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MEMOIRE DESCRIPTIF dépose à l'appui d'une demande de
BREVET D'INVENTION formée par
SENTRACHEM LIMITED pour : "Procédé et composition pour empêcher la multiplication des cellules cancéreuses viables".
Priorité d'une demande de brevet en République Sud-Africaine déposée le 22 septembre 1982, sous le nO 82/6925.
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"Procédé et composition pour cmCcher la multiplication des ccllui & s canccreuscs viables.
La présente invention est relative à des substances et à des compositions contenant de telles substances, utilisables dans la prophylaxie d'états cancéreux.
En 1980, Horrobin (Thé Reversibility of Cancer : The Relevance of Cyclic AMP, Calcium, Essential Fatty Acids and Prostaglandin E-Med.
Hypotheses 1980, Vol. 6, pages 469 à 486) étudie d'une manière poussée les anomalies métaboliques communes à presque toutes les cellules cancéreuses, ainsi que le= facteurs causals éventuels de celles-ci.
Horrobin conclut qu'une anomalie métabolique dans la synthèse des prostaglandines thromboxane A2 (TXA2) et prostaglandine E. (PGE1) est le facteur final qui permet à une cellule cancéreuse amorcée d'exprimer son anomalie, c'est-à-dire de se diviser ad infinitum.
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Horrobin propose en outre (sur la base d'arguments 1 trouvés dans la littérature générale) que le défaut qui mène à l'anomalie dans la synthèse Je TXA2 et de PIGEZ est une inhibition de l'enzyme delta-6-désaturase.
Cette enzyme convertit l'acide gras essentiel, l'acide.
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linoléique (LA), en acide gamma-linolénique (GLA) dans @que toutes les cellules normales du corps. Le GLA est en 1 outre metabolic en acide dihomo-gamma-linolénique
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(DGLA), qui à son tour est converti en prostaglandines de la série 1, qui englobent la PGE1'
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La PIGE et leTXA sont dos régulateurs intracellulaires puissants de la biochimie de toutes les cellules normales. Toutefois, le TXA2 ne peut pas fonctionner en l'absence de PGE. Horrobin émrt l'hypothèse qu'un manque de PIGE et par conséquent du
TXA2 incapable d'agir provoqueront un métabolisme anormal de la cellule, d'une amplitude suffisante pour déclencher une division non contrôlée de cellules cancéreuses potentielles.
Horrobin suggère donc qu'entre autres un complément de GLA devrait être donné aux patients atteints d'un cancer et soumis à un traitement ordi- naire afin d'essayer cette hypothèse, à savoir qu'en évitant le blocage métabolique provoqué par une acti- vité inhibee de la delta-6-désaturase (d-6-d), il serait possible de normaliser les cellules cancéreuses par une transformation inverse.
Dans la demande de brevet européen nO 0037, Horrobin revendique un mélange de GLA et de thioproline pour le traitement du cancer.
Un but de la présente invention est de prévoir des compositions prophylactiques, des complé- \ ments alimentaires et des procédés pour la prévention \, du cancer, en prenant en considération la production d'un ou de plusieurs mélanges normalisés d'eicosanoldes.
Suivant l'invention, un procédé prophylac- tique pour la prévention de la multiplication de cellules cancéreuses viables comprend l'administration, sur une base régulière, à un être humain ou animal. ù'unt :'ll1anti- té prophylactique d'un ou de plusieurs précurseurs pour
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aa production in vivo d'un ou de plusieurs mélanges d'cicosanoides choisis parmi les mélanges d'eicosanoidcs suivants, à savoir
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<tb>
<tb> a <SEP> b <SEP> c
<tb> PGE1 <SEP> PGE2 <SEP> PGE
<tb> PGF1 <SEP> PGF2 <SEP> PGF
<tb> TXA <SEP> PGD2 <SEP> PGD3
<tb> Prostacycline <SEP> # <SEP> Prostacycline
<tb> TXA2 <SEP> TXA3
<tb> LTA3 <SEP> LTA4 <SEP> LTA5
<tb> LTC3 <SEP> LTB4 <SEP> LTB5
<tb> LTD <SEP> LTC <SEP> LTC
<tb> LTD4
<tb> LTE4
<tb>
EMI4.3
d'après le schéma suivant :
EMI4.4
<tb>
<tb> Elongase <SEP> Désaturase
<tb> C18:3, <SEP> #6 <SEP> # <SEP> C20:3, <SEP> #6 <SEP> # <SEP> C20:4, <SEP> #6
<tb> γ-Linolénique <SEP> Dihomo-γ- <SEP> Arachidonique
<tb> linolénique
<tb> # <SEP> #
<tb> PGE1 <SEP> PGE2 <SEP> PGE3
<tb> PGF <SEP> PGF <SEP> PGF
<tb> TXA1 <SEP> PGD2 <SEP> PGD3
<tb> Prostacy- <SEP> #17 <SEP> Proscline <SEP> tacycline
<tb> TXA2 <SEP> TXA3
<tb> LTA3 <SEP> LTA4 <SEP> LTA5
<tb> LTC <SEP> LTB4 <SEP> LTB
<tb> LTD3 <SEP> LTC4 <SEP> LTC5
<tb> LTD4
<tb> LTE4
<tb> C18:4 <SEP> #3 <SEP> # <SEP> C20:4, <SEP> #3 <SEP> # <SEP> C20:5 <SEP> #3
<tb> ostadéca- <SEP> Eicosa- <SEP> Eicosátétraénoïque <SEP> tétraénoïque <SEP> pentaénoïque
<tb>
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Dans la forme préférée de l'invention, le précurseur est choisi parmi les GLA, AA et EPA ou parmi leurs sels, dérivés et analogues.
