JPH05344895A - メタノールおよび／またはグリセロール添加により誘導可能なプロモーターを有する新規ベクター - Google Patents

メタノールおよび／またはグリセロール添加により誘導可能なプロモーターを有する新規ベクター

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JPH05344895A
JPH05344895A JP5038035A JP3803593A JPH05344895A JP H05344895 A JPH05344895 A JP H05344895A JP 5038035 A JP5038035 A JP 5038035A JP 3803593 A JP3803593 A JP 3803593A JP H05344895 A JPH05344895 A JP H05344895A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、メタノール酵母のアルコールオキ
シダーゼ遺伝子を利用した、メタノールおよび／または
グリセロールによって誘導される発現ベクター、および
当該発現ベクターを含有し、異種遺伝子発現産物を著量
蓄積する形質転換細胞、および当該細胞を利用した有用
酵素等の製造法に関する。 【構成】 メタノール酵母が含有するアルコールオキシ
ダーゼ遺伝子由来のプロモーターおよびターミネーター
を利用した発現カセットおよびベクターを構築し、さら
に、本発現ベクターを用いて、有用産物であるアデニル
酸キナーゼ、チトクロームＣおよびペルオキシダーゼを
著量生産する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、メタノールおよび／ま
たはグリセロールの添加により誘導可能であるアルコー
ルオキシダーゼ遺伝子に係るプロモーターの下流に目的
の異種遺伝子が結合し、さらにその下流にアルコールオ
キシダーゼ遺伝子に係るターミネーターが結合した塩基
配列を有する発現ベクターに関する。更に本発明は、当
該発現ベクターを含有する形質転換細胞、および当該細
胞を利用した有用生産物、とりわけアデニル酸キナー
ゼ、チトクロームＣおよびペルオキシダーゼの製造法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】メタノール酵母は、メタノールを唯一の
炭素源として生育する酵母の一群であるが、菌体収率も
高いことから、ホルムアルデヒドなどのアルデヒド類、
メチルケトン、ギ酸などの合成化学工業原料の製造に用
いられてきた。また、菌体そのものを蛋白質源として利
用することや、菌体成分である、アミノ酸、ビタミン等
の生産に利用することも研究され、実用化されているも
のもある。
【０００３】メタノール酵母におけるメタノール代謝系
は、メタノールと酸素からホルムアルデヒドと過酸化水
素を生成するアルコールオキシダーゼによる酸化反応が
第１のステップであり、生成したホルムアルデヒドは異
化されてエネルギー源となり、また資化されて菌体構成
成分となる。アルコールオキシダーゼはメタノールによ
って誘導生産され、過酸化水素を分解するカタラーゼと
共にパーオキシゾームと呼ばれる細胞内小器官を形成
し、メタノールの酸化反応を効率的に行う。従って、メ
タノール酵母をメタノール存在下に培養すると、アルコ
ールオキシダーゼが著量生産され、その生産量は菌体内
可溶性蛋白質の約 40% にも達する。アルコールオキシ
ダーゼおよびカタラーゼの供給源として、メタノール酵
母はその高活性あるいは培養の簡便さの点から有用であ
る。アルコールオキシダーゼは、アルコール定量用の生
化学試薬およびエタノール消毒の際に殺菌力を強める目
的で利用され、またカタラーゼは食品の殺菌を目的に使
用された過酸化水素の分解除去に利用されている。
【０００４】一方、アデニル酸キナーゼはアデニル酸
（AMP）とアデノシン三リン酸（ATP）から２分子のアデ
ノシン二リン酸（ADP）を生成する酵素で、メタノール
酵母における ATP の生産において律速段階となる反応
の酵素である（タニ(Tani, T.)、p253 in "Biology of
Methylotrophs", Bufferworth Heinemann, (1991)）。
アデニル酸キナーゼは AMP の定量などの分析に利用さ
れ、また ATP は生化学試薬だけでなく、種々の酵素に
よる生体内化合物の合成における、エネルギー源として
重要である。すなわち微生物の培養液あるいは培養した
菌体を用いて、ATPを安価に大量生産できれば、ATP を
必要とする様々な酵素反応において、安価にその生成物
を得ることができる。
【０００５】また、チトクローム C552 は好熱性水素細
菌の電子伝達系において重要な働きをしているヘム蛋白
質で、他起源のチトクロームＣに比較して、熱に対して
非常に安定であるという特徴がある。近年、チトクロー
ムＣを電子素子の材料に利用することが期待され、様々
な研究開発が行われているが、チトクローム C552 は耐
熱性の点で優れた伝達素子材料になる可能性がある。し
かしながら、従来の大腸菌を宿主として用いた生産法で
は、嫌気性条件下でしかチトクローム C552 遺伝子が発
現されないため、生産性が低いという問題点があった。
【０００６】ペルオキシダーゼは、過酸化水素水の存在
下で種々の化合物を酸化する酵素であり、近年臨床診断
用試薬として、グルコース、コレステロール、リン脂質
および尿素の定量に種々のオキシダーゼと共に使用され
ている。また、酵素免疫反応法の標識酵素としても利用
されている。とりわけ、糸状菌アルスロマイセス・ラモ
サス(Arthromyces ramosus)が生産する分泌型のペルオ
キシダーゼ(ARP)は、化学発光剤を用いる系での化学発
光触媒能が従来知られていたペルオキシダーゼに比べて
著しく優れている(特開昭62-219398)。しかしながら、
該酵素の生産菌の生育が遅く、酵素の生産コストが高い
という問題点があった。
【０００７】前述の如く、メタノール酵母は安価な培地
で大量の菌体を容易に生産できるので、有用物質や有用
酵素の工業的な生産に好適な微生物である。しかしなが
ら、メタノール酵母による有用物質の生産は、アルデヒ
ド類等のメタノール代謝系酵素の反応生成物やアミノ
酸、ビタミン等の菌体成分に限定されていた。また有用
酵素の生産においても、アルコールオキシダーゼやカタ
ラーゼ等のメタノール酸化系の酵素に限られている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、メタノ
ール酵母がもつメタノール誘導性アルコールオキシダー
ゼ遺伝子の発現系を解明し、異種遺伝子の効果的発現を
達成すべく鋭意研究を行った。すなわち本発明の目的
は、メタノール酵母のアルコールオキシダーゼ遺伝子の
プロモーター、目的の異種遺伝子及びターミネーターを
有する発現カセット、当該発現カセットを有する、メタ
ノールおよび／またはグリセロールの添加によって誘導
される発現ベクター、および当該発現ベクターを含有
し、異種遺伝子の発現産物を著量生産する形質転換細胞
を提供することにある。また、本発現ベクターを利用し
て、メタノール酵母で著量生産させることを特徴とす
る、異種遺伝子の発現産物の製造法を提供することを目
的とする。なお、本明細書中において異種遺伝子という
ときは、メタノール酵母由来のアルコールオキシダーゼ
遺伝子以外の任意の遺伝子を意味する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために、メタノール酵母が含有するアルコール
オキシダーゼ遺伝子由来の塩基配列をそのプロモーター
およびターミネーターと共に解明し、これら要素を利用
した発現ベクターを構築した。さらに、本発現ベクター
を用いて異種遺伝子を発現させたとき、該遺伝子本来の
発現系を用いるときよりもはるかに効率的に遺伝子産物
を生産することを、アデニル酸キナーゼ、チトクローム
Ｃおよびペルオキシダーゼの著量生産の成功により確認
し、本発明を完成するに至った。
【００１０】本発明の発現ベクターは、メタノール酵母
に存在するアルコールオキシダーゼ（以下 AOD と略称
する場合がある）遺伝子のプロモーターおよびターミネ
ーター部分を含む周辺領域を発現カセットとして含み、
そしてAOD 遺伝子コード領域を異種構造遺伝子に置き換
えたものである。これらのプロモーター及びターミネー
ターはいずれも本発明者らにより発見されたもので、そ
れぞれ配列番号１及び２の塩基配列を有する。
【００１１】本発明に用いられるアルコールオキシダー
ゼ遺伝子及びその発現系の各要素は、メタノール酵母か
ら精製したアルコールオキシダーゼの N 末端アミノ酸
配列に対応する合成オリゴヌクレオチドをプローブとし
て使用するコロニーハイブリダイゼーション法あるいは
プラークハイブリダイゼーション法により、メタノール
酵母の染色体 DNA の遺伝子ライブラリーをスクリーニ
ングすることにより取得することができる。遺伝子ライ
ブラリーの作成法、コロニーハイブリダイゼーション
法、プラークハイブリダイゼーション法はいずれも公知
の方法を利用することができる。このようにして取得し
たアルコールオキシダーゼ遺伝子の塩基配列を公知の方
法で決定し、その 5' 末端および 3' 末端の非翻訳領域
を、プロモーターおよびターミネーターとして各々利用
することができる。このようにして取得したプロモータ
ーとターミネーターの間に所望の異種遺伝子を挿入し、
本発明の発現カセットを作成する。
【００１２】本発明の発現ベクターは、所望の異種遺伝
子を含む上記の発現カセットを、適当なベクターに挿入
して構成されている。そのために使用されるベクターと
しては、公知の pUC18、pUC19、pBR322 等の大腸菌ベク
ターが例示される。これらのベクターに異種遺伝子、AO
D プロモーター及び AOD ターミネーターを挿入するこ
とは、後記実施例の記載を参照して、あるいは慣用の技
術により当業者が適宜行うことができる。
【００１３】本発明は、上記発現ベクターにより形質転
換された形質転換細胞及び該細胞を培養し、目的とする
異種遺伝子の発現産物であるペプチド又は蛋白質を単
離、精製する方法にも関する。
【００１４】本発明の形質転換細胞は、メタノールおよ
び／またはグリセロールの存在下で培養すると異種遺伝
子の発現が誘導され、所望のペプチド又は蛋白質を細胞
中若しくは細胞外に著量生産する。
【００１５】本願発明の一態様においては、本発明の発
現ベクターで宿主細胞を形質転換すると、該ベクター中
に存在する異種遺伝子が、いわゆる相同的組換えにより
宿主細胞の染色体 DNA に組み込まれ、安定に宿主中に
存在させることができる。この態様における形質転換の
ための宿主細胞としては特に限定されるものではない
が、好ましいのは酵母であり、特に好ましいものは AOD
遺伝子発現系を取得したものと同じか若しくは近縁の
メタノール酵母またはサッカロマイセス・セレビジアエ
である。宿主の染色体 DNA にベクター中の異種遺伝子
を挿入するには宿主の染色体 DNA と相同な配列をもつ
適当な選択マーカーを用いる。そのための選択マーカー
は当業者が容易に決めることができる。一例として、宿
主細胞の染色体 DNA 上の代謝に関与する特定の遺伝子
を用いることが好ましい。即ち、染色体 DNA 上の上記
遺伝子を突然変異等の適当な手段により機能しないよう
にした宿主細胞を用い、相当する正常な遺伝子を含む発
