NL8303264A

NL8303264A - Materiaal en preparaten voor toepassing bij de profylaxe van kanker.

Info

Publication number: NL8303264A
Application number: NL8303264A
Authority: NL
Original assignee: Sentrachem Ltd
Priority date: 1982-09-22
Filing date: 1983-09-22
Publication date: 1984-04-16
Also published as: BE897806A; IL69782A; GB8325337D0; EP0106571A2; NZ205689A; AU1933383A; CA1225597A; FR2538249B1; DE3334323A1; EP0106571A3; ES525841A0; GB2134782A; ES8600940A1; JPS59134721A; IT1205345B; GB2134782B; IT8349009A0; FR2538249A1

Description

t ί l { VO 5141

Titel: Materiaal en preparaten voor toepassing bij de profylaxe van kanker.

De uitvinding betreft stoffen en preparaten met deze stoffen voor toepassing bij een profylaxe van kanker.

In 1980 schreef Horrobin (The Reversibility of Cancer: The relevance of Cyclic AMP, Calcium, Essential Fatty Acids and Prostaglandin 5 E^ Med. Hypotheses 1980, deel 6, blzn. 469-486) uitgebreid over de metabole abnormaliteiten die gemeen zijn aan nagenoeg alle kankercellen, en over een mogelijke causitieve factor voor deze. Horrobin concludeerde dat een metabole. afwijking bij de synthese van prostaglandine throm-boxaan A2 (TXA^) en prostaglandine (PGE^) de uiteindelijke factor is 10 die een geïnitieerde kankercel tot het exprimeren van zijn afwijking brengt, d.w.z. tot een deling ad infinitum. Horrobin meende voorts (op basis van bewijs in de algemene literatuur) dat het defect dat leidt tot de afwijking in de synthese van TXA^ en PGE^ een remming van het enzym Δ-β-desaturase is. Dit enzym zet het essentiële vet-15 zuurlinolzuur (LA) om in γ-linoleenzuur (GLA) en wel in alle normale cellen van het lichaam. GLA wordt verder gemetaboliseerd tot dihomo-γ- Λ linoleenzuur (DGLA) dat op zijn beurt in prostaglandinen van de 1-serie wordt omgezet, met inbegrip van PGE^.

PGE^ en TXA^ zijn belangrijke intercellulaire regulatoren voor de 20 biochemie van alle normale cellen. TXA^ kan evenwel niet functioneren bij afwezigheid van PGE^. Horrobin vermoedde nu dat een deficiëntie aan PGE en aldus onwerkzaam gemaakte TXA„ een abnormaal metabolisme i. * van de cel veroorzaakt, welke voldoende groot is om een ongeregelde deling van potentiële kankercellen op gang te brengen.

25 Horrobin heeft daarom onder meer voorgesteld een GLA-supplement aan kankerpatiënten die een gebruikelijke behandeling ondergingen toe te dienen, omcfeze hypothese na te gaan, namelijk dat door het passeren van de metabole blokkering veroorzaakt door geremde Δ-6-desaturase (d-6-d) activiteit, mogelijk zou kunnen zijn kankercellen te normalise-30 ren door een omgekeerde transformatie.

In de Europese octrooiaanvrage 0 037 vermeldt Horrobin een mengsel van GLA en thioproline voor de behandeling van kanker.

De uitvinding betreft nu profylactische preparaten, dieet supplementen en werkwijze voor het tegengaan van kanker door de produktie -ι-s —? 7 - ‘ / λ '* , i , -2- van een of meer genormaliseerde mengsels van eicosanoiden.

Volgens de uitvinding omvat een profylactische methode voor het tegengaan van de vermenigvuldiging van levenskrachtige kankercellen en toediening op reguliere basis aan mens of dier van een profylactische hoeveelheid 5 van een of meer voorlopers voor de produktie in vivo van een of meer van de volgende eicosanoide mengsels namelijk a b c PGE1 PGE2 PGE3 PGF1 PGF2 PGF3 10 txAj pgd2 pgd3 prostacycline 417-pr0stacycUne TX&2 TXA3 LTA3 LTA4 LTAg LTC3 ltb4 LTBg 3-5 LTD3 LTC4 LTD4 LTE4 volgens volgend schema

Elongase £3-Desaturase 20 C18:3,u;6 ^0:3,^6 C20:4,w6 Y -linoleenzuur dihomo- V - linoleen- arachidonzuur 4 zuur PGE^ PGE2 PGE3 pgf1 pgf2 pgf3 TXA1 PGD2 PGD3 17 25 prostacycline L -pros tacycline txa2 txa3 lta3 LTA4 LTA5 LTC3 LTB4 LTB5 LTD3 LTC4 LTCg LTD4 / 30 LTE4 / 18:4, * C20:4,^'3 C20:5

Ostadecatetraeenzuur Eicosatetraeenzuur Eicosapentaeenzuur —· -·- - *1 ? e , - ?.

Vv v * * 4 9 -3-

Volgens een voorkeursvorm van de uitvinding wordt de voorloper gekozen uit GLA, AA en EPA of zouten, derivaten of analogen daarvan.

Deze toediening leidt niet tot enig giftig of ander schadelijk neveneffect (de verbindingen beïnvloeden bijvoorbeeld niet de groei van goed-5 aardige cellen).

De uitvinding betreft slechts een profylactische toepassing van de stoffen tegen kanker en omvatten niet een behandeling van een reeds manifeste pathologische kanker. Algemeen gezegd kunnen gebruikelijke kankerbehandelingen zelfs bij profylactische toepassing (in kleine doses).

10 veel ongerief en narigheid veroorzaken en zelfs leiden tot andere kanker-vormen.

In tegenstelling tot de hypothese van Horrobin, dat GLA slechts de ratio tussen PGE^ en TXA2 bij kwaadaardige cellen herstelt, werd nu gevonden, dat het de deling tegengaande effect van GLA (en AA alsmede 15 EPA) afhankelijk is van hun vermogen de produktie van een aantal eicosaan-zuren en verwante verbindingen op gang te brengen, bijvoorbeeld PGA^ en PGD^ bezitten een veel groter deling-tegengaand effect op menselijke kankercellen dan PGEj. PGBj heeft een minder effect terwijl tot dusver andere PG-verbindingen afgeleid van GLA, met inbegrip van PGF^ en 20 PGF2a totaal geen effect hebben op de deling van menselijke kankercellen.