Une telle administration n'implique pas d'effets secondaires défavorables, toxiques ou autres (par exemple les composés ne modifient pas la croissance des cellules bénignes).
La présente invention concerne uniquement l'utilisation prophylactique des substances pour le cancer et n'englobe pas le traitement d'un cancer -- - M pathologique déjà évident. D'une manière générale, lestraitements usuels du cancer, même s'ils pouvaient être utilisés prophylactiquement (en petites doses), provoquent un inconfort et une détresse extrêmes et pourraient même précipiter d'autres états cancéreux.
Contrairement aux hypothèses de Horrobin que le e GLA établit simplement le rapport entre la PGE et le TXA2 dans les cellules malignes, on a constaté à présent que l'effet de suppression de la prolifération du GLA (ainsi que du AA et du EPA) dépend de leur capacité de produire un certain nombre d'eicosanoldes et de composés apparentés ; par exemple, les PGA. et -ion plus PGD. ont un effet suppresseur de la prolifération plus important sur les cellules cancéreuses de l'être humain que la PGE.. La PGB-a un effet moindre tandis que d'autres prostaglanaines dérivées du GLA, y compris les PGF.etPGF, n'ont aucun effet sur la proliférala a tion des cellules cancéreuses humaines.
Dans une forme préférée de l'invention, on administre du GLA et/ou du Ab et/ou du EPA comme complé- 1 [ ; ment alimentaire, ces composés pouvant être présentés
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sous un certain. nombre de formes possibles, telles que, par exemple, des capsules, des comprimés ou d'autres formes pharmaceutiques usuelles, ou en un mélange avec des matières alimentaires, des boissons, etc. La quan- tité d'ingrédient actif dans ce complément, cette matière alimentaire ou cette boisson doit de préfé- rence ne pas dépasser une absorption moyenne de
100 mg d'ingrédient actif pour 100 kg de poids de corps.
L'invention peut également servir de procédé permettant d'éviter les effets. d'un manque de delta-6- désaturase chez des individus par ailleurs en bonne santé.
La d-6-d peut être stimulée par l'incorpora- tion de quantités relativement importantes d'acide omégù-6-linoléique ou d'acide oméga-3-linolénique dans les compositions de l'invention.
On notera que les sels, dérivés ou analogues chimiques intéressants des. substances susmentionnées entrent également dans le cadre de la présente inven- tion. En particulier, les sels de magnésium et de zinc sont importants.
La substance ou composition peut être amenée sous une forme posologique unitaire, par exemple pour une administration journalière ou deux fois par jour, telle que des comprimés ou des capsules. Dans chaque capsule, l'ingrédient actif peut être en solution,
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comme décrit ci-dessus, ou bien il peut être sous la forme d'un mélange du type comprimé ou particulaire, comprenant l'ingrédient dctif avec un diluant ou support.
Un dosage unitaire pour une administration journalière
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pour une personne de 50 à 100 kg, peut contenir jusqu'à
100 mg d'ingrédient actif, ce qui représente 5 à 10% de la dose recommandée pour le traitement d'un cancer pathologique, ce qui représente une différence dans l'ordre de grandeur.
Ce dosage unitaire journalier n'est pas intéressant pour le traitement des états cancéreux pathologiques. Le dosage préféré de la présente invention est également sensiblement plus ba. que celui utilisé pour le traitement de l'alcoolisme et d'autres maladies.
Des solvants intéressants pour les ingré- dients actifs sont des huiles végétales, des solu- tions salines isotoniques ou n'importe quel autre liquide ou solvant aqueux pharmacolcgiquement accep- talle. Les compositions de la présente invention peu- vent également contenir des dérivés de la vitamine A (pour des effets protecteurs contre le cancer de la peau), un complexe de vitamines B (comme co-facteurs), de la vitamine C (avec laquelle il semble y avoir un effet de synergie) ou de la vitamine E (qui sert également d'anti-oxydant). On peut ajouter à la composition des sels de zinc ou ce magnésium.
L'invention sera à présent décrite et illustrée à l'aide des exemples non limitatifs sui- vants.
Exemple 1.
Processus expérimental.
Matières : Acide qamma-linoléniciue (GLA ! On prépare l'acide gras GLA (Sigma L-2378)
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pour l'addition à un milieu de culture sous des conditions anaérobies par le procédé décrit par Ingerman- Wojenski et coll. (Prostaglandirs 1981 : 21, 655-664). On dissout l'acide gras chimiquement pur dans du Na2C03 0, l1 à une concentration de 10 mg/ml sous N.
Cette solution de base est conservée à - 80oC. Lorsque cela est requis. ce mélange ce base est à nouveau dilué avec du Na2C03 O, 1M à des concentrations en acide gras finaude l'ordre de 0,5 à 10 ug/ml. on ajoute ces concentrations finales au milieu de culture décrit ci-après, comme requis et après stérilisation par filtration sur millipore (type GS. dimension des pores de 0, 22 um).
