から投与した。最終免疫の４日後に免疫
したマウスの脾臓細胞を調製し、細胞融合に用いた。
マウス（４週齢）８匹に対して１４日間隔で５回免疫し
た。初回の免疫は０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０／ＰＢＳ
（ｐＨ７．４）に溶解した３０μｇの変性ＰＡＩ―２を
当量のフロイントの完全アジュバント（Freund's Compl
ete adjuvant）と混合し、そのエマルジョンを腹腔内に
投与した（０．５ml／head）。２〜４回目は、３０μｇ
の変性ＰＡＩ―２をフロイントの不完全アジュバント
（Freund's incomplete adjuvant）と混合し、同じく腹
腔内投与した。最終免疫は、１０μｇを０．０１％Ｔｗ
ｅｅｎ８０／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５０μｌに溶解
しマウス尾静脈から投与した。最終免疫の４日後に免疫
したマウスの脾臓細胞を調製し、細胞融合に用いた。
【００３４】免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウス
の骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）を約２：１〜約１５：１の割
合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５４０を
融合促進剤としてKohlerとMilsteinの方法に従い細胞融
合を行った。融合後の細胞は、１×１０6 cell／mlの細
胞濃度となるように１０％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ―１６４０
培地に懸濁し、９６wells マイクロプレートに１ウエル
当り１００μｌずつ分注した。
の骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）を約２：１〜約１５：１の割
合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５４０を
融合促進剤としてKohlerとMilsteinの方法に従い細胞融
合を行った。融合後の細胞は、１×１０6 cell／mlの細
胞濃度となるように１０％ＦＣＳ・ＲＰＭＩ―１６４０
培地に懸濁し、９６wells マイクロプレートに１ウエル
当り１００μｌずつ分注した。
【００３５】融合細胞は、ＣＯ2 インキュベーター（５
％ＣＯ2，３７℃）中で培養し、ヒポキサンチン；アミ
ノプテリン；チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培地
交換を行い、ＨＡＴ培地中で増殖させて、脾臓細胞と、
骨髄腫細胞からなるハイブリドーマのスクリーニングを
行った。
％ＣＯ2，３７℃）中で培養し、ヒポキサンチン；アミ
ノプテリン；チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培地
交換を行い、ＨＡＴ培地中で増殖させて、脾臓細胞と、
骨髄腫細胞からなるハイブリドーマのスクリーニングを
行った。
【００３６】ハイブリドーマの培養上清中の抗体の検出
は、変性ＰＡＩ―２をコーティングしたマイクロタイタ
ープレートを用い、二重抗体法によるＥＬＩＳＡにより
行った。第２抗体には、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（以下ＨＲＰと略す）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用
いた。
は、変性ＰＡＩ―２をコーティングしたマイクロタイタ
ープレートを用い、二重抗体法によるＥＬＩＳＡにより
行った。第２抗体には、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（以下ＨＲＰと略す）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用
いた。
【００３７】この方法で陽性を示したウエルのハイブリ
ドーマについて限界希釈法によるクローニングを２回繰
り返して行い、４個のクローンを得た。このクローンか
ら産生されるモノクローナル抗体を、ＪＴＩ２―１，Ｊ
ＴＩ２―７，ＪＴＩ２―１６，ＪＴＩ２―２２と命名し
た。
ドーマについて限界希釈法によるクローニングを２回繰
り返して行い、４個のクローンを得た。このクローンか
ら産生されるモノクローナル抗体を、ＪＴＩ２―１，Ｊ
ＴＩ２―７，ＪＴＩ２―１６，ＪＴＩ２―２２と命名し
た。
【００３８】得られたクローンは、９０％ＦＣＳ―１０
％ＤＭＳＯに懸濁させ液体窒素中保存した。クローンの
産生するモノクローナル抗体は、クローンをＢａｌｂ／
Ｃマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロテインＡ
―Sepharose ４Ｂカラムを用いて精製した。