Bij een vorm van de uitvinding worden GLA en/of AA en/of EPA als dieettoeslagstof toegediend en deze kunnen aanwezig zijn in een aantal mogelijke vormen, zoals bijvoorbeeld capsules, tabletten of andere gebruikelijke farmaceutica, of in een mengsel met voedingsmiddelen, 25 dranken en dergelijke. De hoeveelheid actieve stof in dergelijke vormen, voedingsmiddelen of dranken moet bij voorkeur niet meer bedragen dan (voor een gemiddelde opname) 100 mg per 100 kg lichaamsgewicht.

De uitvinding betreft tevens een werkwijze voor het ontgaan van de effecten van een Δ-6-desaturase deficiëntie in overigens gezonde 30 patiënten.

De d-6-d kan worden gestimuleerd door verwerking van betrekkelijk grote hoeveelheden w-6-linoleenzuur, of w-3-linoleenzuur in preparaten volgens de uitvinding.

Het zal duidelijk zijn, dat passende zouten, derivaten of 35 chemische analoga van de bovengenoemde stoffen eveneens binnen het bestek -4- * · van de uitvinding vallen. In het bijzonder zijn de magnesium en zink-zouten van belang.

De verbinding of het preparaat kan bijvoorbeeld een doserings-eenheidsvorm bezitten, bijvoorbeeld voor dagelijks of tweemaal dage-5 lijkse toediening, zoals bij tabletten of capsules. In elke capsule kan het actieve bestanddeel zich in oplossing bevinden, zoals bovenbeschreven, of de vorm hebben van een tablet of deeltjesvormig mengsel, met de actieve stof tezamen met een vast verdunningsmiddel of drager.

Een doseringseenheid voor dagelijkse toediening karakteristiek voor 10 een persoon van 50-100 kg kan tot 100 mg actieve stof bevatten, hetgeen 5-10% van de dosis is die wordt aanbevolen voor een behandeling van pathologische kankervormen, hetgeen een duidelijke andere orde van grootte vormt.

Een dergelijke dagelijkse dosering is niet bruikbaar voor het be-15 handelen van pathologische kankervormen. De voorkeursdosering volgens de uitvinding is ook veel lager dan wordt gebruikt voor het behandelen van alcoholisme en andere ziekten.

Passende oplosmiddelen voor de actieve bestanddelen omvatten plantaardige oliën, isotonische zoutoplossingen of andere lipide 20 of waterige oplosmiddelen die geschikt zijn voor menselijk gebruik.

De preparaten volgens de uitvinding kunnen tevens vitamine A-derivaten bevatten (voor een beschermend effect tegen huidkanker), tevens vitamine B-complex (als cefactoren), vitamine C (waarmee het een synergis-tisch effect lijkt te hebben) , of vitamine E (dat eveneens als anti-25 oxydans fungeert) . Zink of magnesiumzouten kunnen aan het preparaat worden toegevoegd.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht.

Voorbeeld I

30 Experimentele procedure Stoffen 5* -linoleenzuur (GLA)

Het vetzuur GLA (Sigma L-2378) werd bereid voor toevoeging aan een cultuurmedium onder anaerobe voorwaarden volgens de methode 35 van Ingerman-Wojenski (Prostaglandins 1981 : 21, 655-864). Het chemisch zuivere vetzuur werd opgelost in 0,1 M Na2C0-j en wel tot een concentratie r\ ' — 7 • % -5- van 10 mg/cm^, onder Nj. Deze voorraadoplossing werd bij -80°C opgeslagen. Indien nodig werd dit voorraadmengsel verder met 0,1 M NajCO^ verdund tot uiteindelijke vetzuurconcentraties van 0,5-10 mg/1.

Deze uiteindelijke concentraties werden toegevoegd aan een cultuurmedium 5 dat hieronder is beschreven, in de benodigde hoeveelheid en na sterilisatie door een millipone-filtratie (type GS, poriegrootte 0,22 yum).

Cellen

Twee cellijnen werden onderhouden in Greiner-plastic kolven (Labor-technik) in McCoys SA medium (Plow Laboratories) met daarin 10% foetaal 10 kalver-serum (Flow Laboratories) en antibiotica (CRYSTAPEN, te weten na-triumbenzylpenicilline en NOVOSTREP). Voorraadculturen werden tweemaal per week opnieuw gevoed en doorgekweekt met weekintervallen of zoveel sneller als nodig, d.w.z. wanneer de cultuur uitgeput raakte. De twee cellijnen omvatten BL6-muizenmelanoom cellen die waren verkregen van Dr 15 c Albrecht, Department of Pharmacology, üniversiteit van Stellenbosch, en MDBK rundemiercellen die waren verkregen van Dr D Verwoerd,

Veterinary Research institute, Onderstepoort.

Het kritische experiment Λ GLA-dosis-effect krommen.

20 16 onafhankelijke groepen van dosis-effect krommen wat betreft GLA werden geëvalueerd volgens de volgende twee standaardprocedures: (1) door bepaling van het totale aantal cellen en hun levensvatbaarheid (n=6), alsmede (2) door nagaan van de celvermenigvuldiging door bepaling van de hoeveelheden DNA en de eiwitsynthese alsmede door 25 toepassing van de opname van radioactief thymidine (n=5) en methionine (n=5). Alle experimenten werden uitgevoerd door een identieke en simultane toevoeging van GLA aan beide cellijnen, waardoor een totaal werd verkregen van 32 afzonderlijke experimentele culturen. Elk van deze 32 culturen omvatte twee controle-culturen en een reeks GLA-houdende 30 culturen. De GLA-doseringen voor de celtelling waren 0,5, 1,2,3,4,5,6,7, 3,9 en 10 mg/1. Zo bevatte elke cultuurset 13 afzonderlijke experimenten.