Cellules.
Deux lignées cellulaires sont maintenues dans des récipients en matière plastique de Greiner (Labortechnik) dans du milieu de McCoys 5A (Flow Laboratories) contenant 10% de sérum de veau foetal (Flow Laboratories) et des antibiotiques (du Crystapène, c'est-à-dire de la benzyl pénicilline de sodium, et du Novostrep). Les cultures de base sent réalimentées deux fois par semaine et sous-cultivées tous les huit jours ou plus rapidement suivant les nécessités, c'est-à-dire lorsque la culture est épuisée. Les deux lignées cellulaires comprennent des cellules de mélanome de souris BL6 qui sont obtenues du Dr. C. Albrecht, Département de Pharmacologie, Université de Stellenbosch, et des cellules de rein bovin MDBK qui sont obtenues du Docteur D.
Verwoerd, Institut de Recherche Vétérinaire, Onderstepoort.
Expérience critique.
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Courbes de réponse à la dos0 de GLA.
Seize groupes indépendants de courbes
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de réponse b des dosas de GLA sont évalués par les deux processus standards suivants, c'est-à-dire : (i) en déterminant le comptage cellulaire total et la viabilité (n = 6) et (ii) en évaluant la prolifé- ration cellulaire par la détermination des vitesses de synthèse de l'ADN et dos protéines, et par l'utilisation de l'incorporation respectivement de thymidine (n = 5) et de méthionine (n = 5) radioactives Toutes les expériences sont réalisées par l'addition identique-et simultanée du GLA aux deux lignées cellulaires, en réalisant en tout 32 groupes de culture expérimentaux séparés.
Chacun de ces 32 groupes de culture comprend deux cultures témoins et une série de cultures contenant duu GLA. Les dosages en GLA pour le processus de comptage cellulaire sont respectivement de 0, 5,1, 2,3, 4,5, 6,7, 8,9 et 10 ug/ml. C'est ainsi que chaque groupe de culture comprend 13 expériences séparées. On utilise par conséquent en tout 156 cultures séparées pour déterminer les taux de croissance en fonction du GLA. Les dosages en GLA pour la thymidine et 14 méthionine sont deux témoins (sans GLA) et de 2, 3 6, 8 et 10 ug/ml. Chaque groupe de dosages est relise en double pour les deux lignées cellulaires. C'est ainsi que l'on utilise en tout 280 cultures séparées pour ces déterminations.
Pour un traitement statistique, une valeur moyenne de chaque dosage réalisé en double est n = 1.
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(ii) Protocole des courbes de croissance : Les cellules sont ensemencées dans un milieu de croissance standard (milieu McCoys 5A) à partir de cultures de base dans des récipients en matière plastique de 50 ml de Greiner à des densités sous-confluentes de
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5 5 l'ordre de 1 x 10 à 2 x l05cellules/récipient.
Après la fixation des cellules, c'est-à-dire après une période de 6 à 24 heures, on ajoute du GLA pour obtenir les concentrations finales décrites cidessus.
Les cultures témoins sont traitées de la marne manière à l'exception de l'omission du GLA.
Ces récipients de culture sont incubés dans une atmosphère humidifiée comprenant 5% de CC2 et 95% d'air à 370C pendant 7 jours. Après cette période, on détermine les comptages cellulaires et les viabilités, ces dernières par élimination du colorant trypan bleu.
(ii) Protocole de prolifération cellulair :. Pour la détermination de la synthèse d'ADN et des protéines,
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4 on ajoute 200 ul de suspension cellulaire (2, 4 x 104 cellules) à chacun des 12 puits d'une plaque Dynatech (icrotitre) (M 29 AR), cette opération étant suivie, après la fixation des cellules, d'une addition de GLA aux concentrations décrites ci-dessus. Les plaques sont incubées dans une atmosphère humidifiée à 5% de
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CO à 37OC. pendant les 24 dernières heures, on 3 ajoute 0 4 uci de [6-H]-thymidine ou luCi de L-[méthyl-3H]-méthionine (New England Nuclear, Boston, Mass) à chaque mélange d'incubation sur la microplaque. Les cellules sont ensu-e recueillies
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en utilisant un dispositif de récolte automatique Skatron sur des filtres de résine renforcée par de la fibre de verre.
Les filtres sont séchés et dissous
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TM dans 10 ml de Picofluor 30 (Packard). L'incorpora- tion de [6¯3a) -thymidine dans l'ADN et l'incorporation de L-[méthyl-3H]-méthionine dans les protéines sont comptées sur un compteur à scintillation Packard Tri-Carb.
Interprétation des résultats et analyses statistiques : En utilisant les valeurs des comptages cellulaires obtenus tels que décrits ci-dessus, la différence (h chaque comptage cellulaire par rapport à son témoin est exprimée en pourcentage du témoin. Lorsque les courbes de croissance sont répétées plusieurs fois pour chaque dose pour des cellules normales et cancéreuses, la valeur moyenne et l'erreur standard sont déterminées pour chaque dose. La signification statistique de la différence entre la réponse des cellules BL6 et MDBK au GU. est déterminée en utilisant l'essai en t de Student par paires. Pour une question de présentation, les différences de pourcentage sont exprimées par le pourcentage de réduction du taux de croissance (-%TC).
