JPH05336988A - ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗体Info
- Publication number
- JPH05336988A JPH05336988A JP3214133A JP21413391A JPH05336988A JP H05336988 A JPH05336988 A JP H05336988A JP 3214133 A JP3214133 A JP 3214133A JP 21413391 A JP21413391 A JP 21413391A JP H05336988 A JPH05336988 A JP H05336988A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- keto
- pgf
- dinor
- antibody
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特
異的に認識するモノクローナル抗体。 【効果】 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特
異的に認識し、それ以外のＰＧ類似化合物とはほとんど
交差しない（１％以下）。従って、２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αの免疫学的定量法や精製法に利用で
きる。
異的に認識するモノクローナル抗体。 【効果】 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特
異的に認識し、それ以外のＰＧ類似化合物とはほとんど
交差しない（１％以下）。従って、２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αの免疫学的定量法や精製法に利用で
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、２，３−ジノル−６−
ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗
体に関するものである。
ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗
体に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】プロスタグランジン（以下、ＰＧと略記
する。）Ｉ2 は、式
する。）Ｉ2 は、式
【化１】
【０００３】で示される生体内活性物質であって、強力
な血管拡張作用、降圧作用、血小板凝集抑制作用を有す
る。ＰＧＩ2 は哺乳動物の血管壁より産生されるが、非
常に不安定でその半減期は約５分と極めて短い。ＰＧＩ
2 は血液中ですぐに代謝され、式
な血管拡張作用、降圧作用、血小板凝集抑制作用を有す
る。ＰＧＩ2 は哺乳動物の血管壁より産生されるが、非
常に不安定でその半減期は約５分と極めて短い。ＰＧＩ
2 は血液中ですぐに代謝され、式
【０００４】
【化２】 で示される６−ケト−ＰＧＦ１αになり、さらに肝臓中
でβ−酸化を受けて、６−ケト−ＰＧＦ１αよりカルボ
キシ側鎖が炭素原子２原子分短い、式
でβ−酸化を受けて、６−ケト−ＰＧＦ１αよりカルボ
キシ側鎖が炭素原子２原子分短い、式
【０００５】
【化３】 で示される２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αとい
う安定代謝物へと代謝される。
う安定代謝物へと代謝される。
【０００６】
【従来の技術とその問題点】今日、さまざまな病態にお
けるＰＧＩ2 の関与を検討するため、血中あるいは尿中
のＰＧＩ2 代謝物の定量が試みられている。一般に、
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αは全身的なＰＧ
Ｉ2 レベルをよく反映していると考えられている。従っ
て、最近では２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの
定量がさかんに試みられている。例えば、Clin. Chem.,
36, 1978(1990) 、J. Chromatog., 383,317(1986) 、B
iology of icosanoids, Colloque INSERM, 152, 187(19
87) に詳しく記載されているが、これらはいずれも、
６−ケト−ＰＧＦ１αに対する抗体が２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αをも認識する（この現象を交差反
応と呼ぶ。）ことを利用したものである。例えば、Cli
n. Chem. に記載された抗体は６−ケト−ＰＧＦ１αに
対する結合を１００としたとき、同じ条件で２，３−ジ
ノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対しても１００結合し
（すなわち、交差率１００％）、またJ. Chromatog. お
よびBiology of icosanoids に記載された抗体は、２，
３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対する交差率がそ
れぞれ１６％および６０％であることが報告されてい
る。
けるＰＧＩ2 の関与を検討するため、血中あるいは尿中
のＰＧＩ2 代謝物の定量が試みられている。一般に、
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αは全身的なＰＧ
Ｉ2 レベルをよく反映していると考えられている。従っ
て、最近では２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの
定量がさかんに試みられている。例えば、Clin. Chem.,
36, 1978(1990) 、J. Chromatog., 383,317(1986) 、B
iology of icosanoids, Colloque INSERM, 152, 187(19
87) に詳しく記載されているが、これらはいずれも、
６−ケト−ＰＧＦ１αに対する抗体が２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αをも認識する（この現象を交差反
応と呼ぶ。）ことを利用したものである。例えば、Cli
n. Chem. に記載された抗体は６−ケト−ＰＧＦ１αに
対する結合を１００としたとき、同じ条件で２，３−ジ
ノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対しても１００結合し
（すなわち、交差率１００％）、またJ. Chromatog. お
よびBiology of icosanoids に記載された抗体は、２，
３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対する交差率がそ
れぞれ１６％および６０％であることが報告されてい
る。
【０００７】このように６−ケト−ＰＧＦ１αに対する
抗血清を用いて、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ
１αを定量する場合には、採取したサンプルから交差率
の大きいＰＧ類似化合物（６−ケト−ＰＧＦ１α）を予
めＨＰＬＣなどで除去しておく必要がある。この前処理
は煩雑な操作であり、大量のサンプルを短時間で定量す
る場合には大きな障害となる。
抗血清を用いて、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ
１αを定量する場合には、採取したサンプルから交差率
の大きいＰＧ類似化合物（６−ケト−ＰＧＦ１α）を予
めＨＰＬＣなどで除去しておく必要がある。この前処理
は煩雑な操作であり、大量のサンプルを短時間で定量す
る場合には大きな障害となる。
【０００８】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、ＰＧＩ
2 の安定代謝物である２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧ
Ｆ１αの定量法を鋭意検討する中で、２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を作製することに成功し、本発明を完成するに至
った。２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対する
抗体を得たという報告はポリクローナル、モノクローナ
ルを問わずこれまでまったくなされていない。従って、
本発明は完全に新規な物質に関するものであるというこ
とができる。
2 の安定代謝物である２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧ
Ｆ１αの定量法を鋭意検討する中で、２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を作製することに成功し、本発明を完成するに至
った。２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対する
抗体を得たという報告はポリクローナル、モノクローナ
ルを問わずこれまでまったくなされていない。従って、
本発明は完全に新規な物質に関するものであるというこ
とができる。
【０００９】
【発明の構成】本発明は、２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗体に関
する。本発明には、本発明の実施例で得られたモノクロ
ーナル抗体の抗原結合部位以外の抗原結合部位を有する
モノクローナル抗体も含まれる。また、免疫グロブリン
のクラスおよびサブクラスも特に限定されるものではな
いが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭクラスであり、特
に好ましくはＩｇＧクラスである。本発明に含まれるモ
ノクローナル抗体の具体的な例としては、ＭＫ−１１Ｅ
４が挙げられるが、本発明はこのモノクローナル抗体の
みに限定されるものではない。本発明のモノクローナル
抗体は、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異
的に認識する。すなわち、２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１α以外のＰＧ類似化合物とはほとんど交差しな
い点に特徴を有する。
ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗体に関
する。本発明には、本発明の実施例で得られたモノクロ
ーナル抗体の抗原結合部位以外の抗原結合部位を有する
モノクローナル抗体も含まれる。また、免疫グロブリン
のクラスおよびサブクラスも特に限定されるものではな
いが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭクラスであり、特
に好ましくはＩｇＧクラスである。本発明に含まれるモ
ノクローナル抗体の具体的な例としては、ＭＫ−１１Ｅ
４が挙げられるが、本発明はこのモノクローナル抗体の
みに限定されるものではない。本発明のモノクローナル
抗体は、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異
的に認識する。すなわち、２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１α以外のＰＧ類似化合物とはほとんど交差しな
い点に特徴を有する。
【００１０】本発明のモノクローナル抗体のうち、好ま
しいものはＰＧＦ２α、ＰＧＦ１α、６−ケト−ＰＧＦ
１α、ＰＧＦ２α−ＭＰＭおよびＰＧＦ２α−ＭＵＭと
の交差率が1.0 ％以下のものである。例えば、本発明の
モノクローナル抗体のうちのひとつ、ＭＫ−１１Ｅ４の
ＰＧＦ２α、ＰＧＦ１α、６−ケト−ＰＧＦ１α、ＰＧ
Ｆ２α−ＭＰＭおよびＰＧＦ２α−ＭＵＭとの交差率
は、それぞれ0.1 ％、0.6 ％、0.42％、0.015 ％以下お
よび0.015 ％以下である。
しいものはＰＧＦ２α、ＰＧＦ１α、６−ケト−ＰＧＦ
１α、ＰＧＦ２α−ＭＰＭおよびＰＧＦ２α−ＭＵＭと
の交差率が1.0 ％以下のものである。例えば、本発明の
モノクローナル抗体のうちのひとつ、ＭＫ−１１Ｅ４の
ＰＧＦ２α、ＰＧＦ１α、６−ケト−ＰＧＦ１α、ＰＧ
Ｆ２α−ＭＰＭおよびＰＧＦ２α−ＭＵＭとの交差率
は、それぞれ0.1 ％、0.6 ％、0.42％、0.015 ％以下お
よび0.015 ％以下である。
【００１１】
【命名法】本発明の研究過程において、２，３−ジノル
−６−ケト−ＰＧＦ１αは式（３）で示されるような構
造で存在する可能性は低いことが判明した。すなわち、
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αはケト−エノー
ル型の互変異性をとり、分子内ラクトン化を起こして、
下式のような平衡関係にあると推察される。
−６−ケト−ＰＧＦ１αは式（３）で示されるような構
造で存在する可能性は低いことが判明した。すなわち、
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αはケト−エノー
ル型の互変異性をとり、分子内ラクトン化を起こして、
下式のような平衡関係にあると推察される。
【００１２】
【化４】
【００１３】特許請求の範囲を含む本明細書において
は、式（３ｂ）の化合物を２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１αのスピロラクトン体、または式（３ａ）化合
物を２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのヘミアセ
タール体と命名することとする。さらに、２，３−ジノ
ル−６−ケト−ＰＧＦ１αという用語を特に制限するこ
となく用いた場合には、相当するスピロラクトン体およ
び相当するヘミアセタール体をも含んでいるものとす
る。また、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの２
０位のメチル基を他の官能基に置き換えた化合物はω−
置換−２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αとして命
名することとする。例えば、式
は、式（３ｂ）の化合物を２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１αのスピロラクトン体、または式（３ａ）化合
物を２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのヘミアセ
タール体と命名することとする。さらに、２，３−ジノ
ル−６−ケト−ＰＧＦ１αという用語を特に制限するこ
となく用いた場合には、相当するスピロラクトン体およ
び相当するヘミアセタール体をも含んでいるものとす
る。また、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの２
０位のメチル基を他の官能基に置き換えた化合物はω−
置換−２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αとして命
名することとする。例えば、式
【００１４】
【化５】 および
【００１５】
【化６】 は、それぞれω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケ
ト−ＰＧＦ１αおよびω−カルボキシ−２，３−ジノル
−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体として命名
される。
ト−ＰＧＦ１αおよびω−カルボキシ−２，３−ジノル
−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体として命名
される。
【００１６】本発明のモノクローナル抗体は、(1) ω鎖
（ＰＧ骨格中の下の側鎖）を修飾した２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体をキャリア−
タン白にコンジュゲートし、(2) 得られたＰＧ−タン白
結合物を免疫抗原として、マウスを感作し、(3) 感作マ
ウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞を細胞融合し、
(4) 得られたハイブリドーマより、２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αに対するモノクローナル抗体を産生
する細胞をスクリーニングし、(5) 目的とする抗体産生
ハイブリドーマをクロ−ニングし、(6) クローン化され
た抗体産生ハイブリドーマを増殖させ、(7) 産生された
抗体を分離精製することによって調整することができ
る。
（ＰＧ骨格中の下の側鎖）を修飾した２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体をキャリア−
タン白にコンジュゲートし、(2) 得られたＰＧ−タン白
結合物を免疫抗原として、マウスを感作し、(3) 感作マ
ウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞を細胞融合し、
(4) 得られたハイブリドーマより、２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αに対するモノクローナル抗体を産生
する細胞をスクリーニングし、(5) 目的とする抗体産生
ハイブリドーマをクロ−ニングし、(6) クローン化され
た抗体産生ハイブリドーマを増殖させ、(7) 産生された
抗体を分離精製することによって調整することができ
る。
【００１７】より具体的に各ステップを説明すると以下
のようになる。(1) の工程における、ω鎖を修飾した
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクト
ン体とは、ω−末端部分でキャリア−タン白の特性基と
直接または間接的に結合できるように、ω−末端に反応
性官能基を導入した２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ
１αのスピロラクトン体を意味する。この反応性官能基
は、キャリア−タン白と直接または間接に結合できるも
のであれば特に限定されない。より具体的には、カルボ
キシル基（−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、ホ
ルミル基（−ＣＨＯ）、アミノ基（−ＮＨ2 ）、アジド
基（−Ｎ3 ）、メルカプト基（−ＳＨ）、スルホ基（−
ＳＯ3 Ｈ）などが挙げられ、好ましくは、カルボキシル
基である。これらの反応性官能基は２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体の２０位の炭素
原子に結合している必要はない。１８位以降の３個の炭
素原子が１乃至３個欠如しているか、あるいは２０位以
降に炭素数１乃至３個のアルキル鎖が付加された２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体の
ω鎖末端に官能基が導入された化合物も同じようにハプ
テンＰＧとして用いることができる。このようなハプテ
ンＰＧを用いても得られたモノクローナル抗体は２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに十分特異的に結合す
るものと考えられる。
のようになる。(1) の工程における、ω鎖を修飾した
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクト
ン体とは、ω−末端部分でキャリア−タン白の特性基と
直接または間接的に結合できるように、ω−末端に反応
性官能基を導入した２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ
