JPH05213772A - ＴＧＦ−β 組成物 - Google Patents
ＴＧＦ−β 組成物Info
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- JPH05213772A JPH05213772A JP3117523A JP11752391A JPH05213772A JP H05213772 A JPH05213772 A JP H05213772A JP 3117523 A JP3117523 A JP 3117523A JP 11752391 A JP11752391 A JP 11752391A JP H05213772 A JPH05213772 A JP H05213772A
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- Japan
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- tgf
- acid
- pufa
- linolenic acid
- cells
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】トランスフォーミング成長因子β (ＴＧＦ−
β) 及び多不飽和脂肪酸 (ＰＵＦＡ) またはその誘導体
の相乗的に有効な量と組み合せてなる組成物、ＴＧＦ−
β１は組み換えヒトＴＧＦ−β１が、ＰＵＦＡとしては
リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸等が
使用される。 【効果】この組成物は新生物疾患、特に癌種及びメラノ
ーマに対する治療活性を増強する。
β) 及び多不飽和脂肪酸 (ＰＵＦＡ) またはその誘導体
の相乗的に有効な量と組み合せてなる組成物、ＴＧＦ−
β１は組み換えヒトＴＧＦ−β１が、ＰＵＦＡとしては
リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸等が
使用される。 【効果】この組成物は新生物疾患、特に癌種及びメラノ
ーマに対する治療活性を増強する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、多不飽和脂肪酸 (ＰＵ
ＦＡ) の相乗的に有効な量を共に投与することによる、
トランスフォーミング成長因子 (ＴＧＦ) の治療活性の
相乗的増強に関する。トランスフォーミング成長因子β
の好ましい形態はＴＧＦ−β１型またはＴＧＦ−β１と
して知られている。
ＦＡ) の相乗的に有効な量を共に投与することによる、
トランスフォーミング成長因子 (ＴＧＦ) の治療活性の
相乗的増強に関する。トランスフォーミング成長因子β
の好ましい形態はＴＧＦ−β１型またはＴＧＦ−β１と
して知られている。
【０００２】
【従来の技術】ヒトＴＧＦ−βはヒト血小板および胎盤
から単離されそして連続ゲル濾過、陽イオン交換クロマ
トグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー (ＨＰ
ＬＣ)を用いて実質的に均質となるまで精製されてい
る。この精製されたタンパク質は、ジスルフィド結合に
よりそれぞれが結合された12,500ダルトンの２個のサブ
ユニットから成る、25,000ダルトンの分子量を有するも
のとして特徴づけられた。その分子量、サブユニット構
造およびアミノ酸組成は、ヨーロッパ特許出願公開第12
8849号 (1984年12月19日公開) に記載されているように
血小板由来増殖因子のそれらとは異なっていた。
から単離されそして連続ゲル濾過、陽イオン交換クロマ
トグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー (ＨＰ
ＬＣ)を用いて実質的に均質となるまで精製されてい
る。この精製されたタンパク質は、ジスルフィド結合に
よりそれぞれが結合された12,500ダルトンの２個のサブ
ユニットから成る、25,000ダルトンの分子量を有するも
のとして特徴づけられた。その分子量、サブユニット構
造およびアミノ酸組成は、ヨーロッパ特許出願公開第12
8849号 (1984年12月19日公開) に記載されているように
血小板由来増殖因子のそれらとは異なっていた。
【０００３】血小板または馴化培地からＴＧＦ−βを精
製するもうひとつの方法は、酸−エタノール抽出、その
抽出物に対する陽イオン交換分離、活性画分に対する疎
水性分離を実施して均質な調製物を得ることであり、ヨ
ーロッパ特許出願公開第323842号 (1989年７月12日公
開) に記載されている。精製された生成物は傷の治癒お
よび組織修復に有用であることが指摘されている。
製するもうひとつの方法は、酸−エタノール抽出、その
抽出物に対する陽イオン交換分離、活性画分に対する疎
水性分離を実施して均質な調製物を得ることであり、ヨ
ーロッパ特許出願公開第323842号 (1989年７月12日公
開) に記載されている。精製された生成物は傷の治癒お
よび組織修復に有用であることが指摘されている。
【０００４】組換えＤＮＡ法を利用するＴＧＦ−β１の
生産は Genentech, Inc.に譲渡された米国特許出願85-7
15,142 (1985年３月22日出願) を優先権主張する日本特
許出願公開第61219395号 (1986年９月29日公開) ならび
に Asahi Chemical IndustryCo. Ltd. に譲渡された日
本特許出願公開第63028386号 (1988年２月６日公開)に
記載されている。両刊行物はＴＧＦ−β１をコードする
ヒト遺伝子のクローニングおよびその真核細胞における
発現を開示している。
生産は Genentech, Inc.に譲渡された米国特許出願85-7
15,142 (1985年３月22日出願) を優先権主張する日本特
許出願公開第61219395号 (1986年９月29日公開) ならび
に Asahi Chemical IndustryCo. Ltd. に譲渡された日
本特許出願公開第63028386号 (1988年２月６日公開)に
記載されている。両刊行物はＴＧＦ−β１をコードする
ヒト遺伝子のクローニングおよびその真核細胞における
発現を開示している。
【０００５】ＰＣＴ特許出願公開第WO8911293号 (1989
年11月30日公開) はインシュリン様成長因子１と組み合
せた傷の治癒におけるＴＧＦ−βの使用を示唆してい
る。Genentech Inc に譲渡されたヨーロッパ特許出願公
開第269408号 (1988年７月１日公開) はリウマチ性関節
炎、炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡等のような炎症性
障害の治療におけるＴＧＦ−βの使用を開示している。
年11月30日公開) はインシュリン様成長因子１と組み合
せた傷の治癒におけるＴＧＦ−βの使用を示唆してい
る。Genentech Inc に譲渡されたヨーロッパ特許出願公
開第269408号 (1988年７月１日公開) はリウマチ性関節
炎、炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡等のような炎症性
障害の治療におけるＴＧＦ−βの使用を開示している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ＴＧＦ−β１型 (ＴＧ
Ｆ−β１) は全ての哺乳動物組織に存在する多機能性タ
ンパク質である。このものは発達、成長、免疫系機能お
よび発癌現象の制御に関係している。ＴＧＦ−β１はイ
ンビボでの傷の治癒を刺激するが、インビトロでの多く
の細胞型の増殖はこの増殖因子により阻害される。さら
に、インビトロでのＴＧＦ−β１に応答する細胞増殖は
細胞型および培養条件の両方に依存することがわかって
いる。癌腫およびメラノーマ細胞の増殖を阻害するＴＧ
Ｆ−β１の能力には特に興味がある、なぜなら、それは
この因子の化学療法剤としての使用可能性を示唆してい
るからである。最近の研究の一つは、ＴＧＦ−β１によ
る無胸腺マウスにおけるＡ５４９肺癌腫瘍増殖の60％阻
害を示している (Twardzikら、 J. Natl. Cancer Inst.
81, 1182-1185 (1989)) 。しかしながら、ＴＧＦ−β１
による細胞増殖阻害の正確な機構は知られていない。
Ｆ−β１) は全ての哺乳動物組織に存在する多機能性タ
ンパク質である。このものは発達、成長、免疫系機能お
よび発癌現象の制御に関係している。ＴＧＦ−β１はイ
ンビボでの傷の治癒を刺激するが、インビトロでの多く
の細胞型の増殖はこの増殖因子により阻害される。さら
に、インビトロでのＴＧＦ−β１に応答する細胞増殖は
細胞型および培養条件の両方に依存することがわかって
いる。癌腫およびメラノーマ細胞の増殖を阻害するＴＧ
Ｆ−β１の能力には特に興味がある、なぜなら、それは
この因子の化学療法剤としての使用可能性を示唆してい
るからである。最近の研究の一つは、ＴＧＦ−β１によ
る無胸腺マウスにおけるＡ５４９肺癌腫瘍増殖の60％阻
害を示している (Twardzikら、 J. Natl. Cancer Inst.