Résultats.
Courbes de réponse à la dose de GLA.
(i) Taux de croissance : La figure 1 et le Tableau I montrent le pourcentage de réduction des taux de croissance (-% ru) des cellules BL6 et NIDBK en réponse à des doses croissantes de GLA. On constate un pourcentage de réduction hautement significatif du point de vue statistique du taux de croissance des
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cellules cancéreuses DLG par rapport aux cellules MDBK normales avec chaque dose de GLA allant de
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1 0, 05 ng/ml (pO. Ol) à 10 ng/ml (p (0, 001).
La courbe de réponse à la dose reçue des cellules cancéreuses BL6 montre une progression graduelle du - % TC pour les doses de GLA allant de 0,5 og/ml à cnviron 7, 0 ug/ml. Aux doses de GLA supérieures à 7ug/ml, la courbe de réponse de croissance atteint un plateau A un-93TC d'environ 70%. Ceci suggère l'existence d'une courbe de réponse à la dose reçue, saturable. La réponse des cellules MDBK est singulière par le fait qu'il n'y a pas de réponse apparente à l'une quelconque des doses de GLA.
(ii) Prolifération cellulaire : L'effet en élevant les doses de GLA sur l'absorption de thymidine et de méthionine radioactives par les cellules BL6 et MDBK est représenté par le Tableau II et sur les figures 2 et 3. Comme attendu, ces réponses sont similaires aux réponses de croissance cellulaire respectives. Une réduction hautement significative
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cl point de vue statistique dans l'absorption de méthionine et de thymidine se produit chez les cellules BL6 malignes comparativement aux cellu es MDBK normales.
A un niveau de dose de GLA de 10 ug/ml, la réduction de l'absorption de méthionine et de thymidine par les cellules BL6 s'élève respectivement il 58. 9% et à 59, 1%.
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Tableau I
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Effet de l'augmentation des doses de GIA sur le taux de croissance des ¯¯ cellules ms n°¯ nr rv Mnr2 ;
f
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<tb>
<tb> Concentration <SEP> BL6 <SEP> MDBK
<tb> en <SEP> GLA, <SEP> g/ml
<tb> Taux <SEP> de <SEP> croissance <SEP> ¯ <SEP> erreur <SEP> Taux <SEP> de <SEP> croissance <SEP> ¯ <SEP> erreur
<tb> moyen,% <SEP> de <SEP> réduction <SEP> standard <SEP> sur <SEP> moyen <SEP> % <SEP> de <SEP> réduc- <SEP> standard <SEP> sur
<tb> par <SEP> rapport <SEP> au <SEP> témoin <SEP> la <SEP> moyenne <SEP> tion <SEP> par <SEP> rapport <SEP> la <SEP> moyenne
<tb> au <SEP> ténioin
<tb> .
<SEP> (-%TC)
<tb> 0,5 <SEP> 16,42 <SEP> 3,69 <SEP> -3,23 <SEP> 3,46
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 27,35 <SEP> 5, <SEP> 95-2, <SEP> 04 <SEP> 5,49
<tb> 2, <SEP> 0 <SEP> 34,87 <SEP> 6, <SEP> 57-1, <SEP> 56 <SEP> 7,27
<tb> 3,0 <SEP> 50,87 <SEP> 9,08 <SEP> 2,04 <SEP> 4,68
<tb> 4,0 <SEP> 54,3 <SEP> 6,39 <SEP> 3,3 <SEP> 5,89
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 54,68 <SEP> 10, <SEP> 75-0, <SEP> 69 <SEP> 3, <SEP> 21
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> 60 <SEP> 08 <SEP> 6,16 <SEP> 3,16 <SEP> 2,96
<tb> 7. <SEP> 0 <SEP> 68,23 <SEP> 3, <SEP> 62-2, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 81
<tb> 8, <SEP> 0 <SEP> 64, <SEP> 12 <SEP> 1,72 <SEP> 1,43 <SEP> 6, <SEP> 4
<tb> 9, <SEP> 0 <SEP> 70,08 <SEP> 4,55 <SEP> 2,1 <SEP> 4.31
<tb> 1D, <SEP> 0 <SEP> 68,43 <SEP> 7,04 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 4, <SEP> 56
<tb> @
<tb>
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Tableau 1 (Suite)
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Effet de l''t'j'n'nt. ition f's doses GLA ur le t.