現ベクターを用いて相同的組換えを起こすことにより、
正常な代謝遺伝子を含む形質転換細胞のみを増殖させて
選択できるものが好ましい。発現ベクターにそのような
マーカー遺伝子を連結しておくことにより、該発現ベク
ターに連結された各マーカー遺伝子と染色体 DNA の相
同部分との間で相同的組換えが起こり、異種遺伝子の発
現カセットを染色体 DNA 中に組み込むことができる。
こうして形質転換された細胞の選択は、組み込まれた異
種遺伝子の発現がメタノールの存在下において誘導さ
れ、目的のペプチド等が生産されることにより行うこと
ができる。
【００１６】もう一方の態様において、本発明の発現ベ
クターは、上記の染色体 DNA 組み込み型ベクターに、
メタノール酵母由来で該宿主内での自律複製を可能なら
しめる DNA 断片を付加することによって該宿主内でプ
ラスミドとして複製可能な発現ベクターである。大腸菌
のベクターとしては、上記のとおり公知の pUC18、pUC1
9、pBR322 等が利用可能である。この場合の好ましい宿
主細胞も上記と同様であるが、特に好ましいものは AOD
遺伝子発現系を取得したものと同一のメタノール酵母
あるいはその近縁の酵母、その他の好メタノール微生物
またはサッカロマイセス・セレビジアエを用いることが
可能である。
【００１７】メタノール酵母の形質転換法および外来遺
伝子が染色体 DNAに組み込まれた形質転換細胞の取得法
は、公知の方法（サカイ(Sakai, Y.)ら、 J. Bacterio
l., 173, 7458〜7463, (1991)）を利用できる。また、
アデニル酸キナーゼ遺伝子は、酵母（Saccharomyces ce
revisiae）由来の遺伝子がすでに開示されている（コン
ラッド(Konrad, M.)、 J. Biol. Chem., 263, 19468〜1
9474, (1988)）。また、自律複製を可能ならしめる DNA
断片の例およびそれらのベクターへの組み込みは、ク
ルツら(Kurts, M. B. et al., Mol. Cel. Biol., 7, 20
9-217, (1987))に開示されている。また、メタノール酵
母の形質転換細胞培養物からのペプチド又は蛋白質の単
離及び精製法は、公知のあらゆる方法を利用することが
できる。一方、チトクローム C552 の遺伝子は、好熱性
水素細菌(Hydrogenobacter thermop hilus)由来の遺伝子
が既に開示されている(Sanbongi, Y., Yang, J. H., Ig
arashi, Y. and Kodama, T., Eur. J. Biochem., 198,
7-12, 1991)。また、糸状菌アルスロマイセス・ラモサ
ス(Arthromyces ramosus)が生産する分泌型のペルオキ
シダーゼ(ARP)は、特開平4-228078に開示されている。
【００１８】本発明で開示したアルコールオキシダーゼ
の発現カセットを利用した発現ベクターおよびそれを含
む形質転換細胞は以下のような利点を有する。
【００１９】i) メタノールおよび／またはグリセロー
ルで誘導される強力なプロモーターを含むので発現の効
率が著しく大きい。
【００２０】ii) 異種遺伝子が宿主細胞の染色体 DNA
中に導入されている態様においては、発現が長期間の培
養において安定であり、安定化のために抗生物質などの
薬剤を培地中に添加する必要はない。
【００２１】iii) 本発現プロモーターは培地中にメタ
ノールおよび／またはグリセロールを添加するだけで誘
導されるので、誘導条件の設定が容易であり、誘導物質
（メタノールおよびグリセロール）も安価である。
【００２２】
【実施例】以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００２３】以下において、発現カセットとしてアルコ
ールオキシダーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネ
ーターを使用し、またマーカー遺伝子として URA3 遺伝
子を使用して本発明を説明するが、これらに限定される
ものではなく、他のマーカー遺伝子も利用可能なことは
明らかである。また、異種遺伝子としてアデニル酸キナ
ーゼ遺伝子、チトクロームＣ遺伝子、ペルオキシダーゼ
遺伝子および G418 耐性遺伝子を使用したが、該遺伝子
に限定されるべきでない。
【００２４】実施例１ キャンディダ・ボイディニイ（Candida boidinii）S2 A
OU-1株（タニ(Tani, Y.)ら、 Agric. Biol. Chem., 49,
2699〜2706, (1985)）より、アルコールオキシダーゼ
遺伝子の取得、およびその塩基配列の決定を行った例で
ある。なお、当該株はCandida boidinii SAM1958と命名
され、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号：微
工研条寄第3766号（FERM BP-3766）として、1992年２月
25日に寄託されている。
【００２５】（１）ライブラリーの作成 キャンディダ・ボイディニイ S2 AOU-1株の菌体より染
色体DNAを単離した。DNA の単離法としては、例えばク
リエールらの方法(Cryer, D.R. et al., Meth. Cell. B
iol., 12, 39〜44, (1975)）が挙げられる。単離したDN
Aを制限酵素 Sau3AI で部分分解し、0.5％アガロースゲ
ルで電気泳動後、12〜22 kb のDNA断片をゲルより回収
した。この DNA 断片を、BamHI で切断した EMBL3 arm
[ストラタジーン社(Stratagene)製；フリシャウフ(Fris
chauf, A.)ら、J. Mol. Biol., 170, 827〜842, (198
3)]とライゲーションした。λファージのインビトロ・
パッケージングシステム、Giga Pack Gold（Stratagene
社製）により反応生成物のファージ遺伝子ライブラリー
を作成した。大腸菌P2392株を宿主として検定した結
果、1.1 × 105の組換え体ファージが得られた。
【００２６】一方、キャンディダ DNA を制限酵素 XbaI
で完全分解し、0.7％アガロースゲルで電気泳動後、4
〜7 kb の DNA 断片をゲルから回収した。回収した DNA
断片をベクター pBluescript II KS+（Stratagene社
製）の XbaI サイトに挿入し、大腸菌 XL1-Blue 株を形
質転換して、プラスミド・ライブラリーを作成した。
【００２７】（２）ライブラリーのスクリーニング キャンディダ・ボイディニイのアルコールオキシダーゼ
の N 末端アミノ酸配列を、ガスフェーズ・ペプチドシ
ーケンサー（model 120-A, アプライドバイオシステム
ズ社(Applied Biosystems)製）によって、Ala-Ile-Pro-
Glu-Glu-Phe-Asp-Val-Ile-Val-と決定した。この N 末
端アミノ酸配列に対応する３種の合成ヌクレオチドを合
成した：プローブ１：5'-TCRAGDGGRATNGCCAT-3'、プロ
ーブ２：5'-ACRATRACRTCRAAYTC-3'、プローブ３：5'-AC
RTCRAAYTCRAGDGG-3'、（R は A または G、Y は C また
は T、H は A または C または T、D は A または G ま
たは T、N は G,A,T,C のいずれかを示す。）。これら
の合成ヌクレオチドをプローブとして、実施例１−
（１）で作成した遺伝子ライブラリーをプラークハイブ
リダイゼーション法あるいはコロニーハイブリダイゼー
ション法によりスクリーニングした。ハイブリダイゼー
ションは、公知の方法[サンブルック(Sambrook,J.)ら、
in "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, 2nd e
dn., (1989)]に従い 37 ℃で 14 時間行い、フィルター
を 6×SSC-0.1%SDS 中で 37 ℃において３回洗浄し、乾
燥後、オートラジオグラフィーによって陽性クローンを
検出した。ファージライブラリーよりクローン CL701
が、プラスミドライブラリーよりpMOX620 を含有するク
ローンが陽性クローンとして選択された。
【００２８】（３）サブクローニング CL701 と pMOX620 の制限酵素地図を作成し、両者を比
較したところ、XbaI-Sau3AI DNA 断片（2.3kb）を共有
することがわかった（図１参照）。CL701 の EcoRI-Sal
I DNA 断片（3.3kb、SalIサイトはベクター EMBL3 上に
ある）、pMOX620の BglII-PstI DNA 断片（1.05kb）お
よび BamHI-XbaI DNA 断片（3.9kb）を、pBluescript I
I KS+ あるいは KS- に挿入し、各々 pMOX330、 pMOX10
5 および pMOX390 を作成した（図１参照）。
【００２９】（４）塩基配列の決定 実施例１−（３）で作成したプラスミド pMOX330、pMOX
105 および pMOX390の挿入 DNA 断片の塩基配列を決定
した。各挿入 DNA 断片をファージ M13 に両方向にクロ
ーニングし、２本鎖 DNA（RF）をおのおの調製した。こ
れらの二本鎖 DNA に大腸菌エキソヌクレアーゼIIIを反
応させ、一方向に欠失が導入された二本鎖 DNA を調製
した。エキソヌクレアーゼIIIを利用した一方向欠失挿
入プラスミドの作成法に関しては、「続生化学実験講
座、第１巻、遺伝子研究法II」の289-305頁に詳しく記
載されている。前記の方法により得られた、一方向に欠
失が挿入された各二本鎖 DNA で大腸菌 JM109 を形質転
換して、一方向に欠失が挿入されたファージクローンを
作成した。各ファージクローンから二本鎖 DNAを調製し
て、制限酵素による切断パターンから欠失の程度を調
べ、適当なクローンから一本鎖ファージ DNA を調製し
た。これら一本鎖ファージ DNA を鋳型として、ジデオ
キシ法（サンガー(Sanger, F.)ら、 Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74, 5463(1977)）によって塩基配列を決定
した。各クローンの塩基配列をつなぎ合わせることによ
り、各プラスミドの挿入 DNA 断片の塩基配列を決定
し、さらにこれらを結合することにより、図１中 EcoRI
サイトから HindIII サイトまでの 4.2kbの全塩基配列
を決定した（図２）。
【００３０】図2中、1〜3番目の ATG で始まり、1990〜
1992 番目の TAA で終わる 1989 塩基対からなるオープ
ンリーディングフレームが存在する。このオープンリー
ディングフレームが目的のアルコールオキシダーゼ遺伝
子をコードしていることは以下の点から明らかである。
【００３１】i) 塩基配列から推定されるアミノ酸配列
が、メタノール酵母 ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenu
la polymorpha)[レデボエル(Ledeboer, A.M.)ら、 Nucl
eicAcids Res., 13, 3063-3082, (1985)]およびピキア
・パストリス(Pichia pastor is)[コウツ(Koutz, P.)