81, 1182-1185 (1989)) 。しかしながら、ＴＧＦ−β１
による細胞増殖阻害の正確な機構は知られていない。
【０００７】多不飽和脂肪酸 (ＰＵＦＡ) は腫瘍細胞に
対して細胞毒性を示すことが知られている。この活性は
ペルオキシドラジカルの生成を刺激するそれらの能力に
基づいている。したがって Beginら (Journal of the N
ational Cancer Institute,80, No.3, 188-194 (April
1988)) はγ−リノレネート (３個の二重結合) と比較
して２、４、５、および６個の二重結合を含有する一連
の脂肪酸を検査した。その結果は、癌細胞におよぼすＰ
ＵＦＡ誘導細胞毒性の有効性はチオバルビツール酸と反
応する細胞内物質の含有量と相関することを示してい
る。３および４個の二重結合を有するγ−リノレネート
およびアラキドネートはそれぞれ最大の細胞毒性を誘導
しチオバルビツール酸検査において最大の相関関係を示
した。この研究の中で記載されている実験の全ては、Ｔ
ＧＦ−β１を含有する血清の存在下で行なわれた。同様
の効果を示す以前の結果はJournal of the National Ca
ncerInstitute, 77, No.5, 1054-1062(1986年11月) の
出版物中に同じグループにより報告された。この研究は
また、ＰＵＦＡ誘導細胞毒性が腫瘍細胞に比較的特異的
であることも示した。腫瘍細胞を殺す脂肪酸濃度は腫瘍
形成していない、すなわち正常細胞の増殖にほとんどま
たは全く作用しなかった。
対して細胞毒性を示すことが知られている。この活性は
ペルオキシドラジカルの生成を刺激するそれらの能力に
基づいている。したがって Beginら (Journal of the N
ational Cancer Institute,80, No.3, 188-194 (April
1988)) はγ−リノレネート (３個の二重結合) と比較
して２、４、５、および６個の二重結合を含有する一連
の脂肪酸を検査した。その結果は、癌細胞におよぼすＰ
ＵＦＡ誘導細胞毒性の有効性はチオバルビツール酸と反
応する細胞内物質の含有量と相関することを示してい
る。３および４個の二重結合を有するγ−リノレネート
およびアラキドネートはそれぞれ最大の細胞毒性を誘導
しチオバルビツール酸検査において最大の相関関係を示
した。この研究の中で記載されている実験の全ては、Ｔ
ＧＦ−β１を含有する血清の存在下で行なわれた。同様
の効果を示す以前の結果はJournal of the National Ca
ncerInstitute, 77, No.5, 1054-1062(1986年11月) の
出版物中に同じグループにより報告された。この研究は
また、ＰＵＦＡ誘導細胞毒性が腫瘍細胞に比較的特異的
であることも示した。腫瘍細胞を殺す脂肪酸濃度は腫瘍
形成していない、すなわち正常細胞の増殖にほとんどま
たは全く作用しなかった。
【０００８】ＴＧＦ−β１に対する細胞応答は、血清中
に存在する増殖因子およびレチノイドを含む他の因子の
存在によりしばしば変化するので、無血清条件下でＴＧ
Ｆ−β１作用の研究を行うのが好都合である。本発明に
おいては改善された無血清培地をＡ５４９ヒト肺癌、Ｍ
ＣＦ−７ヒト乳癌およびＢ１６マウスメラノーマ細胞の
付着依存性増殖に用いた。これらの研究により、ＴＧＦ
−β１による癌腫およびメラノーマ細胞増殖阻害がＰＵ
ＦＡの存在に依存しているという観察が導き出されてい
る。
に存在する増殖因子およびレチノイドを含む他の因子の
存在によりしばしば変化するので、無血清条件下でＴＧ
Ｆ−β１作用の研究を行うのが好都合である。本発明に
おいては改善された無血清培地をＡ５４９ヒト肺癌、Ｍ
ＣＦ−７ヒト乳癌およびＢ１６マウスメラノーマ細胞の
付着依存性増殖に用いた。これらの研究により、ＴＧＦ
−β１による癌腫およびメラノーマ細胞増殖阻害がＰＵ
ＦＡの存在に依存しているという観察が導き出されてい
る。
【０００９】したがって、本発明はトランスフォーミン
グ成長因子β１ (ＴＧＦ−β１) および多不飽和脂肪酸
(ＰＵＦＡ) および／またはその誘導体を含んで成る組
成物を提供する。さらに本発明は医薬調製物製造へのこ
れら組成物の使用にも関する。
グ成長因子β１ (ＴＧＦ−β１) および多不飽和脂肪酸
(ＰＵＦＡ) および／またはその誘導体を含んで成る組
成物を提供する。さらに本発明は医薬調製物製造へのこ
れら組成物の使用にも関する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】以下に明示したある種の
ＰＵＦＡの１種またはそれ以上の存在はＴＧＦ−β１の
腫瘍増殖阻害性質の相乗的増強を生じ、それにより不可
逆的増殖阻害および細胞死がもたらされる。この増強は
米国特許第４,326,055号記載のレチノイン酸またはレチ
ノイドのようなレチノイドの添加により、ある種の腫瘍
の場合にさらに強化できる。ＴＧＦ−β１による非腫瘍
化細胞増殖阻害はＰＵＦＡにより強化されず一般に可逆
的であることがわかった。本明細書および請求の範囲に
おいて用いられる「ＰＵＦＡ」なる用語は単一のＰＵＦ
Ａのみならず、２個またはそれ以上の異なるＰＵＦＡの
混合物をも包含する。
ＰＵＦＡの１種またはそれ以上の存在はＴＧＦ−β１の
腫瘍増殖阻害性質の相乗的増強を生じ、それにより不可
逆的増殖阻害および細胞死がもたらされる。この増強は
米国特許第４,326,055号記載のレチノイン酸またはレチ
ノイドのようなレチノイドの添加により、ある種の腫瘍
の場合にさらに強化できる。ＴＧＦ−β１による非腫瘍
化細胞増殖阻害はＰＵＦＡにより強化されず一般に可逆
的であることがわかった。本明細書および請求の範囲に
おいて用いられる「ＰＵＦＡ」なる用語は単一のＰＵＦ
Ａのみならず、２個またはそれ以上の異なるＰＵＦＡの
混合物をも包含する。
【００１１】本発明の添付図面を説明すれば以下のとお
りである。
りである。
【００１２】
【００１３】図２はＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増
殖阻害におよぼす脂肪酸の作用を示す。細胞を100pM Ｔ
ＧＦ−β１の非存在下 (○) または存在下 (●) で、指
示される脂肪酸を含有する無血清条件下で増殖させた。
細胞数をＴＧＦ−β１添加５日後に測定した。ＴＧＦ−
β１によるＡ５４９細胞増殖のＰＵＦＡ依存性阻害が12
の独立した実験で観察された。
殖阻害におよぼす脂肪酸の作用を示す。細胞を100pM Ｔ
ＧＦ−β１の非存在下 (○) または存在下 (●) で、指
示される脂肪酸を含有する無血清条件下で増殖させた。
細胞数をＴＧＦ−β１添加５日後に測定した。ＴＧＦ−
β１によるＡ５４９細胞増殖のＰＵＦＡ依存性阻害が12
の独立した実験で観察された。
【００１４】図３はリノレン酸の存在下および非存在下
におけるＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増殖の阻害に
関する用量応答曲線を示す。細胞を２μg/mlのリノレン
酸の非存在下 (○) または存在下 (●) で指示されるＴ
ＧＦ−β１濃度での無血清条件下に増殖させた。細胞数
をＴＧＦ−β１添加５日後に測定した。図４は１μg/ml
リノレン酸および 25pM ＴＧＦ−β１の非存在下および
存在下で増殖させたＡ５４９細胞の写真である。細胞は
指示された添加物を有する無血清条件下に増殖させた。
脂肪酸およびＴＧＦ−β１添加４日後 Nikon N200 カメ
ラで写真を撮った。
におけるＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増殖の阻害に
関する用量応答曲線を示す。細胞を２μg/mlのリノレン
酸の非存在下 (○) または存在下 (●) で指示されるＴ
ＧＦ−β１濃度での無血清条件下に増殖させた。細胞数
をＴＧＦ−β１添加５日後に測定した。図４は１μg/ml
リノレン酸および 25pM ＴＧＦ−β１の非存在下および
存在下で増殖させたＡ５４９細胞の写真である。細胞は
指示された添加物を有する無血清条件下に増殖させた。
脂肪酸およびＴＧＦ−β１添加４日後 Nikon N200 カメ
ラで写真を撮った。
【００１５】図５はＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増
殖阻害におよぼす脂肪酸およびプロスタグランジンの作
用を示す。細胞は 40pM ＴＧＦ−β１の非存在下 (−)
または存在下 (＋) 、指示される脂質１μg/mlを含有す
る無血清条件下で増殖させた。細胞数はＴＧＦ−β１添
加４日後に測定した。ＮＡ、無添加；ＬＡ、リノレン