１αのスピロラクトン体を意味する。この反応性官能基
は、キャリア−タン白と直接または間接に結合できるも
のであれば特に限定されない。より具体的には、カルボ
キシル基（−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、ホ
ルミル基（−ＣＨＯ）、アミノ基（−ＮＨ2 ）、アジド
基（−Ｎ3 ）、メルカプト基（−ＳＨ）、スルホ基（−
ＳＯ3 Ｈ）などが挙げられ、好ましくは、カルボキシル
基である。これらの反応性官能基は２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体の２０位の炭素
原子に結合している必要はない。１８位以降の３個の炭
素原子が１乃至３個欠如しているか、あるいは２０位以
降に炭素数１乃至３個のアルキル鎖が付加された２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体の
ω鎖末端に官能基が導入された化合物も同じようにハプ
テンＰＧとして用いることができる。このようなハプテ
ンＰＧを用いても得られたモノクローナル抗体は２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに十分特異的に結合す
るものと考えられる。
【００１８】ω鎖を修飾した２，３−ジノル−６−ケト
−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体は、公知のＰＧ合成法
に従って容易に製造することができる。代表的な合成ス
キームを以下の反応工程式Ｉに示す。さらに、反応工程
式Ｉ中、出発物質として用いられる式（９）の化合物の
代表的な合成スキームを反応工程式IIに示す
−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体は、公知のＰＧ合成法
に従って容易に製造することができる。代表的な合成ス
キームを以下の反応工程式Ｉに示す。さらに、反応工程
式Ｉ中、出発物質として用いられる式（９）の化合物の
代表的な合成スキームを反応工程式IIに示す
【００１９】
【化７】
【００２０】
【化８】
【００２１】
【化９】
【００２２】
【化１０】
【００２３】
【化１１】
【００２４】前記した反応工程式中、各略号はそれぞれ
以下の意味を表わす。 Ｅｔ ：エチル基 ｉＰｒ：ｉ−プロピル基 ｎＢｕ：ｎ−ブチル基 ｔＢｕ：ｔ−ブチル基 Ａｃ ：アセチル基 φ ：フェニル基 Ｍｓ ：メシル基 Ｔｓ ：トシル基 ＴＨＰ：テトラヒドロピラン−２−イル基 ＢＭＳ：ｔ−ブチルジメチルシリル基 Ｐｙ ：ピリジン ＴＨＦ：テトラヒドロフラン ＤＨＰ：ジヒドロピラン ＤＥＡＤ：ジエチルアゾジカルボキシレート ＳＢＮ：（ｓ）−（−）−ビナフトール
以下の意味を表わす。 Ｅｔ ：エチル基 ｉＰｒ：ｉ−プロピル基 ｎＢｕ：ｎ−ブチル基 ｔＢｕ：ｔ−ブチル基 Ａｃ ：アセチル基 φ ：フェニル基 Ｍｓ ：メシル基 Ｔｓ ：トシル基 ＴＨＰ：テトラヒドロピラン−２−イル基 ＢＭＳ：ｔ−ブチルジメチルシリル基 Ｐｙ ：ピリジン ＴＨＦ：テトラヒドロフラン ＤＨＰ：ジヒドロピラン ＤＥＡＤ：ジエチルアゾジカルボキシレート ＳＢＮ：（ｓ）−（−）−ビナフトール
【００２５】各工程は、反応工程式中に記載した試薬を
用いて公知の方法で行なうことができる。反応工程式II
中、出発物質として用いた式（１３）の化合物は、特開
昭50-137961 号明細書、参考例１および８に記載された
方法により製造される公知化合物である。１８位以降の
３個の炭素原子が１乃至３個欠如しているか、あるいは
２０位以降に炭素数１乃至３個のアルキル鎖が付加され
た２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラク
トン体のω鎖末端に官能基が導入された化合物も前記し
た反応工程式と同様にして（ただし、化合物（１３）か
ら化合物（１４）を合成する工程で使用する式
用いて公知の方法で行なうことができる。反応工程式II
中、出発物質として用いた式（１３）の化合物は、特開
昭50-137961 号明細書、参考例１および８に記載された
方法により製造される公知化合物である。１８位以降の
３個の炭素原子が１乃至３個欠如しているか、あるいは
２０位以降に炭素数１乃至３個のアルキル鎖が付加され
た２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラク
トン体のω鎖末端に官能基が導入された化合物も前記し
た反応工程式と同様にして（ただし、化合物（１３）か
ら化合物（１４）を合成する工程で使用する式
【００２６】
【化１２】
【００２７】で示されるホスホネート化合物の代わり
に、所望のアルキル鎖長を有するホスホネート化合物を
使用する必要がある。）製造するすることができる。適
当なキャリア−タン白としては、アルブミン、グロブリ
ン、サイログロブリン、ヘモシアニン、エデスチンなど
の天然タン白、およびポリリジンなどの合成ポリペプチ
ドが挙げられるが、好ましくは、アルブミンである。ω
鎖を修飾した２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの
スピロラクトン体とキャリア−タン白を結合する反応は
公知であり、例えば、文献「酵素免疫測定法」、第２版
（１９８２年）、石川栄治ら編、医学書院発行、８２頁
に詳しく記載されている。すなわち、適当な溶媒（例え
ば、リン酸緩衝液）中、ハプテンとなるＰＧとキャリア
−タン白を直接結合できる場合には、カルボジイミド
法、酸無水物法、マレイミド法など、好ましくはシクロ
ヘキシルカルボジイミドまたは１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを縮合剤とし
て用いる方法、またハプテンＰＧとキャリア−タン白を
直接結合できない場合には、この分野で公知の架橋剤、
例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン
を用いる方法を用いて行なわれる。反応後、目的物はカ
ラムクロマトグラフィーにかけて単離精製される。
に、所望のアルキル鎖長を有するホスホネート化合物を
使用する必要がある。）製造するすることができる。適
当なキャリア−タン白としては、アルブミン、グロブリ
ン、サイログロブリン、ヘモシアニン、エデスチンなど
の天然タン白、およびポリリジンなどの合成ポリペプチ
ドが挙げられるが、好ましくは、アルブミンである。ω
鎖を修飾した２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの
スピロラクトン体とキャリア−タン白を結合する反応は
公知であり、例えば、文献「酵素免疫測定法」、第２版
（１９８２年）、石川栄治ら編、医学書院発行、８２頁
に詳しく記載されている。すなわち、適当な溶媒（例え
ば、リン酸緩衝液）中、ハプテンとなるＰＧとキャリア
−タン白を直接結合できる場合には、カルボジイミド
法、酸無水物法、マレイミド法など、好ましくはシクロ
ヘキシルカルボジイミドまたは１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを縮合剤とし
て用いる方法、またハプテンＰＧとキャリア−タン白を
直接結合できない場合には、この分野で公知の架橋剤、
例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン
を用いる方法を用いて行なわれる。反応後、目的物はカ
ラムクロマトグラフィーにかけて単離精製される。
【００２８】(2) の免疫感作の工程は、初回免疫感作時
には、(1) で得られた、ハプテンＰＧとキャリア−タン
白との結合物を生理的食塩含有リン酸緩衝液（以下、Ｐ
ＢＳと略記する。）中に溶解し、フロイントの完全アジ
ュバント（ＦＣＡ）と１：１の割合で乳化させたものを
マウスに腹腔内投与する。さらに１〜２週間間隔で数
回、ハプテンＰＧとキャリア−タン白との結合物を含む
ＰＢＳをフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）
と１：１の割合で乳化させたものを腹腔内投与し、１〜
２週間後、ハプテンＰＧとキャリア−タン白との結合物
を含むＰＢＳを腹腔内投与することによって行なわれ
る。用いられるマウスの種類は、特に限定されないが、
好ましくはＢＡＬＢ／ｃである。感作の回数は特に限定
されないが、抗体価が十分上がるまで行なうのが望まし
い。抗原の投与量も特に限定されないが、１回につき１
００〜２００μｇ（キャリア−タン白量として）を投与
すれば十分である。免疫感作の工程では、途中マウスの
血中抗体価を測定し、抗体価が十分に上昇していること
を確認するのが望ましい。血中抗体価の測定は、通常の
方法で行なわれる。すなわち、マウス血清の希釈液（例
えば、ＰＢＳ希釈液）とハプテンとして用いたＰＧの標
識物とを反応させた後、抗体画分を分離し、標識物量を
定量することによって行なわれる。
には、(1) で得られた、ハプテンＰＧとキャリア−タン
白との結合物を生理的食塩含有リン酸緩衝液（以下、Ｐ
ＢＳと略記する。）中に溶解し、フロイントの完全アジ
ュバント（ＦＣＡ）と１：１の割合で乳化させたものを
マウスに腹腔内投与する。さらに１〜２週間間隔で数
回、ハプテンＰＧとキャリア−タン白との結合物を含む
ＰＢＳをフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）
と１：１の割合で乳化させたものを腹腔内投与し、１〜
２週間後、ハプテンＰＧとキャリア−タン白との結合物
を含むＰＢＳを腹腔内投与することによって行なわれ
る。用いられるマウスの種類は、特に限定されないが、
好ましくはＢＡＬＢ／ｃである。感作の回数は特に限定
されないが、抗体価が十分上がるまで行なうのが望まし
い。抗原の投与量も特に限定されないが、１回につき１
００〜２００μｇ（キャリア−タン白量として）を投与
すれば十分である。免疫感作の工程では、途中マウスの
血中抗体価を測定し、抗体価が十分に上昇していること
を確認するのが望ましい。血中抗体価の測定は、通常の
方法で行なわれる。すなわち、マウス血清の希釈液（例
えば、ＰＢＳ希釈液）とハプテンとして用いたＰＧの標
識物とを反応させた後、抗体画分を分離し、標識物量を
定量することによって行なわれる。
【００２９】(3) の細胞融合は、(2) で免疫感作したマ
ウスのうち、抗体価が十分に上昇してきたマウスの脾臓
を摘出し、常法に従って、脾細胞の懸濁液を調製し、次
に得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞との混合物に
３７℃でポリエチレングリコール（好ましくは、ＰＥＧ
1000）を加えることによって行なわれる。マウスミエロ
ーマ細胞にはＰ３×６３Ａｇ８、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａ
ｇ４−１、ＳＰ−２／０−ＡＧ−１４など数種類が知ら
れており、いずれも容易に入手可能である。ミエローマ
細胞はＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンお
よびチミジンを含む培地）では生存できないＨＧＰＲＴ
（ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トラン
スフェラーゼ）欠損細胞株が有用であり、さらにミエロ
ーマ細胞自身が抗体を分泌しない細胞株であることが望
ましい。好適にはＳＰ−２／０−Ａｇ−１４が用いられ
る。次に、得られた細胞融合の混合物を、低細胞密度で
９６マイクロウェルプレートに分注し、ＨＡＴ培地で培
養する。１〜２週間の培養で未融合のミエローマ細胞、
ミエローマ細胞同志のハイブリドーマ、さらに未融合の
脾細胞、脾細胞同志のハイブリドーマは生存条件が満足
されないため死滅し、脾細胞とミエローマ細胞とのハイ
ブリドーマのみが増殖してくる。
ウスのうち、抗体価が十分に上昇してきたマウスの脾臓
を摘出し、常法に従って、脾細胞の懸濁液を調製し、次
に得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞との混合物に
３７℃でポリエチレングリコール（好ましくは、ＰＥＧ
1000）を加えることによって行なわれる。マウスミエロ
ーマ細胞にはＰ３×６３Ａｇ８、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａ
ｇ４−１、ＳＰ−２／０−ＡＧ−１４など数種類が知ら
れており、いずれも容易に入手可能である。ミエローマ
細胞はＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンお
よびチミジンを含む培地）では生存できないＨＧＰＲＴ
（ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トラン
スフェラーゼ）欠損細胞株が有用であり、さらにミエロ
ーマ細胞自身が抗体を分泌しない細胞株であることが望
ましい。好適にはＳＰ−２／０−Ａｇ−１４が用いられ
る。次に、得られた細胞融合の混合物を、低細胞密度で
９６マイクロウェルプレートに分注し、ＨＡＴ培地で培
養する。１〜２週間の培養で未融合のミエローマ細胞、
ミエローマ細胞同志のハイブリドーマ、さらに未融合の
脾細胞、脾細胞同志のハイブリドーマは生存条件が満足
されないため死滅し、脾細胞とミエローマ細胞とのハイ
ブリドーマのみが増殖してくる。
【００３０】(4) のスクリーニングは、ハイブリドーマ
培養上清と、ハプテンとして用いたＰＧの標識物とを反
応させた後、抗体画分を分離し、抗体画分中の標識物量
を定量することによって、２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１αに対する抗体を産生しているハイブリドーマ
か否かを判定する。(5) の工程は、抗体産生ハイブリド
ーマを軟寒天培養法［Monoclonal Antibodies, 372頁
(1980年）参照のこと］に従ってクローニングすること
によって行なわれる。この際、限界希釈法を用いること
も可能である。(6) の工程は、クローン化されたハイブ
リドーマを通常の培地で培養し、その培養上清から分離
精製することによって得られるが、より大量の抗体を効
率よく得るにはハイブリドーマをマウス腹腔内に投与
し、増殖させ、その腹水中より分離精製する方法が用い
られる。
培養上清と、ハプテンとして用いたＰＧの標識物とを反
応させた後、抗体画分を分離し、抗体画分中の標識物量
を定量することによって、２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１αに対する抗体を産生しているハイブリドーマ
か否かを判定する。(5) の工程は、抗体産生ハイブリド
ーマを軟寒天培養法［Monoclonal Antibodies, 372頁
(1980年）参照のこと］に従ってクローニングすること
によって行なわれる。この際、限界希釈法を用いること
も可能である。(6) の工程は、クローン化されたハイブ
リドーマを通常の培地で培養し、その培養上清から分離
精製することによって得られるが、より大量の抗体を効
率よく得るにはハイブリドーマをマウス腹腔内に投与
し、増殖させ、その腹水中より分離精製する方法が用い
られる。
【００３１】(7) の工程は、通常の方法、例えば塩析、
イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どにより精製できるが、より効果的にはプロテインＡ−
セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）を用いた
アフィニティークロマトグラフィーが用いられる。本発
明のモノクローナル抗体は、２，３−ジノル−６−ケト
−ＰＧＦ１αを特異的に認識するので、２，３−ジノル
−６−ケト−ＰＧＦ１αの精製、例えばアフィニティー
クロマトグラフィーなどに利用することができる（特開
平2-191544号明細書参照のこと）。しかし、本発明のモ
ノクローナル抗体の最大かつ重要な利用方法は、精度お
よび検出限界に優れた２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧ
Ｆ１αの免疫学的定量法への適用である。
イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どにより精製できるが、より効果的にはプロテインＡ−
セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）を用いた
アフィニティークロマトグラフィーが用いられる。本発
明のモノクローナル抗体は、２，３−ジノル−６−ケト
−ＰＧＦ１αを特異的に認識するので、２，３−ジノル
−６−ケト−ＰＧＦ１αの精製、例えばアフィニティー
クロマトグラフィーなどに利用することができる（特開
平2-191544号明細書参照のこと）。しかし、本発明のモ
ノクローナル抗体の最大かつ重要な利用方法は、精度お
よび検出限界に優れた２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧ
Ｆ１αの免疫学的定量法への適用である。
【００３２】２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの
ような低分子の物質の免疫学的定量法としては競合法が
一般的である。競合法は、(i) 標識抗原と非標識抗原を
抗体に対して競合反応させ、次に(ii)抗体と結合した
（または結合していない）標識抗原を定量することによ
り、非標識抗原量を算出する方法である。抗体に結合し
た（または結合していない）標識抗原量を知るには、抗
体結合抗原と非結合抗原を分離しないで定量する方法
（ホモジニアス）もあるが、抗体結合抗原（Bound,、Ｂ
と略す。）と非結合抗原（free, Ｆと略す。）を分離し
て（Ｂ／Ｆ分離という。）測定する方法（ヘテロジニア
ス）が一般的である。標識抗原としては、２，３−ジノ
ル−６−ケト−ＰＧＦ１αまたは２，３−ジノル−６−
ケト−ＰＧＦ１αの類似化合物（すなわち、抗２，３−
ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１α抗体と交差反応をするも
の、例えば、ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケ
ト−ＰＧＦ１α）の放射標識抗原あるいは酵素標識抗原
が用いられる。ここで用いられる酵素としては、一般に
酵素免疫測定に用いられる酵素であれば何でもよく、例
えばペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素、アセチルコルンエステ
ラーゼ、アルコール脱水素酵素などが挙げられる。
ような低分子の物質の免疫学的定量法としては競合法が
一般的である。競合法は、(i) 標識抗原と非標識抗原を
抗体に対して競合反応させ、次に(ii)抗体と結合した
（または結合していない）標識抗原を定量することによ
り、非標識抗原量を算出する方法である。抗体に結合し
た（または結合していない）標識抗原量を知るには、抗
体結合抗原と非結合抗原を分離しないで定量する方法
（ホモジニアス）もあるが、抗体結合抗原（Bound,、Ｂ
と略す。）と非結合抗原（free, Ｆと略す。）を分離し
て（Ｂ／Ｆ分離という。）測定する方法（ヘテロジニア
ス）が一般的である。標識抗原としては、２，３−ジノ
ル−６−ケト−ＰＧＦ１αまたは２，３−ジノル−６−
ケト−ＰＧＦ１αの類似化合物（すなわち、抗２，３−
ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１α抗体と交差反応をするも
の、例えば、ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケ
ト−ＰＧＦ１α）の放射標識抗原あるいは酵素標識抗原
が用いられる。ここで用いられる酵素としては、一般に
酵素免疫測定に用いられる酵素であれば何でもよく、例
えばペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素、アセチルコルンエステ
ラーゼ、アルコール脱水素酵素などが挙げられる。
【００３３】Ｂ／Ｆ分離の方法も特に限定されることは
ない。放射標識抗原の場合には、ポリエチレングリコー
ルによる沈殿法、活性炭による吸着法などがよく用いら
れる。酵素標識抗原の場合には、第１抗体固相法、第２
抗体法などがある。第１抗体固相法は、(1) 固相化した
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対するモノク
ローナル抗体（第１抗体）に、２，３−ジノル−６−ケ
ト−ＰＧＦ１αを含有するサンプル、および標識抗原を
添加して、競合反応させ、次に(2) 液相を除去した後、
固相に結合した標識物の活性を測定することによってサ
ンプル中の２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの量
を測定する方法である。第１抗体としては、本発明のモ
ノクローナル抗体、例えばＭＫ−１１Ｅ４が用いられ
る。免疫学的定量法に用いられる固相および固定化方法
はよく知られている［千畑一郎編、固定化酵素（1975
年、講談社発行）参照のこと］。例えば、固相として
は、ポリスチレンプレート、ポリスチレンビーズ、ナイ
ロンビーズ、ガラスビーズ、プロテインＡアガローズビ
ーズ、プロテインＧアガローズビーズ、ポリスチレンチ
ューブなどが挙げられる。固定化は、物理的吸着や共有
結合による不溶化法が用いられる。標識抗原の標識物と
しては一般に酵素が用いられるが、放射物質や蛍光物質
も使用できる。ここで用いられる酵素としては、一般に
酵素免疫測定に用いられる酵素であれば何でもよく、例
えば先に列挙した酵素が挙げられる。第１抗体とサンプ
ルおよび標識抗原との反応は、通常４℃、約１０時間か
けて行なうのが望ましい。
ない。放射標識抗原の場合には、ポリエチレングリコー
ルによる沈殿法、活性炭による吸着法などがよく用いら
れる。酵素標識抗原の場合には、第１抗体固相法、第２
抗体法などがある。第１抗体固相法は、(1) 固相化した
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対するモノク
ローナル抗体（第１抗体）に、２，３−ジノル−６−ケ
ト−ＰＧＦ１αを含有するサンプル、および標識抗原を
添加して、競合反応させ、次に(2) 液相を除去した後、
固相に結合した標識物の活性を測定することによってサ
ンプル中の２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの量
を測定する方法である。第１抗体としては、本発明のモ
ノクローナル抗体、例えばＭＫ−１１Ｅ４が用いられ
る。免疫学的定量法に用いられる固相および固定化方法
はよく知られている［千畑一郎編、固定化酵素（1975
年、講談社発行）参照のこと］。例えば、固相として
は、ポリスチレンプレート、ポリスチレンビーズ、ナイ
ロンビーズ、ガラスビーズ、プロテインＡアガローズビ
ーズ、プロテインＧアガローズビーズ、ポリスチレンチ
ューブなどが挙げられる。固定化は、物理的吸着や共有
結合による不溶化法が用いられる。標識抗原の標識物と
しては一般に酵素が用いられるが、放射物質や蛍光物質
も使用できる。ここで用いられる酵素としては、一般に
酵素免疫測定に用いられる酵素であれば何でもよく、例
えば先に列挙した酵素が挙げられる。第１抗体とサンプ
ルおよび標識抗原との反応は、通常４℃、約１０時間か
けて行なうのが望ましい。
【００３４】(2) の標識物の活性の測定も公知の方法に
より行なわれる。例えば、ペルオキシダーゼで標識した
場合には、基質として３，３′，５，５′−テトラメチ
ルベンチジンを用いて過酸化水素と反応させ、反応生成
物の吸光度を測定することによって行なわれる。この場
合、基質として３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピ
オン酸やオルトフェニレンジアミン、ルミノールなどを
使用することもできる。これ以外の酵素で標識した場合
でも適当な基質を用いて行なわれる。第２抗体法には、
第１抗体と第２抗体の反応を液相で行なう方法と、第２
抗体固相法がある。特に、第２抗体固相法は、第２抗体
を固相化することによりＢ／Ｆ分離が容易となって有利
である。第２抗体固相法は、(1) マウスＩｇＧに対する
抗体（第２抗体）を固相化し、(2) そこに、２，３−ジ
ノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを含むサンプル、標識抗原
および２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対する
モノクローナル抗体（第１抗体）を加え、反応させた
後、(3) 固相の標識を測定することによって行なわれ
る。
より行なわれる。例えば、ペルオキシダーゼで標識した
場合には、基質として３，３′，５，５′−テトラメチ
ルベンチジンを用いて過酸化水素と反応させ、反応生成
物の吸光度を測定することによって行なわれる。この場
合、基質として３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピ
オン酸やオルトフェニレンジアミン、ルミノールなどを
使用することもできる。これ以外の酵素で標識した場合
でも適当な基質を用いて行なわれる。第２抗体法には、
第１抗体と第２抗体の反応を液相で行なう方法と、第２
抗体固相法がある。特に、第２抗体固相法は、第２抗体
を固相化することによりＢ／Ｆ分離が容易となって有利
である。第２抗体固相法は、(1) マウスＩｇＧに対する
抗体（第２抗体）を固相化し、(2) そこに、２，３−ジ
ノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを含むサンプル、標識抗原
および２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対する
モノクローナル抗体（第１抗体）を加え、反応させた
後、(3) 固相の標識を測定することによって行なわれ
る。
【００３５】第２抗体は、マウスＩｇＧに対する抗体で
あればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも
よく、また感作する動物種に制限はない。マウスＩｇＧ
に対するポリクローナル抗体は、マウス血清あるいはマ
ウスγ−グロブリンを一般的に知られた方法で別種の動
物（例えばラット、モルモット、ウサギ、ヤギなど）に
投与、感作して調製することができる［臨床検査、２６
巻（７）、７７７頁（１９８２年）参照のこと］が、マ
ウスＩｇＧに対するポリクローナル抗体のいくつかは市
販されている。その他、固相、固定化方法、標識抗原、
標識方法、第１抗体、標識物の活性測定方法、反応温度
と時間等は、第１抗体固相法に準じて任意に選択でき
る。また、上記以外の方法として、２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル
抗体（第１抗体、本発明のモノクローナル抗体）に対
し、固相化した抗原とサンプル中の２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αを競合させた後、固相または液相の
第１抗原量を、予め第１抗体を標識しておくが、または
第１抗体と結合する標識された第２抗体を用いることな
どにより定量する方法もある。
あればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも
よく、また感作する動物種に制限はない。マウスＩｇＧ
に対するポリクローナル抗体は、マウス血清あるいはマ
ウスγ−グロブリンを一般的に知られた方法で別種の動
物（例えばラット、モルモット、ウサギ、ヤギなど）に
投与、感作して調製することができる［臨床検査、２６
巻（７）、７７７頁（１９８２年）参照のこと］が、マ
ウスＩｇＧに対するポリクローナル抗体のいくつかは市
販されている。その他、固相、固定化方法、標識抗原、
標識方法、第１抗体、標識物の活性測定方法、反応温度
と時間等は、第１抗体固相法に準じて任意に選択でき
る。また、上記以外の方法として、２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル
抗体（第１抗体、本発明のモノクローナル抗体）に対
し、固相化した抗原とサンプル中の２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αを競合させた後、固相または液相の
第１抗原量を、予め第１抗体を標識しておくが、または
第１抗体と結合する標識された第２抗体を用いることな
どにより定量する方法もある。
【００３６】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識し、か
つ他のＰＧ類似化合物との交差反応率が極めて低い優れ
たモノクローナル抗体である。従って、本発明のモノク
ローナル抗体を用いることによって、測定感度が極めて
高く、特異性に優れた、再現性の高い２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αの免疫学的定量法が確立された。
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識し、か
つ他のＰＧ類似化合物との交差反応率が極めて低い優れ
たモノクローナル抗体である。従って、本発明のモノク
ローナル抗体を用いることによって、測定感度が極めて
高く、特異性に優れた、再現性の高い２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αの免疫学的定量法が確立された。
【００３７】
【より広範囲な開示】２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧ
Ｆ１αのスピロラクトン体のω鎖部分に反応性官能基を
導入し、この部分でキャリア−タン白とコンジュゲート
することは本発明にとって意義深い。なぜなら、この操
作によって、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを
特異的に認識するモノクローナル抗体が得られたと考え
られるからである。すなわち、α鎖（ＰＧ骨格中の上の
側鎖）にもともと存在するカルボキシル基をキャリア−
タン白とコンジュゲートしたものを抗原に用いると、得
られた抗体はα鎖の構造上の特徴を十分認識することが
困難となる。従って、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧ
Ｆ１αに対する特異性が低く、６−ケト−ＰＧＦ
１α（２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αよりα鎖
の炭素鎖が２個長い）との交差反応が大きくなることが
予想される。このことは、実際に６−ケト−ＰＧＦ１α
のα鎖末端のカルボキシル基をキャリア−タン白とコン
ジュゲートして得られた抗体が２，３−ジノル−６−ケ
ト−ＰＧＦ１αに対して高い交差率を示す（
Ｆ１αのスピロラクトン体のω鎖部分に反応性官能基を
導入し、この部分でキャリア−タン白とコンジュゲート
することは本発明にとって意義深い。なぜなら、この操
作によって、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを
特異的に認識するモノクローナル抗体が得られたと考え
られるからである。すなわち、α鎖（ＰＧ骨格中の上の
側鎖）にもともと存在するカルボキシル基をキャリア−
タン白とコンジュゲートしたものを抗原に用いると、得
られた抗体はα鎖の構造上の特徴を十分認識することが
困難となる。従って、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧ
Ｆ１αに対する特異性が低く、６−ケト−ＰＧＦ
１α（２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αよりα鎖
の炭素鎖が２個長い）との交差反応が大きくなることが
予想される。このことは、実際に６−ケト−ＰＧＦ１α
のα鎖末端のカルボキシル基をキャリア−タン白とコン
ジュゲートして得られた抗体が２，３−ジノル−６−ケ
ト−ＰＧＦ１αに対して高い交差率を示す（
【従来技術とその問題点】で記載した文献を参照のこ
と）ことからも十分推察される。
と）ことからも十分推察される。
【００３８】従って、ω鎖末端に反応性官能基を導入
し、キャリア−タン白とコンジュゲートすることによっ
て、α鎖の構造上の特徴を十分に認識する特異性の高い
モノクローナル抗体が得られたものと考えられる。この
ことは、他のＰＧ代謝物のモノクローナル抗体の作製に
も応用できる理論である。とりわけ、α鎖の炭素鎖末端
の長さが異なる複数の代謝物を、それぞれ特異的に認識
するモノクローナル抗体を得る場合には極めて有効な手
法である。例えば、トロンボキサン（以下、ＴＸと略記
する。）Ａ2 の主要代謝物のひとつである、式
し、キャリア−タン白とコンジュゲートすることによっ
て、α鎖の構造上の特徴を十分に認識する特異性の高い
モノクローナル抗体が得られたものと考えられる。この
ことは、他のＰＧ代謝物のモノクローナル抗体の作製に
も応用できる理論である。とりわけ、α鎖の炭素鎖末端
の長さが異なる複数の代謝物を、それぞれ特異的に認識
するモノクローナル抗体を得る場合には極めて有効な手
法である。例えば、トロンボキサン（以下、ＴＸと略記
する。）Ａ2 の主要代謝物のひとつである、式
【００３９】
【化１３】 で示される２，３−ジノル−ＴＸＢ2 の場合が挙げられ
る。すなわち、ω鎖末端に反応性官能基を導入した２，
３−ジノル−ＴＸＢ2 をハプテンとしてキャリア−タン
白とコンジュゲートした化合物を抗原として用いると、
得られたモノクローナル抗体は、２，３−ジノル−ＴＸ
Ｂ2 に対し特異性が高く、他の代謝物である式
る。すなわち、ω鎖末端に反応性官能基を導入した２，
３−ジノル−ＴＸＢ2 をハプテンとしてキャリア−タン
白とコンジュゲートした化合物を抗原として用いると、
得られたモノクローナル抗体は、２，３−ジノル−ＴＸ
Ｂ2 に対し特異性が高く、他の代謝物である式
【００４０】
【化１４】 で示されるＴＸＢ2 との交差反応はほとんど起こらない
のではないかと予想される。ω鎖末端に反応性官能基を
導入した２，３−ジノル−ＴＸＢ2 を製造するために、
例えば次の反応工程式III およびＩＶが提示される。
のではないかと予想される。ω鎖末端に反応性官能基を
導入した２，３−ジノル−ＴＸＢ2 を製造するために、
例えば次の反応工程式III およびＩＶが提示される。
【００４１】
【化１５】
【００４２】
【化１６】
【００４３】
【化１７】
【００４４】
【化１８】
【００４５】
【化１９】
【００４６】
【化２０】
【００４７】
【化２１】
【００４８】前記した反応工程式中、９−ＢＢＮは９−
ボラビシクロ［３．３．１］ノナンを表わし、その他の
記号は前記と同じ意味を表わす。式（３０−１）から
（３０−６）で示されるハプテンは、前記した方法でキ
ャリア−タン白と結合することができる。得られたハプ
テンとキャリア−タン白の結合物は、アルカリ条件下の
加水分解（例えば、炭酸カリウムを用いた）に付し、α
鎖末端を、フリーのカルボン酸とした後、感作抗原とし
て用いられる。
ボラビシクロ［３．３．１］ノナンを表わし、その他の
記号は前記と同じ意味を表わす。式（３０−１）から
（３０−６）で示されるハプテンは、前記した方法でキ
ャリア−タン白と結合することができる。得られたハプ
テンとキャリア−タン白の結合物は、アルカリ条件下の
加水分解（例えば、炭酸カリウムを用いた）に付し、α
鎖末端を、フリーのカルボン酸とした後、感作抗原とし
て用いられる。
【００４９】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。なお、実施例中、「ＴＬＣ」、「ＭＳ」、「Ｉ
Ｒ」および「ＮＭＲ」は、それぞれ「薄層クロマトグラ
フィー」、「質量分析」、「赤外吸収スペクトル」およ
び「核磁気共鳴スペクトル」を表わす。クロマトグラフ
ィーによる分離の箇所に記載されているカッコ内の溶媒
は、使用した溶出溶媒または展開溶媒を示し、割合は体
積比を表わす。また、ＡｃＯＥｔは酢酸エチルを表わ
し、その他の記号は前記と同じ意味を表わす。
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。なお、実施例中、「ＴＬＣ」、「ＭＳ」、「Ｉ
Ｒ」および「ＮＭＲ」は、それぞれ「薄層クロマトグラ
フィー」、「質量分析」、「赤外吸収スペクトル」およ
び「核磁気共鳴スペクトル」を表わす。クロマトグラフ
ィーによる分離の箇所に記載されているカッコ内の溶媒
は、使用した溶出溶媒または展開溶媒を示し、割合は体
積比を表わす。また、ＡｃＯＥｔは酢酸エチルを表わ
し、その他の記号は前記と同じ意味を表わす。
【００５０】実施例１ ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対するモノク
ローナル抗体の作製 （１）ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ＰＧＦ
１αのスピロラクトン体の合成 (a) 式
ローナル抗体の作製 （１）ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ＰＧＦ
１αのスピロラクトン体の合成 (a) 式
【化２２】 の合成
【００５１】アルゴン雰囲気下、ジメチルホスホナート
（2.6 ｍｌ）のＴＨＦ溶液（４８ｍｌ）に、ｎ−ブチル
リチウムのｎ−ヘキサン溶液（2.2 Ｍ、14.7ｍｌ）を、
−７８℃でかきまぜながらゆっくりと滴下し、滴下後４
０分間かきまぜた。次に、ε−カプロラクトン（1.11ｍ
ｌ）を同温度でゆっくりと滴下した後、1.4 時間かけて
−１０℃まで昇温した。反応液に飽和塩化アンモニウム
水溶液を加え、エーテルで抽出した。さらに水層をクロ
ロホルムで抽出した。ふたつの抽出液を一緒にして乾燥
した後、減圧濃縮した。残留物を塩化メチレン（５０ｍ
ｌ) に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸（３９ｍｇ）を
加え、アルゴン雰囲気下、室温でジヒドロピラン（1.37
ｍｌ) をゆっくり加え、２０分間かきまぜた。トリエチ
ルアミン（６０μｌ）を加えた後、減圧濃縮して、残留
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥ
ｔ：メタノール＝99.5：0.5 ）で精製し、次の物性値を
有する標題化合物物（3.2 ｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：メタノール＝９：１）：Ｒｆ 0.
52。
（2.6 ｍｌ）のＴＨＦ溶液（４８ｍｌ）に、ｎ−ブチル
リチウムのｎ−ヘキサン溶液（2.2 Ｍ、14.7ｍｌ）を、
−７８℃でかきまぜながらゆっくりと滴下し、滴下後４
０分間かきまぜた。次に、ε−カプロラクトン（1.11ｍ
ｌ）を同温度でゆっくりと滴下した後、1.4 時間かけて
−１０℃まで昇温した。反応液に飽和塩化アンモニウム
水溶液を加え、エーテルで抽出した。さらに水層をクロ
ロホルムで抽出した。ふたつの抽出液を一緒にして乾燥
した後、減圧濃縮した。残留物を塩化メチレン（５０ｍ
ｌ) に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸（３９ｍｇ）を
加え、アルゴン雰囲気下、室温でジヒドロピラン（1.37
ｍｌ) をゆっくり加え、２０分間かきまぜた。トリエチ
ルアミン（６０μｌ）を加えた後、減圧濃縮して、残留
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥ
ｔ：メタノール＝99.5：0.5 ）で精製し、次の物性値を
有する標題化合物物（3.2 ｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：メタノール＝９：１）：Ｒｆ 0.