％ＤＭＳＯに懸濁させ液体窒素中保存した。クローンの
産生するモノクローナル抗体は、クローンをＢａｌｂ／
Ｃマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロテインＡ
―Sepharose ４Ｂカラムを用いて精製した。
【００３９】
【実施例３】 モノクローナル抗体の免疫グロブリンク
ラス ４種のモノクローナル抗体（ＪＴＩ２―１，ＪＴＩ２―
７，ＪＴＩ２―１６，ＪＴＩ２―２２）の免疫グロブリ
ンクラスを、マウスモノクローナルタイピングキット
（The BINDING SITE Ltd. ）で決定した。結果は表１に
示した。
ラス ４種のモノクローナル抗体（ＪＴＩ２―１，ＪＴＩ２―
７，ＪＴＩ２―１６，ＪＴＩ２―２２）の免疫グロブリ
ンクラスを、マウスモノクローナルタイピングキット
（The BINDING SITE Ltd. ）で決定した。結果は表１に
示した。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【実施例４】 変性ＰＡＩ―２との結合能 得られた４種のモノクローナル抗体の変性ＰＡＩ―２へ
の結合能を、抗原固定化エンザイムイムノアッセイ法を
用いて検定した。
の結合能を、抗原固定化エンザイムイムノアッセイ法を
用いて検定した。
【００４２】変性ＰＡＩ―２を１μｇ／mlに０．１５Ｍ
ＮａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）で希釈し、ポリスチレンプラスチックウエルに１０
０μｌ／wellで加え、４℃で一晩静置してコーティング
した。ＰＡＩ―２溶液をすて、１％牛血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略す）／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１７０μｌ／
wellで加え、３７℃で２時間静置してブロッキングし
た。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％Ｎａ
Ｃｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４））１
７０μｌ／wellで３回洗浄した後、抗体（ＪＴＩ２―
１，ＪＴＩ２―７，ＪＴＩ２―１６，ＪＴＩ２―２２）
を、２５０ng／ml〜１，０００ng／mlに０．１％ＢＳＡ
／洗浄液で希釈し１００μｌ／wellで加え、３７℃で２
時間反応させた。洗浄液で３回洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ
抗マウスＩｇＧ抗体を１００μｌ／wellで加え、３７℃
で時間反応させた。洗浄液で４回洗浄後、ペルオキシダ
ーゼ基質溶液を加え、室温で３０分間反応し、４１５ｎ
ｍの吸光度を測定した。結果を図１に示した。
ＮａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）で希釈し、ポリスチレンプラスチックウエルに１０
０μｌ／wellで加え、４℃で一晩静置してコーティング
した。ＰＡＩ―２溶液をすて、１％牛血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略す）／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１７０μｌ／
wellで加え、３７℃で２時間静置してブロッキングし
た。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％Ｎａ
Ｃｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４））１
７０μｌ／wellで３回洗浄した後、抗体（ＪＴＩ２―
１，ＪＴＩ２―７，ＪＴＩ２―１６，ＪＴＩ２―２２）
を、２５０ng／ml〜１，０００ng／mlに０．１％ＢＳＡ
／洗浄液で希釈し１００μｌ／wellで加え、３７℃で２
時間反応させた。洗浄液で３回洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ
抗マウスＩｇＧ抗体を１００μｌ／wellで加え、３７℃
で時間反応させた。洗浄液で４回洗浄後、ペルオキシダ
ーゼ基質溶液を加え、室温で３０分間反応し、４１５ｎ
ｍの吸光度を測定した。結果を図１に示した。
【００４３】図１より、４種のモノクローナル抗体は、
抗体濃度に比例して、変性ＰＡＩ―２との結合量も増加
していた。このことより、結合力の強弱はあるものの、
４種のモノクローナル抗体は、変性ＰＡＩ―２に結合し
た。
抗体濃度に比例して、変性ＰＡＩ―２との結合量も増加
していた。このことより、結合力の強弱はあるものの、
４種のモノクローナル抗体は、変性ＰＡＩ―２に結合し
た。
【００４４】
【実施例５】 ＰＡＩ―２の変性操作と変性ＰＡＩ―２
測定系 今回得られた変性ＰＡＩ―２に対するモノクローナル抗
体を使った免疫学的測定系に、未変性および変性ＰＡＩ