ら、 Yeast, 5, 167〜177 (1989)]のアルコールオキシ
ダーゼのアミノ酸配列と、各々 77 ％および73 ％の相
同性を示す。
【００３２】ii) 塩基配列から推定される N 末端のア
ミノ酸配列が、精製酵素の N 末端アミノ酸配列と一致
する（図２中、下線部のアミノ酸配列）。
【００３３】iii)塩基配列から推定されるアミノ酸組成
が、精製酵素のアミノ酸組成と一致する。
【００３４】iv) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定した酵素の分子量（72〜75kDa）が、推
定されるアミノ酸組成から計算した分子量（73,947）と
一致する。
【００３５】コード領域の 5'側上流域には真核生物で
の転写に必要な TATA 配列が、3' 側下流域には転写終
結シグナルおよび polyA 付加シグナルが認められる
（いずれも図２の塩基配列中に下線で示す）。なお、5'
側上流（プロモーター領域）および3' 側下流域（ター
ミネーター領域）の塩基配列には、上述の H. polymorp
h a および P. pastoris のそれらとの相同性は全く認め
られない。
【００３６】実施例２ 実施例１で取得したキャンディダ・ボイディニイ S2 AO
U-1由来のアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモータ
ー、ターミネーター部分を利用した酵母（Sacc haromyce
s cerevisiae）由来のアデニル酸キナーゼ遺伝子の発現
ベクターを作成し、キャンディダ・ボイディニイを形質
転換した例である。
【００３７】（１）発現カセットの作成 アルコールオキシダーゼ（AOD）のプロモーターとター
ミネーターの間にアデニル酸キナーゼのコード領域を挿
入した発現カセットを作成した（図３）。アデニル酸キ
ナーゼ遺伝子（ADK）の取得法およびその塩基配列は、
コンラッドにより開示されている（Konrad, M., J. Bio
l. Chem., 263, 19468〜19474, (1988)）。
【００３８】アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモー
ター、ターミネーター部分およびアデニル酸キナーゼの
構造遺伝子部分を切り出すために、PCR（ポリメラーゼ
・チェーン・リアクション）法を用いた。PCR 法のプラ
イマーとして下記の４種類のオリゴヌクレオチドを合成
した。
【００３９】PADK1 (37mer) : 5'-GGATTCTGAACTAGACA
TTATTGAAAAATAATTTTGT-3' PADK2 (37mer) : 5'-ACAAAATTATTTTTCAATAATGTCTAGTT
CAGAATCC-3' SPETERM (29mer) : 5'-GGAACTAGTTAATTCAACAAGTTGTATCT
-3' ADKSPE (31mer) : 5'-GGAACTAGTTCATTAATCCTTACCTAACT
TG-3' ノーマル・プライマー（NP: 17mer）およびリバース・
プライマー（RV: 17mer）は、各々マルチクローニング
サイトの 3'側および 5'側の塩基配列と相同であり、宝
酒造株式会社より購入した。PADK1 および PADK2 は、
互いに相補的な塩基配列になっており、AOD プロモータ
ーと ADK コード領域を結合するために用いた。PADK1、
PADK2 の下線部は、各々、AOD プロモーターの 3'末端
および ADKコード領域の開始コドンから 3'側の塩基配
列と相補的になっている。SPETERMは AOD ターミネータ
ー部分の 5'末端と同一塩基配列（下線部）を含み、そ
の 5'側の４番目から９番目に SpeI サイト（ACTAGT）
を持っている。ADKSPE は ADKコード領域の 3'末端側に
相補的な塩基配列を含み、その 5'側の４番目から９番
目に SpeI サイト（ACTAGT）を持っている。
【００４０】AOD のプロモーター領域を含むプラスミド
pMOX330（図１参照）とプライマーRV および PADK1 と
を混合し、PCR 反応を行った。反応生成物をアガロース
ゲル電気泳動し、増幅された DNA 断片を回収した。回
収した DNA 断片（PAOD 断片）は、AOD プロモーター領
域の 5'末端側にマルチクローニングサイトとその 5'上
流域、および 3'末端にプライマー PADK1 の配列が付加
された構造を持っている。ADK の構造遺伝子を含むプラ
スミド pADK1（Konrad, M., J. Biol. Chem.,263, 1946
8〜19474, (1988)） とプライマー PADK2 および ADKSP
E を混合し、PCR反応を行った。反応生成物をアガロー
スゲル電気泳動で分画後、増幅された DNA 断片（CADK
断片）を回収した。CADK 断片は ADK コード領域の 5'
末端側にプライマー PADK2 の配列が、3'末端側に SpeI
サイトの配列が付加された構造を持っている。
【００４１】PAOD 断片と CADK 断片を混合し、プライ
マー RV および ADKSPE を加え PCR反応を行うと PAOD
断片と CADK 断片が結合した DNA 断片（PAOD-CADK 断
片）が増幅された。これは PAOD 断片の 3'末端と CADK
断片の 5'末端の塩基配列が互いに相補的であるため
（プライマー PADK1 および PADK2 の塩基配列を参
照）、その部分で二本鎖 DNA が形成され、PCR反応によ
り PAOD-CADK 断片が生成されるためである。さらに、
この PAOD-CADK 断片の両端にプライマーRVおよびADKSP
Eがアニールし、PCR反応により PAOD-CADK 断片が増幅
されることによる。増幅された PAOD-CADK 断片を XbaI
/SpeI で切断し、アガロースゲル電気泳動後 PCx 断片
を回収した。PCx 断片は、AOD プロモーター領域の Xba
I サイトから3'側の部分と ADK コード領域が結合した
構造になっている。一方 pMOX33（図１参照）を EcoRI/
XbaI で切断した後、Px 断片を回収した。Px 断片は AO
D プロモーター領域の XbaI サイトから 5'側上流域を
含んでいる。
【００４２】プラスミド pMOX390 を BamHI/HindIII で
切断して得られる 0.6 kb の DNA断片を pBluescript I
I KS+ の BamHI/HindIII サイトに挿入して pMOX078
を作成した。pMOX078 は AOD 遺伝子のターミネーター
領域を含んでいる。pMOX078にプライマー SPETERM およ
び NP を加え PCR 反応を行った。SpeI/HindIIIで切断
後、アガロースゲル電気泳動により分画し、増幅された
DNA 断片（TAOD 断片）を回収した。TAOD 断片は AOD
ターミネーター領域の5'末端に SpeI 切断端を、3'末端
にHindIII 切断端を持っている。
【００４３】以上、得られた３種の DNA 断片（Px 断
片、PCx 断片、TAOD 断片）とベクター pBluescript II
KS+ の EcoRI/HindIII 切断による DNA 断片を T4 リ
ガーゼで結合し、pECA1 を作成した。pECA1 は、AOD 遺
伝子の EcoRI サイトから 3'側下流域のプロモーター領
域、ADK 構造遺伝子領域、および AOD 遺伝子の HindII
I サイトの 5'側上流域からなる ADK 発現カセットを含
んでいる。
【００４４】（２）発現ベクターの作成 キャンディダ・ボイディニイ由来の URA3 遺伝子を含む
pRCU350 から、URA3遺伝子を含む DNA 断片を SalI で
切り出し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端にした後、p
UC19 の NdeI サイトに挿入して pCU350 を作成した。
キャンディダ・ボイディニイ由来の URA3 遺伝子の取得
法および pRCU350 の作成法はサカイらによって明らか
にされている(Sakai, Y., et al., J. Bacteriol., 17
3, 7458〜7463, (1991)）。pECA1 から EcoRI/SalI に
よって発現カセット部分を切り出し、pCU350 の EcoRI-
SalI サイトに挿入して発現ベクター pTRex を作成し
た。pTRex の制限酵素地図を図4に示す。pTRex は pUC1
9 の SalI サイトに ADK 遺伝子の発現カセットが挿入
され、NdeI サイトに URA3 遺伝子が挿入された構造を
持つ。
【００４５】（３）形質転換 キャンディダ・ボイディニイ S2 AOU-1株よりウラシル
要求株（TK62 株）を取得した。ウラシル要求株の取得
法およびこのウラシル要求株が URA3 遺伝子の変異株で
あることは、サカイらによって明らかにされている(Sak
ai, Y., et al.,J. Bacteriol., 173, 7458〜7463, 199
1）。
【００４６】このウラシル要求株をプラスミド pTRex
で形質転換し、アデニル酸キナーゼを著量生産するキャ
ンディダ・ボイディニイの形質転換細胞を取得した。形
質転換法はリチウム法（イトウ(Ito, H.)ら、J. Bacter
iol., 153, 163〜168, (1983)）あるいはスフェロプラ
スト法（ヒンネン(Hinnen, A.)ら、Proc. Natl. Acad.S
ci. USA, 75, 1929〜1933, (1978)）によった。形質転
換細胞のスクリーニング法は、サカイらによって詳しく
開示されている(Sakai, Y., et al., J. Bacteriol., 1
73, 7458-7463, (1991)）。形質転換細胞では、pTRex
の URA3 遺伝子部分が、キャンディダ・ボイディニイの
染色体 DNA 中の URA3 遺伝子部分と相同組換えを起こ
し、ADK 発現カセットが染色体 DNA 中に組み込まれて
いる。従って、形質転換細胞は、メタノール添加培地中
で培養することにより、極めて安定にアデニル酸キナー
ゼを生産する。
【００４７】実施例３ アデニル酸キナーゼ遺伝子の発現カセットが、キャンデ
ィダ・ボイディニイの染色体 DNA に組み込まれた形質
転換細胞による、アデニル酸キナーゼの製造法を示した
例である。
【００４８】形質転換細胞のうち１株（1-1株）および
その親株（TK62 株）を、炭素源としてメタノールある
いはグルコースを添加した培地で培養し、経時的に菌体
量および菌体内のアデニル酸キナーゼ活性を測定した