Een totaal van 156 afzonderlijke cultures werd daarom gekweekt voor een snelheidsbepaling wat betreft de GLA-groei. De GLA-doseringen voor zowel thymidine als methionine waren twee controles (zonder GLA) alsmede 2,3, 35 6,8 en 10 mg/1. Elke reeks doseringen werd voor beide cellijnen gedupli ceerd. Zodoende werd een totaal van 280 afzonderlijke culturen gebruikt 4 *· -6- voor deze bepalingen- Voor een statistische behandeling werd een gemiddelde waarde van elk duplikaat toegepast van n = 1.

(1) Groeikrommen protocol; De cellen werden geënt in een standaard groei- medium (McCoys 5a medium) uit voorraadculturen in Greiner plastic kolven 3 5 5 5 van 50 cm bij subconfluente dichtheden tussen 1 x 10 en 2 x 10 cellen/kolf. Na celaanhechting na 6 - 24 uren werd GLA toegevoegd tot de bovenweergegeven uiteindelijke concentraties. De controleculturen werden identiek behandeld maar hierbij werd geen GLA toegevoegd.

Deze cultuurkolven werden geincubeerd in een vochtige atmosfeer van 10 5% CO2 en 95% lucht en wel 7 dagen bij 37°C. Na deze periode werden de cellen geteld en hun levensvatbaarheid bepaald, de laatste door een exclusie van trypan blauw.

(2) Celproliferatie protocol; Voor de bepaling van DNA en eiwit-synthe- 3 4 se werd 200 mm celsuspensie (2,4 x 10 cellen) toegevoegd aan elk 15 van 12 kuiltjes van een Dynatech (microtiter) plaat (M 29 AR) , gevolgd na celaanhechting door de bovenweergegevm GLA-concentraties.

De platen werden vervolgens geincubeerd in een vochtige atmosfeer van 37°C met 5% CCL . Gedurende de laatste 24 uren werd 0,4 ,uCi aan 6- HJ -thymidine of 1 ^uCi aan L- ^methyl- HJ -methionine 20 (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) aan elk incubatiemengsel op de microplaat toegevoegd. De cellen werden vervolgens verzameld met een Skatron automatische opvanger en wel op twee met glasvezels versterkte harsfilters. De filters werden gedroogd en opgelost in 3 TM /—3-7 10 cm Picofluor 30 (Packard). De / 6- H / -thymidine-opname in 25 dna en de L-^/methyl- H,7-methionine-opname in eiwitten werd geteld op een Packard Tri-Carb scintilatie teller.

Cijfers en statistische analyse: Onder toepassing van de cijfers van de celtellingen die boven waren verkregen, het verschil van elke celtelling van zijn controle werd uitgedrukt als percentage van deze 30 controle. Aangezien de groeikrommen enige malen voor elke dosis zowel voor normale als kankercellen werden herhaald, werd de gemiddelde waarde en de standaard afwijking voor elke dosis bepaald.

De statistische significantie van de verschillen tussen het effect van de BL6 en MDBK-cellen tegen GLA werd bepaald onder toepassing van de 35 paren-Student-t-proef. Ter illustratie zijn deze percentage-verschillen uitgedrukt als een procentuele vermindering van de groeisnelheid(-GR%).

V ' \ A

..

-7- # ι

Resultaten GLA dosis effect krommen (1) Groeisnelheden: Fig. 1 en tabel A geven het percentage vermindering van de groeisnelheden (-GR%) van BL6 en MDBK cellen weer als gevolg 5 van toenemende doses GLA. Een statistisch hoog significant vermin- deringspercentage in de groeisnelheid van BL6 kankercellen werd gevonden vergeleken met de normale MDBK-cellen bij elke dosis van GLA van 0,05 mg/1 (p ^ 0,01) tot 10 mg/1 (p 40,001). De dosis effectkronme van de BL6 kankercellen toonde een trapsgewijze progressie voor de -GR% aan 10 voor GLA doses van 0,5 mg/1 tot ca 7,0 mg/1. Bij GLA doses boven 7 mg/1 bereikte het groeieffect een plateau bij een -GR% van ongeveer 70%.

Dit suggereert een verzadigbare dosis effectkromme. Het effect van de MDBK cellen is opmerkelijk omdat er geen duidelijke: respons is tot enige van de GLA-doses.

15 (2) Celproliferatie: Het effect van toenemende GLA-doses op de opname van radioactief thymidine en methionine door BL6 en MDBK cellen is weergegeven in tabel B en in de figuren 2 en 3. Als te verwachten zijn deze effecten analoog aan de respectievelijke celgroei-reffecten. Een statistisch hoog significante vermindering in de opname van methionine 20 en thymidine trad op bij de maligne BL6 cellen vergeleken met de normale MDBK cellen. Bij een GLA dosis niveau van 10 mg/1 bedroeg de vermindering in methionine en thymidine opname door BL6 cellen respectievelijk 58,9% en 59,1%.

fs *** -' 1 w . ·- - ? * " ‘ . ' -8- — v- ,. - . -4—* -t—l J_] 4—1 • CCCCCCCCCCC . m <C.ra Ό rtl rO Λ3 Λ3 ra « π3 ra .¾ uu uuuuuuuv u , U <- — ·*- ·— ·τ- — -1— ·*- ·— *r- g 4-4-4-4-(+--(+-(+-(+-4-(+-1^ - ,rt ·** ·<··— ·'“· I-. **— ·»—·—. v— 1— u cccrcrcccccce - οιοίΦοισισσοοισισ ήj (+. -r* -r· *r— ·»— ·—™ **· Ί—> ·»— *— ·** ,_+ (j1Ul(/l(/tU1lrt4CIUlmmt/» -4 e" «J cn X ·: . - 0 —- μ= = ϊϊ-----*

^ 4J

ffl cn

Q

X

3· ooooaooooao

§ <3. VVVVVVVV. VVV

40 μ4 1 " ' " "' " " .

« a © g σ> ^ ^ © •w ^ 51 2 usenr^cnen—ru3—- — 40 η 3·5φ «•ercMUDcocucncQ'ïrnvo (Q * - y if] — — — — — — — — — S α·ηΌ fi)inrs<?in(*){vi--ifls·^· — (0 -Η Ή i 5 jj T- e 5 cn w © ? , id Cn Ό + I .: . .: .