酸；ＬＮ、α−リノレン酸；ＤＨＡ、ドコサヘキサエン
酸；Ｅ1 , Ｅ2 , Ｄ2 ,Ｆ2Ａ, それぞれプロスタグラン
ジンＥ1 , Ｅ2 , Ｄ2 およびＦ2α。
殖阻害におよぼす脂肪酸およびプロスタグランジンの作
用を示す。細胞は 40pM ＴＧＦ−β１の非存在下 (−)
または存在下 (＋) 、指示される脂質１μg/mlを含有す
る無血清条件下で増殖させた。細胞数はＴＧＦ−β１添
加４日後に測定した。ＮＡ、無添加；ＬＡ、リノレン
酸；ＬＮ、α−リノレン酸；ＤＨＡ、ドコサヘキサエン
酸；Ｅ1 , Ｅ2 , Ｄ2 ,Ｆ2Ａ, それぞれプロスタグラン
ジンＥ1 , Ｅ2 , Ｄ2 およびＦ2α。
【００１６】図６はビタミンＥによる、リノレン酸およ
びＴＧＦ−β１媒介Ａ５４９細胞増殖阻害の逆転を示
す。細胞は 25pM ＴＧＦ−β１の非存在下 (○) または
存在下(●) 、２μg/mlのリノレン酸および指示される
濃度のビタミンＥを有する無血清条件下で増殖させた。
細胞数をＴＧＦ−β１およびビタミンＥ添加５日後に測
定した。同様の結果が３種の独立した実験で得られた。
びＴＧＦ−β１媒介Ａ５４９細胞増殖阻害の逆転を示
す。細胞は 25pM ＴＧＦ−β１の非存在下 (○) または
存在下(●) 、２μg/mlのリノレン酸および指示される
濃度のビタミンＥを有する無血清条件下で増殖させた。
細胞数をＴＧＦ−β１およびビタミンＥ添加５日後に測
定した。同様の結果が３種の独立した実験で得られた。
【００１７】図７Ａは10％ウシ胎児血清および無血清培
地中におけるＢ１６メラノーマ細胞の付着依存性増殖を
示す。細胞 (１×104 ／ウェル) を無血清培地 (△) ま
たは10％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地 (○)
中で増殖させた。図７ＢはＴＧＦ−β１によるＢ１６細
胞増殖阻害におよぼすα−リノレン酸およびビタミンＥ
の作用を示す。細胞 (５×103 ／ウェル) を10μg/mlの
α−リノレン酸、100pM ＴＧＦ−β１および (または)
１μM ビタミンＥの非存在下または存在下無血清条件下
で増殖させた。細胞数は脂肪酸、ＴＧＦ−β１およびビ
タミンＥ添加３日後に測定した。同様の結果が３種の独
立した実験で得られた。
地中におけるＢ１６メラノーマ細胞の付着依存性増殖を
示す。細胞 (１×104 ／ウェル) を無血清培地 (△) ま
たは10％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地 (○)
中で増殖させた。図７ＢはＴＧＦ−β１によるＢ１６細
胞増殖阻害におよぼすα−リノレン酸およびビタミンＥ
の作用を示す。細胞 (５×103 ／ウェル) を10μg/mlの
α−リノレン酸、100pM ＴＧＦ−β１および (または)
１μM ビタミンＥの非存在下または存在下無血清条件下
で増殖させた。細胞数は脂肪酸、ＴＧＦ−β１およびビ
タミンＥ添加３日後に測定した。同様の結果が３種の独
立した実験で得られた。
【００１８】本発明の実施に際して用いられるＴＧＦ−
β１は当業上知られた方法を用いて血小板またはその他
任意の哺乳動物組織から誘導されうる。さらに、組換え
細胞培養物 (この物質もまた本発明の目的に好適であ
る) から精製ＴＧＦ−β１を生産することは当業上知ら
れている。ＴＧＦ−β１は種特異的でないので、ヒト以
外の動物源、例えばブタまたはウシ源からのＴＧＦ−β
１の使用は本発明の範囲内である。
β１は当業上知られた方法を用いて血小板またはその他
任意の哺乳動物組織から誘導されうる。さらに、組換え
細胞培養物 (この物質もまた本発明の目的に好適であ
る) から精製ＴＧＦ−β１を生産することは当業上知ら
れている。ＴＧＦ−β１は種特異的でないので、ヒト以
外の動物源、例えばブタまたはウシ源からのＴＧＦ−β
１の使用は本発明の範囲内である。
【００１９】さらに、本発明はＴＧＦ−β１、ＰＵＦＡ
および／またはその誘導体および不活性で無毒の治療上
許容される担体物質を含有する医薬調製物を提供する。
これらの医薬調製物は新生物疾患、好ましくはメラノー
マおよび癌腫の治療に有用である。新生物疾患の治療に
用いられるＴＧＦ−β１組成物は治療される障害、個々
の患者の状態、ＴＧＦ−β１の放出部位、投与方法およ
び診療医に知られている他の要素を考慮して、良好な医
療行為と一致した方法で処方され投与される。
および／またはその誘導体および不活性で無毒の治療上
許容される担体物質を含有する医薬調製物を提供する。
これらの医薬調製物は新生物疾患、好ましくはメラノー
マおよび癌腫の治療に有用である。新生物疾患の治療に
用いられるＴＧＦ−β１組成物は治療される障害、個々
の患者の状態、ＴＧＦ−β１の放出部位、投与方法およ
び診療医に知られている他の要素を考慮して、良好な医
療行為と一致した方法で処方され投与される。
【００２０】ＴＧＦ−β１は生理学的に許容できる担体
すなわち用いられる用量および濃度でレシピエントに無
毒である担体と所望の純度のＴＧＦ−β１を混合するこ
とにより投与用に調製される。通常、これはＴＧＦ−β
１を緩衝液、低分子量 (約10残基以下) ポリペプチド、
タンパク質、アミノ酸、グルコースまたはデキストラン
を含めた炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート化剤およ
び他の賦形剤と混合することを必要としよう。治療用投
与に用いられるＴＧＦ−β１は無菌でなければならな
い。これはこの目的に当業上知られている膜を通した滅
菌濾過により容易に達成される。再構成のための凍結乾
燥処方物が許容されるが、ＴＧＦ−β１は通常水溶液と
して保存される、なぜならこのものは熱および酸化的変
性に対して高度に安定だからである。
すなわち用いられる用量および濃度でレシピエントに無
毒である担体と所望の純度のＴＧＦ−β１を混合するこ
とにより投与用に調製される。通常、これはＴＧＦ−β
１を緩衝液、低分子量 (約10残基以下) ポリペプチド、
タンパク質、アミノ酸、グルコースまたはデキストラン
を含めた炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート化剤およ
び他の賦形剤と混合することを必要としよう。治療用投
与に用いられるＴＧＦ−β１は無菌でなければならな
い。これはこの目的に当業上知られている膜を通した滅
菌濾過により容易に達成される。再構成のための凍結乾
燥処方物が許容されるが、ＴＧＦ−β１は通常水溶液と
して保存される、なぜならこのものは熱および酸化的変
性に対して高度に安定だからである。
【００２１】使用されるＴＧＦ−β１の用量は上記の要
素の如何による。一般的提案として、ＴＧＦ−β１は約
0.25ng／グラム組織以上のＴＧＦ−β１レベルを新生物
組織に確立できる用量で処方され標的新生物部位に放出
されるべきである。代表的には、標的新生物部位または
その付近のＴＧＦ−β１濃度は約0.25−5.０ng／グラム
組織の範囲であるべきである。これらの組織内濃度は、
継続注入、徐放性処方物またはＰＥＧ化によるか、また
は実験的に決定された頻度で注射することによりできれ
ば治療期間中維持されるべきである。
素の如何による。一般的提案として、ＴＧＦ−β１は約
0.25ng／グラム組織以上のＴＧＦ−β１レベルを新生物
組織に確立できる用量で処方され標的新生物部位に放出
されるべきである。代表的には、標的新生物部位または
その付近のＴＧＦ−β１濃度は約0.25−5.０ng／グラム
組織の範囲であるべきである。これらの組織内濃度は、
継続注入、徐放性処方物またはＰＥＧ化によるか、また
は実験的に決定された頻度で注射することによりできれ
ば治療期間中維持されるべきである。
【００２２】本発明の目的はもちろん患者にＴＧＦ−β
１での治療と同時に所望のＰＵＦＡの相乗的に有効な量
を提供することである。これはいくつかの選択肢の任意
のひとつにより容易に達成できる。ひとつの態様では、
投与後新生物部位に約10−１,000μg ＰＵＦＡ／グラム
組織の範囲の濃度を付与するに十分な量でＰＵＦＡを１
回量形態中でＴＧＦ−β１と混合する。ＴＧＦ−β１の
濃度は上に規定された有効範囲内であろう。その結果、
新生物部位でのＴＧＦ−β１：ＰＵＦＡの重量比は１：
２×103−４×106 の範囲である。好ましい比率は１：1
04−５×105である。
１での治療と同時に所望のＰＵＦＡの相乗的に有効な量
を提供することである。これはいくつかの選択肢の任意
のひとつにより容易に達成できる。ひとつの態様では、
投与後新生物部位に約10−１,000μg ＰＵＦＡ／グラム
組織の範囲の濃度を付与するに十分な量でＰＵＦＡを１