52。
【００５２】(b) 式
【化１６】の合成
【００５３】アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム（２
８４ｍｇ）のＴＨＦ懸濁液（３０ｍｌ）に、(a) で得ら
れたホスホネート（2.55ｇ）のＴＨＦ懸濁液（２５ｍ
ｌ) を室温で滴下し、２５分間かきまぜた後、２−オキ
サ−６β−ホルミル−７α−（テトラヒドロピラン−２
−イルオキシ）−シス−ビシクロ［３．３．０］オクタ
ン−３−オン（特開昭50-137961 号明細書、参考例１お
よび８記載の方法で製造した。1.82ｇ）のＴＨＦ溶液
（１２ｍｌ）を４℃で滴下し３０分間かきまぜた。さら
に、３０分間かきまぜて室温まで昇温した後、反応液に
飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出
した。抽出液を水洗し、乾燥後、減圧濃縮した。残留物
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：Ａ
ｃＯＥｔ＝１：１）で精製し、次の物性値を有する標題
化合物（2.8 ｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）：Ｒｆ 0.61； ＭＳ：ｍ／ｚ ３８５、３４８、２８２、２６５、２７
４。
８４ｍｇ）のＴＨＦ懸濁液（３０ｍｌ）に、(a) で得ら
れたホスホネート（2.55ｇ）のＴＨＦ懸濁液（２５ｍ
ｌ) を室温で滴下し、２５分間かきまぜた後、２−オキ
サ−６β−ホルミル−７α−（テトラヒドロピラン−２
−イルオキシ）−シス−ビシクロ［３．３．０］オクタ
ン−３−オン（特開昭50-137961 号明細書、参考例１お
よび８記載の方法で製造した。1.82ｇ）のＴＨＦ溶液
（１２ｍｌ）を４℃で滴下し３０分間かきまぜた。さら
に、３０分間かきまぜて室温まで昇温した後、反応液に
飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出
した。抽出液を水洗し、乾燥後、減圧濃縮した。残留物
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：Ａ
ｃＯＥｔ＝１：１）で精製し、次の物性値を有する標題
化合物（2.8 ｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）：Ｒｆ 0.61； ＭＳ：ｍ／ｚ ３８５、３４８、２８２、２６５、２７
４。
【００５４】(c) 式
【化２４】 の合成
【００５５】水素化リチウムアルミニウム（５３０ｍ
ｇ）のＴＨＦ溶液（３３ｍｌ）に、アルゴン雰囲気下、
室温でエタノール（７８０μｌ）とＴＨＦ（6.5 ｍｌ）
の混合液を徐々に滴下し、１５分間かきまぜた後、ＳＢ
Ｎ［（ｓ）−（−）−ビナフトール］（3.81ｇ）のＴＨ
Ｆ溶液（２０ｍｌ）を加え、０℃で２時間激しくかきま
ぜた。次に、反応液に(b) で得られたケトン体（1.0
ｇ）のＴＨＦ溶液（１０ｍｌ）を−７８℃で滴下した。
滴下後、メタノール（1.78ｍｌ）および１Ｎ−塩酸（1
4.2ｍｌ）を順次加え、室温まで昇温した。反応液をセ
ライトを通じてろ過し、ろ液を酢酸エチルで抽出した。
抽出液を水洗し、乾燥後減圧濃縮した。残留物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯ
Ｅｔ＝１：３）で精製し、２−オキサ−６β−（８−
（テトラヒドロピラン−２−イルオキシ）−３α−ヒド
ロキシオクタ−トランス−１−エニル）−７α−（テト
ラヒドロピラン２−イルオキシ）−シス−ビシクロ
［３．３．０］オクタン−３−オン（９５０ｍｇ）を得
た。
ｇ）のＴＨＦ溶液（３３ｍｌ）に、アルゴン雰囲気下、
室温でエタノール（７８０μｌ）とＴＨＦ（6.5 ｍｌ）
の混合液を徐々に滴下し、１５分間かきまぜた後、ＳＢ
Ｎ［（ｓ）−（−）−ビナフトール］（3.81ｇ）のＴＨ
Ｆ溶液（２０ｍｌ）を加え、０℃で２時間激しくかきま
ぜた。次に、反応液に(b) で得られたケトン体（1.0
ｇ）のＴＨＦ溶液（１０ｍｌ）を−７８℃で滴下した。
滴下後、メタノール（1.78ｍｌ）および１Ｎ−塩酸（1
4.2ｍｌ）を順次加え、室温まで昇温した。反応液をセ
ライトを通じてろ過し、ろ液を酢酸エチルで抽出した。
抽出液を水洗し、乾燥後減圧濃縮した。残留物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯ
Ｅｔ＝１：３）で精製し、２−オキサ−６β−（８−
（テトラヒドロピラン−２−イルオキシ）−３α−ヒド
ロキシオクタ−トランス−１−エニル）−７α−（テト
ラヒドロピラン２−イルオキシ）−シス−ビシクロ
［３．３．０］オクタン−３−オン（９５０ｍｇ）を得
た。
【００５６】得られたビス（テトラヒドロピラン−２−
イルオキシ）体（９５０ｍｌ) をメタノール（２２ｍ
ｌ) に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸（１２ｍｇ）を
加えて、アルゴン雰囲気下、室温で５０分間かきまぜ
た。反応液にトリエチルアミン（0.2 ｍｌ）を加えて減
圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー（ＡｃＯＥｔ：エタノール＝９７：３）で精製し
て、次の物性値を有する２−オキサ−６β−（８，３α
−ジヒドロキシオクタ−トランス−１−エニル）−７α
−ヒドロキシ−シス−ビシクロ［３．３．０］オクタン
−３−オン（５６７ｍｇ）を得た。
イルオキシ）体（９５０ｍｌ) をメタノール（２２ｍ
ｌ) に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸（１２ｍｇ）を
加えて、アルゴン雰囲気下、室温で５０分間かきまぜ
た。反応液にトリエチルアミン（0.2 ｍｌ）を加えて減
圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー（ＡｃＯＥｔ：エタノール＝９７：３）で精製し
て、次の物性値を有する２−オキサ−６β−（８，３α
−ジヒドロキシオクタ−トランス−１−エニル）−７α
−ヒドロキシ−シス−ビシクロ［３．３．０］オクタン
−３−オン（５６７ｍｇ）を得た。
【００５７】ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：メタノール＝１９：
１）：Ｒｆ 0.11。 次に得られたトリヒドロキシ体（５６７ｍｇ）を塩化メ
チレン（3.8 ｍｌ) に溶解し、ピリジン（１ｍｌ) を加
えて、さらにアルゴン雰囲気下、０℃でｔ−ブチルジメ
チルシリルクロライド（４６０ｍｇ) を加えて１時間か
き混ぜた。反応液を水で希釈し、１０分間かきまぜた
後、酢酸エチルで抽出した。抽出液を硫酸銅水溶液、水
および飽和食塩水で順次洗浄し、乾燥後、減圧濃縮し
た。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ
−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１：２）で精製して、次の物
性値を有する標題化合物（６２８ｍｇ) を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：メタノール＝９５：５）：Ｒｆ
0.69。
１）：Ｒｆ 0.11。 次に得られたトリヒドロキシ体（５６７ｍｇ）を塩化メ
チレン（3.8 ｍｌ) に溶解し、ピリジン（１ｍｌ) を加
えて、さらにアルゴン雰囲気下、０℃でｔ−ブチルジメ
チルシリルクロライド（４６０ｍｇ) を加えて１時間か
き混ぜた。反応液を水で希釈し、１０分間かきまぜた
後、酢酸エチルで抽出した。抽出液を硫酸銅水溶液、水
および飽和食塩水で順次洗浄し、乾燥後、減圧濃縮し
た。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ
−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１：２）で精製して、次の物
性値を有する標題化合物（６２８ｍｇ) を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：メタノール＝９５：５）：Ｒｆ
0.69。
【００５８】(d) 式
【化２５】 の合成
【００５９】アルゴン雰囲気下、(c) で得られたジヒド
ロキシ体（３６３ｍｇ) 、ｐ−トルエンスルホン酸一水
和物（４ｍｇ) および塩化メチレン（１０ｍｌ）の混合
物に、室温でジヒドロピラン（１００μｌ）を滴下し、
同温度で１０分間かきまぜた。反応液にトリエチルアミ
ン（0.5 ｍｌ) を加え、減圧濃縮した。残留物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯ
Ｅｔ＝４：１）で精製して、次の物性値を有する標題化
合物（４８８ｍｇ）を得た。 ＴＬＣ（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝２：１）：Ｒｆ
0.36。
ロキシ体（３６３ｍｇ) 、ｐ−トルエンスルホン酸一水
和物（４ｍｇ) および塩化メチレン（１０ｍｌ）の混合
物に、室温でジヒドロピラン（１００μｌ）を滴下し、
同温度で１０分間かきまぜた。反応液にトリエチルアミ
ン（0.5 ｍｌ) を加え、減圧濃縮した。残留物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯ
Ｅｔ＝４：１）で精製して、次の物性値を有する標題化
合物（４８８ｍｇ）を得た。 ＴＬＣ（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝２：１）：Ｒｆ
0.36。
【００６０】(e) 式
【化２６】 の合成
【００６１】アルゴン雰囲気下、乾燥トルエン（２６ｍ
ｌ) とジイソプロピルアミン（７４３μｌ）の混合液
に、ｎ−ブチルリチウムのｎ−ヘキサン溶液（1.5 Ｍ、
3.25ｍｌ）を室温で滴下し、−７８℃まで冷却した。こ
こへ(d) で得られたラクトン体（1.20ｇ）の乾燥トルエ
ン溶液（5.6 ｍｌ）を滴下し、４５分間かきまぜた。得
られた混合物に、３−メトキシカルボニルプロピオニル
クロライド（３５０μｌ）の乾燥トルエン溶液（3.8 ｍ
ｌ) を１０分間かけて徐々に加えた後、４０分間かきま
ぜた。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢
酸エチルで抽出した。抽出液を水および飽和食塩水で順
次洗浄し、乾燥後、減圧濃縮した。残留物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ
＝３：１）で精製して、次の物性値を有する標題化合物
（1.18ｇ）を得た。 ＴＬＣ（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝３：２）：Ｒｆ
0.49。
ｌ) とジイソプロピルアミン（７４３μｌ）の混合液
に、ｎ−ブチルリチウムのｎ−ヘキサン溶液（1.5 Ｍ、
3.25ｍｌ）を室温で滴下し、−７８℃まで冷却した。こ
こへ(d) で得られたラクトン体（1.20ｇ）の乾燥トルエ
ン溶液（5.6 ｍｌ）を滴下し、４５分間かきまぜた。得
られた混合物に、３−メトキシカルボニルプロピオニル
クロライド（３５０μｌ）の乾燥トルエン溶液（3.8 ｍ
ｌ) を１０分間かけて徐々に加えた後、４０分間かきま
ぜた。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢
酸エチルで抽出した。抽出液を水および飽和食塩水で順
次洗浄し、乾燥後、減圧濃縮した。残留物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ
＝３：１）で精製して、次の物性値を有する標題化合物
（1.18ｇ）を得た。 ＴＬＣ（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝３：２）：Ｒｆ
0.49。
【００６２】(f) 式
【化２７】 の合成
【００６３】(e) で得られたジケトン体（１５５ｍｇ)
、エチレングリコールジメチルエーテル（2.5 ｍｌ)
および１Ｍ 水酸化リチウム水溶液（1.2 ｍｌ) の混合
液を室温で３０分間かきまぜた後、２Ｎ 水酸化ナトリ
ウム水溶液（0.2 ｍｌ) を加えて、８０℃で6.5 時間か
きまぜた。反応液を氷水で冷却し、飽和塩化アンモニウ
ム水溶液を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を１Ｎ
塩酸で洗浄し、乾燥後、減圧濃縮した。残留物をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：Ａｃ
ＯＥｔ＝１：３）で精製して、次の物性値を有する標題
化合物（７９ｍｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：酢酸＝９９：１）：Ｒｆ 0.27。
、エチレングリコールジメチルエーテル（2.5 ｍｌ)
および１Ｍ 水酸化リチウム水溶液（1.2 ｍｌ) の混合
液を室温で３０分間かきまぜた後、２Ｎ 水酸化ナトリ
ウム水溶液（0.2 ｍｌ) を加えて、８０℃で6.5 時間か
きまぜた。反応液を氷水で冷却し、飽和塩化アンモニウ
ム水溶液を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を１Ｎ
塩酸で洗浄し、乾燥後、減圧濃縮した。残留物をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：Ａｃ
ＯＥｔ＝１：３）で精製して、次の物性値を有する標題
化合物（７９ｍｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：酢酸＝９９：１）：Ｒｆ 0.27。
【００６４】(g) 式
【化２８】 の合成
【００６５】アルゴン雰囲気下、オキザリルクロライド
（１４μｌ）の塩化メチレン溶液１ml) を−７８℃まで
冷却し、ここへジメチルスルホキシド（２３μｌ）の塩
化メチレン溶液（0.5 ｍｌ) を滴下し、１０分間かきま
ぜた。さらに、(f) で得られたアルコール体（５０ｍ
ｇ) の塩化メチレン溶液（１ｍｌ) を徐々に加えた後、
２０分間かきまぜた。反応液にトリエチルアミン（７５
μｌ）を加えた後、４５分間かけて−５０℃まで昇温
し、次に水（２ｍｌ) を加え、１０分間かけて室温まで
昇温した。反応液を酢酸エチルで抽出し、抽出液を水お
よび飽和塩化アンモニウム水溶液で順次洗浄し、乾燥
後、減圧濃縮して、２−オキサ−６β−（７−ホルミル
−３α−（テトラヒドロピラン−２−イルオキシ）ヘプ
タ−トランス−１−エニル）−７α−（テトラヒドロピ
ラン−２−イルオキシ）−シス−ビシクロ［３．３．
０］オクタン−３−スピロ−２′−オキソラン−５′−
オンの粗生成物（約４９ｍｇ）を得た。
（１４μｌ）の塩化メチレン溶液１ml) を−７８℃まで
冷却し、ここへジメチルスルホキシド（２３μｌ）の塩
化メチレン溶液（0.5 ｍｌ) を滴下し、１０分間かきま
ぜた。さらに、(f) で得られたアルコール体（５０ｍ
ｇ) の塩化メチレン溶液（１ｍｌ) を徐々に加えた後、
２０分間かきまぜた。反応液にトリエチルアミン（７５
μｌ）を加えた後、４５分間かけて−５０℃まで昇温
し、次に水（２ｍｌ) を加え、１０分間かけて室温まで
昇温した。反応液を酢酸エチルで抽出し、抽出液を水お
よび飽和塩化アンモニウム水溶液で順次洗浄し、乾燥
後、減圧濃縮して、２−オキサ−６β−（７−ホルミル
−３α−（テトラヒドロピラン−２−イルオキシ）ヘプ
タ−トランス−１−エニル）−７α−（テトラヒドロピ
ラン−２−イルオキシ）−シス−ビシクロ［３．３．
０］オクタン−３−スピロ−２′−オキソラン−５′−
オンの粗生成物（約４９ｍｇ）を得た。
【００６６】得られたホルミル体（約４９ｍｇ）をアセ
トン（1.1 ｍｌ) に溶かし、−３０℃で2.7 Ｍ ジョー
ンズ（Ｊｏｎｅ′ｓ）試薬（0.17ｍｌ) を滴下し、１５
分間かきまぜた後、イソプロパノール（0.1 ｍｌ) を加
えて、さらに１０分間かきまぜた。反応液に水（１ｍ
ｌ）を加えてジエチルエーテルと酢酸エチル（２：１）
の混合液で抽出し、抽出液を水洗し、乾燥後、減圧濃縮
して、２−オキサ−６β−（７−カルボキシ−３α−
（テトラヒドロピラン−２−イルオキシ）ヘプタ−トラ
ンス−１−エニル）−７α−（テトラヒドロピラン−２
−イルオキシ）−シス−ビシクロ［３．３．０］オクタ
ン−３−スピロ−２′−オキソラン−５′−オンの粗生
成物を得た。
トン（1.1 ｍｌ) に溶かし、−３０℃で2.7 Ｍ ジョー
ンズ（Ｊｏｎｅ′ｓ）試薬（0.17ｍｌ) を滴下し、１５
分間かきまぜた後、イソプロパノール（0.1 ｍｌ) を加
えて、さらに１０分間かきまぜた。反応液に水（１ｍ
ｌ）を加えてジエチルエーテルと酢酸エチル（２：１）
の混合液で抽出し、抽出液を水洗し、乾燥後、減圧濃縮
して、２−オキサ−６β−（７−カルボキシ−３α−
（テトラヒドロピラン−２−イルオキシ）ヘプタ−トラ
ンス−１−エニル）−７α−（テトラヒドロピラン−２
−イルオキシ）−シス−ビシクロ［３．３．０］オクタ
ン−３−スピロ−２′−オキソラン−５′−オンの粗生
成物を得た。
【００６７】得られたカルボキシ体を少量のテトラヒド
ロフランに溶かし、６５％酢酸（1.5 ｍｌ) を加え、４
５℃で1.5 時間かきまぜた後、減圧濃縮した。残留物を
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ：エ
タノール＝９９：１）で精製して、次の物性値を有する
標題化合物（２０ｍｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：メタノール：酢酸＝９０：１０：
１）：Ｒｆ 0.46； ＮＭＲ：δ 5.70〜5.40(2H,m)、4.70〜4.57(1H,m)、4.
18〜4.00(1H,m)、4.00〜3.60(1H,m)、2.90〜1.20(18H,
m) ； ＩＲ（液膜法）：ν 3351、2931、2284、1757、1027、
1088、 895cm-1； ＭＳ：ｍ／ｚ ３５５、３３８、３０７、２８９、２４
６、１８５、１５４、１３８。
ロフランに溶かし、６５％酢酸（1.5 ｍｌ) を加え、４
５℃で1.5 時間かきまぜた後、減圧濃縮した。残留物を
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ：エ
タノール＝９９：１）で精製して、次の物性値を有する
標題化合物（２０ｍｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：メタノール：酢酸＝９０：１０：
１）：Ｒｆ 0.46； ＮＭＲ：δ 5.70〜5.40(2H,m)、4.70〜4.57(1H,m)、4.
18〜4.00(1H,m)、4.00〜3.60(1H,m)、2.90〜1.20(18H,
m) ； ＩＲ（液膜法）：ν 3351、2931、2284、1757、1027、
1088、 895cm-1； ＭＳ：ｍ／ｚ ３５５、３３８、３０７、２８９、２４
６、１８５、１５４、１３８。
【００６８】（２）感作抗原の調製 （１）で合成したω−カルボキシ−２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体（３００μｇ）
のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１００μｌ）
に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩（９００μｇ）の水溶液（５０μ
ｌ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（６００μｇ）の
水溶液（５０μｌ）を加えて、３０℃で２時間かきまぜ
た後、水（1.8 ｍｌ）を加えた。反応混合物を酢酸エチ
ルで抽出し、抽出液を濃縮乾固した。得られた固体を、
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する。３ｍ
ｇ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（以下、ＰＢと略記す
る。ｐＨ7.4 、２００μｌ）に加え、４℃で一晩反応さ
せた。反応液をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと１０ｍ
Ｍ−ＰＢ（２：３）の混合液で透析し、さらに１０ｍＭ
ＰＢで透析し、目的とする感作抗原を得た。
−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体（３００μｇ）
のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１００μｌ）
に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩（９００μｇ）の水溶液（５０μ
ｌ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（６００μｇ）の
水溶液（５０μｌ）を加えて、３０℃で２時間かきまぜ
た後、水（1.8 ｍｌ）を加えた。反応混合物を酢酸エチ
ルで抽出し、抽出液を濃縮乾固した。得られた固体を、
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する。３ｍ
ｇ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（以下、ＰＢと略記す
る。ｐＨ7.4 、２００μｌ）に加え、４℃で一晩反応さ
せた。反応液をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと１０ｍ
Ｍ−ＰＢ（２：３）の混合液で透析し、さらに１０ｍＭ
ＰＢで透析し、目的とする感作抗原を得た。
【００６９】（３）マウスの感作 （２）で調製した感作抗原（ＢＳＡ量として１００μ
ｇ）を含む１０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ7.4 、８０μｌ）と0.