•H

5 (D

2 § · o 2 © g T; c .. o ·« io «r σ\ 40 co · co 5 ,. m C csjotnoco Ό r-'- 'C ·— —· — ïj ·η © .—> ^ ίτ, .¾^ # ΓΟΓ4-— CMroOcoca — CMco $ „ ,25 0 g ' ' ' 1 . ' 5 j !;S3 0 > S' > Λ cn · a) -- j ., -------------1--- tn ...

0 ^ Ό , v - tg - s-t © cr>LDr>.cocnir>u3CviCjm-«- j 2-2 40 CT4 4n ® . j r** — ic > in a {J lu 4 H + 03 40 (O ® 40 O 40 CO «— «Q- f§ Λ Ό 2 -U · ·μ .

§ tn ,3 S - 1 ,<w © I +| ns cn S VO Ό © S -J I -H O': 44 · 03 mu® a , Λ -© -ü

I 3 > s I

, m 1-3 (4 U1 p> ts cn 03 co OJ C3 CO

+4 .μ <u : *rro33c3. ro-οο^ — O'S- U d> T3 4J : Λ

Si o-C © # vor-r—O'cro-oaS'iroco £: Μ ‘-μ g. K -Wr)ininmu343U3i4U3 m ' 1 & £ O ·

“ 54 C I

M . © © — © S > Ai S © ©

K &i nf H

* Έ c ^ ai o u 31^ £ 4nooaaaooooo

• O

c^n^riravor^coa^® —J «3

O N

«. } —-- ^ ^ ... _ ,.v .

— . '-9- ' c. . . .---— _ __

<D· JfU

- ccccc ccccc

. m ' <t3 Π3 re Π3 Γ3 «3 (¾ ro fO rO

η i- m -UUUUU U U U U <J

I -r— ·.— ·»— ·*— -r- ·τ— ·*— , V4 Tj 4_ 4- 4- 4- 4- 4_ U_ 4_ V1_ O-, - CQ r* ·ι— h-“ -r— »r— ·*· —* ,r“ Q § CCCCC cccc-c a o o o o o cr> 01 σ> σι σ σ ·«» ·««· *i-· t· *f— •r*·

1) Vl V> WH 1/1 V> VI Crt t/ï J/ï VI

g · I u ==== = g 5 3 = = = = ·

M

>4 ...

W ’ * <U L----—--- 10 ‘

* CQ

' . TJ OOOOO OOOO

w *4 «* <·! A » « * * * * *

g, Λ OOOOO OOOOO

•h jg vvVv v v v y v Λ Q.

ε ___ .

u o Ό ? -fc* · — CO rr cm - co in 03 o

5> 2 S' ί · m o r>- in m o ιλ η w N

C ® 5 1 ••CO'— - - - « - · ·£ ei' O — - - CV! ,— Ο ΓΟ O P" o ® - <n o - ,4 '+» *w C W ,3

-U ,<P

.0 +1 ιβ { 0) S g> .

a) S -w c P - £ « * , cn r«~ o O o — m cn 2 s 1, m cn cd n o - σ* «e· g -5 <u ‘..... , “ “ * “ " ξ, s's . o ·** γί» ,* p*h m — cn po — s * I g — ^ cv» % -7 t , , ts (DC S i i i i t > Qi 10 2 BJ <D a 0 C 5 > B Q< & ^ o ‘ <u a o 0 £H i-{· · &> ·Η § S __ o; _L_g._ ' 61 8 : ·£ c

Ί* *0 Q

Ό Ό ' t- .Z.

aj S-ι S - 54 S S' -E1 ci m n cv «3* jp η- — ·— cn c «-3 c; ,— cm i— in ·β· aj cn cn cn — a.

(ö ca! ··«·** si · * * · · > . nj-n m <a « n o η ® o o n

-0 -H

a) m 5 • S .«w as +1 ra % . --- s s

Oi -η as 0 go, n cm cn ^3- σι ροιηττιηο cn cjo a'srvomo m a cn vo co φ ^ · ·· ^ ^ ·· ·«··· tn G “Z rrCMinuoo m^r-— mao 0 · -η ** co “o· ^ TT m cm ^ m m in Ό Ό w 1 ό σ'

Λ ·Η C

κ3 Ξ ή O Φ ^

Oi fl) Ώ -- -------- ------r '3 r—» 3 I *Z - s gf o S ? c —v.

Q CM-^rioaDO CM-^-VOCOO

Οι uS

> <η

P Tc£ rO 'I

O ΙΟ -IP I

lp lp j 1 ¢) ___

U

OJ · *** .

^ — - --.¾ f * - * ' -t j -* --------- -10- 4 te

Voorbeeld II Experimentele procedure Materialen GLA: GLA (sigma - 2378) werd opgelost in natriumcarbonaat onder 5 stikstof als beschreven in voorbeeld I. Een GLA-dosis van 20 mg/1 werd bij deze experimenten steeds gebruikt. Deze werd bereikt door toevoeging van 20 cm^ GLA in natriumcarbonaatvoorraad (10 g/1) direct aan elke GLA kolf met een 10 cm^ cultuunnedium. Aan de controle-kolven werd slechts 20 mm^ natriumcarbonaat basis toegevoegd.

10 Cellen: Cellen van menselijke primaire carcinomen van de leverlijn werden geleverd door Dr J.J. Alexander van de Division of Virology, Department of Microbiology, Medical University van Zuid-Afrika. Deze cellen werden bewaard in Grenier plastic kolven in een McCoy 5A medium als beschreven in voorbeeld I.