（図5）。メタノール酵母の培地はサカイら(Sakai, Y.,
et al., Appl. Environ. Microbiol., 53, 1812〜181
8,(1987)）によって開示されているが、メタノールある
いはグルコースの添加量は 2% とした。アデニル酸キナ
ーゼ活性の測定法はブロリンらによって開示されており
(Brolin, S. E., et al., Methods of Enzymatic Analy
sis, vol. 3, Third Edition, pp540〜544, (1983)）、
24 ℃で 1 分間に ２μmole の ADP を生成する酵素活
性を 1 U とした。メタノール培地において 72 時間後
に、1-1 株は菌体蛋白質 1 mg あたり 93.5 U のアデニ
ル酸キナーゼ活性、即ち親株の0.0328 U に比較して 29
00 倍の酵素活性の増加を示した。この酵素活性の増加
はグルコース培地では認められず、アデニル酸キナーゼ
の発現がメタノールによって誘導されることを示してい
る。
【００４９】実施例４ 各種炭素源による誘導発現 キャンディダ・ボイディニイのアルコールオキシダーゼ
遺伝子のプロモーター領域およびターミネーター領域を
利用した発現ベクターにおいて、アデニル酸キナーゼの
誘導発現がメタノールのみならず、グリセロールによっ
ても誘導されること、また、エタノールやグルコースに
よって抑制されることを示した例である。さらに、該発
現カセットがサッカロマイセス・セレビジアエでも機能
することを、G418 耐性遺伝子の発現がグリセロールで
強力に誘導されることで示した例である。
【００５０】上記実施例３に記載の形質転換細胞、1-1
株でグルコース、エタノール、メタノールまたはグリセ
ロールを単独ないし混合して添加し、24 時間培養した
後のアデニル酸キナーゼの活性を表１に示す。メタノー
ルおよびグリセロールは AODプロモーターを活性化し、
アデニル酸キナーゼの発現量を増加させた。メタノール
とグリセロールの両方を添加したときに最も高い発現量
が得られ、メタノール単独の場合の約 1.7 倍の生産量
が認められた。メタノールおよびグリセロールによる誘
導効果は、グルコースないしエタノールの共存によって
完全に抑制される。メタノールやグリセロールは安価な
炭素源であるので、本発明の形質転換細胞を使用するな
ら異種遺伝子産物を安価に製造することができる。ま
た、グリセロールはメタノールと異なり、培養液中に高
濃度で加えても形質転換体の生育阻害も起こさず、最終
菌体濃度も高くすることができるので、該メタノール酵
母による生産には最適な炭素源である。
【００５１】
【表１】 形質転換細胞 1-1 株の ADK 活性に対する炭素源の効果 炭素源 特異活性（Ｕ／ｍｇ） グルコース（２％，ｗ／ｖ） ＋メタノール（１．５％，ｖ／ｖ） ０．７７ グルコース（２％，ｗ／ｖ） ０．４０ エタノール（１．５％，ｖ／ｖ） ＋メタノール（１．５％，ｖ／ｖ） ０．２５ エタノール（１．５％，ｖ／ｖ） ０．０８ グリセロール（３％，ｖ／ｖ） ＋メタノール（１．５％，ｖ／ｖ） ２２３ グリセロール（３％，ｖ／ｖ） １７．３ メタノール（１．５％，ｖ／ｖ） １３５ AOD プロモーター/ターミネーターの間に G418 耐性遺
伝子を挿入した発現カセットを作成した。トランスポゾ
ン Tn5 由来の G418 耐性遺伝子は、プラスミド PNEO
(ファルマシア社製）から取得できる。発現カセットの
構築は、実施例２に記載したのと全く同様に PCR 法を
利用して行った。構築した発現カセットをサッカロマイ
セス・セレビジアエ由来の URA3 遺伝子を含んでいる Y
Ip型ベクター pRS406 (Stratagene社製)に挿入した。ウ
ラシル要求性の宿主酵母(サッカロマイセス・セレビジ
アエ) YPH500株（Sikorski, R. et al., Genetics, 12
2,19-27, (1989)）の URA3 遺伝子部位に、相同組換え
により該発現カセットが組み込まれた形質転換体をウラ
シル非要求性を指標にして選別した。形質転換酵母を各
種濃度（0〜100 mg/ml）の G418 を含む培地での生育を
指標にして、G418耐性を調べた。宿主酵母は 0.1 mg/ml
以上の G418 を含む培地で生育できないのに対して、形
質転換酵母は、3%グリセロールを含む培地で、100mg/ml
の G418 存在下でも生育できた。また、該形質転換酵母
を、2%グルコースを炭素源として培養した場合、宿主酵
母と同様、0.1mg/ml 以上の G418を含む培地では生育で
きなかった。これらの結果から、メタノール酵母由来の
AOD プロモーター/ターミネーターを利用した発現カセ
ットはサッカロマイセス・セレビジアエでも機能し、培
地にグリセロールを添加することにより、強力に発現が
誘導されることがわかった。なお、メタノールのみを添
加しても、メタノールとグリセロールを共に添加して
も、同様に誘導されると考えられる。
【００５２】実施例５ 実施例２で構築した発現ベクターとは別に、実施例１で
取得したキャンディダ・ボイディニイ S2AOU-1 由来の
アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター、ターミ
ネーター部分を利用し、その間に制限酵素 NotI の認識
部位の塩基配列を挿入した発現ベクターを作成した（図
６）。この発現ベクターに好熱性水素細菌由来のチトク
ローム C552 遺伝子を挿入し、キャンディダ・ボイディ
ニイを形質転換することにより、チトクローム C552 を
生産した。
【００５３】（１）ＡＯＤプロモーター／ターミネータ
ーの単離 アルコールオキシダーゼ(AOD)のプロモーターとターミ
ネーターの間に制限酵素 NotI の認識部位の塩基配列を
挿入した多目的発現カセットを作成した。
【００５４】アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモー
ター、ターミネーターの部分を切り出すために、 PCR
（ポリメラーゼチェインリアクション）法を用いた。PC
R 法のプライマーとして下記の３種類のオリゴヌクレオ
チドを合成した。
【００５５】 PMAL1(29mer): 5'-GGGCGGCCGCTATTGAAAAATAATTTTGT-3' PMAL2(30mer): 5'-GGGCGGCCGCTAATTCAACAAAGTTGTATCT-
3' PMAL3(23mer): 5'-ACTTCTAGAATTTCATTATTTAT-3' PMAL1 と PMAL2 は、それぞれの 5'末端に制限酵素 Not
I の認識部位の塩基配列（下線部）を有する。PMAL1 は
AOD プロモーターの 3'末端の塩基配列を含み、PMAL2
は AOD ターミネーターの 5'末端と同一の塩基配列を含
む。PMAL3 は AOD プロモーターの途中に存在する XbaI
認識部位の塩基配列（下線部）を有する。
【００５６】AOD のプロモーター領域を含むプラスミド
pMOX330 とプライマー PMAL1 および PMAL3 を混合
し、PCR 反応を行った。反応生成物をアガロースゲル電
気泳動し、増幅された DNA 断片を回収した。回収した
DNA 断片（PN3 断片）は、AODプロモーター領域の XbaI
認識部位より下流領域を含み、3'末端に NotI 認識部
位を有する構造を持っている。AOD のターミネーター領
域を含むプラスミド pMOX078 と、プライマー PMAL2 お
よびプライマー NP（実施例１参照）とを混合し、PCR
反応を行った。反応生成物をアガロースゲル電気泳動
し、増幅された DNA断片を回収した。回収した DNA 断
片（TN 断片）は、AOD ターミネーターの HindIII認識
部位より上流領域を含み、5'末端に NotI 認識部位を有
する構造を持っている。AOD のプロモーター領域を含む
プラスミド pMOX330 を制限酵素 EcoRIおよび XbaI で
切断し、アガロースゲル電気泳動後、XbaI 認識部位よ
り上流のAOD プロモーター領域を含む DNA 断片（PN5
断片）を回収した。
【００５７】（２）発現ベクターの作成 制限酵素 NotI および XbaI で切断した PN3 断片、制
限酵素 NotI および HindIII で切断した TN 断片およ
び XbaI/HindIII 処理したベクター pUC18を、T4DNA リ
ガーゼによって結合し、プラスミド pPN1 を作成した。
プラスミド pPN1を EcoRI/XbaI 処理後、PN5 断片を挿
入して、pNOT1 を作成した。キャンディダ・ボイディニ
イ由来の URA3 遺伝子を含むプラスミド pRCU350 か
ら、URA3 遺伝子を含む DNA 断片を制限酵素 SalI で切
り出し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端にした後、pNO
T1 の NdeI 認識部位に挿入して pNOTe1 を作成した。p
NOTe1は、pUC18 の EcoRI 認識部位と HindIII 認識部
位との間に AOD プロモーター／ターミネーターからな
る発現カセットが挿入され、AOD プロモーター／ターミ
ネーター間の NotI 認識部位に異種遺伝子を挿入するこ
とができる。また、NdeI認識部位に、メタノール酵母の
形質転換および染色体 DNA への組み込みに必要な URA3
遺伝子が挿入された構造を持つ（図６参照）。
【００５８】（３）チトクローム C552 用発現プラスミ
ドの作成 チトクローム C552 (CytC552)遺伝子の取得方法および
その塩基配列は、サンボンギらにより開示されている(S
anbongi, Y., Yang, J. H., Igarashi, Y. andKodama,
T., Eur. J. Biochem., 198, 7-12, (1991)）。ベクタ
ー pUC18 の EcoRI認識部位に CytC552 の構造遺伝子が
挿入されたプラスミド pKHC12 から該遺伝子を制限酵素
EcoRI および SalI で切り出し、そして T4 DNA ポリ
メラーゼで平滑末端にした。NotI で消化した後、同じ
く平滑末端にしたプラスミド pNOTe1 に、この断片を挿
入することにより、CytC552 用発現プラスミド pNOTe1C
552を作成した。
【００５９】（４）形質転換およびチトクロームＣの生
産 形質転換は、実施例２で示した形質転換法と全く同様に
行った。形質転換細胞の培養法、培地等についても実施
例２と全く同様である。
【００６０】形質転換細胞のうち１株（1-a 株）および
その親株（TK62株）を、炭素源としてメタノールあるい