75Ｍ 塩化ナトリウム水溶液（２０μｌ）とＦＣＡ（１
００μｌ）からなるエマルジョンを８週令のＢＡＬＢ／
ｃ雌性マウスに腹腔内投与した。以後約１０日の間隔
で、前回と同様に調製した、感作抗原を含むＰＢ溶液
（８０μｌ）と0.75Ｍ 塩化ナトリウム水溶液（２０μ
ｌ）とＦＩＣＡ（１００μｌ）からなるエマルジョンを
７回腹腔内投与した。さらに、７回目の感作から１０日
後、感作抗原（ＢＳＡ量として３００μｇ）を含む１０
ｍＭ ＰＢ（ｐＨ7.4 、１２０μｌ）と0.75Ｍ 塩化ナ
トリウム水溶液（３０μｌ）の混合液を腹腔内投与し
た。なお、感作抗原とＦＩＣＡによる感作のうち、３回
目、５回目、６回目、７回目の感作の後に、血中抗体価
を測定した。方法は以下のとおりである。
ｇ）を含む１０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ7.4 、８０μｌ）と0.
75Ｍ 塩化ナトリウム水溶液（２０μｌ）とＦＣＡ（１
００μｌ）からなるエマルジョンを８週令のＢＡＬＢ／
ｃ雌性マウスに腹腔内投与した。以後約１０日の間隔
で、前回と同様に調製した、感作抗原を含むＰＢ溶液
（８０μｌ）と0.75Ｍ 塩化ナトリウム水溶液（２０μ
ｌ）とＦＩＣＡ（１００μｌ）からなるエマルジョンを
７回腹腔内投与した。さらに、７回目の感作から１０日
後、感作抗原（ＢＳＡ量として３００μｇ）を含む１０
ｍＭ ＰＢ（ｐＨ7.4 、１２０μｌ）と0.75Ｍ 塩化ナ
トリウム水溶液（３０μｌ）の混合液を腹腔内投与し
た。なお、感作抗原とＦＩＣＡによる感作のうち、３回
目、５回目、６回目、７回目の感作の後に、血中抗体価
を測定した。方法は以下のとおりである。
【００７０】マウスより採血し、血清をＰＢＳで１００
倍に希釈し、希釈液（１００μｌ）に対して、水（４０
０μｌ）、0.5 ％γ−グロブリン（８０μｌ）、飽和硫
安（５８０μｌ）を加え、遠心分離した。沈殿物を0.1
Ｍ ＰＢ（２００μｌ）に溶かし、ω−カルボキシ−
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの［ 3Ｈ］−ω
−メチルエステル（ω−カルボキシ−２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αをMoonenらの方法［Prostaglandi
ns, 29,443(1985)参照のこと］に従って［ 3Ｈ］−ＣＨ
3 Ｉと反応させることにより製造した。比放射能は 3.1
×１０6 ＭＢｑ／ｍｍｏｌであった。）３００Ｂｑを含
む0.1 Ｍ ＰＢ（１００μｌ）を加え、４℃で一晩反応
させた後、0.5 ％ウシγ−グロブリンを含む0.1 Ｍ Ｐ
Ｂ（２００μｌ）を加え、さらに３０％ポリエチレング
リコール6000（登録商標、和光純薬製、６００μｌ）を
加えて遠心分離した後、沈殿物の放射活性を測定した。
７回目の感作の後の血中抗体価が有意に上昇していたの
で、ここで感作抗原とＦＩＣＡによる感作を打ち切っ
た。
倍に希釈し、希釈液（１００μｌ）に対して、水（４０
０μｌ）、0.5 ％γ−グロブリン（８０μｌ）、飽和硫
安（５８０μｌ）を加え、遠心分離した。沈殿物を0.1
Ｍ ＰＢ（２００μｌ）に溶かし、ω−カルボキシ−
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの［ 3Ｈ］−ω
−メチルエステル（ω−カルボキシ−２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αをMoonenらの方法［Prostaglandi
ns, 29,443(1985)参照のこと］に従って［ 3Ｈ］−ＣＨ
3 Ｉと反応させることにより製造した。比放射能は 3.1
×１０6 ＭＢｑ／ｍｍｏｌであった。）３００Ｂｑを含
む0.1 Ｍ ＰＢ（１００μｌ）を加え、４℃で一晩反応
させた後、0.5 ％ウシγ−グロブリンを含む0.1 Ｍ Ｐ
Ｂ（２００μｌ）を加え、さらに３０％ポリエチレング
リコール6000（登録商標、和光純薬製、６００μｌ）を
加えて遠心分離した後、沈殿物の放射活性を測定した。
７回目の感作の後の血中抗体価が有意に上昇していたの
で、ここで感作抗原とＦＩＣＡによる感作を打ち切っ
た。
【００７１】（４）細胞融合 最終免疫から３日後に、感作マウスから脾臓を摘出し脾
細胞を調製した。得られた脾細胞とマウス骨髄腫細胞Ｓ
Ｐ−２／０−Ａｇ１４［Nature, 276, 269(1978)記載の
方法により調製した。］を５：１の割合で混合し、ポリ
エチレングリコール［ＰＥＧ1000（登録商標）、和光純
薬製］を５０％の濃度で加えて、Godingの方法［J. Imm
unol, Methods, 39, 285 1989)参照のこと］に準じて細
胞融合を行なった。融合操作後の細胞混合物を、２０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ＮＣＴＣ１０９培地
（登録商標、ＭＡバイオプロダクト社製）、ヒポキサン
チン（13.6μｇ／ｍｌ）、チミジン（3.9 μｇ／ｍｌ)
およびグリシン（2.0 μｇ／ｍｌ) を含有するダルベッ
コ変法イーグル培地（以下、ＤＭＥと略記する。）（4.
5 ｇ／ｌグルコース含有タイプ、ギブコ社製）に浮遊さ
せ、３７℃、７％ＣＯ2 含有大気下で培養した。培養後
２、４および７日目に、培地の半量をＨＡＴ培地（アミ
ノプテリン0.18μｇ／ｍｌを含有する上記イーグル培
地）に変換し培養を続けた。培養１０日目ごろより、い
くつかのウェルではブドウの房状のコロニーが形成さ
れ、最終的に1215ウェルにおいてハイブリドーマの増殖
が認められた。
細胞を調製した。得られた脾細胞とマウス骨髄腫細胞Ｓ
Ｐ−２／０−Ａｇ１４［Nature, 276, 269(1978)記載の
方法により調製した。］を５：１の割合で混合し、ポリ
エチレングリコール［ＰＥＧ1000（登録商標）、和光純
薬製］を５０％の濃度で加えて、Godingの方法［J. Imm
unol, Methods, 39, 285 1989)参照のこと］に準じて細
胞融合を行なった。融合操作後の細胞混合物を、２０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ＮＣＴＣ１０９培地
（登録商標、ＭＡバイオプロダクト社製）、ヒポキサン
チン（13.6μｇ／ｍｌ）、チミジン（3.9 μｇ／ｍｌ)
およびグリシン（2.0 μｇ／ｍｌ) を含有するダルベッ
コ変法イーグル培地（以下、ＤＭＥと略記する。）（4.
5 ｇ／ｌグルコース含有タイプ、ギブコ社製）に浮遊さ
せ、３７℃、７％ＣＯ2 含有大気下で培養した。培養後
２、４および７日目に、培地の半量をＨＡＴ培地（アミ
ノプテリン0.18μｇ／ｍｌを含有する上記イーグル培
地）に変換し培養を続けた。培養１０日目ごろより、い
くつかのウェルではブドウの房状のコロニーが形成さ
れ、最終的に1215ウェルにおいてハイブリドーマの増殖
が認められた。
【００７２】（５）モノクローナル抗体産生株のスクリ
ーニング ハイブリドーマ培養上清（１００μｌ）と、ω−カルボ
キシ−２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの
［ 3Ｈ］−ω−メチルエステル３００Ｂｑを含む0.1Ｍ
ＰＢ（２００μｌ）を４℃で１０時間反応させた。反
応液に0.5 ％ウシγ−グロブリンを含む0.1 Ｍ ＰＢ
（２００μｌ）加え、さらに３０％ポリエチレングリコ
ール6000（６００μｌ）を加えて遠心分離し、沈殿物の
放射活性を測定した。有意に放射活性の上昇している培
養上清をもって、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ
１αに対するモノクローナル抗体を産生しているウェル
であると判定した。
ーニング ハイブリドーマ培養上清（１００μｌ）と、ω−カルボ
キシ−２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの
［ 3Ｈ］−ω−メチルエステル３００Ｂｑを含む0.1Ｍ
ＰＢ（２００μｌ）を４℃で１０時間反応させた。反
応液に0.5 ％ウシγ−グロブリンを含む0.1 Ｍ ＰＢ
（２００μｌ）加え、さらに３０％ポリエチレングリコ
ール6000（６００μｌ）を加えて遠心分離し、沈殿物の
放射活性を測定した。有意に放射活性の上昇している培
養上清をもって、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ
１αに対するモノクローナル抗体を産生しているウェル
であると判定した。
【００７３】（６）抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対する抗体を
産生していると判定された細胞をKennett の方法［Mono
clonal Antibodies, 372頁(1989)参照のこと］に従っ
て、軟寒天培養法でクローニングした。クローン化した
細胞株をＭＫ−１１Ｅ４株と命名した。クローン化した
株細胞１０7 個を予めプリスタン処理しておいたＢＡＬ
Ｂ／ｃ雌性マウスの腹腔内に移植した。約２週間後、腹
水が大量に蓄積された時点で腹水を採取した。得られた
採水を５０％飽和硫安で分画した後、プロテインＡ−セ
ファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）を用い
たアフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製して
ＩｇＧ画分を得た。なお、本発明のモノクローナル抗
体、ＭＫ−１１Ｅ４を産生するハイブリドーマ、ＭＫ−
１１Ｅ４株は、微生物工業技術研究所に寄託番号微工研
条寄第3481号（ＦＥＲＭ ＢＰ−4381）で１９９１年７
月１０日に寄託されている。
産生していると判定された細胞をKennett の方法［Mono
clonal Antibodies, 372頁(1989)参照のこと］に従っ
て、軟寒天培養法でクローニングした。クローン化した
細胞株をＭＫ−１１Ｅ４株と命名した。クローン化した
株細胞１０7 個を予めプリスタン処理しておいたＢＡＬ
Ｂ／ｃ雌性マウスの腹腔内に移植した。約２週間後、腹
水が大量に蓄積された時点で腹水を採取した。得られた
採水を５０％飽和硫安で分画した後、プロテインＡ−セ
ファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）を用い
たアフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製して
ＩｇＧ画分を得た。なお、本発明のモノクローナル抗
体、ＭＫ−１１Ｅ４を産生するハイブリドーマ、ＭＫ−
１１Ｅ４株は、微生物工業技術研究所に寄託番号微工研
条寄第3481号（ＦＥＲＭ ＢＰ−4381）で１９９１年７
月１０日に寄託されている。
【００７４】実施例２ 本発明のモノクローナル抗体の諸性質 （１）イムノグロブリンサブクラス 実施例１で作製したモノクローナル抗体、ＭＫ−１１Ｅ
４について、マウスＭｏｎｏ Ａｂ−ＩＤ ＥＩＡキッ
ト（Zymed 社製）を用いてサブクラスをスクリーニング
した。その結果、ＭＫ−１１Ｅ４は、マウスＩｇＧ2b，
κであった。
４について、マウスＭｏｎｏ Ａｂ−ＩＤ ＥＩＡキッ
ト（Zymed 社製）を用いてサブクラスをスクリーニング
した。その結果、ＭＫ−１１Ｅ４は、マウスＩｇＧ2b，
κであった。
【００７５】（２）種々のＰＧ類似体との交差 ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ
１αの［ 3Ｈ］−ω−メチルエステル３００Ｂｇを含む
0.1 Ｍ ＰＢ（ｐＨ7.3 、１００μｌ）、本発明のモノ
クローナル抗体ＭＫ−１１Ｅ４（１００ng) 、ニワトリ
卵アルブミン（0.1 ｍｇ）を含む0.1 Ｍ ＰＢ（ｐＨ7.
3 、１００μｌ）に下表に示すＰＧ類似体の標準液［0.
1 Ｍ ＰＢ（ｐＨ7.3 ）溶液、１００μｌ）を加え、４
℃で一晩反応させた。反応液に、0.5 ％ウシγ−アルブ
ミンを含む0.1 Ｍ ＰＢ（２００μｌ）および３０％ポ
リエチレングリコール6000（６００μｌ）を加えて遠心
分離した後、沈殿物の放射活性を測定した。結果を次の
表１に示す。
１αの［ 3Ｈ］−ω−メチルエステル３００Ｂｇを含む
0.1 Ｍ ＰＢ（ｐＨ7.3 、１００μｌ）、本発明のモノ
クローナル抗体ＭＫ−１１Ｅ４（１００ng) 、ニワトリ
卵アルブミン（0.1 ｍｇ）を含む0.1 Ｍ ＰＢ（ｐＨ7.
3 、１００μｌ）に下表に示すＰＧ類似体の標準液［0.