15 Groeisnelheid protocol

De cellen werden geënt in een standaard groeimedium uit voorraad- 3 cultures en wel in Greiner plastic-kolven van 50 cm in subconfluente dichtheden tussen 2 x 10 en 3 x 10 cellen per kolf. Na celaanhechting 6 uur later werd 20 mg/1 GLA in natriumcarbonaat aan de GLA-kolven toe-20 gevoegd, terwijl natriumcarbonaat alleen aan de controlekolven werd toegevoegd. Deze cultuurkolven werden in een vochtige atmosfeer met 5% CO21 95% lucht bij 37°C gelncubeerd. Na elk experiment werden de dode afgescheiden cellen uit het cultuurmedium verwijderd. De levende aangehechte cellen werden getrypsiniseerd en vervolgens geteld onder toe-25 passing van een Coulterteller. De cel-levensvatbaarheid werd nagegaan door uitsluiting van trypan blauw. Bovendien werden de cultuurkolven dagelijks onder een Nikon diafoto-omgekeerde fasemicroscoop bekeken en gefotografeerd. Om het effect van de duur van de GLA-behandeling te bepalen werden twee verschillende procedures toegepast.

30 (l) Dagelijkse dosis effect: Het cultuurmedium werd dagelijks ver nieuwd en elke dag nieuw GLA toegevoegd. De cellen werden gefotografeerd en geteld op de dagen 1, 2,3 en 4 (proef 1: n = 4 voor zowel GLA als controles op elke dag). De procedure op dag 4 werd herhaald: (proef 2: N = 4 voor zowel GLA als controles).

35 (2) Enkelvoudig dosis effect: Een dosis GLA werd toegevoegd aan de V’ i'! ·*> * .4f· - - **? '«# * -11- GLA-kolven (η = 8) en een dosis natriumcarbonaat aan de controles (n = 8) op dag 1 van het experiment. De cellen werden geteld na 4 dagen in cultuur.

Resultaten 5 Dagelijkse dosis effecten

Tabel C geeft de effecten weer van een dagelijkse dosis van GLA op de groeisnelheid van menselijke hepatoom cellen. De gemiddelde vermindering van de groeisnelheid in de GLA-kolven vergeleken met de blanco-kolven bedroeg 66% op dag.2, 78% op dag 3, en 87% en 78% op dag 4 voor IQ respectievelijk proef 1 en proef 2. De gemiddelde waarden en de standaard afwijking van het gemiddelde voor proef 1 is weergegeven in fig. 4.

Deze geeft de normale proliferatiesnelheid van de onbehandelde controlecellen weer. Er was een plaat-effcientie van ca 35% en een verdubbeling gedurende elke twee dagen, die overigens karakteristiek is 15 voor deze hepatoomcelllijn. . Daarentegen · werd een statistisch, hoog significante vermindering gevonden in de groeisnelheid van de met GLA behandelde cellen vergeleken met de blanco-cellen. De volgende verschillen werden genoteerd na 3 dagen tussen de behandelde GLA-cellen en de blanco cellen bij vergrotingen van 100 x en 200 x. De controle-20 cellen waren uniform gedistribueerd over de kolf. Daarentegen waren er grote gebieden met een nulgroei in de met GLA behandelde kolven en de zichtbare cellen waren veel minder, minder dicht en verschilden duidelijk van beide controles welke laatste zich karakteristiek voor dit soort cellijnen gedroeg.

25 Effect van een enkelvoudige dosis:

Na vier dagen werden de cellen geteld na een enkelvoudige dosis 4 GLA op dag 1 van 19,81 x 10 +_ 4,85 vergeleken met 2,18 voor de controles- Er bestond geen significant verschil tussen de groeisnelheden van de met GLA begiftigde en controlecellen.

30 De resultaten van de voorbeelden I en II tonen aan dat zowel voor de muizenmelanoancellen als de menselijke kankercellen een in vitro toediening van GLA een statistisch· significante verminde ring van de groeisnelheid van de kankercellen oplevert. Zo kan dus door het handhaven van een bepaald GLA niveau de ongecontroleerde vermenigvuldiging van 35 potentiële kankercellen worden verhinderd.

J» * ' ' -12-

JJ 4-1 4_> JJ

c cc c c: re fO Π3 Π3

01 · 5 U O .U U

H *» 4J <-> t*_ νμ. ' V*.

S *·” ·*“ **— ·*— - £ c e c c ^ ^ σ> cn en o Üj (Λ ΙΛ m «Λ S. <Λ ·.

σ' !

•H

01 +J O' 01 0 Ï •HO. : __C Λ_s TJ " o o o o o

M 3 O o o O O

o ? A V v V V

N P Λ * Y Y

C 0 -——--- dl o φ p H <H 1 0 0 -HO - · -

•HU G O' 0 O· 5 S S ffl N

H C ·ΗΕ^£# e«NON

1 -H S -Η 0Ή — I

(d Η H 01

SC 0) <U G G

S 0) ’ > Ό Ή . 01

(ΰ H

O' H

01 03 CO _ H · id S O' H (0 S „ >0 Giö^ieo) co co r«~ c-> ua ο ή pe* Ό O' o r-* co co cn O' P .¾ G O . G .· ···* CO t~i <d H ,(d > — OO — »“ •H ft -H (d K P · G 01 1 5 ~ oi S *

0) Λ <H 0 G ,<W

•H rd Ό 01 +| ld ΓΟ 0) rl H ... ......

I 01 X Ό 01 H

. 1 o ·η Η Ό ai ai O +1 H <0 ’Ü O <0 H ïd ·Η 01 rH _ - , — 010) Ό S <H 0) S Irt Η 01 01 C 0) 0 Ό Ό* VO CM -W <«T un ,A!G <0 θ' Η Ό - * · * *

J riSi ρ p -h || in«*-iftcoCM

03 -H S oi.c c S ·.— —- cm ra

«3 η . td o ai G

p ai c + > ü o> ^ O' id ia > -—----—-——— <0 Ό Ό H · .

C Ή H id S -

Sc - JS $ & SS ΞΪ -S Ïï C a> § o > * ^ * “ " *

(3G G P · O O O O O

>01 01 5

Η Ό ,*W

PO) G «-« +1 <0

0 0' OW

01 H -HO—* --:---

Ή O' Ό rH

Ή 0) >0 01 ai αι σ' Ό , Ό 0) <Η Ν θ' ΙΛ Ο θ'

mo 0 G ® — r^cncncM

Oj & Η dl ^ - - - - * *°„ r-j 'ö ^ co ra co cm r^.