―２をかけ、測定できるかを確めた。
測定系 今回得られた変性ＰＡＩ―２に対するモノクローナル抗
体を使った免疫学的測定系に、未変性および変性ＰＡＩ
―２をかけ、測定できるかを確めた。
【００４５】変性ＰＡＩ―２測定系としては、１次抗体
としてＪＴＩ２―２２、二次抗体としてＪＴＩ２―７を
使った。また、未変性ＰＡＩ―２サンプルとしては、Ｐ
ＡＩ―２を産生するＵ９３７株化細胞の培養上清（約２
００〜３００ng／mlＰＡＩ―２を含有）を使用した。
としてＪＴＩ２―２２、二次抗体としてＪＴＩ２―７を
使った。また、未変性ＰＡＩ―２サンプルとしては、Ｐ
ＡＩ―２を産生するＵ９３７株化細胞の培養上清（約２
００〜３００ng／mlＰＡＩ―２を含有）を使用した。
【００４６】ＰＡＩ―２の変性操作としては、免疫学的
測定系に影響が少なく、操作性の簡単な次の２つの方法
を使った。
測定系に影響が少なく、操作性の簡単な次の２つの方法
を使った。
【００４７】第１の方法は、ＮａＳＣＮを使った。１０
０μｌ未変性ＰＡＩ―２サンプルに終濃度１Ｍになるよ
うにＮａＳＣＮを加え、３７℃で３０分間変性させた。
その後、４００μｌにして、ＰＡＩ―２測定系にのせ
た。
０μｌ未変性ＰＡＩ―２サンプルに終濃度１Ｍになるよ
うにＮａＳＣＮを加え、３７℃で３０分間変性させた。
その後、４００μｌにして、ＰＡＩ―２測定系にのせ
た。
【００４８】第２の方法は、酸を使った。１００μｌ未
変性ＰＡＩ―２サンプルに１００μｌの０．１Ｍ ＨＣ
ｌを加え、４℃で３０分間変性させた。それに１００μ
ｌ、０．１Ｍ ＮａＯＨと１００μｌ、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ／１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を加
え、中和した後ＰＡＩ―２測定系にのせた。
変性ＰＡＩ―２サンプルに１００μｌの０．１Ｍ ＨＣ
ｌを加え、４℃で３０分間変性させた。それに１００μ
ｌ、０．１Ｍ ＮａＯＨと１００μｌ、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ／１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を加
え、中和した後ＰＡＩ―２測定系にのせた。
【００４９】このように変性させたＰＡＩ―２サンプル
を、下記の方法で測定系にのせた。
を、下記の方法で測定系にのせた。
【００５０】１次抗体ＪＴＩ２―２２を、０．１Ｍ Ｎ
ａＨＣＯ3 （ｐＨ９．５）で１０μｇ／mlに希釈し、９
６well immunoplateに１００μｌ／wellでのせ、４℃で
一晩静置してコーティングした。抗体溶液をすて、１％
ＢＳＡ／０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ９．５）を１７
０μｌ／wellでのせ、３７℃，２時間静置してブロッキ
ングした。その後、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
／０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ７．４））１７０μｌ／wellで３回洗浄する。こ
こに、未変性および変性ＰＡＩ―２を４倍、８倍、１６
倍希釈して、１００μｌ／wellでのせ、３７℃で２時間
反応させた。その後、洗浄液１７０μｌ／wellで３回洗
浄した。２次抗体ＨＲＰ標識化ＪＴＩ２―７を、０．１
％ＢＳＡと５００Ｕ／mlトラシロールを加えた洗浄液で
希釈し、１００μｌ／wellでのせ３７℃，２時間反応さ
せた。洗浄液１７０μｌ／wellで４回洗浄後、ＨＲＰの
発色基質液を１００μｌ／wellでのせ、室温で１時間発
色後、４１５ｎｍの吸光度を測定した。結果は図２に示
す。
ａＨＣＯ3 （ｐＨ９．５）で１０μｇ／mlに希釈し、９
６well immunoplateに１００μｌ／wellでのせ、４℃で
一晩静置してコーティングした。抗体溶液をすて、１％
ＢＳＡ／０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ９．５）を１７
０μｌ／wellでのせ、３７℃，２時間静置してブロッキ
ングした。その後、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
／０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ７．４））１７０μｌ／wellで３回洗浄する。こ
こに、未変性および変性ＰＡＩ―２を４倍、８倍、１６
倍希釈して、１００μｌ／wellでのせ、３７℃で２時間
反応させた。その後、洗浄液１７０μｌ／wellで３回洗
浄した。２次抗体ＨＲＰ標識化ＪＴＩ２―７を、０．１
％ＢＳＡと５００Ｕ／mlトラシロールを加えた洗浄液で
希釈し、１００μｌ／wellでのせ３７℃，２時間反応さ
せた。洗浄液１７０μｌ／wellで４回洗浄後、ＨＲＰの