はグルコースを添加した培地で培養し、そして菌体内の
チトクロームＣの発現量を測定した。チトクロームＣの
発現量は 552nm における吸光度を測定することにより
算出した。メタノール培地において、培養 100 時間後
に、1-a 株は培地１リットルあたり 0.8 mgのチトクロ
ーム C552 を生産した。この誘導発現はグルコース培地
では認められず、親株においては、メタノール培地およ
びグルコース培地のいずれにおいても全く認められなか
った。このことは、チトクローム C552 の発現がメタノ
ールにより誘導されることを示している。
【００６１】実施例６ メタノール酵母キャンディダ・ボイディニイの自律複製
配列（ARS）の単離と、その塩基配列の決定、および AR
S を有することにより該宿主内でプラスミドとしての複
製が可能なプラスミドの作成を示した例である。
【００６２】（１）自律複製配列（ARS）の単離 ARS の単離は、キャンディダ・ボイディニイの染色体 D
NA ライブラリーから公知の方法でスクリーニングする
ことにより行うことができる。キャンディダ・ボイディ
ニイの遺伝子ライブラリーの作成法は、Sakai らの方法
（Sakai, Y., Kazarimoto, T and Tani, Y., J. Bacter
iol. 173, 7458-7463(1991)）によった。
【００６３】ARS を有するプラスミドのスクリーニング
は、以下のように行った。キャンディダ・ボイディニイ
の染色体 DNA を EcoRI あるいは HindIII で完全消化
後、キャンディダ・ボイディニイ由来の URA3 を含有す
るベクター pBCU351（Sakai,Y., Kazarimoto, T. and T
ani, Y., J. Ferment. Bioeng., 73, 255-260 (1992)）
の EcoRI 認識部位あるいは HindIII 認識部位に挿入し
て、大腸菌 JM109 株を形質転換し、ウラシル非要求性
を指標に ARS を含むプラスミドをスクリーニングし
た。得られた 350 のメタノール酵母形質転換細胞から
プラスミドを調製し、再びキャンディダ・ボイディニイ
を形質転換し、該大腸菌形質転換細胞からプラスミドを
調製してウラシル非要求性を指標に選別した。大腸菌 J
M109 株を形質転換し、そしてキャンディダ・ボイディ
ニイに戻すというこの操作を都合３回繰り返すことによ
り、強い ARS 活性を有する DNA 断片を含む 28 種類の
プラスミドが得られた。このうち、CARS1 と CARS2 と
いう２つの強い ARS 活性を有する DNA 断片を含むプラ
スミド pBARCU1 および pBARCU2 について、以後解析を
進めた（図８参照）。
【００６４】（２）ＡＲＳを含むプラスミドの作成と形
質転換頻度 サッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cere
visiae）の形質転換用のプラスミドは以下のように構築
した。得られた CARS1 および CARS2 を含む DNA 断片
は、pBARCU1 あるいは pBARCU2 をそれぞれ HindIII あ
るいは EcoRI 処理することにより調製した。該 DNA 断
片を、サッカロマイセス・セレビジアエ由来の URA3 遺
伝子を含む YIp 型べクターの HindIII あるいは EcoRI
認識部位に各々挿入して、pRAC1 および pRAC2 を作成
した。キャンディダ・ボイディニイ由来のマーカー遺伝
子 URA3、および CARS1 あるいは CARS2 を含むプラス
ミドの作成法については、上記実施例６−（１）に記載
されている。作成した４種類のプラスミド pBARCU1、pB
ARCU2、pRAC1 および pRAC2 については、その構成を図
８に示す。
【００６５】この４種類のプラスミドのキャンディダ・
ボイディニイあるいはサッカロマイセス・セレビジアエ
を宿主とした場合の形質転換効率を表２に示す。キャン
ディダ・ボイディニイをこれらのプラスミドで形質転換
した場合、ARS を含まない対照のプラスミドの形質転換
効率は極めて低いのに対して、高い形質転換効率を示し
た。また、サッカロマイセス・セレビジアエをこのベク
ターで形質転換した場合も、キャンディダ・ボイディニ
イを宿主とした場合よりも高い効率で形質転換細胞が得
られた。なお、対照とした pBCU351 でもサッカロマイ
セス・セレビジアエで形質転換細胞が得られたが、これ
は該プラスミドに含有されるキャンディダ・ボイディニ
イ由来のマーカー遺伝子 URA3 に、サッカロマイセス・
セレビジアエでの ARS 活性があり、且つ、該酵母のウ
ラシル要求性を相補できるためと考えられる。
【００６６】
【表２】 ARS を有するプラスミドで C. boidinii と S. cerevisiae の ウラシル要求株を形質転換したときの効率 プラスミド マーカー遺伝子 複製起点 形質転換効率 （コロニー数/mg DNA） C. boidinii S. cerevisiae pBCU351 C. boidinii ----- <1 4.5 × 104 URA3 pBARCU1 C. boidinii CARS1 1.0 × 104 7.5 × 104 URA3 pBARCU2 C. boidinii CARS2 5.0 × 103 6.1 × 104 URA3 pRS406 S. cerevisiae ----- <1 <1 URA3 pRAC1 S. cerevisiae CARS1 4.0 × 102 1.3 × 105 URA3 pARC2 S. cerevisiae CARS2 1.0 × 102 7.1 × 104 URA3 pYCU350 C. boidinii ARS1 <1 1.0 × 104 URA3 YEp24 S. cerevisiae 2μm DNA <1 n.t. URA3 以上の結果から、CARS1 あるいは CARS2 を含むベクタ
ーはキャンディダ・ボイディニイの形質転換効率を向上
させ、該宿主における異種遺伝子発現系の構築を容易に
する。また、これらのベクターはキャンディダ・ボイデ
ィニイだけでなく、サッカロマイセス・セレビジアエを
形質転換できることから、これら宿主の間のシャトルベ
クターとしても利用できる。
【００６７】（３）ARS の塩基配列 上記方法により得られた CARS1 を含有する DNA 断片の
全塩基配列を決定した。塩基配列の決定方法は、公知の
Sanger らの方法（Sanger, F., Nicklen, S and Couls
on, A. R., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467
（1977））によって行うことができる。この方法により
決定された CARS1 の塩基配列を図７に示す。図中、ボ
ックスで囲まれた部分は、サッカロマイセス・セレビジ
アエにおける ARS のコンセンサス配列（5'-(A/T)TTTAT
RTTT(A/T)-3'）に類似の配列を示し、下線部分は同じく
サッカロマイセス・セレビジアエにおける ARS ボック
ス（5'-TNTRAA-3'）に類似の配列を示す。
【００６８】（４）ＡＲＳ上の機能部位の解析 キャンディダ・ボイディニイおよびサッカロマイセス・
セレビジアエにおけるCARS1 の機能部位の解析を以下の
ようにして行った。キャンディダ・ボイディニイでの A
RS 機能を有する pRAC1、および CARS1 が pRAC1 とは
逆向きに挿入された pRAC1R について制限酵素およびヌ
クレアーゼを利用して各種欠失変異プラスミドを作成し
た。これらの欠失変異プラスミドによる、キャンディダ
・ボイディニイおよびサッカロマイセス・セレビジアエ
を宿主とした場合の形質転換効率を図９に示す。キャン
ディダ・ボイディニイにおける ARS 活性を示す最少配
列は塩基番号 1-495 であり、サッカロマイセス・セレ
ビジアエにおける ARS 活性を示す最少配列は塩基番号
693-850 であった。
【００６９】実施例７ 実施例５で構築した AOD プロモーターとターミネータ
ーとの間に NotI サイトを持つ発現ベクター pNOTe1 に
糸状菌 Arthromyces ramosus 由来のペルオキシダーゼ
遺伝子を挿入し、キャンディダ・ボイディニイを形質転
換して、ペルオキシダーゼを生産した例である。
【００７０】（１）Arthromyces ramosus ペルオキシダ
ーゼ発現プラスミドの作成Arthromyces ramosus ペルオキシダーゼ(ARP)遺伝子の
取得方法およびその塩基配列は、特開平4-228078および
欧州特許公開第0486067号に開示されている。ARPの cDN
A 遺伝子を持つ酵母での発現プラスミド pYEPOD1（特開
平4-228078）を鋳型として用い、合成オリゴヌクレオチ
ド A664 5'-AAGCGGCCGCATGAAGCTCTCGCTTTTCTCCA-3' と
A663 5'-GTGCGGCCGCAGGATGTACCATCTTCACCAGA-3' をプラ
イマーとして PCR 法にて DNA を増幅した。反応生成物
をアガロースゲル電気泳動し、増幅された DNA 断片を
回収した。回収した DNA 断片は 5'末端（開始コドンに
接して 5'側）と 3'末端（終止コドン TGA より 21 bp
下流）に NotI サイトを持つ ARP 遺伝子である。この
DNA 断片を NotI で消化し、同じく NotI で消化したプ
ラスミド pNOTe1 に挿入することにより、ARP 発現プラ
スミド pNOTe1ARPを作成した。
【００７１】（２）形質転換およびＡＲＰの生産 形質転換は、実施例２で示した形質転換法と全く同様に
行った。形質転換細胞の培養法、培地等についても実施
例３と全く同様である。
【００７２】形質転換細胞のうち、１株（AP-1）および
その親株（TK62株）を、炭素源としてメタノールを添加
した培地で 100 時間培養し、集菌後、培養液上清のペ
ルオキシダーゼ活性を測定した。ペルオキシダーゼ活性
の測定法は、特開平4-228078に開示されているとおりに
行った。その結果、AP-1は137 u/l、TK62株は0.6 u/lの
ペルオキシダーゼ活性が認められた。したがって、明ら
かに、AP-1 株では活性型の ARP が発現し、培地中に分
泌されていると考えられる。
【００７３】
【発明の効果】本発明により、メタノール酵母キャンデ
ィダ・ボイディニイのアルコールオキシダーゼ遺伝子が
取得され、本遺伝子のプロモーターおよびターミネータ
ーを利用した発現カセットおよびベクターが作成でき
た。さらに、この発現ベクターで形質転換された細胞を