<33 Ή t3 j οι S ii : C3 0 01

O' G

r-T CM

P

01 P P lp x: G ai. ai 0). 0 0

G Ξ 'MM

id ή · ft ft > u ai O' ft *- cm ro id x a ai ' C T · -;' ; v > f ·>* ./ _· ς.„ λ -13-

In tegenstelling tot de muizemelanoomcel response op een enkelvoudige dosis GLA bleken de menselijke hepatoomcellen voor een overeenkomstig effect een herhaalde toediening van GLA nodig te hebben. Voorbeeld III

5 Methoden en materialen

Cellen MG63 osteoide-sarcoomcellen werden verkregen van Flow Laboratories.Oesophagus· carcinoomcellen werden verkregen van Prof J. Alexander van het Department of Microbiology te Medunsa. Als controle werden gebruikt goedaardige rundemiercellen (MDBK) van dezelfde voor-10 raad als gebruikt bij de voorafgaande voorbeelden.

Technieken De gebruikte technieken voor het kweken van cellen in cultuur, de GLA toediening aan de groeimedia en het verkrijgen van de cel-tellingen waren overeenkomstig die van de voorgaande voorbeelden. Resultaten 15 MG63 osteoide-sarcoomcellen.Uit fig.5 blijkt dat een GLA toediening aan de cultuurmedia van MG63 cellen een duidelijke statistisch hoog-significante groeivermindering opleverde van deze cellen vergeleken met de groei van blanco MG63 cellen (tabel D): Na afloop van een λ zeven dagen durende cultuur bij dagelijkse toediening van GLA nam het 20 gemiddelde aantal MG63 cellen toe van een aanvankelijke entdichtheid 6 6 van 0,3 x 10 cellen tot 0,56 x 10 cellen.

Het gemiddelde aantal MG63 cellen in de onbehandelde controles nam toe van 0,3 x 10^ tot 2,3 x 10® cellen gedurende dezelfde tijdsperiode. Dit verschil in groeisnelheid komt overeen met een groei-remmend 25 effect van 76% voor de met GLA behandelde MG._,63 cellen gedurende de zeven dagen durende experimentele periode. Het gemiddelde aantal met GLA behandelde controle-MDBK cellen, in tegenstelling tot de MG63 cellen, overschreed het gemiddelde aantal onbehandelde MDBK cellen na afloop van de zeven dagen durende periode.

30 Oesophagus carcinoom cellen. Fig. 6 geeft de groei-snelheid weer van oesophagus carcinoom cellen bij behandeling van een groeimedia met 10 yug GLA per dag gedurende 6 dagen, vergeleken met de groei van controleculturen van onbehandelde oesophagus carcinoom cellen. Het gemiddelde aantal onbehandelde cellen nam toe van een aanvankelijk ent- 6 6 35 aantal van 0,14 x 10 tot 6,62 x 10 na afloop van 8 dagen kweken (tabel D). Daarentegen nam het gemiddelde aantal met GLA behandelde cellen toe van 0,14 x 10^ tot slechts 2,04 x 10® cellen gedurende dezelfde tijdsperiode. Dit groei-remmende effect van 69% na afloop •n w» pi Λ ƒ 3 V V \J ί. V Hl· -14- van de acht dagen durende periode bleek statistisch in hoge mate significant. Een statistisch significant groeiremmend effect door GLA op de oesophagus carcinoom cellen was duidelijk zichtbaar bij zes dagen kweken. (Tabel D).

5 Voorbeeld IV

Experimentele procedure Materialen GLA: GLA (sigma-2378) werd opgelost in natriumcarbonaat onder stikstof als beschreven in de voorbeelden I en II. Een GLA dosis van 20 3 3 10 mm GLA in de natriumcarbonaatvoorraad direct aan elke kolf met 10 cm cultuurmedium. Slechts 20 mm^ van een natriumcarbonaatoplossing werd toegevoegd aan de controlekolven.

Cellen

Maligne BL6 muize-melanoomcellen werden gehouden in Greiner plastic IS kolven (Labortechnik) met elk 10% foetaal kalverserum (Flor Laboratories) en antibiotica. Voorraadculturen werden tweemaal per week opnieuw gevoed en verder gekweekt met wekelijkse intervallen of eerder indien nodig.

De BLö muize-melanoomcellen waren afkomstig van Dr. C. Albrecht van het Department of Pharmacology van de Universiteit van Stellenbosch.

20 Procedure BLö melanoomcellen werden geënt in het standaard groeimedium uit voorraad cultures en wel in 50 cm^ Greiner plastic kolven tot sub-confluente dichtheden van 500, 1000 en 2000 cellen/kolf. Duplicaten werden opgezet voor deze drie dichtheden. Na celaanhechting na 24 uren 25 werd GLA aan de groeimedia in de kolven toegevoegd tot de uiteindelijke concentraties van 20 mg/1.

De groeimedia werden dagelijks vervangen en GLA werd gedurende twee weken dagelijks toegevoegd. De controleculturen werden identiek behandeld alleen werd daar GLA weggelaten. De cultuurkolven werden in een 30 vochtige atmosfeer met 5% CC>2 en 95% lucht bij 37°c gelncubeerd. Na afloop van twee weken werden de kolven gekleurd met 0,1% Amidoschwarz kleur-oplossing.

Resultaten ” ” λ Λ Λ t - '-· ··. ü L· Ό 4

Na afloop van de twee weken bleken de aanvankelijk geënte melanoom- 35 cellen kolonies te hebben gevormd van diverse grootte, in de controle cultuurkolven. De dichtste concentratie van de kolonies was gevormd in -1S- de kolven waarin 2000 cellen waren geënt. Daarentegen koifc niet één enkele kolonie worden waargenomen na twee weken in de met GLA behandelde cultuurkolven, noch in de met 500, noch in de met 1000, noch in de met 2000 cellen geënte kolven. De groei en de proliferatie van de 5 maligne BL6 melanoomcellen bleek dus volledig onderdrukt te zijn door de GLA toediening.