回量形態中でＴＧＦ−β１と混合する。ＴＧＦ−β１の
濃度は上に規定された有効範囲内であろう。その結果、
新生物部位でのＴＧＦ−β１：ＰＵＦＡの重量比は１：
２×103−４×106 の範囲である。好ましい比率は１：1
04−５×105である。
【００２３】明らかに、固定された組合せ態様を用いる
能力は選択された化合物の特性、それらの溶解度、およ
び／または処方物中に用いられる溶媒、緩衝液および担
体に対するそれらの相互適合性の如何によるであろう。
本発明はさらに、新生物疾患の治療において同時に、別
々にまたは連続的に使用するためのＴＧＦ−β１、ＰＵ
ＦＡおよび／またはその誘導体を含有する調製物にも関
する。
能力は選択された化合物の特性、それらの溶解度、およ
び／または処方物中に用いられる溶媒、緩衝液および担
体に対するそれらの相互適合性の如何によるであろう。
本発明はさらに、新生物疾患の治療において同時に、別
々にまたは連続的に使用するためのＴＧＦ−β１、ＰＵ
ＦＡおよび／またはその誘導体を含有する調製物にも関
する。
【００２４】しかしながら、同時にまたは別々の時間計
画量で投与される独立した用量形態で活性剤を使用する
ことも本発明の範囲内である。さらに、２種の薬剤のた
めに独立した投与経路を用いることも可能である。した
がって、例えば非経口溶液の形態でＴＧＦ−β１を投与
し、一方選択されたＰＵＦＡを精製ＰＵＦＡを含有する
錠剤または軟ゼラチンカプセルまたはＰＵＦＡ含有組織
抽出物のような経口投薬形態物として投与することは本
発明の範囲内である。組織は魚または種子のような動物
または植物起源であることができる。
画量で投与される独立した用量形態で活性剤を使用する
ことも本発明の範囲内である。さらに、２種の薬剤のた
めに独立した投与経路を用いることも可能である。した
がって、例えば非経口溶液の形態でＴＧＦ−β１を投与
し、一方選択されたＰＵＦＡを精製ＰＵＦＡを含有する
錠剤または軟ゼラチンカプセルまたはＰＵＦＡ含有組織
抽出物のような経口投薬形態物として投与することは本
発明の範囲内である。組織は魚または種子のような動物
または植物起源であることができる。
【００２５】本発明で使用できる詳細なＰＵＦＡは既知
化合物であり、２−６個の２重結合を有するものが包含
される。好適なＰＵＦＡには既知物質であるリンレン
酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸、
ジホモγ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサ
ヘキサエン酸およびそれらの誘導体、例えば低アルキル
エステル、例えばメチルまたはエチルエステルが包含さ
れる。これらＰＵＦＡのうちでω−３ＰＵＦＡが好まし
い。選択されたＰＵＦＡの誘導体形成は、特に１回量形
態でＴＧＦ−β１と処方する場合または徐放または半減
期の延長に好適な特別の投与形態におけるそれらの使用
を探求する場合に、溶解度または安定性に影響を与える
ために使用される。
化合物であり、２−６個の２重結合を有するものが包含
される。好適なＰＵＦＡには既知物質であるリンレン
酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸、
ジホモγ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサ
ヘキサエン酸およびそれらの誘導体、例えば低アルキル
エステル、例えばメチルまたはエチルエステルが包含さ
れる。これらＰＵＦＡのうちでω−３ＰＵＦＡが好まし
い。選択されたＰＵＦＡの誘導体形成は、特に１回量形
態でＴＧＦ−β１と処方する場合または徐放または半減
期の延長に好適な特別の投与形態におけるそれらの使用
を探求する場合に、溶解度または安定性に影響を与える
ために使用される。
【００２６】本発明のさらにもう一つの好ましい面にお
いては、レチノイドが治療法に加えられる。好適なレチ
ノイドには全てのトランスレチノイン酸全てのシスレチ
ノイン酸および米国特許第4,105,681 ; 4,193,931 ; 4,
326,055 ; 4,396,553 および4,689,350号記載のレチノ
イドが包含される。これらレチノイドは当業上知られた
治療上有効な量例えば１日当り0.１−10mg／体重kgで本
発明の上記の単一剤組成物および複数剤組成物に添加で
きる。
いては、レチノイドが治療法に加えられる。好適なレチ
ノイドには全てのトランスレチノイン酸全てのシスレチ
ノイン酸および米国特許第4,105,681 ; 4,193,931 ; 4,
326,055 ; 4,396,553 および4,689,350号記載のレチノ
イドが包含される。これらレチノイドは当業上知られた
治療上有効な量例えば１日当り0.１−10mg／体重kgで本
発明の上記の単一剤組成物および複数剤組成物に添加で
きる。
【００２７】
【実施例】好ましい態様における本発明を下記実施例を
参照することにより説明する。 実施例１材料および細胞 無血清培地成分を得、そして貯蔵液を以下のように調製
した、すなわち結晶化した、脂肪酸不含ウシ血清アルブ
ミン (ＢＳＡ)(カルシウムおよびマグネシウム不含リン
酸緩衝食塩水ＰＳＢ中 50mg/ml) ; 大豆トリプシンイン
ヒビター；インシュリン (６mM HCl中 20μg/ml) ; ト
ランスフェリン (ＰＢＳ中 5μg/ml) ;ヒドロコルチゾ
ン (エタノール中 500μg/ml、−20℃、アルゴン下で暗
所保存); およびトリヨードチロニン (10mM NaOH 中 20
nM)は Sigmaから得た。ブタＴＧＦ−β１ (４mM HCl、
１mg/ml ＢＳＡ中) および塩基性線維芽細胞成長因子
(ｂＦＧＦ)(１mg/ml ＢＳＡ中) はＲ＆Ｄ (Minneapoli
s, MN)からであった。レセプター等級表皮成長因子 (Ｅ
ＧＦ)(１mg/ml のＢＳＡ含有) 、ビタミンＥおよび液体
ＲＰＭＩ１６４０培地はGibco からであった。ウシ血漿
フィブロネクチンはGibco または Sigmaからであった。
ウシ皮膚Ｉ型コラーゲンは Collagen Corp. (Palo Alt
o, CA) からであった。脂肪酸は SigmaまたはNu Check
Prep(Elysian,MN) からでありアルゴン下−20℃または
−80℃でエタノール中で保存した。供給源または保存温
度にかかわりなく同様の結果が得られた。注文の脂肪酸
不含 Dulbecco's 改変 Eagle's培地／Ham's Ｆ１2(ＤＭ
Ｅ／Ｆ１2)は Specialty Media, Inc., Lavallette, NJ
からであった。Milli-Q (Millipore) 水を全ての実験に
おいて用いた。他のすべての材料は Sigmaまたは Gibco
からの組織培養等級であった。全ての貯蔵物は２−３ケ
月毎に新しくした。
参照することにより説明する。 実施例１材料および細胞 無血清培地成分を得、そして貯蔵液を以下のように調製
した、すなわち結晶化した、脂肪酸不含ウシ血清アルブ
ミン (ＢＳＡ)(カルシウムおよびマグネシウム不含リン
酸緩衝食塩水ＰＳＢ中 50mg/ml) ; 大豆トリプシンイン
ヒビター；インシュリン (６mM HCl中 20μg/ml) ; ト
ランスフェリン (ＰＢＳ中 5μg/ml) ;ヒドロコルチゾ
ン (エタノール中 500μg/ml、−20℃、アルゴン下で暗
所保存); およびトリヨードチロニン (10mM NaOH 中 20
nM)は Sigmaから得た。ブタＴＧＦ−β１ (４mM HCl、
１mg/ml ＢＳＡ中) および塩基性線維芽細胞成長因子
(ｂＦＧＦ)(１mg/ml ＢＳＡ中) はＲ＆Ｄ (Minneapoli
s, MN)からであった。レセプター等級表皮成長因子 (Ｅ
ＧＦ)(１mg/ml のＢＳＡ含有) 、ビタミンＥおよび液体
ＲＰＭＩ１６４０培地はGibco からであった。ウシ血漿
フィブロネクチンはGibco または Sigmaからであった。
ウシ皮膚Ｉ型コラーゲンは Collagen Corp. (Palo Alt
o, CA) からであった。脂肪酸は SigmaまたはNu Check
Prep(Elysian,MN) からでありアルゴン下−20℃または
−80℃でエタノール中で保存した。供給源または保存温
度にかかわりなく同様の結果が得られた。注文の脂肪酸
不含 Dulbecco's 改変 Eagle's培地／Ham's Ｆ１2(ＤＭ
Ｅ／Ｆ１2)は Specialty Media, Inc., Lavallette, NJ
からであった。Milli-Q (Millipore) 水を全ての実験に
おいて用いた。他のすべての材料は Sigmaまたは Gibco