液体培養することにより、アデニル酸キナーゼ、チトク
ロームＣおよびペルオキシダーゼのメタノールおよび／
またはグリセロールの添加による大量生産が可能となっ
た。
【００７４】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：１６６７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 存在位置：１．．１６６７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAATTCCGGA GTATACGTAA ATATATAATT ATATATAATC ATATATATGA ATACAATGAA 60 AGTAAATATG ATAAGATTGA AATAATAACA AACAGCGATA AATATATCTC AAAATGGAGT 120 TACACAACAA ATAATAATAA AATATAAATT ATAAAATATA AAGGAATAAA ATAAACCCCA 180 CTAATTTATT TTATTAAAAG ATAGATTGGT ATCTTTACTT AATAACAATT CTGAAACTTT 240 ATTCACTTAA TTTTATTTAA CTTATTTAAT TTATTTTTAC CCCAGTTTTT TCAGTACAGT 300 GCAGCTCCGA AACTTTATTT GGCTGTGATT TGGCTGTGAT TTGGCTTGGC TTGGCTGGCT 360 GGAATTGTCT CCTGCAGGAA TTGCTCGGGG TCCGGTTCTC CCGCAGCTGG ATATTTGGCT 420 GGCTGCTCTG TCTGGCTGCT CTGCCATCTG CTGTGGCCAC CCCCGCATCT CTGGATGCAC 480 GCCGTGCAGC TGGACTTGCG TCTACCCTGC AGCCGTGTGC CTCATCTCCC AATCTCTCAA 540 TCAGCCAGTC AGCCAGCCAG CCAAAATACG GGCCAGGCAG GCAGGCAGGC AGGCAGGCAG 600 GCAGGCAGGC AGGCAGGCAG GCAGTGATGC CTTCCCACGC CCCACCCCGC ATAAACATCC 660 CCAGCAGTTT CCCCAGCAGT TTCCCCAGCT TTTCAATTTA ATAAAATAGC CTGTTTCTGT 720 TTCTGTTTTA TATTATACAA TTTTTTATCC TAATAATTAC TCTTTTGGGA ATTAAATAAT 780 AATTATATCA TATACCCATA TCACATTTTA CTATATTTAC TATCTATAAA TAATTTCATA 840 TTATAATATT AATTTATATT CGCTTAATTA AAATGCTCTT TTCCATCATC ATCATCATCA 900 TCATCACGAG TTTTCGGTTA TCAATACTCT TTTCATTAAC TTCTAGAATT TCATTATTTA 960 TTTTTTATTG ACTGGAAATT TTCAATCAAT TTTATTTATT TTTATTTATT TATTTTCATA 1020 TTCTTAGATT TAAACTTTTT AGATGACCGC TATTTTACTT ACTTACTTAC TTACTTACTT 1080 ACTTACTTAC TTACATACCT ACTTACTGTG ATTTTATAAT ATGATAAGAA TTAATTTTCA 1140 TATTTATGAT GATGTAAATT TAACCTAGTA TACTATTTTA AAGTTATCAC TATCTTTTAG 1200 TGCTGGCATT TTTTATTCTA TTTTCATATA TGTATATAAG TAAATTAAGT ATCATCACGC 1260 TGCTTACTGT ACGTTTAAAA TGTGGAGATG GAAATAGAGA TGGGGATGAA GATGAAGATG 1320 ATGAGAATTA TAAACCATTC ATTCATTAAT CAATCAATAT AACTTATAAA AAAATTTATA 1380 TTTAAATGAA TTAATTTCCT TTATTTTAAT AATATCGTTA ATTCTTTTAA ATTCTATTTT 1440 ATTTTAATTC TTTCTTTATC ATAGTTATCA TATAACAATT ATATAACATA GATACACAAT 1500 TATTATTTTA TTATCATATT ATTTTTTAAA ATATTGATTA TTTTTAAAAT AATATCTTAA 1560 TTAATTAATT TTTACGAATA TACAAATTTT AACGACTTTC TTTTTTTAAC GAATTTTAAC 1620 GAACTTTTAA AAAAACAAAA AAAAAAAAAC AAAATTATTT TTCAATA 1667 配列番号：２ 配列の長さ：５１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ 存在位置：１．．５１８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TAATTCAACA AGTTGTATCT TTTTTTACTG CTCTTTTTTA ATGATCTCTC TTTATTTTTT 60 TTTCAATCAA TTTATTTATT TAATTTTTTC ACTTTTATAA TTCTTGATAT GATATGATAT 120 GATATGATTT TAGTTCTTTG TCTGTTTTTT TTTTTTTTTT TCAAACTTTT CTTTTAATGA 180 CTTTATACCA AAAATTTTCA AAAATTTCCA AAAAAAAAAA CAATAATGTT CTTTTTACGT 240 CTCTTTCCTT TTACAAAATA TATTTATTGC CTGCCTCATT TTTTTCAAAT ACTTTTTTTT 300 CCCTGTAACA GTAATTAGTA AATTGAAAAA AATAATTATT AATTTAAGTA AATAGCAGCA 360 ACATTGAGGT TTACAAATAT AGTAATAATA GTCTATCTAC AACCAATATT AAATAATTTG 420 ATCATTTAAA ACAACATTAA ATTTGAAATT TAGTACATAA TTAATAAAAG AAAAGAGGAG 480 AAACAAAAGC ATAATAAATC ATTAAAATTT GAGTATAG 518 配列番号：３ 配列の長さ：１９９２ 配列の型：核酸 鎖の型：二本鎖：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１．．１９８９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG GCT ATC CCA GAA GAA TTT GAC GTT ATT GTT TGT GGT GGT GGT TCC 48 Met Ala Ile Pro Glu Glu Phe Asp Val Ile Val Cys Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 ACT GGT TGT GTT ATT GCA GGT CGT CTT GCA AAT GTC GAT GAA AAT TTA 96 Thr Gly Cys Val Ile Ala Gly Arg Leu Ala Asn Val Asp Glu Asn Leu 20 25 30 AAA GTT TTA TTG ATT GAA AAT GGT GAA AAT AAT TTA AAT AAT CCA TGG 144 Lys Val Leu Leu Ile Glu Asn Gly Glu Asn Asn Leu Asn Asn Pro Trp 35 40 45 GTT TAT TTA CCA GGT ATT TAT CCA AGA AAT ATG AGA TTA GAT TCA AAA 192 Val Tyr Leu Pro Gly Ile Tyr Pro Arg Asn Met Arg Leu Asp Ser Lys 50 55 60 ACT GCA ACT TTT TAT AAT TCA AGA CCA TCA AAA CAT TTA AAT GGT CGT 240 Thr Ala Thr Phe Tyr Asn Ser Arg Pro Ser Lys His Leu Asn Gly Arg 65 70 75 80 CGT GCT ATT GTT CCT CAA GCT AAT ATC TTA GGT GGT GGT TCA TCT ATT 288 Arg Ala Ile Val Pro Gln Ala Asn Ile Leu Gly Gly Gly Ser Ser Ile 85 90 95 AAT TTT ATG ATG TAT ACA AGA GCT TCT GCT TCT GAT TAT GAT GAT TGG 336 Asn Phe Met Met Tyr Thr Arg Ala Ser Ala Ser Asp Tyr Asp Asp Trp 100 105 110 GAA TCT GAA GGT TGG ACT ACT GAT GAA TTA TTA CCA TTG ATG AAA AAA 384 Glu Ser Glu Gly Trp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Pro Leu Met Lys Lys 115 120 125 TTT GAA ACT TAT CAA CGT CCT TGT AAT AAC AGA GAT GTT CAT GGT TTT 432 Phe Glu Thr Tyr Gln Arg Pro Cys Asn Asn Arg Asp Val His Gly Phe 130 135 140 GAT GGT CCA ATT AAA GTT TCT TTT GGT AAT TAT ACT TAT CCT CAA TGT 480 Asp Gly Pro Ile Lys Val Ser Phe Gly Asn Tyr Thr Tyr Pro Gln Cys 145 150 155 160 CAA GAT TTC CTT AGA GCT TGT GAA ACA CAA GGT ATC CCA TAC GTT GAT 528 Gln Asp Phe Leu Arg Ala Cys Glu Thr Gln Gly Ile Pro Tyr Val Asp 165 170 175 GAT TTA GAA GAT