De resultaten van dit experiment zijn duidelijk en twee feiten blijken uit deze resultaten: Eerstens bevestigen zij dat de maligne-eigenschappen bij dit specifieke cel-type afhankelijk is van een GLA de-10 ficientie. Ten tweede blijkt dat de groei van dit soort maligne-cellen volledig kan worden onderdrukt door de aanwezigheid van GLA.

Λ ” <Λ Λ J

. V . ·.. - 'j 4 -16- TABEL D: Het effect van een dagelijkse GLA toediening op de groeisnelheid van benigne MDBK, MG63 osteoide sarcoom - · en menselijke oesophagus cellen in cultüur_ ' celtype eir-enf- Dagen Celtelling (n=4j (xlO ) dichtheid" in — .....

(x 10^)

cultuur Controls + GLA

_____ j * , / / gem. S.A. ·' gem. S.A. · P -teken MDBK U---;------- 0,3 2 0,41 0,02 0,43 0,02 >0,05' ns 3 0,76 0,003 0,70 0,02 0,05 <>0,01 ps 6 1,2 0,04 1,53 0,06 <0,01 hs 7 1,3 0,05 1 ,81 0,01 <0,01 hs MG63 0,3__ 2 0,21 0,02 ' 0,19 0,008 < 0,05 ' ns 3 0,41 0,04 0,31 0,007 0,05<>0,01 ps 4 0,69 0,07 0,48 0,018 0,05 00,01 ps 7 2,34 0,14 0,56 0,034 <0,01 hs

Oesophagus carcinoom v - 2 0,18 0,03 0,14 0,02 >0,05 ns 3 0,22 :0,01 0,22 0,01 >0,05 ns * 4 0,39 0,05 0,31 0,01 >0,05 ns 5 1,07 0,16 0,68 0,10 >0,05 ns 6 2,39 0,19 0,63 0,12 <0,01 hs 7 4,22 0,28 1,82 0,21 <0,01 hs .

8 6,62 0,35 .2,04 0,19 <0,01 hs Γ /1 " ' . \ - - . -1 - -- · “ / ♦ ___________—-- -17- * „>

Voorbeeld V

Menselijke osteogene sarcoomcellen werden geënt in 50 cm^ Greiner-plastic kolven en precies als weergegeven in voorbeeld IV bewaard.

De cellen werden drie weken gekweekt bij aanwezigheid van 5 1) alleen het groeimedium - controle 2) groeimedium + 10 mm^ cm^, toegevoegd om de dag 3) groeimedium + 20 ug AA/cm^ medium, toegevoegd om de dag ^ 3 4) groeimedium + 20 p.q linoleenzuur/cm medium, toegevoegd om de dag 10 5) groeimedium + 20 jnq oliezuur/cm^, toegevoegd om de dag 6) groeimedium + 20jaq GLA/cm?, toegevoegd om de dag 7) groeimedium + 5 ^ug PGE^/cm^, toegevoegd om de dag 8) groeimedium + 5 .ug PGA^/cm^, toegevoegd om de dag 9) groeimedium + 5 ^ug PGF^^/cm , toegevoegd om de dag 15 Na afloop van drie weken werden de cultuurkolven gekleurd met een 0,1%'s Amidoschwarz kleuroplossing.

Resultaten

Na afloop van de drie weken durende periode bleken de aanvankelijk geënte osteogene sarcoomcellen kolonies te hebben gevormd met ver- 20 schillende grootten, die nagenoeg de gehele bodem van de cultuurkolven van de controles en de met Na7C0, begiftigde kolven bedekten.

ca

Met linolzuur begiftigde cultures bereikten 75% van de groei van de controlecultures. Met oliezuur begiftigde cultures bereikten ongeveer dezelfde groei als de controleculturen.

25 PGEj en PGA^ culturen bereikten ca 25% van de groei van de controleculturen.

PGFla culturen bereikten nagenoeg dezelfde groei als de controleculturen.

Met GLA en AA behandelde culturen misten dit soort kolonies vol-30 ledig in de celculturen met 500, 1000 en 2000 cellen.

Deze resultaten tonen aan, dat oliezuur geen remmend effect heeft op kankercellen en dat de prostaglandine-voorloper linolzuur een gering remmend effect heeft op de kankercellen in cultuur (vanwege zijn stimulerend effect op d-6-d). PGE^ en PGA^ hadden een duidelijker groeirem-35 mend effect, terwijl PGFia geen enkel effect had op de kankergroei.

-18-

Daarentegen hadden GLA en AA, de tussenprodukten tussen de voorloper-vetzuren en de prostaglandinen, een volledig groei-remmend effect.

Deze resultaten suggereren, dat een ongecontroleerde celdeling bij kankercellen het resultaat kan zijn van afwijkingen in de con-5 centratie van enige prostaglandinen in dit soort cellen, resulterend uit een blokkering van hun synthese uit voorloper-vetzuren. Dergelijke afwijkingen worden kennelijk geëlimineerd door toediening aan de kankercellen van GLA of AA, het substraat waaruit de benodigde-prostaglandinen kunnen worden gesynthetiseerd in hun benodigde con-10 centraties. Zodra dit door kankercellen wordt bereikt wordt hun ongecontroleerde deling kennelijk volledig onderdrukt.

Dit suggereert sterk dat GLA en/of AA kunnen worden gebruikt als een profylacticum tegen kanker.

Voorbeeld VI

15 In verband met de verrassende waarneming volgens voorbeeld V, dat arachidonzuur (AA) toediening in een hoeveelheid van 40 mg/1 aan een medium van mg63 osteogene sarcoomcellen de proliferatie en kolonievorming van de cellen in cultuur volledig onderdrukt, werd dit experiment herhaald om de waarneming te bevestigen. Bovendien werd het 20 effect onderzocht van een toediening van eicosapentaeenzuur (EPA) een essentieel vetzuurtussenprodukt voor de prostaglandinevorming van de prostaglandine-3-serie, prostacycline, thromboxaan A3 en leukotriënen. EPA wordt verkregen uit het natuurlijke vetzuur A-lino-leenzuur (C 18:3 W3) onder invloed van d-6-d waardoor octadecatetraeen-25 zuur (C 18:4 W3) wordt verkregen, dat een ketenverlenging ondergaat tot eicosatetraeenzuur (C20:4 W3), dat op zijn beurt met Δ-5-desaturase in eicosatetraeenzuur wordt omgezet.