1 Ｍ ＰＢ（ｐＨ7.3 ）溶液、１００μｌ）を加え、４
℃で一晩反応させた。反応液に、0.5 ％ウシγ−アルブ
ミンを含む0.1 Ｍ ＰＢ（２００μｌ）および３０％ポ
リエチレングリコール6000（６００μｌ）を加えて遠心
分離した後、沈殿物の放射活性を測定した。結果を次の
表１に示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】1)はＰＧＦ２αの主要血漿代謝物である式
【化２９】 で示される１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ
２αを表わし、
２αを表わし、
【００７８】2)はＰＧＦ２αの主要尿代謝物である式
【化３０】 で示される９α，１１α−ジヒドロキシ−１５−ケト−
２，３，４，５−テトラノルプロスタン−１，２０−ジ
オイックアシッドを表わし、
２，３，４，５−テトラノルプロスタン−１，２０−ジ
オイックアシッドを表わし、
【００７９】3)はＰＧＥ2 の主要血漿代謝物である式
【化３１】 で示せされる１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧ
Ｅ2 を表わす。
Ｅ2 を表わす。
【００８０】表１より、本発明のモノクローナル抗体
は、低濃度の２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αと
特異的に結合し、他のＰＧ類似化合物との交差率は１％
以下と非常に低いものであることが理解される。
は、低濃度の２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αと
特異的に結合し、他のＰＧ類似化合物との交差率は１％
以下と非常に低いものであることが理解される。
【００８１】実施例３ 本発明のモノクローナル抗体、ＭＫ−１１Ｅ４を用いた
免疫学的定量法 （１）ペルオキシダーゼで標識されたω−カルボキシ−
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクト
ン体の調製 実施例１（２）と同様にして、ω−カルボキシ−２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体と
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを用
いて、ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケト−Ｐ
ＧＦ１αのスピロラクトン体のコハク酸イミドエステル
を調製した。コハク酸イミドエステル体（２５μｇ）
に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡製、0.5 ｍ
ｇ）を含むＰＢＳ（２５０ｍｌ) を加え、４℃で一晩反
応させた後、反応物を１，４−ジオキサンとＰＢＳ
（１：１）の混合液で透析し、さらにＰＢＳで透析し
て、目的とする標識抗原を得た。
免疫学的定量法 （１）ペルオキシダーゼで標識されたω−カルボキシ−
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクト
ン体の調製 実施例１（２）と同様にして、ω−カルボキシ−２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体と
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを用
いて、ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケト−Ｐ
ＧＦ１αのスピロラクトン体のコハク酸イミドエステル
を調製した。コハク酸イミドエステル体（２５μｇ）
に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡製、0.5 ｍ
ｇ）を含むＰＢＳ（２５０ｍｌ) を加え、４℃で一晩反
応させた後、反応物を１，４−ジオキサンとＰＢＳ
（１：１）の混合液で透析し、さらにＰＢＳで透析し
て、目的とする標識抗原を得た。
【００８２】（２）２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ
１αの免疫学的定量試薬の調製 (a) 抗体溶液 本発明のモノクローナル抗体（ＭＫ−１１Ｅ４、実施例
１で調製した。）をＰＢＳで１μｇ／１５０μｌになる
ように調製したもの。 (b) 標識抗原溶液 実施例３（１）で調製したペルオキシダーゼ標識抗原
を、0.1 ％ニワトリ卵アルブミンを含むＰＢＳで２０ｎ
ｇ／ｍｌ（ペルオキシダーゼタン白として）となるよう
に調製したもの。 (c) 標準溶液 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αをＰＢＳで、１
μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４ｎ
ｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ、１６０ｐｇ／ｍｌ、１６
ｐｇ／ｍｌおよび1.6 ｐｇ／ｍｌとなるように調製した
もの。
１αの免疫学的定量試薬の調製 (a) 抗体溶液 本発明のモノクローナル抗体（ＭＫ−１１Ｅ４、実施例
１で調製した。）をＰＢＳで１μｇ／１５０μｌになる
ように調製したもの。 (b) 標識抗原溶液 実施例３（１）で調製したペルオキシダーゼ標識抗原
を、0.1 ％ニワトリ卵アルブミンを含むＰＢＳで２０ｎ
ｇ／ｍｌ（ペルオキシダーゼタン白として）となるよう
に調製したもの。 (c) 標準溶液 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αをＰＢＳで、１
μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４ｎ
ｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ、１６０ｐｇ／ｍｌ、１６
ｐｇ／ｍｌおよび1.6 ｐｇ／ｍｌとなるように調製した
もの。
【００８３】(d) 洗浄液 0.1 ％ニワトリ卵アルブミンを含むＰＢＳ。 (e) ブロッキング剤 0.5 ％ＢＳＡを含むＰＢＳ。 (f) 基質溶液１ ジメチルスルホキシド ４０μｌ 蒸留水 ４６０μｌ ２０ｍＭ ３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジン を含む0.1 Ｍ クエン酸溶液 ２０μｌ マックイルバイン（McIlvaine ）緩衝液（ｐＨ4.5 ） ３８０μｌ を混合したもの（上記の量は１回分）。 (g) 基質溶液２ １０ｍＭ 過酸化水素溶液。 (h) 反応停止液 １Ｎ 硫酸溶液。
【００８４】（３）（２）で調製した試薬を用いた２，
３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの測定 1) ポリスチレンチューブ（ファルコン社製）に抗体溶
液１５０μｌを加え、３７℃で１時間放置した。 2) ポリスチレンチューブ内の抗体溶液を除き、洗浄液
１ｍｌで洗浄した。 3) ブロッキング液1.5 ｍｌを加え、３７℃で３０分間
放置した。 4) ブロッキング液を除去した後洗浄した。 5) 標準溶液（またはサンプル）１００μｌを加えた
後、標識抗原溶液１００μｌを加え、４℃で一晩放置し
た。 6) チューブ内の溶液を除去した後、洗浄液で２回洗浄
した。 7) 基質溶液１ ９００μｌおよび基質溶液２ １００
μｌを加えて、２５℃で１時間反応させた。 8) 反応停止液を２００μｌ加え、反応を停止させた。 9) ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。 標準２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの測定値を
プロットした標準検量線を図１に示す。図１から明らか
なように、本定量法では、３〜５６０ｐｇ／testの範囲
の２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αが測定可能で
ある。
３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの測定 1) ポリスチレンチューブ（ファルコン社製）に抗体溶
液１５０μｌを加え、３７℃で１時間放置した。 2) ポリスチレンチューブ内の抗体溶液を除き、洗浄液
１ｍｌで洗浄した。 3) ブロッキング液1.5 ｍｌを加え、３７℃で３０分間
放置した。 4) ブロッキング液を除去した後洗浄した。 5) 標準溶液（またはサンプル）１００μｌを加えた
後、標識抗原溶液１００μｌを加え、４℃で一晩放置し
た。 6) チューブ内の溶液を除去した後、洗浄液で２回洗浄
した。 7) 基質溶液１ ９００μｌおよび基質溶液２ １００
μｌを加えて、２５℃で１時間反応させた。 8) 反応停止液を２００μｌ加え、反応を停止させた。 9) ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。 標準２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの測定値を
プロットした標準検量線を図１に示す。図１から明らか
なように、本定量法では、３〜５６０ｐｇ／testの範囲
の２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αが測定可能で
ある。
【図１】本発明のモノクローナル抗体、ＭＫ−１１Ｅ４
を用いた２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの免疫
学的定量法における検量線である。
を用いた２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの免疫
学的定量法における検量線である。
【化２３】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年８月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】
【発明の構成】本発明は、２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗体に関
する。本発明には、本発明の実施例で得られたモノクロ
ーナル抗体の抗原結合部位以外の抗原結合部位を有する
モノクローナル抗体も含まれる。また、免疫グロブリン
のクラスおよびサブクラスも特に限定されるものではな
いが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭクラスであり、特
に好ましくはＩｇＧクラスである。本発明に含まれるモ
ノクローナル抗体の具体的な例としては、ＭＨ−１１Ｅ
４が挙げられるが、本発明はこのモノクローナル抗体の
みに限定されるものではない。本発明のモノクローナル
抗体は、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異
的に認識する。すなわち、２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１α以外のＰＧ類似化合物とはほとんど交差しな
い点に特徴を有する。
ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗体に関
する。本発明には、本発明の実施例で得られたモノクロ
ーナル抗体の抗原結合部位以外の抗原結合部位を有する
モノクローナル抗体も含まれる。また、免疫グロブリン
のクラスおよびサブクラスも特に限定されるものではな
いが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭクラスであり、特
に好ましくはＩｇＧクラスである。本発明に含まれるモ
ノクローナル抗体の具体的な例としては、ＭＨ−１１Ｅ
４が挙げられるが、本発明はこのモノクローナル抗体の
みに限定されるものではない。本発明のモノクローナル
抗体は、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異
的に認識する。すなわち、２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１α以外のＰＧ類似化合物とはほとんど交差しな
い点に特徴を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】 本発明のモノクローナル抗体のうち、好
ましいものはＰＧＦ２α、ＰＧＦ１α、６−ケト−ＰＧ
Ｆ１α、ＰＧＦ２α−ＭＰＭおよびＰＧＦ２α−ＭＵＭ
との交差率が1.0 ％以下のものである。例えば、本発明
のモノクローナル抗体のうちのひとつ、ＭＨ−１１Ｅ４
のＰＧＦ２α、ＰＧＦ１α、６−ケト−ＰＧＦ１α、Ｐ
ＧＦ２α−ＭＰＭおよびＰＧＦ２α−ＭＵＭとの交差率
は、それぞれ0.1 ％、0.6 ％、0.42％、0.015 ％以下お
よび0.015 ％以下である。
ましいものはＰＧＦ２α、ＰＧＦ１α、６−ケト−ＰＧ
Ｆ１α、ＰＧＦ２α−ＭＰＭおよびＰＧＦ２α−ＭＵＭ
との交差率が1.0 ％以下のものである。例えば、本発明
のモノクローナル抗体のうちのひとつ、ＭＨ−１１Ｅ４
のＰＧＦ２α、ＰＧＦ１α、６−ケト−ＰＧＦ１α、Ｐ
ＧＦ２α−ＭＰＭおよびＰＧＦ２α−ＭＵＭとの交差率
は、それぞれ0.1 ％、0.6 ％、0.42％、0.015 ％以下お
よび0.015 ％以下である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】 特許請求の範囲を含む本明細書において
は、式（３ｂ）の化合物を２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１αのスピロラクトン体、また式（３ａ）化合物
を２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのヘミアセタ
ール体と命名することとする。さらに、２，３−ジノル
−６−ケト−ＰＧＦ１αという用語を特に制限すること
なく用いた場合には、相当するスピロラクトン体および
相当するヘミアセタール体をも含んでいるものとする。
また、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの２０位
のメチル基を他の官能基に置き換えた化合物はω−置換
−２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αとして命名す
ることとする。例えば、式
は、式（３ｂ）の化合物を２，３−ジノル−６−ケト−
ＰＧＦ１αのスピロラクトン体、また式（３ａ）化合物
を２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのヘミアセタ
ール体と命名することとする。さらに、２，３−ジノル
−６−ケト−ＰＧＦ１αという用語を特に制限すること
なく用いた場合には、相当するスピロラクトン体および
相当するヘミアセタール体をも含んでいるものとする。
また、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの２０位
のメチル基を他の官能基に置き換えた化合物はω−置換
−２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αとして命名す
ることとする。例えば、式
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】 本発明のモノクローナル抗体は、(1) ω
鎖（ＰＧ骨格中の下の側鎖）を修飾した２，３−ジノル
−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体をキャリア
−タン白にコンジュゲートし、(2) 得られたＰＧ−タン
白結合物を免疫抗原として、マウスを感作し、(3) 感作
マウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞を細胞融合し、
(4) 得られたハイブリドーマより、２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αに対するモノクローナル抗体を産生
する細胞をスクリーニングし、(5) 目的とする抗体産生
ハイブリドーマをクロ−ニングし、(6) クローン化され
た抗体産生ハイブリドーマを増殖させ、(7) 産生された
抗体を分離精製することによって調製することができ
る。
鎖（ＰＧ骨格中の下の側鎖）を修飾した２，３−ジノル
−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体をキャリア
−タン白にコンジュゲートし、(2) 得られたＰＧ−タン
白結合物を免疫抗原として、マウスを感作し、(3) 感作
マウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞を細胞融合し、
(4) 得られたハイブリドーマより、２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αに対するモノクローナル抗体を産生
する細胞をスクリーニングし、(5) 目的とする抗体産生
ハイブリドーマをクロ−ニングし、(6) クローン化され
た抗体産生ハイブリドーマを増殖させ、(7) 産生された
抗体を分離精製することによって調製することができ
る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】 ω鎖を修飾した２，３−ジノル−６−ケ
ト−ＰＧＦ １α のスピロラクトン体は、公知のＰＧ合成
法に従って容易に製造することができる。代表的な合成
スキームを以下の反応工程式Ｉに示す。さらに、反応工
程式Ｉ中、出発物質として用いられる式（９）の化合物
の代表的な合成スキームを反応工程式IIに示す。
ト−ＰＧＦ １α のスピロラクトン体は、公知のＰＧ合成
法に従って容易に製造することができる。代表的な合成
スキームを以下の反応工程式Ｉに示す。さらに、反応工
程式Ｉ中、出発物質として用いられる式（９）の化合物
の代表的な合成スキームを反応工程式IIに示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１α
のような低分子の物質の免疫学的定量法としては競合法
が一般的である。競合法は、(i) 標識抗原と非標識抗原
を抗体に対して競合反応させ、次に(ii)抗体と結合した
（または結合していない）標識抗原を定量することによ
り、非標識抗原量を算出する方法である。抗体に結合し
た（または結合していない）標識抗原量を知るには、抗
体結合抗原と非結合抗原を分離しないで定量する方法
（ホモジニアス）もあるが、抗体結合抗原（ Bound, Ｂ
と略す。）と非結合抗原（free, Ｆと略す。）を分離し
て（Ｂ／Ｆ分離という。）測定する方法（ヘテロジニア
ス）が一般的である。標識抗原としては、２，３−ジノ
ル−６−ケト−ＰＧＦ １α または２，３−ジノル−６−
ケト−ＰＧＦ１αの類似化合物（すなわち、抗２，３−
ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１α抗体と交差反応をするも
の、例えば、ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケ
ト−ＰＧＦ１α）の放射標識抗原あるいは酵素標識抗原
が用いられる。ここで用いられる酵素としては、一般に
酵素免疫測定に用いられる酵素であれば何でもよく、例
えばペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素、アセチルコルンエステ
ラーゼ、アルコール脱水素酵素などが挙げられる。
のような低分子の物質の免疫学的定量法としては競合法
が一般的である。競合法は、(i) 標識抗原と非標識抗原
を抗体に対して競合反応させ、次に(ii)抗体と結合した
（または結合していない）標識抗原を定量することによ
り、非標識抗原量を算出する方法である。抗体に結合し
た（または結合していない）標識抗原量を知るには、抗
体結合抗原と非結合抗原を分離しないで定量する方法
（ホモジニアス）もあるが、抗体結合抗原（ Bound, Ｂ
と略す。）と非結合抗原（free, Ｆと略す。）を分離し
て（Ｂ／Ｆ分離という。）測定する方法（ヘテロジニア
ス）が一般的である。標識抗原としては、２，３−ジノ
ル−６−ケト−ＰＧＦ １α または２，３−ジノル−６−
ケト−ＰＧＦ１αの類似化合物（すなわち、抗２，３−
ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１α抗体と交差反応をするも
の、例えば、ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケ
ト−ＰＧＦ１α）の放射標識抗原あるいは酵素標識抗原
が用いられる。ここで用いられる酵素としては、一般に
酵素免疫測定に用いられる酵素であれば何でもよく、例
えばペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素、アセチルコルンエステ
ラーゼ、アルコール脱水素酵素などが挙げられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】 Ｂ／Ｆ分離の方法も特に限定されること
はない。放射標識抗原の場合には、ポリエチレングリコ
ールによる沈殿法、活性炭による吸着法などがよく用い
られる。酵素標識抗原の場合には、第１抗体固相法、第
２抗体法などがある。第１抗体固相法は、(1) 固相化し
た２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対するモノ
クローナル抗体（第１抗体）に、２，３−ジノル−６−
ケト−ＰＧＦ１αを含有するサンプル、および標識抗原
を添加して、競合反応させ、次に(2) 液相を除去した
後、固相に結合した標識物の活性を測定することによっ
てサンプル中の２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１α
の量を測定する方法である。第１抗体としては、本発明
のモノクローナル抗体、例えばＭＨ−１１Ｅ４が用いら
れる。免疫学的定量法に用いられる固相および固定化方
法はよく知られている［千畑一郎編、固定化酵素（1975
年、講談社発行）参照のこと］。例えば、固相として
は、ポリスチレンプレート、ポリスチレンビーズ、ナイ
ロンビーズ、ガラスビーズ、プロテインＡアガロースビ
ーズ、プロテインＧアガロースビーズ、ポリスチレンチ
ューブなどが挙げられる。固定化は、物理的吸着や共有
結合による不溶化法が用いられる。標識抗原の標識物と
しては一般に酵素が用いられるが、放射物質や蛍光物質
も使用できる。ここで用いられる酵素としては、一般に
酵素免疫測定に用いられる酵素であれば何でもよく、例
えば先に列挙した酵素が挙げられる。第１抗体とサンプ
ルおよび標識抗原との反応は、通常４℃、約１０時間か
けて行なうのが望ましい。
はない。放射標識抗原の場合には、ポリエチレングリコ
ールによる沈殿法、活性炭による吸着法などがよく用い
られる。酵素標識抗原の場合には、第１抗体固相法、第
２抗体法などがある。第１抗体固相法は、(1) 固相化し
た２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対するモノ
クローナル抗体（第１抗体）に、２，３−ジノル−６−