TTG AAA ACT TCT CAT GGT GCT GAA CAA TGG TTA AAA 576 Asp Leu Glu Asp Leu Lys Thr Ser His Gly Ala Glu Gln Trp Leu Lys 180 185 190 TGG ATT AAC AGA GAT TTT GGT AGA CGT TCT GAT ACT GCT CAT GCT TTT 624 Trp Ile Asn Arg Asp Phe Gly Arg Arg Ser Asp Thr Ala His Ala Phe 195 200 205 ATT CAT TCA ACT ATG AGA AAT AAA GAA AAT TTA TTT TTA ATG ACT AAT 672 Ile His Ser Thr Met Arg Asn Lys Glu Asn Leu Phe Leu Met Thr Asn 210 215 220 ACT AAA GTT GAT AAA GTT ATT ATT GAA GAT GGT AGA GCA GTT GCA GTT 720 Thr Lys Val Asp Lys Val Ile Ile Glu Asp Gly Arg Ala Val Ala Val 225 230 235 240 AGA ACC GTT CCA TCA AAA CCA ATT GGT GAT TCT AAA GTT TCA AGA ACT 768 Arg Thr Val Pro Ser Lys Pro Ile Gly Asp Ser Lys Val Ser Arg Thr 245 250 255 TTT AAA GCT AGA AAA CAA ATT GTT GTT TCT TGT GGT ACT GTT TCT TCT 816 Phe Lys Ala Arg Lys Gln Ile Val Val Ser Cys Gly Thr Val Ser Ser 260 265 270 CCA ATG GTT TTA CAA AGA TCT GGT ATT GGT GAA CCA TCT AAA TTA AGA 864 Pro Met Val Leu Gln Arg Ser Gly Ile Gly Glu Pro Ser Lys Leu Arg 275 280 285 GCT GCT GGT GTT AAA CCA ATT GTT GAA TTA CCA GGT GTT GGT AGA AAT 912 Ala Ala Gly Val Lys Pro Ile Val Glu Leu Pro Gly Val Gly Arg Asn 290 295 300 TTC CAA GAT CAT TTC TGT TAT TTC GTT CCA TAT AGA ATC AAA CAA GAT 960 Phe Gln Asp His Phe Cys Tyr Phe Val Pro Tyr Arg Ile Lys Gln Asp 305 310 315 320 TCT GAA TCA TTC GAT GCA TTT GTC TCT GGT GAT AAA GAA GCT CAA AAA 1008 Ser Glu Ser Phe Asp Ala Phe Val Ser Gly Asp Lys Glu Ala Gln Lys 325 330 335 TCA GCT TTT GAT CAA TGG TAT GCT ACA GGT GCT GGT CCA TTA GCT ACA 1056 Ser Ala Phe Asp Gln Trp Tyr Ala Thr Gly Ala Gly Pro Leu Ala Thr 340 345 350 AAT GGT ATT GAA GCT GGT GTT AAA ATT AGA CCA ACA GAA GCT GAA TTG 1104 Asn Gly Ile Glu Ala Gly Val Lys Ile Arg Pro Thr Glu Ala Glu Leu 355 360 365 GCA ACT GCT GAT AAG GCT TTC CAA CAA GGT TGG GAA TCT TAT TTT GAA 1152 Ala Thr Ala Asp Lys Ala Phe Gln Gln Gly Trp Glu Ser Tyr Phe Glu 370 375 380 AAT AAA CCA GAT AAA CCA TTA ATG CAT TAT TCT GTT ATT TCA GGT TTC 1200 Asn Lys Pro Asp Lys Pro Leu Met His Tyr Ser Val Ile Ser Gly Phe 385 390 395 400 TTT GGT GAT CAC ACT AGA TTA CCA CCA GGA AAA TAT ATG ACT ATG TTC 1248 Phe Gly Asp His Thr Arg Leu Pro Pro Gly Lys Tyr Met Thr Met Phe 405 410 415 CAT TTC TTA GAA TAT CCA TTC TCA AGA GGT TGG TTA CAC ATT TCA TCT 1296 His Phe Leu Glu Tyr Pro Phe Ser Arg Gly Trp Leu His Ile Ser Ser 420 425 430 GAT GAT CCA TAT GCT GCT CCA GAT TTC GAT CCA GGT TTT ATG AAT GAT 1344 Asp Asp Pro Tyr Ala Ala Pro Asp Phe Asp Pro Gly Phe Met Asn Asp 435 440 445 GAC AGA GAT ATG TGG CCA ATG GTT TGG GCA TTC AAG AAA TCA AGA GAA 1392 Asp Arg Asp Met Trp Pro Met Val Trp Ala Phe Lys Lys Ser Arg Glu 450 455 460 ACC GCT AGA AGA ATG GAA TGT TTT GCT GGT GAA CCA ACA GCT TTC CAT 1440 Thr Ala Arg Arg Met Glu Cys Phe Ala Gly Glu Pro Thr Ala Phe His 465 470 475 480 CCA CAT TAT AAA GTT GAT TCT CCT GCT AGA GCT TTA GAA CAA AGT GCT 1488 Pro His Tyr Lys Val Asp Ser Pro Ala Arg Ala Leu Glu Gln Ser Ala 485 490 495 GAA GAT ACT AAG AAA GTT GCT GGT CCA CTT CAC TTA ACT GCT AAC TTG 1536 Glu Asp Thr Lys Lys Val Ala Gly Pro Leu His Leu Thr Ala Asn Leu 500 505 510 TAT CAC GGT TCT TGG TCT ACT CCA ATT GGT GAA GCT GAT AAA CAT GAT 1584 Tyr His Gly Ser Trp Ser Thr Pro Ile Gly Glu Ala Asp Lys His Asp 515 520 525 CCA AAT CAT GTT ACT TCT TCT CAT ATT AAC GTT TAC TCT AAG GAT ATT 1632 Pro Asn His Val Thr Ser Ser His Ile Asn Val Tyr Ser Lys Asp Ile 530 535 540 CAA TAC ACA AAA GAA GAT GAT GAA GCT ATT GAA AAT TAC ATT AAG GAA 1680 Gln Tyr Thr Lys Glu Asp Asp Glu Ala Ile Glu Asn Tyr Ile Lys Glu 545 550 555 560 CAC GCT GAA ACT ACA TGG CAT TGT CTT GGT ACT AAC TCC ATG GCT CCA 1728 His Ala Glu Thr Thr Trp His Cys Leu Gly Thr Asn Ser Met Ala Pro 565 570 575 AGA GAA GGT AAT AAG AAT GCT CCA GAA GGT GGT GTC TTG GAT CCA AGA 1776 Arg Glu Gly Asn Lys Asn Ala Pro Glu Gly Gly Val Leu Asp Pro Arg 580 585 590 TTA AAC GTT CAT GGT GTT AAG GGA TTA AAA GTT GCT GAT TTA TCA GTT 1824 Leu Asn Val His Gly Val Lys Gly Leu Lys Val Ala Asp Leu Ser Val 595 600 605 TGT CCA GAT AAT GTT GGT TGT AAT ACT TTC TCA ACT GCT TTA ACT ATT 1872 Cys Pro Asp Asn Val Gly Cys Asn Thr Phe Ser Thr Ala Leu Thr Ile 610 615 620 GGT GAA AAA GCT GCA GTT TTA GTA GCT GAA GAT TTA GGT TAC TCT GGT 1920 Gly Glu Lys Ala Ala Val Leu Val Ala Glu Asp Leu Gly Tyr Ser Gly 625 630 635 640 TCT GAA TTA GAT ATG GAA GTT CCA CAA CAT AAA TTA AAA ACT TAT GAA 1968 Ser Glu Leu Asp Met Glu Val Pro Gln His Lys Leu Lys Thr Tyr Glu 645 650 655 CAA ACT GGT GCT GCT CGT TAT TAA 1992 Gln Thr Gly Ala Ala Arg Tyr STP 660 配列番号：４ 配列の長さ：８５０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｒｅｐ ｏｒｉｇｉｎ 存在位置：１．．