Procedure MG63 menselijke osteogene sarcoomcellen werden geënt in cultuur-30 kolven als beschreven in de voorbeelden IV en V. 2000 cellen werden in elke kolf geënt. Duplikaatreeksen kolven werden gebruikt voor elk van de te onderzoeken vetzuren. De volgende vetzuren, opgelost in een standaard groeimedium werden toegevoegd aan de cellen in cultuur, nadat men deze zich gedurende 2 dagen had laten vasthechten, en opnieuw 35 na een verder drietal dagen. Elke cultuur kreeg dus 2 toedieningen van het betreffende vetzuur. De cellen werden gekleurd en onderzocht na 7 dagen in cultuur: Λ Γ Λ Ï -19-

J

1. Alleen cultuurmedium - controle.

2. 5,10,20,40,60,80 en 100 jug oliezuur respectievelijk per cm^ cultuurmedium. (oliezuur (OA) is een vetzuur met 18 koolstofatomen en een onverzadigde binding op de 9-plaats. Het is derhalve 5 structureel bijna identiek met linolzuur (LA) en a-linoleenzuur (ALA) met alleen deze uitzondering dat het aantal dubbele bindingen in het molecuul wisselt. In verband met dit laatste verschil kan OA anders dan LA en ALA niet in eicosaanzuren (PG1s, LT's, TXA's en prostacycline) worden omgezet. Het wordt daarom beschouwd 10 als een voortreffelijk vetzuur voor een controle^ bij het nagaan van de effecten van de eicosaanzuren).

3 3. 5, 10, 20, 40, 60, 80 en 100 ^ug LA respectievelijk per cm cul-tuurmedium.

4. 5, 10, 20, 40, 60, 80 en 100 ^,ug ALA respectievelijk per cm^ 15 cultüurmedium.

5. 5, 10, 20, 40, 60, 80 en 100 yug/cm^ AA respectievelijk per cm3 cultuurmedium.

6. 5, 10, 20, 40, 60, 80 en 100 .ug per cm^ EPA respectievelijk per cm cultuurmedium.

20 7. 5, 10, 20, 40,60, 80 en 100 ^,ug GLA respectievelijk per cm·^ cultuurmedium.

Resultaten 1. Met OA behandelde cellen bereikten gelijke dichtheden wat betreft de kolonies voor alle doseringen tussen 5 en 100 ^ug per cm^ en 25 hetzelfde geldt voor de controles met alleen cultuurmedium.

2. LA en ALA hadden een duidelijk remmend effect op de toename in de hogere concentraties van de doseringen, d.w.z. bij 80 resp. 100 ,ug 3 7 per cm .

3. EPA, AA en GLA vertoonde een nagenoeg gelijke, voortschrijdende rem- 30 mende activiteit op de zelfvermeerdering en de kolonievorming bij de MG63 osteogene carcoomcellen.

4. EPA, AA en GLA onderdrukten volledig celgroei en de kolonievorming bij toegediende hoeveelheden boven 40 ^ug per cm^ cultuurmedium.

Geen enkele enkelvoudige cel of kolonie van cellen kon worden 35 gevonden bij microscopisch onderzoek in de culturen die begiftigd waren met EPA, AA of GLA in hoeveelheden tussen 40 en 100 ^,ug per cm^.

SvX

* J

-20- a

V

Hieruit volgt, dat de drie voorlopervetzuur-tussenprodukten: GLA, AA en EP A die elk leiden tot een afzonderlijke familie van eicosaan-zuren het vermogen bezitten individueel de kankercelgroei te remmen en te onderdrukken. Voorts blijkt, dat elk van deze eicosanoidevoorlopers 5 afzonderlijk of in combinatie profylactisch tegen kanker kan worden gebruikt, a - -*

Claims

1. Profylactische methode voor het tegengaan van de vermeerdering van levensvatbare kankercellen, met het kenmerk, dat men op een regulaire basis aan een mens of dier een profylactische hoeveelheid toedient van een of meer voorlopers voor de in vivo produktie van een 5 of meer van de volgende eicosanoide mengsels, namelijk a. b. c. PGEX PGE2 PGE3 PGPj^ PGF2 PGF3 TXA, PGD- PGD, i * η

10 Prostacycline Δ -prostacycline TXA2 txa3 LTA3 LTA4 LTAg LTC3 ltb4 ltb5 15 ltd3 ltc4 ltc5 ltd4 *· LTE4 volgens het volgende schema: _E1ongase d uesaturase CIS:3,“S-* C2£):3, “S-" C20:4,u6 y-tinoleeïlzuur OihonKi-y- AracM don-zuur linoleenzuur ‘i P6E, PCEn PGE, ' · pgf. pgf? pgf^ TxAj ?Gd\ _ PGO3 P r o s ta cy c 11 ne Δ17 ? ro $ t a cy c 1 i n*j txa2 txa- ^"^3 l-TA4 ltac LTC3 LTa^ LT3c LTD3 LTC . LTC ITO’ . - J LT< X \ Jr £ί3:4,^ ^20:4/^ -* ^20:5, * Ootadeca- . Eicosa- Eicosa- tstraeenzuur, tetraeenzuur. pentaeenzuur ___________-___ •Λ -22-

2. Profylactische methode volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de voorloper wordt gekozen uit GLA, ΑΔ en/o£ EPA of de zouten, derivaten of analoga daarvan.

3. Profylactisch preparaat met daarin een of meer van de voorlopers 5 volgens conclusie 2 in een hoeveelheid voor eenheidsdoseringsvormen voor dagelijkse toediening tot 100 mg voorloper per 100 kg lichaamsgewicht.

4. Dieetsupplement met daarin een of meer van de voorlopers, gekozen uit GLA, AA en/of EPA, hun zouten, derivaten of analoga, voor eenheids- 10 doseringsvormen voor dagelijkse toediening tot 100 mg voorloper per 100 kg lichaamsgewicht.

5. Voedingsmiddel of drank met daarin een dieettoeslagstof volgens conclusie 4. S 3 Λ "