Tjx d < 'crissQr. c les cellules malignes BLG et nornlales. N
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<tb>
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> GLA. <SEP> Valeur <SEP> p <SEP> Signification
<tb> g/ml
<tb> 0,5 <SEP> < <SEP> 0 <SEP> 01 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> (0, <SEP> 01 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 2,0 <SEP> (0, <SEP> 01 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 3, <SEP> 0 <SEP> < 0, <SEP> 001 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> < 0, <SEP> 001 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 3, <SEP> 0 <SEP> (0, <SEP> 001 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> < 0, <SEP> 001 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 7, <SEP> 0 <SEP> < 0, <SEP> 001 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 8, <SEP> 0 <SEP> < 0, <SEP> 001 <SEP> Hautement <SEP> significatif
<tb> 9, <SEP> 0 <SEP> < 0, <SEP> 001 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 10,
0 <SEP> < 0,001 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb>
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Tableau II Effet de l'augmentation des doses de GLA sur l'absorption de thymidine et de méthionine radioactives par les cellules BL6 malignes et MDBK normales
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<tb>
<tb> Concentration <SEP> en
<tb> GLA, <SEP> g/ml <SEP> BL6 <SEP> MDBF
<tb> Réduction <SEP> + <SEP> erreur <SEP> Réduction <SEP> d'absorp-+ <SEP> erreur <SEP> standard
<tb> d'absorption <SEP> standard <SEP> sur <SEP> tion <SEP> moyenne <SEP> (%) <SEP> sur <SEP> la <SEP> oyenne
<tb> moyenne <SEP> (%) <SEP> moyenne <SEP> Abscrption <SEP> de <SEP> thymidine
<tb> 2 <SEP> 34, <SEP> 85 <SEP> 5, <SEP> 19-16, <SEP> 53 <SEP> 10, <SEP> 51
<tb> 4 <SEP> 42,42 <SEP> 8, <SEP> 25-11, <SEP> 97 <SEP> 11, <SEP> 08
<tb> 6 <SEP> 45, <SEP> 69 <SEP> 4, <SEP> 73 <SEP> -17, <SEP> 79 <SEP> 9,
<SEP> 87
<tb> 8 <SEP> 46, <SEP> 34 <SEP> 7, <SEP> 62-21, <SEP> 8 <SEP> 6, <SEP> 15
<tb> 10 <SEP> 59, <SEP> 09 <SEP> 8, <SEP> 44-7, <SEP> 3 <SEP> 12, <SEP> 34
<tb> Absorption <SEP> de <SEP> méthionine
<tb> 2 <SEP> 25,93 <SEP> 7,97 <SEP> -25,08 <SEP> 11. <SEP> 82
<tb> 4 <SEP> 44,05 <SEP> 8, <SEP> 91-11, <SEP> 78 <SEP> 8, <SEP> 53
<tb> 6 <SEP> 51,94 <SEP> 8, <SEP> 97-19, <SEP> 11 <SEP> 13, <SEP> 35
<tb> 8 <SEP> 55,65 <SEP> 9, <SEP> 11-3, <SEP> 93 <SEP> 10,28
<tb> 10 <SEP> 58. <SEP> 88 <SEP> 3, <SEP> 03-1, <SEP> 49 <SEP> 7,26
<tb>
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Tableau II (suite) Fffot d < ? l'aofjrrenf-atior. des dosf's de CLA s'.) r l'absorption de thy iin ; et de ntéthionine radioactives par les c"H. uls BL6 malignes et M. !'K nr'-. ales.
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<tb>
<tb>
Concentration <SEP> en
<tb> GLA1 <SEP> g/ml <SEP> valeur <SEP> p <SEP> Signification
<tb> Absorption <SEP> de <SEP> thymidine
<tb> 2 <SEP> < 0,01 <SEP> hautement <SEP> significative
<tb> 4 <SEP> < 0,01 <SEP> hautement <SEP> significative
<tb> 6 <SEP> < 0,01 <SEP> hautemant <SEP> significative
<tb> 8 <SEP> (0, <SEP> 01 <SEP> hautement <SEP> significative
<tb> 10 <SEP> < 0,01 <SEP> hautement <SEP> significative
<tb> Absorption <SEP> de <SEP> méthionine
<tb> 2 <SEP> < 0,01 <SEP> hautement <SEP> significative
<tb> 4 <SEP> (0, <SEP> 01 <SEP> hautement <SEP> significative
<tb> 6 <SEP> 40, <SEP> 01 <SEP> hautement <SEP> significative
<tb> 8 <SEP> < 0,01 <SEP> hautement <SEP> significative
<tb> 10 <SEP> < 0,01 <SEP> hautement <SEP> significative
<tb> .
<tb>
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Exempte 2.
Processus expérimental. rets GLA : On dissout du GLA (Sigma-2J78) dans du carbonate de sodium sous N, comme décrit ci-dessus dans late de sodium sous N 2' l'exemple 1. On utilise une dose de GLA de 20 g/ml tout au long de ces expériences. On réalise ceci en ajoutant 20 ni de GLA dans du carbonate de sodium de base (10 mg/ml) directement à chaque flacon de GLA contenant 10 ml de milieu de culture. Pour contrôler le flacon, on ajoute 20 l du véhicule de carbonate de sodium.
Cellules Cellules: On utilise des cellules de carcinome primaire humain du foie, ces cellules étant obtenues du Dr. J. J. Alexander de la Division de Virologie, Département de Microbiologie, Medical University of South Afrca. Ces cellules sont maintenues dans des récipients en matière de Grenier dans du milieu de McCoys 5A, comme décrit dans l'exemple 1.
Protocole de taux de croissance.
Les cellules sont ensemencées dans le milieu de croissance standard à partir de cultures de base dans des récipients en matière plastique de 50 ml de Grciner à des densités sous-confluentes de l'ordre de 2 x 105 à 3 x 105 cellules par récipient.
Après la fixation des cellules (6 heures), on ajoute 20 g/ml de GLA dans du carbonate de sodium aux récipients au GLA tandis que l'on que du carbonate de sodium aux récipients témoing. Ces récipients de culture sont incubés dans une atmos- phère humidifiée composée de 5% de CO2 et de 95%
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d'air à 37 C. A la fin de chaque expérience, les ccllulcs mortes, détachées sont cartes avec le n'. iliou or culture. Les cellules fixées, vivantes sont
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trypsiniF0es et ensuite comptees en utilisant un t compteur Coulter. La viabilité des cellules est vérifiée par l'élimination du colorant trypan bleu.