発色基質液を１００μｌ／wellでのせ、室温で１時間発
色後、４１５ｎｍの吸光度を測定した。結果は図２に示
す。
【００５１】このグラフより、上記の変性ＰＡＩ―２測
定系は、未変性ＰＡＩ―２をほとんど測定せず、酸また
はＮａＳＣＮで変性したＰＡＩ―２に特異的に反応し
た。また、ＮａＳＣＮ処理より、酸処理のほうが感度が
上がることが判った。
定系は、未変性ＰＡＩ―２をほとんど測定せず、酸また
はＮａＳＣＮで変性したＰＡＩ―２に特異的に反応し
た。また、ＮａＳＣＮ処理より、酸処理のほうが感度が
上がることが判った。
【００５２】
【実施例６】 Bio pool社，ＰＡＩ―２測定キットとの
比較 本特許記載のＰＡＩ―２測定系と市販されているBio po
ol社のＰＡＩ―２測定キット（“Tint Elize”（商標）
ＰＡＩ―２）との比較を、ＰＡＩ―２を含んでいる妊婦
の母体血（２４検体）について行った。
比較 本特許記載のＰＡＩ―２測定系と市販されているBio po
ol社のＰＡＩ―２測定キット（“Tint Elize”（商標）
ＰＡＩ―２）との比較を、ＰＡＩ―２を含んでいる妊婦
の母体血（２４検体）について行った。
【００５３】本特許記載のＰＡＩ―２測定系は次のよう
に行った。
に行った。
【００５４】１次抗体ＪＴＩ２―２２を、０．１Ｍ Ｎ
ａＨＣＯ3 （ｐＨ９．５）で１０μｇ／mlに希釈し、９
６wellイムノプレートに１００μｌ／wellでのせ、４℃
で一晩静置してコーティングした。抗体溶液をすて、１
％ＢＳＡ／０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ９．５）を１
７０μｌ／wellでのせ、３７℃，２時間静置してブロッ
キングした。その後、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０／０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ７．４））１７０μｌ／wellで３回洗浄する。そ
こに検体サンプルおよび検量線用ＰＡＩ―２を酸処理し
て１００μｌ／wellでのせた。ただし、酸処理はエンザ
イムイムノアッセイの直前に次のように行った。サンプ
ル１００μｌまたはＰＡＩ―２貧血清に検量線用ＰＡＩ
―２を終濃度０，５０，１００，２００，４００，８０
０ng／mlで加えたもの１００μｌに、１００μｌ、０．
１Ｍ ＨＣｌを加え、よく混ぜた後４℃で３０分間変性
させる。その後、１００μｌ、０．１Ｍ ＮａＯＨと１
００μｌ、０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
８）を加え中和し、測定サンプルとした。このサンプル
をプレートにのせた後、３７℃で２時間反応させた。そ
の後、洗浄液１７０μｌ／wellで３回洗浄した。２次抗
体ＨＲＰ標識化ＪＴＩ２―７を、０．１％ＢＳＡと５０
０Ｕ／mlトラシロールを加えた洗浄液で希釈し、１００
μｌ／wellでのせ３７℃，２時間反応させた。洗浄液１
７０μｌ／wellで４回洗浄後、ＨＲＰの発色基質液を１
００μｌ／wellでのせ、室温で１時間発色後、４１５ｎ
ｍの吸光度を測定した。その検量線用ＰＡＩ―２サンプ
ルの吸光度より、検量線を描き、その検量線より検体中
のＰＡＩ―２量を算定した。
ａＨＣＯ3 （ｐＨ９．５）で１０μｇ／mlに希釈し、９
６wellイムノプレートに１００μｌ／wellでのせ、４℃
で一晩静置してコーティングした。抗体溶液をすて、１
％ＢＳＡ／０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ９．５）を１
７０μｌ／wellでのせ、３７℃，２時間静置してブロッ
キングした。その後、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０／０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ７．４））１７０μｌ／wellで３回洗浄する。そ
こに検体サンプルおよび検量線用ＰＡＩ―２を酸処理し
て１００μｌ／wellでのせた。ただし、酸処理はエンザ
イムイムノアッセイの直前に次のように行った。サンプ
ル１００μｌまたはＰＡＩ―２貧血清に検量線用ＰＡＩ
―２を終濃度０，５０，１００，２００，４００，８０
０ng／mlで加えたもの１００μｌに、１００μｌ、０．
１Ｍ ＨＣｌを加え、よく混ぜた後４℃で３０分間変性
させる。その後、１００μｌ、０．１Ｍ ＮａＯＨと１
００μｌ、０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
８）を加え中和し、測定サンプルとした。このサンプル
をプレートにのせた後、３７℃で２時間反応させた。そ
の後、洗浄液１７０μｌ／wellで３回洗浄した。２次抗
体ＨＲＰ標識化ＪＴＩ２―７を、０．１％ＢＳＡと５０
０Ｕ／mlトラシロールを加えた洗浄液で希釈し、１００
μｌ／wellでのせ３７℃，２時間反応させた。洗浄液１