からの組織培養等級であった。全ての貯蔵物は２−３ケ
月毎に新しくした。
【００２８】Ａ５４９ヒト肺癌細胞は Dr. Lawrence Le
vine (Brandeis University)からのものであり、ＡＴＣ
Ｃ受託番号ＣＣＬ１８５の下に American Type Culture
Collection (ATTC)からも入手できる。Ｂ１６−Ｆ１マ
ウスメラノーマ細胞はＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ６３２３
の下に入手できる。これら細胞は37℃ (５％ CO2) で10
％ウシ胎児血清 (Hyclone, Logan, UT) および15mMへペ
スを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｂ１
６メラノーマ細胞は 100単位／mlペニシリンおよびスト
レプトマイシンの存在下でさらに維持した。新しい培養
は凍結保存物から２−３ケ月毎に開始した。Ａ５４９肺癌細胞の無血清増殖 Ａ５４９細胞の増殖を Brower ら、Cancer Res. 46 798
-806 (1986) の方法を改変したものにより行った。組織
培養ウエル (２cm2 ) をＲＰＭＩ１６４０培地中の10μ
g/mlのフィブロネクチン 0.3mlで37℃で一夜処理した
後、吸引しそしてコラーゲンＩ型で同様の処理をした。
細胞塗布に先立ちウエルをＰＢＳで１回洗った。Ａ５４
９細胞 (100mm 皿) を１回洗い続いて0.05％トリプシン
／ＰＢＳ中0.53mM ＥＤＴＡ、の３mlで解離させそれを
細胞がまだ付着している間に取り出した。トリプシンイ
ンヒビター (ＲＰＭＩ１６４０中１mg/ml のもの５ml)
を加え、細胞を分散させそしてＲＰＭＩ１６４０で２回
洗浄した。細胞 (５×103／ウエル) を１mg/ml ＢＳ
Ａ、20μg/ml インシュリン、10μg/ml トランスフェリ
ン、0.５mM ピルビン酸ナトリウム、５ng/ml ｂＦＧ
Ｆ、５ng/ml ＥＧＦ、２mMグルタミン、100nM ヒドロコ
ルチゾン、 50nM 亜セレン酸ナトリウムおよび３ng/ml
レチノイン酸を含有するＲＰＭＩ１６４０ 0.5mlに塗布
した。塗布18−24時間後にＴＧＦ−β１、脂肪酸、プロ
スタグランジンおよびビタミンＥを加え、続いて３、４
または５日インキュベート後に細胞数を測定した。脂肪
酸およびプロスタグランジンはエタノール２ml中に加え
るか、またはより最近は濃縮貯蔵物 (20mg/ml)の希釈後
に１mg/ml ＢＳＡ (各実験ごとに新しくした) を含有す
る組織培養培地に加えた。全ての実験において、処理細
胞を賦形剤対照を与えられた細胞と比較した。全ての実
験を３組行い、その結果を平均細胞数±ＳＤとして表わ
す。Ｂ１６メラノーマ細胞の無血清増殖 組織培養ウエルをＡ５４９細胞に関し上記したようにし
て脂肪酸不含ＤＭＥ／Ｆ１２／ＲＰＭＩ１６４０培地
(１／１／２）中のフィブロネクチン３μg で被覆し
た。細胞を非酵素性のＰＢＳをベースとした細胞解離溶
液 (Sigma)とインキュベートし、次にＤＭＥ／Ｆ１２／
ＲＰＭＩ１６４０培地中に分散させた後、同じ培地で１
回洗浄した。増殖培地は Fernandez-Polら (Cancer Re
s. 46, 5153-5161 (1986))により記載されたものの改変
物であった。細胞を１mg/ml ＢＳＡ、５μg/ml インシ
ュリン、５μg/ml トランスフェリン、２mM グルタミ
ン、５pMトリヨードチロニン、10nM 亜セレン酸ナトリ
ウムおよび50nM ヒドロコルチゾンを含有する脂肪酸不
含ＤＭＥ／Ｆ１２／ＲＰＭＩ１６４０培地 0.5ml中に塗
布した。他の全ての添加および測定はＡ５４９細胞に関
して上記したようにして行った。 実施例２血清含有培地および無血清培地におけるＡ５４９細胞の
増殖に及ぼすＴＧＦ−β１の作用 改善された無血清培地をＡ５４９肺癌細胞（図１）の増
殖のために開発した。この培地は上記Browerら、により
開発されたＡＣＬ−３培地に基づく。改変にはいくつか
の因子の濃度の変更、トリヨードチロニンの除外および
塩基性ＦＧＦおよびレチノイン酸の添加が包含される。
Ａ５４９細胞を改変ＡＣＬ−３培地中で増殖した場合、
遅滞期は何ら観察されず、倍加時間はＡＣＬ−３培地中
におけるこれら細胞の増殖について報告された36時間に
比べ27.1時間であった。血清含有培地中での倍加時間
（18.7時間）は Brower ら、上記、により報告されてい
るそれに匹敵した。
vine (Brandeis University)からのものであり、ＡＴＣ
Ｃ受託番号ＣＣＬ１８５の下に American Type Culture
Collection (ATTC)からも入手できる。Ｂ１６−Ｆ１マ
ウスメラノーマ細胞はＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ６３２３
の下に入手できる。これら細胞は37℃ (５％ CO2) で10
％ウシ胎児血清 (Hyclone, Logan, UT) および15mMへペ
スを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｂ１
６メラノーマ細胞は 100単位／mlペニシリンおよびスト
レプトマイシンの存在下でさらに維持した。新しい培養
は凍結保存物から２−３ケ月毎に開始した。Ａ５４９肺癌細胞の無血清増殖 Ａ５４９細胞の増殖を Brower ら、Cancer Res. 46 798
-806 (1986) の方法を改変したものにより行った。組織
培養ウエル (２cm2 ) をＲＰＭＩ１６４０培地中の10μ
g/mlのフィブロネクチン 0.3mlで37℃で一夜処理した
後、吸引しそしてコラーゲンＩ型で同様の処理をした。
細胞塗布に先立ちウエルをＰＢＳで１回洗った。Ａ５４
９細胞 (100mm 皿) を１回洗い続いて0.05％トリプシン
／ＰＢＳ中0.53mM ＥＤＴＡ、の３mlで解離させそれを
細胞がまだ付着している間に取り出した。トリプシンイ
ンヒビター (ＲＰＭＩ１６４０中１mg/ml のもの５ml)
を加え、細胞を分散させそしてＲＰＭＩ１６４０で２回
洗浄した。細胞 (５×103／ウエル) を１mg/ml ＢＳ
Ａ、20μg/ml インシュリン、10μg/ml トランスフェリ
ン、0.５mM ピルビン酸ナトリウム、５ng/ml ｂＦＧ
Ｆ、５ng/ml ＥＧＦ、２mMグルタミン、100nM ヒドロコ
ルチゾン、 50nM 亜セレン酸ナトリウムおよび３ng/ml
レチノイン酸を含有するＲＰＭＩ１６４０ 0.5mlに塗布
した。塗布18−24時間後にＴＧＦ−β１、脂肪酸、プロ
スタグランジンおよびビタミンＥを加え、続いて３、４
または５日インキュベート後に細胞数を測定した。脂肪
酸およびプロスタグランジンはエタノール２ml中に加え
るか、またはより最近は濃縮貯蔵物 (20mg/ml)の希釈後
に１mg/ml ＢＳＡ (各実験ごとに新しくした) を含有す
る組織培養培地に加えた。全ての実験において、処理細
胞を賦形剤対照を与えられた細胞と比較した。全ての実
験を３組行い、その結果を平均細胞数±ＳＤとして表わ
す。Ｂ１６メラノーマ細胞の無血清増殖 組織培養ウエルをＡ５４９細胞に関し上記したようにし
て脂肪酸不含ＤＭＥ／Ｆ１２／ＲＰＭＩ１６４０培地
(１／１／２）中のフィブロネクチン３μg で被覆し
た。細胞を非酵素性のＰＢＳをベースとした細胞解離溶
液 (Sigma)とインキュベートし、次にＤＭＥ／Ｆ１２／
ＲＰＭＩ１６４０培地中に分散させた後、同じ培地で１
回洗浄した。増殖培地は Fernandez-Polら (Cancer Re
s. 46, 5153-5161 (1986))により記載されたものの改変
物であった。細胞を１mg/ml ＢＳＡ、５μg/ml インシ
ュリン、５μg/ml トランスフェリン、２mM グルタミ
ン、５pMトリヨードチロニン、10nM 亜セレン酸ナトリ
ウムおよび50nM ヒドロコルチゾンを含有する脂肪酸不
含ＤＭＥ／Ｆ１２／ＲＰＭＩ１６４０培地 0.5ml中に塗
布した。他の全ての添加および測定はＡ５４９細胞に関
して上記したようにして行った。 実施例２血清含有培地および無血清培地におけるＡ５４９細胞の
増殖に及ぼすＴＧＦ−β１の作用 改善された無血清培地をＡ５４９肺癌細胞（図１）の増
殖のために開発した。この培地は上記Browerら、により
開発されたＡＣＬ−３培地に基づく。改変にはいくつか
の因子の濃度の変更、トリヨードチロニンの除外および
塩基性ＦＧＦおよびレチノイン酸の添加が包含される。
Ａ５４９細胞を改変ＡＣＬ−３培地中で増殖した場合、
遅滞期は何ら観察されず、倍加時間はＡＣＬ−３培地中