De plus, les récipierts de culture sont examinés et photographiés chaque jour sous un microscope à phase inversée du type pour diapositives Nikon. Pour déterminer l'effet de la durée du traitement au GLA, on adopte deux processus différents.
(i) Effet d'une dose journalière : On modifie quotidiennement le milieu de culture et on ajoute du nouveau GLA chaque jour. On photographie les cellules et on les compte le premier jour, le second jour, le troisième jour et le quatrième jour (essai 1 : n = 4 pour le-GLA, et les témoins chaque jour). On répète le processus le quatrième jour : (essai 2 : n = 4 pour le GLA et les témoins).
(ii) Effet d'une dose unique : On ajoute une dose de GLA aux récipients au GLA (n = 8) et une dose de carbonare de sodium aux témoins (n = 8) le premier jour de l'expérience. Les cellules sont comptées après 4 jours de culture.
Résultats : Effets d'une duse journalière Le Tableau III montre les effets d'une dose journalière de GLA sur le taux de croissance de cellules d'hépatome humain. La réduction moyenne du taux de croissance dans les flacons au GLA comparativement aux flacons témoins est de 66% le deuxième jour, de
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78-lu troisième jour et de 87% et 78 le qutrième jour respectivement pour l'essai 1 et l'essai 2. Les valeurs moyennes et les erreurs standards moyennes pour l'essai 1 sont représentées sur la figure 4.
Celle-ci montre le taux de prolifération normal des cellules témoins non traitées. Il y a une efficacité d'étalement d'environ 35% et un doublement d'efficacité tous les deux jours, qui sont considérés comme étant caractéristiques pour cette lignée de cellules d'hépatome. Par contre, il y a une diminution statistiquement hautement significative du taux de croissance des cellules traitées au GLA comparativement aux cellules témoins. Les différences suivantes sont enregistrées après trois jours entre les cellules traitées au GLA et les cellules témoins à des grossissements de 100 x et de 200x. Les cellules témoins sont distribuées uniformément dans le flacon.
Par contre, il y a des zones importâmes avec une croissance cellulaire nulle dans les flacons traités au GLA et les cellules visualisées sont de loin moins nombreuses, moins denses et diffèrent sensiblement des cellules témoins et de celles rapportées comme étant caractéristiques de cette lignée cellulaire.
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Tak r I.
Effet de l'apport joti-rnali, : r s-, jr le t ; a,-jz de croissance de cellules d'hépaton'e hurin en culture.
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<tb>
<tb>
Jour <SEP> de <SEP> l'expérience <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules <SEP> au <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> cellules <SEP> tésoins
<tb> GLA <SEP> (x104) <SEP> (x <SEP> 104)
<tb> Moyenne <SEP> ¯ <SEP> erreur <SEP> Moyenne <SEP> n <SEP> = <SEP> 4 <SEP> + <SEP> erreur
<tb> n <SEP> = <SEP> 4 <SEP> standard <SEP> standard
<tb> sur <SEP> la <SEP> sur <SEP> la
<tb> Moyenne <SEP> ¯ <SEP> erreur <SEP> Moyenne <SEP> n <SEP> = <SEP> 4 <SEP> ¯ <SEP> erreur
<tb> n <SEP> = <SEP> 4 <SEP> standard <SEP> standar
<tb> sur <SEP> la <SEP> sur <SEP> la
<tb> moyenne <SEP> moyenne
<tb> 1 <SEP> 8,12 <SEP> 0,88 <SEP> 5,63 <SEP> 1,08
<tb> 2 <SEP> 3,79 <SEP> 0,39 <SEP> 11, <SEP> 25 <SEP> 0,73
<tb> 3 <SEP> 3,35 <SEP> 0,29 <SEP> 15,42 <SEP> 0,87
<tb> 4 <SEP> essai <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 96 <SEP> 0,47 <SEP> 23,44 <SEP> 1,83
<tb> 4 <SEP> essai <SEP> 2 <SEP> 7,25 <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> 32,5 <SEP> 1,
96
<tb>
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Tableau III (suite) Effet de l'apport journalier d'acide gamma-linolenique sur le taux de croissance de cellules d'hépatome humain en culture.
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<tb>
<tb>
Jour <SEP> de <SEP> l'expérience <SEP> Réduction <SEP> du <SEP> taux <SEP> de <SEP> Valeur <SEP> p <SEP> Signification
<tb> croissance <SEP> (%)
<tb> 1-44 <SEP> -44) <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> non <SEP> significatif
<tb> 2 <SEP> 66/0, <SEP> 01 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 3 <SEP> 78 <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 4 <SEP> essai <SEP> 1 <SEP> 87 <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb> 4 <SEP> essai <SEP> 2 <SEP> 78. <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> hautement <SEP> significatif
<tb>
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Lfot t-t'une rione unique : Apres 4 jours, le comptage ccllulnire, après une seule dose do CLA le premier jour, 4 + est de 19, 81 x 10 - 4,85 et de 2. 18 pour les témoins.