ケト−ＰＧＦ１αを含有するサンプル、および標識抗原
を添加して、競合反応させ、次に(2) 液相を除去した
後、固相に結合した標識物の活性を測定することによっ
てサンプル中の２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１α
の量を測定する方法である。第１抗体としては、本発明
のモノクローナル抗体、例えばＭＨ−１１Ｅ４が用いら
れる。免疫学的定量法に用いられる固相および固定化方
法はよく知られている［千畑一郎編、固定化酵素（1975
年、講談社発行）参照のこと］。例えば、固相として
は、ポリスチレンプレート、ポリスチレンビーズ、ナイ
ロンビーズ、ガラスビーズ、プロテインＡアガロースビ
ーズ、プロテインＧアガロースビーズ、ポリスチレンチ
ューブなどが挙げられる。固定化は、物理的吸着や共有
結合による不溶化法が用いられる。標識抗原の標識物と
しては一般に酵素が用いられるが、放射物質や蛍光物質
も使用できる。ここで用いられる酵素としては、一般に
酵素免疫測定に用いられる酵素であれば何でもよく、例
えば先に列挙した酵素が挙げられる。第１抗体とサンプ
ルおよび標識抗原との反応は、通常４℃、約１０時間か
けて行なうのが望ましい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】 (2) の標識物の活性の測定も公知の方法
により行なわれる。例えば、ペルオキシダーゼで標識し
た場合には、基質として３，３′，５，５′−テトラメ
チルベンチジンを用いて過酸化水素と反応させ、反応生
成物の吸光度を測定することによって行なわれる。この
場合、基質として３−（４−ヒドロキシフェニル）プロ
ピオン酸やオルトフェニレンジアミン、ルミノールなど
を使用することもできる。これ以外の酵素で標識した場
合でも適当な基質を用いて行なわれる。第２抗体法に
は、第１抗体と第２抗体の反応を液相で行なう方法と、
第２抗体固相法がある。特に、第２抗体固相法は、第２
抗体を固相化することによりＢ／Ｆ分離が容易となって
有利である。第２抗体固相法は、(1) マウスＩｇＧに対
する抗体（第２抗体）を固相化し、(2) そこに、２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを含むサンプル、標識
抗原および２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対
するモノクローナル抗体（第１抗体）を加え、反応させ
た後、(3) 固相の標識物を測定することによって行なわ
れる。
により行なわれる。例えば、ペルオキシダーゼで標識し
た場合には、基質として３，３′，５，５′−テトラメ
チルベンチジンを用いて過酸化水素と反応させ、反応生
成物の吸光度を測定することによって行なわれる。この
場合、基質として３−（４−ヒドロキシフェニル）プロ
ピオン酸やオルトフェニレンジアミン、ルミノールなど
を使用することもできる。これ以外の酵素で標識した場
合でも適当な基質を用いて行なわれる。第２抗体法に
は、第１抗体と第２抗体の反応を液相で行なう方法と、
第２抗体固相法がある。特に、第２抗体固相法は、第２
抗体を固相化することによりＢ／Ｆ分離が容易となって
有利である。第２抗体固相法は、(1) マウスＩｇＧに対
する抗体（第２抗体）を固相化し、(2) そこに、２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを含むサンプル、標識
抗原および２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対
するモノクローナル抗体（第１抗体）を加え、反応させ
た後、(3) 固相の標識物を測定することによって行なわ
れる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】 第２抗体は、マウスＩｇＧに対する抗体
であればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体で
もよく、また感作する動物種に制限はない。マウスＩｇ
Ｇに対するポリクローナル抗体は、マウス血清あるいは
マウスγ−グロブリンを一般的に知られた方法で別種の
動物（例えばラット、モルモット、ウサギ、ヤギなど）
に投与、感作して調製することができる［臨床検査、２
６巻（７）、７７７頁（１９８２年）参照のこと］が、
マウスＩｇＧに対するポリクローナル抗体のいくつかは
市販されている。その他、固相、固定化方法、標識抗
原、標識方法、第１抗体、標識物の活性測定方法、反応
温度と時間等は、第１抗体固相法に準じて任意に選択で
きる。また、上記以外の方法として、２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体（第１抗体、本発明のモノクローナル抗体）に対
し、固相化した抗原とサンプル中の２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αを競合させた後、固相または液相の
第１抗体量を、予め第１抗体を標識しておくか、または
第１抗体と結合する標識された第２抗体を用いることな
どにより定量する方法もある。
であればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体で
もよく、また感作する動物種に制限はない。マウスＩｇ
Ｇに対するポリクローナル抗体は、マウス血清あるいは
マウスγ−グロブリンを一般的に知られた方法で別種の
動物（例えばラット、モルモット、ウサギ、ヤギなど）
に投与、感作して調製することができる［臨床検査、２
６巻（７）、７７７頁（１９８２年）参照のこと］が、
マウスＩｇＧに対するポリクローナル抗体のいくつかは
市販されている。その他、固相、固定化方法、標識抗
原、標識方法、第１抗体、標識物の活性測定方法、反応
温度と時間等は、第１抗体固相法に準じて任意に選択で
きる。また、上記以外の方法として、２，３−ジノル−
６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体（第１抗体、本発明のモノクローナル抗体）に対
し、固相化した抗原とサンプル中の２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αを競合させた後、固相または液相の
第１抗体量を、予め第１抗体を標識しておくか、または
第１抗体と結合する標識された第２抗体を用いることな
どにより定量する方法もある。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４８】 前記した反応工程式中、９−ＢＢＮは９
−ボラビシクロ［３．３．１］ノナンを表わし、その他
の記号は前記と同じ意味を表わす。式（３０−１）から
（３０−７）で示されるハプテンは、前記した方法でキ
ャリア−タン白と結合することができる。得られたハプ
テンとキャリア−タン白の結合物は、アルカリ条件下の
加水分解（例えば、炭酸カリウムを用いた）に付し、α
鎖末端を、フリーのカルボン酸とした後、感作抗原とし
て用いられる。
−ボラビシクロ［３．３．１］ノナンを表わし、その他
の記号は前記と同じ意味を表わす。式（３０−１）から
（３０−７）で示されるハプテンは、前記した方法でキ
ャリア−タン白と結合することができる。得られたハプ
テンとキャリア−タン白の結合物は、アルカリ条件下の
加水分解（例えば、炭酸カリウムを用いた）に付し、α
鎖末端を、フリーのカルボン酸とした後、感作抗原とし
て用いられる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５０】 実施例１ ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対するモノク
ローナル抗体の作製（１）ω−カルボキシ−２，３−ジ
ノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体の合成 (a) 式
ローナル抗体の作製（１）ω−カルボキシ−２，３−ジ
ノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体の合成 (a) 式
【化２２】 の合成
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５１】 アルゴン雰囲気下、ジメチルメチルホス
ホナート（2.6 ｍｌ）のＴＨＦ溶液（４８ｍｌ）に、ｎ
−ブチルリチウムのｎ−ヘキサン溶液（2.2 Ｍ、14.7ｍ
ｌ）を、−７８℃でかきまぜながらゆっくりと滴下し、
滴下後４０分間かきまぜた。次に、ε−カプロラクトン
（1.11ｍｌ）を同温度でゆっくりと滴下した後、1.4 時
間かけて−１０℃まで昇温した。反応液に飽和塩化アン
モニウム水溶液を加え、エーテルで抽出した。さらに水
層をクロロホルムで抽出した。ふたつの抽出液を一緒に
して乾燥した後、減圧濃縮した。残留物を塩化メチレン
（５０ｍｌ) に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸（３９
ｍｇ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温でジヒドロピラ
ン（1.37ｍｌ) をゆっくり加え、２０分間かきまぜた。
トリエチルアミン（６０μｌ）を加えた後、減圧濃縮し
て、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ａ
ｃＯＥｔ：メタノール＝99.5：0.5 ）で精製し、次の物
性値を有する標題化合物物（3.2 ｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：メタノール＝９：１）：Ｒｆ 0.
52。
ホナート（2.6 ｍｌ）のＴＨＦ溶液（４８ｍｌ）に、ｎ
−ブチルリチウムのｎ−ヘキサン溶液（2.2 Ｍ、14.7ｍ
ｌ）を、−７８℃でかきまぜながらゆっくりと滴下し、
滴下後４０分間かきまぜた。次に、ε−カプロラクトン
（1.11ｍｌ）を同温度でゆっくりと滴下した後、1.4 時
間かけて−１０℃まで昇温した。反応液に飽和塩化アン
モニウム水溶液を加え、エーテルで抽出した。さらに水
層をクロロホルムで抽出した。ふたつの抽出液を一緒に
して乾燥した後、減圧濃縮した。残留物を塩化メチレン
（５０ｍｌ) に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸（３９
ｍｇ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温でジヒドロピラ
ン（1.37ｍｌ) をゆっくり加え、２０分間かきまぜた。
トリエチルアミン（６０μｌ）を加えた後、減圧濃縮し
て、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ａ
ｃＯＥｔ：メタノール＝99.5：0.5 ）で精製し、次の物
性値を有する標題化合物物（3.2 ｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ：メタノール＝９：１）：Ｒｆ 0.
52。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】 アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム
（２８４ｍｇ）のＴＨＦ懸濁液（３０ｍｌ）に、(a) で
得られたホスホネート（2.55ｇ）のＴＨＦ溶液（２５ｍ
ｌ) を室温で滴下し、２５分間かきまぜた後、２−オキ
サ−６β−ホルミル−７α−（テトラヒドロピラン−２
−イルオキシ）−シス−ビシクロ［３．３．０］オクタ
ン−３−オン（特開昭50-137961 号明細書、参考例１お
よび８記載の方法で製造した。1.82ｇ）のＴＨＦ溶液
（１２ｍｌ）を４℃で滴下し３０分間かきまぜた。さら
に、３０分間かきまぜて室温まで昇温した後、反応液に
飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出
した。抽出液を水洗し、乾燥後、減圧濃縮した。残留物
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：Ａ
ｃＯＥｔ＝１：１）で精製し、次の物性値を有する標題
化合物（2.8 ｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）：Ｒｆ 0.61； ＭＳ：ｍ／ｚ ３８５、３４８、２８２、２６５、２７
４。
（２８４ｍｇ）のＴＨＦ懸濁液（３０ｍｌ）に、(a) で
得られたホスホネート（2.55ｇ）のＴＨＦ溶液（２５ｍ
ｌ) を室温で滴下し、２５分間かきまぜた後、２−オキ
サ−６β−ホルミル−７α−（テトラヒドロピラン−２
−イルオキシ）−シス−ビシクロ［３．３．０］オクタ
ン−３−オン（特開昭50-137961 号明細書、参考例１お
よび８記載の方法で製造した。1.82ｇ）のＴＨＦ溶液
（１２ｍｌ）を４℃で滴下し３０分間かきまぜた。さら
に、３０分間かきまぜて室温まで昇温した後、反応液に
飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出
した。抽出液を水洗し、乾燥後、減圧濃縮した。残留物
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：Ａ
ｃＯＥｔ＝１：１）で精製し、次の物性値を有する標題
化合物（2.8 ｇ）を得た。 ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ）：Ｒｆ 0.61； ＭＳ：ｍ／ｚ ３８５、３４８、２８２、２６５、２７
４。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５５】 水素化リチウムアルミニウム（５３０ｍ
ｇ）のＴＨＦ溶液（３３ｍｌ）に、アルゴン雰囲気下、
室温でエタノール（７８０μｌ）とＴＨＦ（6.5ｍｌ）
の混合液を徐々に滴下し、１５分間かきまぜた後、ＳＢ
Ｎ［（ｓ）−（−）−ビナフトール］（3.81ｇ）のＴＨ
Ｆ溶液（２０ｍｌ）を加え、０℃で２時間激しくかきま
ぜた。次に、反応液に(b) で得られたケトン体（1.0
ｇ）のＴＨＦ溶液（１０ｍｌ）を−７８℃で滴下した。
滴下後、メタノール（1.78ｍｌ）および１Ｎ 塩酸（1
4.2ｍｌ）を順次加え、室温まで昇温した。反応液をセ
ライトを通じてろ過し、ろ液を酢酸エチルで抽出した。
抽出液を水洗し、乾燥後減圧濃縮した。残留物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯ
Ｅｔ＝１：３）で精製し、２−オキサ−６β−（８−
（テトラヒドロピラン−２−イルオキシ）−３α−ヒド
ロキシオクタ−トランス−１−エニル）−７α−（テト
ラヒドロピラン２−イルオキシ）−シス−ビシクロ
［３．３．０］オクタン−３−オン（９５０ｍｇ）を得
た。
ｇ）のＴＨＦ溶液（３３ｍｌ）に、アルゴン雰囲気下、
室温でエタノール（７８０μｌ）とＴＨＦ（6.5ｍｌ）
の混合液を徐々に滴下し、１５分間かきまぜた後、ＳＢ
Ｎ［（ｓ）−（−）−ビナフトール］（3.81ｇ）のＴＨ
Ｆ溶液（２０ｍｌ）を加え、０℃で２時間激しくかきま
ぜた。次に、反応液に(b) で得られたケトン体（1.0
ｇ）のＴＨＦ溶液（１０ｍｌ）を−７８℃で滴下した。
滴下後、メタノール（1.78ｍｌ）および１Ｎ 塩酸（1
4.2ｍｌ）を順次加え、室温まで昇温した。反応液をセ
ライトを通じてろ過し、ろ液を酢酸エチルで抽出した。
抽出液を水洗し、乾燥後減圧濃縮した。残留物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯ
Ｅｔ＝１：３）で精製し、２−オキサ−６β−（８−
（テトラヒドロピラン−２−イルオキシ）−３α−ヒド
ロキシオクタ−トランス−１−エニル）−７α−（テト
ラヒドロピラン２−イルオキシ）−シス−ビシクロ
［３．３．０］オクタン−３−オン（９５０ｍｇ）を得
た。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５６】 得られたビス（テトラヒドロピラン−２
−イルオキシ）体（９５０ｍｇ) をメタノール（２２ｍ
ｌ) に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸（１２ｍｇ）を
加えて、アルゴン雰囲気下、室温で５０分間かきまぜ
た。反応液にトリエチルアミン（0.2 ｍｌ）を加えて減
圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー（ＡｃＯＥｔ：エタノール＝９７：３）で精製し
て、次の物性値を有する２−オキサ−６β−（８，３α
−ジヒドロキシオクタ−トランス−１−エニル）−７α
−ヒドロキシ−シス−ビシクロ［３．３．０］オクタン
−３−オン（５６７ｍｇ）を得た。
−イルオキシ）体（９５０ｍｇ) をメタノール（２２ｍ
ｌ) に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸（１２ｍｇ）を
加えて、アルゴン雰囲気下、室温で５０分間かきまぜ
た。反応液にトリエチルアミン（0.2 ｍｌ）を加えて減
圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー（ＡｃＯＥｔ：エタノール＝９７：３）で精製し
て、次の物性値を有する２−オキサ−６β−（８，３α
−ジヒドロキシオクタ−トランス−１−エニル）−７α
−ヒドロキシ−シス−ビシクロ［３．３．０］オクタン
−３−オン（５６７ｍｇ）を得た。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６５】 アルゴン雰囲気下、オキザリルクロライ
ド（１４μｌ）の塩化メチレン溶液（１ml）を−７８℃
まで冷却し、ここへジメチルスルホキシド（２３μｌ）
の塩化メチレン溶液（0.5 ｍｌ) を滴下し、１０分間か
きまぜた。さらに、(f) で得られたアルコール体（５０
ｍｇ) の塩化メチレン溶液（１ｍｌ) を徐々に加えた
後、２０分間かきまぜた。反応液にトリエチルアミン
（７５μｌ）を加えた後、４５分間かけて−５０℃まで
昇温し、次に水（２ｍｌ) を加え、１０分間かけて室温
まで昇温した。反応液を酢酸エチルで抽出し、抽出液を
水および飽和塩化アンモニウム水溶液で順次洗浄し、乾
燥後、減圧濃縮して、２−オキサ−６β−（７−ホルミ
ル−３α−（テトラヒドロピラン−２−イルオキシ）ヘ
プタ−トランス−１−エニル）−７α−（テトラヒドロ
ピラン−２−イルオキシ）−シス−ビシクロ［３．３．
０］オクタン−３−スピロ−２′−オキソラン−５′−
オンの粗生成物（約４９ｍｇ）を得た。
ド（１４μｌ）の塩化メチレン溶液（１ml）を−７８℃
まで冷却し、ここへジメチルスルホキシド（２３μｌ）
の塩化メチレン溶液（0.5 ｍｌ) を滴下し、１０分間か
きまぜた。さらに、(f) で得られたアルコール体（５０
ｍｇ) の塩化メチレン溶液（１ｍｌ) を徐々に加えた
後、２０分間かきまぜた。反応液にトリエチルアミン
（７５μｌ）を加えた後、４５分間かけて−５０℃まで
昇温し、次に水（２ｍｌ) を加え、１０分間かけて室温
まで昇温した。反応液を酢酸エチルで抽出し、抽出液を
水および飽和塩化アンモニウム水溶液で順次洗浄し、乾
燥後、減圧濃縮して、２−オキサ−６β−（７−ホルミ
ル−３α−（テトラヒドロピラン−２−イルオキシ）ヘ
プタ−トランス−１−エニル）−７α−（テトラヒドロ
ピラン−２−イルオキシ）−シス−ビシクロ［３．３．
０］オクタン−３−スピロ−２′−オキソラン−５′−
オンの粗生成物（約４９ｍｇ）を得た。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６８】 （２）感作抗原の調製 （１）で合成したω−カルボキシ−２，３−ジノル−６
−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体（３００μｇ）
のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１００μｌ）
に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩（９００μｇ）の水溶液（５０μ
ｌ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（６００μｇ）の
水溶液（５０μｌ）を加えて、３０℃で２時間かきまぜ
た後、水（1.8 ｍｌ）を加えた。反応混合物を酢酸エチ
ルで抽出し、抽出液を濃縮乾固した。得られた固体を、
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する。３ｍ
ｇ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（以下、ＰＢと略記す
る。ｐＨ7.4 、２００μｌ）に加え、４℃で一晩反応さ
せた。反応液をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと１０ｍ
Ｍ ＰＢ（２：３）の混合液で透析し、さらに１０ｍＭ
ＰＢで透析し、目的とする感作抗原を得た。
−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体（３００μｇ）
のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１００μｌ）
に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩（９００μｇ）の水溶液（５０μ
ｌ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（６００μｇ）の
水溶液（５０μｌ）を加えて、３０℃で２時間かきまぜ
た後、水（1.8 ｍｌ）を加えた。反応混合物を酢酸エチ
ルで抽出し、抽出液を濃縮乾固した。得られた固体を、
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する。３ｍ
ｇ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（以下、ＰＢと略記す
る。ｐＨ7.4 、２００μｌ）に加え、４℃で一晩反応さ
せた。反応液をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと１０ｍ
Ｍ ＰＢ（２：３）の混合液で透析し、さらに１０ｍＭ
ＰＢで透析し、目的とする感作抗原を得た。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７１】 （４）細胞融合 最終免疫から３日後に、感作マウスから脾臓を摘出し脾
細胞を調製した。得られた脾細胞とマウス骨髄腫細胞Ｓ
Ｐ−２／０−Ａｇ１４［Nature, 276, 269(1978)記載の
方法により調製した。］を５：１の割合で混合し、ポリ
エチレングリコール［ＰＥＧ1000（登録商標）、和光純
薬製］を５０％の濃度で加えて、Godingの方法［J. Imm
unol, Methods, 39, 285 1980)参照のこと］に準じて細
胞融合を行なった。融合操作後の細胞混合物を、２０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ＮＣＴＣ１０９培地
（登録商標、ＭＡバイオプロダクト社製）、ヒポキサン
チン（13.6μｇ／ｍｌ）、チミジン（3.9 μｇ／ｍｌ)
およびグリシン（2.0 μｇ／ｍｌ) を含有するダルベッ
コ変法イーグル培地（以下、ＤＭＥと略記する。）（4.