におけるこれら細胞の増殖について報告された36時間に
比べ27.1時間であった。血清含有培地中での倍加時間
（18.7時間）は Brower ら、上記、により報告されてい
るそれに匹敵した。
【００２９】ＴＧＦ−β１（60pM）は、２％ウシ胎児血
清を含有する培地中でＡ５４９細胞の付着依存増殖を可
逆的に70％阻害することがわかっている(Robertsら、Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA, 82, 119-123 (1985)）。本
研究において、200pM のＴＧＦ−β１の添加により10％
ウシ胎児血清の存在下で亜集密Ａ５４９細胞増殖が33％
阻害された。一方、ＴＧＦ−β１はこれら細胞の無血清
増殖を18−20％阻害できるのみであった（図１）。 実施例３外因性ＰＵＦＡの存在下でのＴＧＦ−β１によるＡ５４
９細胞増殖の阻害 ５μg/ml以下の濃度のＰＵＦＡの添加はＡ５４９細胞の
無血清増殖にほとんど影響を及ぼさなかった。しかしな
がら、リノレン酸またはα−リノレン酸の存在はＴＧＦ
−β１による増殖阻害に対する細胞の感受性を有意に増
大させた。アッセイを１−３μg/mlリノレン酸またはα
−リノレン酸の存在下で行った場合、ＴＧＦ−β１添加
時点の細胞密度に比べてＴＧＦ−β１はＡ５４９細胞の
増殖をほぼ 100％阻害した（図２）。同様の結果がアラ
キドン酸エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン
酸で得られた。増殖培地中におけるレチノイン酸の存在
はＴＧＦ−β１による有意なＰＵＦＡ依存増殖阻害に必
要であった（データーは示されず）。不飽和およびモノ
不飽和脂肪酸はＴＧＦ−β１による増殖阻害に対するＡ
５４９の細胞感受性を増大できなかった（図２）。同様
の結果がカプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸および
エライジン酸で得られた。
清を含有する培地中でＡ５４９細胞の付着依存増殖を可
逆的に70％阻害することがわかっている(Robertsら、Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA, 82, 119-123 (1985)）。本
研究において、200pM のＴＧＦ−β１の添加により10％
ウシ胎児血清の存在下で亜集密Ａ５４９細胞増殖が33％
阻害された。一方、ＴＧＦ−β１はこれら細胞の無血清
増殖を18−20％阻害できるのみであった（図１）。 実施例３外因性ＰＵＦＡの存在下でのＴＧＦ−β１によるＡ５４
９細胞増殖の阻害 ５μg/ml以下の濃度のＰＵＦＡの添加はＡ５４９細胞の
無血清増殖にほとんど影響を及ぼさなかった。しかしな
がら、リノレン酸またはα−リノレン酸の存在はＴＧＦ
−β１による増殖阻害に対する細胞の感受性を有意に増
大させた。アッセイを１−３μg/mlリノレン酸またはα
−リノレン酸の存在下で行った場合、ＴＧＦ−β１添加
時点の細胞密度に比べてＴＧＦ−β１はＡ５４９細胞の
増殖をほぼ 100％阻害した（図２）。同様の結果がアラ
キドン酸エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン
酸で得られた。増殖培地中におけるレチノイン酸の存在
はＴＧＦ−β１による有意なＰＵＦＡ依存増殖阻害に必
要であった（データーは示されず）。不飽和およびモノ
不飽和脂肪酸はＴＧＦ−β１による増殖阻害に対するＡ
５４９の細胞感受性を増大できなかった（図２）。同様
の結果がカプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸および
エライジン酸で得られた。
【００３０】ＴＧＦ−β１の滴定ではＡ５４９細胞によ
るこの因子への二相性応答が示された。ピコモル以下の
濃度のＴＧＦ−β１は、リノレン酸の非存在下または存
在下で細胞増殖の小さな刺激を再現可能に生じた。無血
清条件下でのＴＧＦ−β１のピコモル以下の濃度による
正常ラット腎臓細胞増殖の同様の刺激は先に Nugentお
よび Newman (J. Biol. Chem. 264 18060-18067 (198
9))により観察された。ピコモル濃度のＴＧＦ−β１は
上記のようにリノレン酸の非存在下でＡ５４９細胞増殖
を最大20％阻害した。0.５−10pM（0.0125−0.25ng/ml)
間のＴＧＦ−β１滴定は、２μg/mlリノレン酸の存在下
で細胞増殖を用量依存的に95−100％阻害した（図
３）。ＴＧＦ−β１存在下での最終細胞数は初めの塗布
密度またはＴＧＦ−β１添加時の細胞密度より低かっ
た。 実施例４ＰＵＦＡ存在下でのＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増
殖の不可逆的阻害 ＰＵＦＡおよびＴＧＦ−β１の存在下で行ったＡ５４９
増殖曲線では、はじめの１−２日間はＴＧＦ−β１媒介
増殖阻害がほとんど起らないことが示された。しかしな
がら、ＰＵＦＡおよびＴＧＦ−β１処理により３日目ま
でに増殖の完全な停止を生じ、それに続くインキュベー
ションの間に付着した細胞の破壊および損失を生じた。
図４はリノレン酸およびＴＧＦ−β１で細胞を処理する
と細胞増殖阻害およびそれに続く細胞破壊の両方を生じ
たことを示す。この観察は未処理細胞およびＴＧＦ−β
１処理細胞のトリパンブルー排除分析により確認され
た。リノレン酸およびＴＧＦ−β１の存在下で増殖した
後、残った細胞の約80％はトリパンブルー摂取に基づけ
ば生存能力がなかった。これらの結果はまた細胞の直接
再塗布によっても確認された。細胞をＴＧＦ−β１添加
または無添加の１μg/mlリノレン酸の存在下で４日間増
殖させた。未処理ウエルは平均 10.24×104 個の細胞を
含有し、ＴＧＦ−β１処理ウエルは0.27×104 個の細胞
を含有した。ＴＧＦ−β１処理細胞をトリプシン処理お
よび10％ウシ胎児血清を含有する培地中に再塗布する
と、数コロニーだけが単離された。未処理細胞は容易に
高効率で再塗布された。
るこの因子への二相性応答が示された。ピコモル以下の
濃度のＴＧＦ−β１は、リノレン酸の非存在下または存
在下で細胞増殖の小さな刺激を再現可能に生じた。無血
清条件下でのＴＧＦ−β１のピコモル以下の濃度による
正常ラット腎臓細胞増殖の同様の刺激は先に Nugentお
よび Newman (J. Biol. Chem. 264 18060-18067 (198
9))により観察された。ピコモル濃度のＴＧＦ−β１は
上記のようにリノレン酸の非存在下でＡ５４９細胞増殖
を最大20％阻害した。0.５−10pM（0.0125−0.25ng/ml)
間のＴＧＦ−β１滴定は、２μg/mlリノレン酸の存在下
で細胞増殖を用量依存的に95−100％阻害した（図
３）。ＴＧＦ−β１存在下での最終細胞数は初めの塗布
密度またはＴＧＦ−β１添加時の細胞密度より低かっ
た。 実施例４ＰＵＦＡ存在下でのＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増
殖の不可逆的阻害 ＰＵＦＡおよびＴＧＦ−β１の存在下で行ったＡ５４９
増殖曲線では、はじめの１−２日間はＴＧＦ−β１媒介
増殖阻害がほとんど起らないことが示された。しかしな
がら、ＰＵＦＡおよびＴＧＦ−β１処理により３日目ま
でに増殖の完全な停止を生じ、それに続くインキュベー
ションの間に付着した細胞の破壊および損失を生じた。
図４はリノレン酸およびＴＧＦ−β１で細胞を処理する
と細胞増殖阻害およびそれに続く細胞破壊の両方を生じ
たことを示す。この観察は未処理細胞およびＴＧＦ−β
１処理細胞のトリパンブルー排除分析により確認され
た。リノレン酸およびＴＧＦ−β１の存在下で増殖した
後、残った細胞の約80％はトリパンブルー摂取に基づけ
ば生存能力がなかった。これらの結果はまた細胞の直接
再塗布によっても確認された。細胞をＴＧＦ−β１添加
または無添加の１μg/mlリノレン酸の存在下で４日間増
殖させた。未処理ウエルは平均 10.24×104 個の細胞を
含有し、ＴＧＦ−β１処理ウエルは0.27×104 個の細胞
を含有した。ＴＧＦ−β１処理細胞をトリプシン処理お
よび10％ウシ胎児血清を含有する培地中に再塗布する
と、数コロニーだけが単離された。未処理細胞は容易に
高効率で再塗布された。
【００３１】ＰＵＦＡの存在下での無血清条件下での非
腫瘍形成線維芽細胞および上皮細胞の増殖は、ＴＧＦ−
β１による阻害に対して腫瘍細胞の増殖よりも感受性が
低いことがわかった。さらに、ＴＧＦ−β１による非形
質転換細胞の増殖阻害はＰＵＦＡにより強化されず、一
般に可逆的であることがわかった（データーは示され