Il n'y a pas de différence significative entre les toux de croissance des cellules au GLA et des cellules témoins.
Les résultats des exemples 1 et 2 montrent que pour les cellules de mélanome de souris et les cellules de cancer humain l'apport in vitro de GLA produit une diminution statistiquement significative du taux de croissance des cellules cancéreuses. C'est ainsi qu'en maintenant le niveau de GLA à une certaine valeurs on empOche la multiplication non contrôlée de cellules cancéreuses en puissance.
Contrairement à la réponse des cellules de mdanome de souris à une dose unique de GLA, les cellules d'h6atome humain paraissent devoir requérir
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un apport répète de GLA pour produire un effet similaire.
Exemple 3.
Méthodes et mërières.
Cellules : Les cellules de sarcome d'ostéolde MG63 sont obtenues des Flow Laboratories. Les cellules de carcinome oesophagien sont obtenues du Professeur J.
Alexander du Département de Microbiologie de Mcdunsa.
Les cellules de rein bovin bénignes témoins (MDBK) sont de la même origine que celles utilisées dans les exemples précédents.
Techniques : Les techniques utilisées pour faire croître les cellules en culture. pour amener un apport de GLA aux milieux de croissance et pour obtenir des comptages cellulaires sont similaires à celles rapportées dans les
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exemples précédents.
Résultats Cellules de sarcome d'ostéolde MG63 : D'après la figure 5, on peut voir que l'apport de GLA des milieux de culture de cellules MG63 provoque un effet d'arrêt de la croissance statistiquement hautement significatif de ces cellules comparativement à la croissance des cellules MG63 sans apport de GLA (Tableau IV) : Après 7 jours de culture qui suivent un apport journalier en GLA, le nombre moyen de cellules MG63 s'est élevé de la densité d'ensemencement initiale de 0, 3 x 106
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cellules à 0, 56 x 10 L nombre de moyens do cellules MG63 t6moine non traitées augmente de 0, 3 x 106 à 2, 3 x 106 cellu- les sur la intme période de temps.
Cette différence de taux de croissance représente un effet de suppression de croissance de 76% pour les cellules MG63 avec un apport de GLA sur la période expérimen tale de 7 jours.
Le nombre moyen de cellules MDBK témoins avec un apport de GLA, à l'opposé des cellu'Xs MG63, excède le nombre moyen de cellules MDBK sans apport à la fin de la période de 7 jours.
Cellules de carcinome oesophagien. : La figure 6 montre le taux de croissance de cellules de carcinome oesophagien après un apport dans leur milieu de croissance de 10 g de GLA par jour pendant 6 jours comparativement à la croissance de cultures témoins de cellules de carcinome oesophagien sans apport. Le nombre moyen de cellules s'élève du nombre d'ensemencement initial
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de 0, 14 x 106 à 6, 62 x 106 après 8 jours de culture (Tableau IV). Par contre, le nombre moyen de cellules
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uvcc j. ppcrt- df GLA passe de 0, 14 x 10 il sculencnt x 04 ccol lules sur la mOrne période de temps. on a constaté que cet effet supprcsseur de croissance de 69% è la fin de la période de 8 jours était statistiquement hautement significatif.
Un effet suppresseur de croissance statistiquement significatif provoqué par le GLA des cellules de carcinome oesophagien devient évident à partir du sixième jour de culture (Tableau IV). exempl e 4, Processus expérimental.
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atièrc : GLA : On dissout du GLA (Sigma-2378) dans du carbonate de sodium sous N,comme décrit dans les exemples 1 et 2. Une doss'de GLA de 20-pu cb GLA dans du carbo- nate de sodium est directement ajoutée à chaque flacon contenant 10 ml de milieu de culture. On ajoute uniquement 20 ¯l du véhicule de carbonate de sodium aux flacons témoins.
Cellules On maintient ces cellules de mélanome de souris BL6 malignes dans des flacons ou récipients de matière plastique de Greiner (Labortechnik) contenant 10 de sérum de'.'eau f. oetal (Flor Laboratories) et des antibiotiques. Les cultures de base sont réalimentées 2 fois par semaine et sont sous-cultivées à des intrrvalles d'une semaine ou plus rapidement suivant les nécessités. Les cellules de mélanome de souris BL6 proviennent du Dr. C. Albrccht, Département de Pharmacologie, Université de Stellenbosch.
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rrccsun.
On ensemence des cellules de mélanome BL6 dans des milieux de croissance standards à partir de cultures de base dans des récipients de matière plastique de Grciner de 50 ml pour donner rlas densités sousconfluentes de 500, 1000 et 2000 ceJlL-les/récipient. On réa lise l'expérience en double pour les trois densités. Après la fixation des cellules (24 heures), on ajoute du GLA aux milieux de croissance dans bs récipients de manière à obtenir la ""'ncc : 1tration finale de 20 pg/ml.
On remplace chaque jour les milieux de croissance et on ajoute chaque jour du GLA pendant deux semaines. On traite les cultures témoins d'une manière identique excepté le fait que l'on n'ajoute pas de GLA.
Les récipients de culture sont incubés dans une atmosphère humidifiée composée de 5% de CO et de 95% d'air à 37OC. A la fin de-la période de deux semaines, on colore les récipients de culture en utilisant une solution de coloration d'Amidoschwarz à 0. 1%.