5 ｇ／ｌグルコース含有タイプ、ギブコ社製）に浮遊さ
せ、３７℃、７％ＣＯ2 含有大気下で培養した。培養後
２、４および７日目に、培地の半量をＨＡＴ培地（アミ
ノプテリン0.18μｇ／ｍｌを含有する上記イーグル培
地）に変換し培養を続けた。培養１０日目ごろより、い
くつかのウェルではブドウの房状のコロニーが形成さ
れ、最終的に1215ウェルにおいてハイブリドーマの増殖
が認められた。
細胞を調製した。得られた脾細胞とマウス骨髄腫細胞Ｓ
Ｐ−２／０−Ａｇ１４［Nature, 276, 269(1978)記載の
方法により調製した。］を５：１の割合で混合し、ポリ
エチレングリコール［ＰＥＧ1000（登録商標）、和光純
薬製］を５０％の濃度で加えて、Godingの方法［J. Imm
unol, Methods, 39, 285 1980)参照のこと］に準じて細
胞融合を行なった。融合操作後の細胞混合物を、２０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ＮＣＴＣ１０９培地
（登録商標、ＭＡバイオプロダクト社製）、ヒポキサン
チン（13.6μｇ／ｍｌ）、チミジン（3.9 μｇ／ｍｌ)
およびグリシン（2.0 μｇ／ｍｌ) を含有するダルベッ
コ変法イーグル培地（以下、ＤＭＥと略記する。）（4.
5 ｇ／ｌグルコース含有タイプ、ギブコ社製）に浮遊さ
せ、３７℃、７％ＣＯ2 含有大気下で培養した。培養後
２、４および７日目に、培地の半量をＨＡＴ培地（アミ
ノプテリン0.18μｇ／ｍｌを含有する上記イーグル培
地）に変換し培養を続けた。培養１０日目ごろより、い
くつかのウェルではブドウの房状のコロニーが形成さ
れ、最終的に1215ウェルにおいてハイブリドーマの増殖
が認められた。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７３】 （６）抗体産生ハイブリドーマ細胞の培
養 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対する抗体を
産生していると判定された細胞をKennett の方法［Mono
clonal Antibodies, 372頁(1980)参照のこと］に従っ
て、軟寒天培養法でクローニングした。クローン化した
細胞株をＭＨ−１１Ｅ４株と命名した。クローン化した
株細胞１０7 個を予めプリスタン処理しておいたＢＡＬ
Ｂ／ｃ雌性マウスの腹腔内に移植した。約２週間後、腹
水が大量に蓄積された時点で腹水を採取した。得られた
採水を５０％飽和硫安で分画した後、プロテインＡ−セ
ファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）を用い
たアフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製して
ＩｇＧ画分を得た。なお、本発明のモノクローナル抗
体、ＭＨ−１１Ｅ４を産生するハイブリドーマ、ＭＨ−
１１Ｅ４株は、微生物工業技術研究所に寄託番号微工研
条寄第3481号（ＦＥＲＭ ＢＰ−3481）で１９９１年７
月１０日に寄託されている。
養 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αに対する抗体を
産生していると判定された細胞をKennett の方法［Mono
clonal Antibodies, 372頁(1980)参照のこと］に従っ
て、軟寒天培養法でクローニングした。クローン化した
細胞株をＭＨ−１１Ｅ４株と命名した。クローン化した
株細胞１０7 個を予めプリスタン処理しておいたＢＡＬ
Ｂ／ｃ雌性マウスの腹腔内に移植した。約２週間後、腹
水が大量に蓄積された時点で腹水を採取した。得られた
採水を５０％飽和硫安で分画した後、プロテインＡ−セ
ファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）を用い
たアフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製して
ＩｇＧ画分を得た。なお、本発明のモノクローナル抗
体、ＭＨ−１１Ｅ４を産生するハイブリドーマ、ＭＨ−
１１Ｅ４株は、微生物工業技術研究所に寄託番号微工研
条寄第3481号（ＦＥＲＭ ＢＰ−3481）で１９９１年７
月１０日に寄託されている。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７４】 実施例２ 本発明のモノクローナル抗体の諸性質 （１）イムノグロブリンサブクラス 実施例１で作製したモノクローナル抗体、ＭＨ−１１Ｅ
４について、マウスＭｏｎｏ Ａｂ−ＩＤ ＥＩＡキッ
ト（Zymed 社製）を用いてサブクラスをスクリーニング
した。その結果、ＭＨ−１１Ｅ４は、マウスＩｇＧ2b，
κであった。
４について、マウスＭｏｎｏ Ａｂ−ＩＤ ＥＩＡキッ
ト（Zymed 社製）を用いてサブクラスをスクリーニング
した。その結果、ＭＨ−１１Ｅ４は、マウスＩｇＧ2b，
κであった。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７５】 （２）種々のＰＧ類似体との交差 ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ
１αの［ 3Ｈ］−ω−メチルエステル３００Ｂｇを含む
0.1 Ｍ ＰＢ（ｐＨ7.3 、１００μｌ）、本発明のモノ
クローナル抗体ＭＨ−１１Ｅ４（１００ng) およびニワ
トリ卵アルブミン（0.1 ｍｇ）を含む0.1 Ｍ ＰＢ（ｐ
Ｈ7.3 、１００μｌ）に下表に示すＰＧ類似体の標準液
［0.1 Ｍ ＰＢ（ｐＨ7.3 ）溶液、１００μｌ）を加
え、４℃で一晩反応させた。反応液に、0.5 ％ウシγ−
グロブリンを含む0.1 Ｍ ＰＢ（２００μｌ）および３
０％ポリエチレングリコール6000（６００μｌ）を加え
て遠心分離した後、沈殿物の放射活性を測定した。結果
を次の表１に示す。
１αの［ 3Ｈ］−ω−メチルエステル３００Ｂｇを含む
0.1 Ｍ ＰＢ（ｐＨ7.3 、１００μｌ）、本発明のモノ
クローナル抗体ＭＨ−１１Ｅ４（１００ng) およびニワ
トリ卵アルブミン（0.1 ｍｇ）を含む0.1 Ｍ ＰＢ（ｐ
Ｈ7.3 、１００μｌ）に下表に示すＰＧ類似体の標準液
［0.1 Ｍ ＰＢ（ｐＨ7.3 ）溶液、１００μｌ）を加
え、４℃で一晩反応させた。反応液に、0.5 ％ウシγ−
グロブリンを含む0.1 Ｍ ＰＢ（２００μｌ）および３
０％ポリエチレングリコール6000（６００μｌ）を加え
て遠心分離した後、沈殿物の放射活性を測定した。結果
を次の表１に示す。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８１】 実施例３ 本発明のモノクローナル抗体、ＭＨ−１１Ｅ４を用いた
免疫学的定量法 （１）ペルオキシダーゼで標識されたω−カルボキシ−
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクト
ン体の調製 実施例１（２）と同様にして、ω−カルボキシ−２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体と
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを用
いて、ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケト−Ｐ
ＧＦ１αのスピロラクトン体のコハク酸イミドエステル
を調製した。コハク酸イミドエステル体（２５μｇ）
に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡製、0.5 ｍ
ｇ）を含むＰＢＳ（２５０μｌ) を加え、４℃で一晩反
応させた後、反応物を１，４−ジオキサンとＰＢＳ
（１：１）の混合液で透析し、さらにＰＢＳで透析し
て、目的とする標識抗原を得た。
免疫学的定量法 （１）ペルオキシダーゼで標識されたω−カルボキシ−
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクト
ン体の調製 実施例１（２）と同様にして、ω−カルボキシ−２，３
−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αのスピロラクトン体と
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを用
いて、ω−カルボキシ−２，３−ジノル−６−ケト−Ｐ
ＧＦ１αのスピロラクトン体のコハク酸イミドエステル
を調製した。コハク酸イミドエステル体（２５μｇ）
に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡製、0.5 ｍ
ｇ）を含むＰＢＳ（２５０μｌ) を加え、４℃で一晩反
応させた後、反応物を１，４−ジオキサンとＰＢＳ
（１：１）の混合液で透析し、さらにＰＢＳで透析し
て、目的とする標識抗原を得た。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８２】 （２）２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧ
Ｆ１αの免疫学的定量試薬の調製 (a) 抗体溶液 本発明のモノクローナル抗体（ＭＨ−１１Ｅ４、実施例
１で調製した。）をＰＢＳで１μｇＩｇＧ／１５０μｌ
になるように調製したもの。 (b) 標識抗原溶液 実施例３（１）で調製したペルオキシダーゼ標識抗原
を、0.1 ％ニワトリ卵アルブミンを含むＰＢＳで２０ｎ
ｇ／ｍｌ（ペルオキシダーゼタン白として）となるよう
に調製したもの。 (c) 標準溶液 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αをＰＢＳで、１
μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４ｎ
ｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ、１６０ｐｇ／ｍｌ、１６
ｐｇ／ｍｌおよび1.6 ｐｇ／ｍｌとなるように調製した
もの。
Ｆ１αの免疫学的定量試薬の調製 (a) 抗体溶液 本発明のモノクローナル抗体（ＭＨ−１１Ｅ４、実施例
１で調製した。）をＰＢＳで１μｇＩｇＧ／１５０μｌ
になるように調製したもの。 (b) 標識抗原溶液 実施例３（１）で調製したペルオキシダーゼ標識抗原
を、0.1 ％ニワトリ卵アルブミンを含むＰＢＳで２０ｎ
ｇ／ｍｌ（ペルオキシダーゼタン白として）となるよう
に調製したもの。 (c) 標準溶液 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αをＰＢＳで、１
μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４ｎ
ｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ、１６０ｐｇ／ｍｌ、１６
ｐｇ／ｍｌおよび1.6 ｐｇ／ｍｌとなるように調製した
もの。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８３】 (d) 洗浄液 0.1 ％ニワトリ卵アルブミンを含むＰＢＳ。 (e) ブロッキング剤 0.5 ％ＢＳＡを含むＰＢＳ。 (f) 基質溶液１ ジメチルスルホキシド ４０μｌ 蒸留水 ４６０μｌ ２０ｍＭ ３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジン を含む0.1 Ｍ クエン酸溶液 ２０μｌ マックイルバイン（McIlvaine ）緩衝液（ｐＨ4.5 ） ３８０μｌ を混合したもの（上記の量は１回分）。 (g) 基質溶液２１４ ｍＭ 過酸化水素溶液。 (h) 反応停止液 １Ｎ 硫酸溶液。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８４】 （３）（２）で調製した試薬を用いた
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの測定 1) ポリスチレンチューブ（ファルコン社製）に抗体溶
液１５０μｌを加え、３７℃で１時間放置した。 2) ポリスチレンチューブ内の抗体溶液を除き、洗浄液
１ｍｌで洗浄した。 3) ブロッキング液1.5 ｍｌを加え、３７℃で３０分間
放置した。 4) ブロッキング液を除去した後洗浄した。 5) 標準溶液（またはサンプル）１００μｌを加えた
後、標識抗原溶液１００μｌを加え、４℃で一晩放置し
た。 6) チューブ内の溶液を除去した後、洗浄液で２回洗浄
した。 7) 基質溶液１ ９００μｌおよび基質溶液２ １００
μｌを加えて、２４℃で１時間反応させた。 8) 反応停止液を２００μｌ加え、反応を停止させた。 9) ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。 標準２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの測定値を
プロットした標準検量線を図１に示す。図１から明らか
なように、本定量法では、３〜５６０ｐｇ／testの範囲
の２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αが測定可能で
ある。
２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの測定 1) ポリスチレンチューブ（ファルコン社製）に抗体溶
液１５０μｌを加え、３７℃で１時間放置した。 2) ポリスチレンチューブ内の抗体溶液を除き、洗浄液
１ｍｌで洗浄した。 3) ブロッキング液1.5 ｍｌを加え、３７℃で３０分間
放置した。 4) ブロッキング液を除去した後洗浄した。 5) 標準溶液（またはサンプル）１００μｌを加えた
後、標識抗原溶液１００μｌを加え、４℃で一晩放置し
た。 6) チューブ内の溶液を除去した後、洗浄液で２回洗浄
した。 7) 基質溶液１ ９００μｌおよび基質溶液２ １００
μｌを加えて、２４℃で１時間反応させた。 8) 反応停止液を２００μｌ加え、反応を停止させた。 9) ４５０ｎｍでの吸光度を測定した。 標準２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの測定値を
プロットした標準検量線を図１に示す。図１から明らか
なように、本定量法では、３〜５６０ｐｇ／testの範囲
の２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αが測定可能で
ある。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】本発明のモノクローナル抗体、ＭＨ−１１Ｅ４
を用いた２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの免疫
学的定量法における検量線である。
を用いた２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αの免疫
学的定量法における検量線である。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｃ 405/00 Ｆ 8619−4Ｈ ５０３ Ｅ 8619−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 山本 尚三 徳島県徳島市八万町中津浦24−59
Claims (5)
- 【請求項１】 ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１α
を特異的に認識するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 前記抗体のＰＧＦ２α、ＰＧＦ１α、６
−ケト−ＰＧＦ１α、ＰＧＦ２α−ＭＰＭおよびＰＧＦ
２α−ＭＵＭに対する交差率が1.0 ％以下である請求項
１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 前記抗体の免疫グロブリンがマウス由来
のものである請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 前記抗体の免疫グロブリンのクラスがＩ
ｇＧである請求項３記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 前記抗体がＭＫ−１１Ｅ４である請求項
４記載のモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3214133A JPH05336988A (ja) | 1991-08-01 | 1991-08-01 | ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3214133A JPH05336988A (ja) | 1991-08-01 | 1991-08-01 | ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05336988A true JPH05336988A (ja) | 1993-12-21 |
Family
ID=16650778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3214133A Pending JPH05336988A (ja) | 1991-08-01 | 1991-08-01 | ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05336988A (ja) |
-
1991
- 1991-08-01 JP JP3214133A patent/JPH05336988A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4841856B2 (ja) | クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法 | |
| EP0733903B1 (fr) | Procédé de dosage immunologique du cortisol, notamment urinaire, et réactifs utilisés | |
| US5470956A (en) | Antibodies for mevalonic acid and methods for immunological determination of mevalonic acid by using them | |
| JP4916128B2 (ja) | フィプロニルのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法 | |
| JPH05336988A (ja) | ２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ１αを特異的に認識するモノクローナル抗体 | |
| JP4057046B2 (ja) | ハプテン化合物および抗体 | |
| JP2005247822A (ja) | コプラナーｐｃｂハプテン、コプラナーｐｃｂに対する抗体およびそれを用いる免疫学的測定方法 | |
| JP2001272401A (ja) | フタル酸エステル類のハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| JP2600325B2 (ja) | 抗体、抗体産生細胞および抗体の作製方法 | |
| JPH06273417A (ja) | メバロン酸に対する抗体、および該抗体を用いるメバロン酸の定量法 | |
| JP2008094729A (ja) | ハプテン化合物および抗体 | |
| JPH0789998A (ja) | 抗ミクロシスチンモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ | |
| JPH06321998A (ja) | 抗フモニシンモノクローナル抗体、ハイブリドーマ、ハプテン抗原及びその製造法 | |
| JP2005035893A (ja) | アラクロールハプテン、アラクロールに対する抗体およびそれを用いる免疫学的測定方法 | |
| JP3849001B2 (ja) | 抗−２′−デオキシシチジン抗体並びにその製造及び使用 | |
| JPH11343300A (ja) | 新規ハプテン、それを認識する抗体およびそれらを用いた免疫学的測定法 | |
| JP4221119B2 (ja) | ドウモイ酸に対する特異的抗体及びドウモイ酸の免疫学的分析方法 | |
| JP2001255324A (ja) | フサライドの抗体及び測定方法 | |
| US6291198B1 (en) | Antibody that recognizes pyrazine derivative and method for measuring 1,2-dicarbonyl derivative using said antibody | |
| JP2000281645A (ja) | クロルフェナピルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 | |
| CA2558596A1 (en) | Anti fk778 antibodies and high sensitive immunoassay methods | |
| JPH09176200A (ja) | ハロゲン化ベンジレート化合物に特異的な抗体、その抗体の製造方法、及び免疫学的測定方法 | |
| JP2001506985A (ja) | ５−ヒドロキシトリプトフォール（５−ｈｔｏｌ）誘導体、抗体、イムノアッセイおよび最近のアルコール消費の検出 | |
| JPH08196294A (ja) | 抗体作製方法及び免疫学的測定方法 | |
| JPH04211362A (ja) | （ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−アラビノフラノシルウラシルに結合するモノクローナル抗体およびそれに基づく診断法 |