ず）。 実施例５ＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増殖阻害におけるＰＵ
ＦＡの役割 ＰＵＦＡ代謝産物がＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増
殖阻害の媒介物である可能性を検査した。図５は１μg/
mlのリノレン酸、α−リノレン酸またはドコサヘキサエ
ン酸はＴＧＦ−β１による増殖阻害を媒介できるが、同
様の濃度のプロスタグランジンＥ1 , Ｅ2 , Ｄ2 および
Ｆ2αはＡ５４９細胞の増殖を阻害するのにＴＧＦ−β
１と相乗的に作用できなかったことを示す。
腫瘍形成線維芽細胞および上皮細胞の増殖は、ＴＧＦ−
β１による阻害に対して腫瘍細胞の増殖よりも感受性が
低いことがわかった。さらに、ＴＧＦ−β１による非形
質転換細胞の増殖阻害はＰＵＦＡにより強化されず、一
般に可逆的であることがわかった（データーは示され
ず）。 実施例５ＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増殖阻害におけるＰＵ
ＦＡの役割 ＰＵＦＡ代謝産物がＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増
殖阻害の媒介物である可能性を検査した。図５は１μg/
mlのリノレン酸、α−リノレン酸またはドコサヘキサエ
ン酸はＴＧＦ−β１による増殖阻害を媒介できるが、同
様の濃度のプロスタグランジンＥ1 , Ｅ2 , Ｄ2 および
Ｆ2αはＡ５４９細胞の増殖を阻害するのにＴＧＦ−β
１と相乗的に作用できなかったことを示す。
【００３２】リノレン酸（ω−６脂肪酸）、α−リノレ
ン酸およびドコサヘキサエン酸（ω−３脂肪酸）は種々
のシクロオキシゲナーゼまたはリポキシゲナーゼ産物の
生合成前駆体として働く。したがって上記の結果は、Ｐ
ＵＦＡそれ自体、または全てのＰＵＦＡに共通するある
産物がＴＧＦ−β１による増殖阻害の媒介をしているに
ちがいないことを示唆している。ＰＵＦＡはペルオキシ
ド化され易く、有毒な分解産物を生成する。したがっ
て、１μg/mlのリノレン酸および 25pM ＴＧＦ−β１に
よる細胞増殖阻害を抗酸化剤ビタミンＥの存在下または
非存在下で検査した。図６はビタミンＥがリノレン酸の
存在下でＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増殖阻害を阻
止できることを示す。ビタミンＥはＴＧＦ−β１媒介増
殖阻害を完全には逆転させなかった。 実施例６Ｂ１６メラノーマ細胞増殖のＴＧＦ−β１による多不飽
和脂肪酸依存性阻害 ＴＧＦ−β１による腫瘍細胞増殖阻害においてＰＵＦＡ
が一般的役割を果すかどうか判定するために、第２の細
胞型を検査した。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞系が選択
された。なぜなら血清の存在下においてこの細胞型の付
着非依存型増殖はＴＧＦ−β１により阻害されるが、無
血清培地中におけるＢ１６細胞の付着非依存型増殖はＴ
ＧＦ−β１により刺激されるからである。これらの結果
は、ＴＧＦ−β１によるＢ１６細胞増殖阻害はＰＵＦＡ
のような血清中に含有される未確認因子に依存している
可能性を示唆する。
ン酸およびドコサヘキサエン酸（ω−３脂肪酸）は種々
のシクロオキシゲナーゼまたはリポキシゲナーゼ産物の
生合成前駆体として働く。したがって上記の結果は、Ｐ
ＵＦＡそれ自体、または全てのＰＵＦＡに共通するある
産物がＴＧＦ−β１による増殖阻害の媒介をしているに
ちがいないことを示唆している。ＰＵＦＡはペルオキシ
ド化され易く、有毒な分解産物を生成する。したがっ
て、１μg/mlのリノレン酸および 25pM ＴＧＦ−β１に
よる細胞増殖阻害を抗酸化剤ビタミンＥの存在下または
非存在下で検査した。図６はビタミンＥがリノレン酸の
存在下でＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増殖阻害を阻
止できることを示す。ビタミンＥはＴＧＦ−β１媒介増
殖阻害を完全には逆転させなかった。 実施例６Ｂ１６メラノーマ細胞増殖のＴＧＦ−β１による多不飽
和脂肪酸依存性阻害 ＴＧＦ−β１による腫瘍細胞増殖阻害においてＰＵＦＡ
が一般的役割を果すかどうか判定するために、第２の細
胞型を検査した。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞系が選択
された。なぜなら血清の存在下においてこの細胞型の付
着非依存型増殖はＴＧＦ−β１により阻害されるが、無
血清培地中におけるＢ１６細胞の付着非依存型増殖はＴ
ＧＦ−β１により刺激されるからである。これらの結果
は、ＴＧＦ−β１によるＢ１６細胞増殖阻害はＰＵＦＡ
のような血清中に含有される未確認因子に依存している
可能性を示唆する。
【００３３】Ａ５４９細胞に関して上記したように、本
研究はＢ１６メラノーマ細胞の付着依存性増殖のための
改良された無血清培地の開発に依存していた。培地はFe
rnandez-Pol ら、上記、により開発されたＤＭＥ／Ｆ１
２＋Ｈ＋Ｆに基づく。改変には細胞付着を促進するため
に血清でなくむしろフィブロネクチンの使用、プロスタ
グランジンＥ1 の除外および結晶状脂肪酸不含ＢＳＡの
添加が包含される。基礎培地もまた変更され、そしてＤ
ＭＥ，Ham's Ｆ１２およびＲＰＭＩ１６４０の混合物で
構成される。血清の存在下および無血清培地中における
Ｂ１６細胞の倍加時間は、それぞれ13.4時間および15.8
時間であった（図７Ａ）。
研究はＢ１６メラノーマ細胞の付着依存性増殖のための
改良された無血清培地の開発に依存していた。培地はFe
rnandez-Pol ら、上記、により開発されたＤＭＥ／Ｆ１
２＋Ｈ＋Ｆに基づく。改変には細胞付着を促進するため
に血清でなくむしろフィブロネクチンの使用、プロスタ
グランジンＥ1 の除外および結晶状脂肪酸不含ＢＳＡの
添加が包含される。基礎培地もまた変更され、そしてＤ
ＭＥ，Ham's Ｆ１２およびＲＰＭＩ１６４０の混合物で
構成される。血清の存在下および無血清培地中における
Ｂ１６細胞の倍加時間は、それぞれ13.4時間および15.8
時間であった（図７Ａ）。
【００３４】無血清付着依存条件下でＢ１６細胞を 100
pMのＴＧＦ−β１で処理すると、Ａ５４９細胞に関して
上記したように増殖が10−15％阻害された（図７Ｂ）。
10μg/mlのα−リノレン酸単独の添加は細胞の増殖にほ
とんど影響しなかったが、α−リノレン酸の存在により
ＴＧＦ−β１は細胞増殖を85％阻害できた。同様の結果
がリノレン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸およびド
コサヘキサエン酸で得られた。Ａ５４９細胞について記
載されたように、ＴＧＦ−β１およびＰＵＦＡでの長期
間処理によりＢ１６細胞増殖の不可逆的阻害を生じた。
α−リノレン酸の存在下ではＴＧＦ−β１によるＢ１６
細胞の増殖阻害はビタミンＥにより逆転されたが、非存
在下ではそうではなかった（図７Ｂ）。α−リノレン酸
もまた血清の存在下でＴＧＦ−β１による増殖阻害に対
するＢ１６の感受性を増大させた。血清存在下のＴＧＦ
−β１およびＰＵＦＡの相乗的阻害作用はレチノイン酸
の添加に依存しそしてビタミンＥおよび亜セレン酸ナト
リウム両方の添加により大きく逆転された。
pMのＴＧＦ−β１で処理すると、Ａ５４９細胞に関して
上記したように増殖が10−15％阻害された（図７Ｂ）。
10μg/mlのα−リノレン酸単独の添加は細胞の増殖にほ
とんど影響しなかったが、α−リノレン酸の存在により
ＴＧＦ−β１は細胞増殖を85％阻害できた。同様の結果
がリノレン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸およびド
コサヘキサエン酸で得られた。Ａ５４９細胞について記
載されたように、ＴＧＦ−β１およびＰＵＦＡでの長期
間処理によりＢ１６細胞増殖の不可逆的阻害を生じた。
α−リノレン酸の存在下ではＴＧＦ−β１によるＢ１６
細胞の増殖阻害はビタミンＥにより逆転されたが、非存
在下ではそうではなかった（図７Ｂ）。α−リノレン酸
もまた血清の存在下でＴＧＦ−β１による増殖阻害に対
するＢ１６の感受性を増大させた。血清存在下のＴＧＦ
−β１およびＰＵＦＡの相乗的阻害作用はレチノイン酸
の添加に依存しそしてビタミンＥおよび亜セレン酸ナト
リウム両方の添加により大きく逆転された。
【図１】ＴＧＦ−β１の存在下および非存在下における
10％ウシ血清含有培地および無血清培地中のＡ５４９細
胞の付着依存性増殖を示す。