８５０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAGCTTTTTA TCACTAGTGA AATTAGTGAT TATAATGATA TAATCAAAAA TAGTACCTTG 60 GATGAGAAAA GCATTGTGTT TAATATTTAT GTATTGCACT ACACTCAATA GGACCGTGCG 120 AGGCAGTCTA AGAGATCCAC AAAATTTATG TAAATGATAT TATCACGTGA TATTAATGAA 180 ACATTTTAAT TGTTGTTTTT GCGTCGAGTT ATCAACTGAC TTCTTATGTA CTTTGTGACT 240 ATATAGATTT TGAGTAGTAT TAAGTATTTC TCAGCGCGTA ATAATCAGTG TTGGTCTACC 300 AGCTAATTAT TACTATATGA TCTCTATGAT ACGATATTCT GAGAAATGAT TAATAAGCGT 360 TAATATGCAT ACAATAACAA AATGATTTAT ATTAATTAAT AACAAAGTTA TAAAGTAAAT 420 AAATATAATA AATACAATTG AATAAAATAA GATAAGTAAG ATAGATCTCT TTTCTATTCG 480 TTATGAACTT ATAACAAACA GTAAGAGTTA AAAGGATATA GATTTATATA TATAAAAGAG 540 TAAACTATAT AGAAGGTAGT GTACTAATGC TAAGTAAACT AATCCTAAAT AAGTTGAAAA 600 CTAATAAATA CGTTAAATCC GTACATTAGA AAGTAGTGTA ATAAACAATG TAGAAATGAA 660 CTAAAGTTCA TAATCTACAT TTATATGTAT TTATAAAAAT TCGCGTGACT TTAACTTAAG 720 ATAGATTATA GTTAAAACTG CTATAGAAAT AATATGTAAC AATTTTATGT TGTATACATT 780 TAATTATATT TAGTTTATAA AAATAAAGTA TATAGTGAAA AAGTGAATAA AAGTGAATAA 840 AATAAAGCTT 850
【図面の簡単な説明】
【図１】アルコールオキシダーゼ遺伝子を含有するプラ
スミドの制限酵素地図およびそれらの作成法を示す図で
ある。
【図２】アルコールオキシダーゼ遺伝子を含む DNA 断
片の塩基配列および当該塩基配列より推定されるアミノ
酸配列を示す図である。図中、塩基配列の下線部は TAT
A 配列、転写終結シグナル、poly A 付加シグナルを示
す。アミノ酸配列の下線部は精製酵素のＮ末端配列と一
致する部分を示す。
【図３】アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター
およびターミネーターを利用した、アデニル酸キナーゼ
の発現カセットの作成法を示す図である。
【図４】アルコールオキシダーゼの発現ベクター pTRex
の制限酵素地図を示す。図中、太線は ADK 遺伝子およ
び URA3 遺伝子を含む DNA 断片を示す。
【図５】アデニル酸キナーゼを発現している 1-1 株お
よびその親株である TK62 株について、メタノール培地
あるいはグルコース培地でのアデニル酸キナーゼの生成
量と菌体量を示した図である。図中、（◇）は TK62株
（メタノール培地）、（△）は 1-1 株（メタノール培
地）、（〇）は TK62株（グルコース培地）、（□）は
1-1 株（グルコース培地）での菌体量を OD610 で測定
した結果を示し、同じ記号がぬりつぶされているとき
は、同じ菌株および培地でのアデニル酸キナーゼ活性を
示す。
【図６】アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター
およびターミネーターを利用し、その間に制限酵素 Not
I の認識部位の塩基配列を挿入した発現ベクターの作成
法を示す図である。
【図７】キャンディダ・ボイディニイの染色体 DNA 中
の自律複製配列（ARS）の塩基配列を示す図である。
【図８】４種類のプラスミドpRAC1、pRAC2、pBARCU1 お
よび pBARCU2 の構築を示す図である。
【図９】キャンディダ・ボイディニイおよびサッカロマ
イセス・セレビジアエを宿主とした場合の、欠失変異プ
ラスミドによる形質転換の効率を示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成５年７月９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】アルコールオキシダーゼ遺伝子を含有するプラ
スミドの制限酵素地図およびそれらの作成法を示す図で
ある。
【図２】アルコールオキシダーゼ遺伝子を含む DNA 断
片の塩基配列および当該塩基配列より推定されるアミノ
酸配列を示す図である。図中、塩基配列の下線部はTATA
配列を示す。アミノ酸配列の下線部は精製酵素のＮ末
端配列と一致する部分を示す。
【図３】アルコールオキシダーゼ遺伝子を含む DNA 断
片の塩基配列および当該塩基配列より推定されるアミノ
酸配列を示す図である。図中、塩基配列の下線部は転写
終結シグナル、poly A 付加シグナルを示す。
【図４】アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター
およびターミネーターを利用した、アデニル酸キナーゼ
の発現カセットの作成法を示す図である。
【図５】アルコールオキシダーゼの発現ベクター pTRex
の制限酵素地図を示す。図中、太線は ADK 遺伝子お
よび URA3 遺伝子を含む DNA 断片を示す。
【図６】アデニル酸キナーゼを発現している 1-1 株お
よびその親株である TK62 株について、メタノール培地
あるいはグルコース培地でのアデニル酸キナーゼの生成
量と菌体量を示した図である。図中、（◇）は TK62 株
（メタノール培地）、（△）は 1-1 株（メタノール培
地）、（〇）は TK62 株（グルコース培地）、（□）は
1-1 株（グルコース培地）での菌体量を OD610 で測
定した結果を示し、同じ記号がぬりつぶされているとき
は、同じ菌株および培地でのアデニル酸キナーゼ活性を
示す。
【図７】アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター
およびターミネーターを利用し、その間に制限酵素 Not
I の認識部位の塩基配列を挿入した発現ベクターの作成
法を示す図である。
【図８】キャンディダ・ボイディニイの染色体 DNA 中
の自律複製配列（ARS ）の塩基配列を示す図である。
【図９】４種類のプラスミドpRAC1 、pRAC2 、pBARCU1
および pBARCU2 の構築を示す図である。
【図１０】キャンディダ・ボイディニイおよびサッカロ
マイセス・セレビジアエを宿主とした場合の、欠失変異
プラスミドによる形質転換の効率を示す図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【図９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/08 9161−4Ｂ 9/12 ＺＮＡ 9161−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/11 15/53 15/54 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 近藤 平人 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社基礎研究所内 (72)発明者 畠中 治代 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社基礎研究所内

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 メタノールの添加により誘導可能であ
    り、且つ配列番号１の塩基配列を有するプロモーターの
    下流に目的の異種遺伝子が結合し、さらにその下流に配
    列番号２の塩基配列を有するターミネーターが結合した
    発現カセット。
  2. 【請求項２】 メタノールおよびグリセロールの添加に
    より誘導可能なアルコールオキシダーゼ遺伝子由来のプ
    ロモーターの下流に目的の異種遺伝子が結合し、さらに
    その下流にアルコールオキシダーゼ遺伝子由来のターミ
    ネーターが結合した発現カセット。
  3. 【請求項３】 グリセロールの添加により誘導可能なア
    ルコールオキシダーゼ遺伝子由来のプロモーターの下流
    に目的の異種遺伝子が結合し、さらにその下流にアルコ
    ールオキシダーゼ遺伝子由来のターミネーターが結合し
    た発現カセット。
  4. 【請求項４】 請求項１乃至３の何れか１項に記載の発
    現カセットを有する発現ベクター。
  5. 【請求項５】 宿主細胞の染色体 DNA と相同な部分を
    含み、且つこの部分において相同的組換えを起こすこと
    により、請求項１乃至３の何れか１項に記載の発現カセ
    ットを染色体 DNA に組み込ませることができることを
    特徴とする請求項４記載の発現ベクター。
  6. 【請求項６】 宿主細胞内での自律複製を可能ならしめ
    る塩基配列を有する請求項４記載の発現ベクター。
  7. 【請求項７】 宿主細胞内での自律複製を可能ならしめ
    る塩基配列が配列表４の塩基配列である請求項６記載の
    発現ベクター。
  8. 【請求項８】 請求項４乃至７の何れか１項に記載の発
    現ベクターにより形質転換された形質転換細胞。
  9. 【請求項９】 異種構造遺伝子によりコードされるペプ
    チド又は蛋白質の製造方法において、請求項８に記載の
    形質転換細胞を培養し、該培養物から該異種構造遺伝子
    の発現生産物であるペプチド又は蛋白質を単離、精製す
    ることを特徴とする製造方法。
  10. 【請求項１０】 異種構造遺伝子がサッカロマイセス・
    セレビジアエ（Sacc haromyces cerevisiae）由来のアデ
    ニル酸キナーゼをコードする遺伝子である請求項９記載
    の製造方法。
  11. 【請求項１１】 異種構造遺伝子が好熱性水素細菌(Hyd
    rogenobacter therm ophilus)由来のチトクローム C552
    をコードする遺伝子である請求項９記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】 異種構造遺伝子がアルスロマイセス・
    ラモサス(Arthromyc es ramosus)由来のペルオキシダー
    ゼをコードする遺伝子である請求項９記載の製造方法。
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