７０μｌ／wellで４回洗浄後、ＨＲＰの発色基質液を１
００μｌ／wellでのせ、室温で１時間発色後、４１５ｎ
ｍの吸光度を測定した。その検量線用ＰＡＩ―２サンプ
ルの吸光度より、検量線を描き、その検量線より検体中
のＰＡＩ―２量を算定した。
【００５５】また、Bio pool社のＰＡＩ―２測定キット
TintElize，ＰＡＩ―２にも、同一の検体をかけた。た
だし、この場合の検体は酸処理等の変性操作は行ってい
ない。
TintElize，ＰＡＩ―２にも、同一の検体をかけた。た
だし、この場合の検体は酸処理等の変性操作は行ってい
ない。
【００５６】この両ＰＡＩ―２測定系より得られたＰＡ
Ｉ―２値の相関関係を図３に示す。
Ｉ―２値の相関関係を図３に示す。
【００５７】この図において、両測定系が同一のＰＡＩ
―２濃度を示した場合、点は図中に示した直線上にく
る。しかし、全ての点はこの直線より下に存在すること
より、本特許記載のＰＡＩ―２測定系は、Bio pool社の
キットより高濃度のＰＡＩ―２を検出した。これより、
本測定は、Bio pool社キットが測定不可能な形態をした
ＰＡＩ―２をも測定していると考えられた。
―２濃度を示した場合、点は図中に示した直線上にく
る。しかし、全ての点はこの直線より下に存在すること
より、本特許記載のＰＡＩ―２測定系は、Bio pool社の
キットより高濃度のＰＡＩ―２を検出した。これより、
本測定は、Bio pool社キットが測定不可能な形態をした
ＰＡＩ―２をも測定していると考えられた。
【図１】本発明の抗体の、変性ＰＡＩ―２への結合特性
を示す図である。
を示す図である。
【図２】本発明の測定キットを用いた、変性ＰＡＩ―２
と未変性ＰＡＩ―２の測定結果を示す図である。
と未変性ＰＡＩ―２の測定結果を示す図である。
【図３】本発明の測定キットと従来の測定キットとの差
を示す図である。
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒトプラスミノーゲンアクチベータイン
ヒビタ―２（ＰＡＩ―２）を酸またはＮａＳＣＮで変性
させることにより得られる変性ＰＡＩ―２を特異的に認
識し、未変性なＰＡＩ―２は認識しないモノクローナル
抗体。 - 【請求項２】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ。 - 【請求項３】 サンドイッチ法による免疫学的測定キッ
トにおいて、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体との
いずれか一方が請求項１記載のモノクローナル抗体の一
種であることを特徴とするヒトプラスミノーゲンアクチ
ベータインヒビタ―２の免疫学的測定のためのキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22641591A JPH0541997A (ja) | 1991-08-13 | 1991-08-13 | 変性ヒトｐａｉ―２に特異的なモノクローナル抗体及びそれを使つた免疫学的ｐａｉ―２測定系 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22641591A JPH0541997A (ja) | 1991-08-13 | 1991-08-13 | 変性ヒトｐａｉ―２に特異的なモノクローナル抗体及びそれを使つた免疫学的ｐａｉ―２測定系 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0541997A true JPH0541997A (ja) | 1993-02-23 |
Family
ID=16844766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22641591A Pending JPH0541997A (ja) | 1991-08-13 | 1991-08-13 | 変性ヒトｐａｉ―２に特異的なモノクローナル抗体及びそれを使つた免疫学的ｐａｉ―２測定系 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0541997A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000097939A (ja) * | 1998-07-22 | 2000-04-07 | Santen Pharmaceut Co Ltd | 検査方法及び診断キット |
-
1991
- 1991-08-13 JP JP22641591A patent/JPH0541997A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000097939A (ja) * | 1998-07-22 | 2000-04-07 | Santen Pharmaceut Co Ltd | 検査方法及び診断キット |
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