10％ウシ血清含有培地および無血清培地中のＡ５４９細
胞の付着依存性増殖を示す。
【図２】ＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増殖阻害にお
よぼす脂肪酸の作用を示す。
よぼす脂肪酸の作用を示す。
【図３】リノレン酸の存在下および非存在下におけるＴ
ＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増殖の阻害に関する用量
応答曲線を示す。
ＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増殖の阻害に関する用量
応答曲線を示す。
【図４】 １μg/ml リノレン酸および25pM ＴＧＦ−β
１の非存在下および存在下で増殖させたＡ５４９細胞の
写真である。
１の非存在下および存在下で増殖させたＡ５４９細胞の
写真である。
【図５】ＴＧＦ−β１によるＡ５４９細胞増殖阻害にお
よぼす脂肪酸およびプロスタグランジンの作用を示す。
よぼす脂肪酸およびプロスタグランジンの作用を示す。
【図６】ビタミンＥによる、リノレン酸およびＴＧＦ−
β１媒介Ａ５４９細胞増殖阻害の逆転を示す。
β１媒介Ａ５４９細胞増殖阻害の逆転を示す。
【図７】Ａは10％ウシ胎児血清および無血清培地中にお
けるＢ１６メラノーマ細胞の付着依存性増殖を示し、Ｂ
は ＴＧＦ−β１によるＢ１６細胞増殖阻害におよぼす
α−リノレン酸をおよびビタミンＥの作用を示す。
けるＢ１６メラノーマ細胞の付着依存性増殖を示し、Ｂ
は ＴＧＦ−β１によるＢ１６細胞増殖阻害におよぼす
α−リノレン酸をおよびビタミンＥの作用を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】 １μｇ／ｍｌリノレン酸および２５ｐＭＴＧ
Ｆ−β１の非存在下および存在下で増殖させたＡ５４９
細胞の生物の形態の写真である。
Ｆ−β１の非存在下および存在下で増殖させたＡ５４９
細胞の生物の形態の写真である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/06 8619−4Ｈ // Ｃ１２Ｎ 5/08
Claims (16)
- 【請求項１】 トランスフォーミング成長因子β１ (Ｔ
ＧＦ−β１) および多不飽和脂肪酸 (ＰＵＦＡ) および
／またはその誘導体を含んでなる組成物。 - 【請求項２】 前記ＴＧＦ−β１が組換えヒトＴＧＦ−
β１である請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】 前記ＰＵＦＡが２またはそれ以上の二重
結合を有する請求項１または２記載の組成物。 - 【請求項４】 前記ＰＵＦＡがリノレン酸、α−リノレ
ン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸、ジホモγ−リノ
レン酸、エイコサペンタエン酸および／またはドコサヘ
キサエン酸、または多不飽和脂肪酸含有組織抽出物であ
る請求項１−３のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項５】 レチノイドも含有する請求項１−４のい
ずれかに記載の組成物。 - 【請求項６】 前記レチノイドがレチノイン酸である請
求項５記載の組成物。 - 【請求項７】 薬剤として使用するための請求項１−６
のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項８】 新生物疾患の治療に使用するための請求
項１−６のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項９】 請求項１−６のいずれかに記載の組成物
の有効量およびかかる調製物中に一般に用いられる１ま
たはそれ以上の不活性で無毒な治療上許容される担体物
質を含有する医薬調製物。 - 【請求項10】 ＴＧＦ−β１、ＰＵＦＡおよび／または
その誘導体、場合によりレチノイド、および１種または
それ以上の不活性で無毒な治療上許容される担体を含ん
で成る、同時の、別個のまたは連続投与用の調製物とし
ての新生物疾患の治療に使用するための生成物。 - 【請求項11】 前記ＴＧＦ−β１が組換えヒトＴＧＦ−
β１である請求項10記載の生成物。 - 【請求項12】 前記ＰＵＦＡが２またはそれ以上の二重
結合を有する請求項10または11記載の生成物。 - 【請求項13】 前記ＰＵＦＡがリノレン酸、α−リノレ
ン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸、ジホモγ−リノ
レン酸、エイコサペンタエン酸および／またはドコサヘ
キサエン酸、または多不飽和脂肪酸含有組織抽出物から
選択される請求項10−12のいずれかに記載の生成物。 - 【請求項14】 ＰＵＦＡまたはその誘導体と組み合せた
有効量のＴＧＦ−β１を同時に、別個にまたは連続的に
投与することを含んでなる、新生物疾患、特に癌腫およ
びメラノーマを治療する方法。 - 【請求項15】 前記治療が有効量のレチノイドの投与を
も包含する請求項14記載の方法。 - 【請求項16】 特に実施例に関連して実質的に本文中に
記載されている発明。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/527215 | 1990-05-22 | ||
| US07/527,215 US5147854A (en) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | Tgf-b compositions and method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05213772A true JPH05213772A (ja) | 1993-08-24 |
Family
ID=24100576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3117523A Pending JPH05213772A (ja) | 1990-05-22 | 1991-05-22 | ＴＧＦ−β 組成物 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5147854A (ja) |
| EP (1) | EP0462398A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05213772A (ja) |
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| AU (1) | AU636489B2 (ja) |
| CA (1) | CA2042973A1 (ja) |
| FI (1) | FI912462A (ja) |
| HU (1) | HUT57599A (ja) |
| IE (1) | IE911736A1 (ja) |
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| MC (1) | MC2259A1 (ja) |
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| NZ (1) | NZ238179A (ja) |
| PT (1) | PT97728A (ja) |
| YU (1) | YU89891A (ja) |
| ZA (1) | ZA913647B (ja) |
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- 1991-05-20 KR KR1019910008175A patent/KR910019638A/ko not_active Application Discontinuation
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- 1991-05-21 NO NO91911949A patent/NO911949L/no unknown
- 1991-05-21 CA CA002042973A patent/CA2042973A1/en not_active Abandoned
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- 1991-05-22 JP JP3117523A patent/JPH05213772A/ja active Pending
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