Résultats : Au bout des deux semaines, les cellules de mélanome ensemencées initialement comportent des colonies établies de différentes dimensions dans les récipients de culture témoins. La concentration la plus dense de colonies apparaît dans les récipients dans lesquels 2000 cellules ont été ensemencées. Par contre, par une seule colonie n'a pu être observée après deux semaines dans les récipients de culture traités au GLA, que ce soit dans les récipients avec 500, 1000 ou 2000 cellules ensemenacées. La croissance et la prolifération des cellules de mélanome BL6 malignes sont par conséquent compic-tomcnt
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nprt. t : ' : ! p.'r t'upport de GL.
J, si (.'suçais de cct : tc t'xpcricncc sont analysés et < '. '- tcteur ressortent dos icHul tats : d'abord, ils contirment que la maligninité dans ce type do cellules particulier dépend du manque de GLA. En deuxième lieu, l. i croissance de ces cellules malignes peut être complètement supprimee par la présence de GLA.
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Tableau IV : Effet de l'apport journalier de GLA sur le taux de croissance de cellules MDBK bénignes, de cellules de sarcome d'ostéoide MG63 et de cellules oesophagiennes humaines en culture.
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<tb>
<tb>
Type <SEP> de <SEP> cel-6
<tb> lules <SEP> et <SEP> den- <SEP> Jour <SEP> Comptage <SEP> cellulaire <SEP> (n <SEP> = <SEP> 4) <SEP> (x <SEP> 10@)
<tb> sités <SEP> d'ense- <SEP> de
<tb> mencement <SEP> culture
<tb> (x <SEP> 106) <SEP> Témoins <SEP> + <SEP> GLA
<tb> Moyen- <SEP> ES <SEP> Moyen- <SEP> Es <SEP> p <SEP> Sign
<tb> MDRX <SEP> ne <SEP> ne
<tb> 0. <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 41 <SEP> 0. <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 43 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> > 0, <SEP> 05 <SEP> ns
<tb> 3 <SEP> 0, <SEP> 76 <SEP> 0,003 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0. <SEP> 05 < > 0,01 <SEP> fs
<tb> 6 <SEP> 1. <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP> 1, <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> < 0.
<SEP> 01 <SEP> hs
<tb> 7 <SEP> 1,3 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 1, <SEP> 81 <SEP> 0,01 <SEP> < 0, <SEP> 01 <SEP> hs
<tb> MG63
<tb> 0,3 <SEP> 2 <SEP> 0,21 <SEP> 0,02 <SEP> 0,19 <SEP> 0,008 <SEP> < <SEP> 0,05 <SEP> ns
<tb> 3 <SEP> 0, <SEP> 41 <SEP> 0,04 <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 007 <SEP> 0. <SEP> 05 < <SEP> > 0, <SEP> 01 <SEP> fs
<tb> 4 <SEP> 0, <SEP> 69 <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP> 0,48 <SEP> 0,018 <SEP> 0,05 < <SEP> > 0,01 <SEP> fs
<tb> 7 <SEP> 2, <SEP> 34 <SEP> 0. <SEP> 14 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> 0. <SEP> 034 <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> hs
<tb> Carcinome
<tb> oesophagien
<tb> 0, <SEP> 14 <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP> 0. <SEP> 02 <SEP> > <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> ns
<tb> 3 <SEP> 0, <SEP> 22.
<SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> > 0, <SEP> 05 <SEP> ns
<tb> 4 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> > 0, <SEP> 05 <SEP> ns
<tb> 5 <SEP> 1, <SEP> 07 <SEP> 0, <SEP> 16 <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> > 0, <SEP> 05 <SEP> ns
<tb> 6 <SEP> 2. <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 19 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 0. <SEP> 12 <SEP> < 0, <SEP> 01 <SEP> hs
<tb> 7 <SEP> 4, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 1. <SEP> 82 <SEP> 0,21 <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> hs
<tb> 8 <SEP> 6,62 <SEP> 0. <SEP> 35 <SEP> 2, <SEP> 04 <SEP> 0,19 <SEP> < <SEP> 0,01 <SEP> hs
<tb>
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es s. os : HS- : : rrour standarù = lignification ns. = non significatif fs. = faiblement significatif hs. = hautement significatif
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Excms 5.
Des cellules de sarcome ostéogènes humaines sont ensemencées dans des récipients de matière plastique de Greiner de 50 ml et maintenues exactement comme expliqué dans l'exemple 4.
Les cellules sont cultivées pendant trois semaines en présence : i) du milieu de croissance uniquement-témoin ; ii) du milieu de croissante et de 10 ¯l de Na2CO3/ ml ajoutés tous les deux jours ; iii) du milieu de croissance et de 20pg de
AA/ml de milieu ajoutés tous les deux jours ;
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iv) du milieu de croissance et de mg d'acide linoloique/ml de milieu ajoutés tous les deux jours ; v) du milieu de croissance et de mg d'acide oléique/ml ajoutés tous les deux jours ; vi) du milieu de croissance et de 20 pg de GLA/ml ajoutés tous les deux jours ; vii) du milieu de croissance et de 5 pg de PGE1/ml ajoutés tous les deux jours ; viii) du milieu de croissance et de 5 pg de PGAl/ml ajoutés tous les deux jours ; ix) du milieu de croissance et de 5 ¯g de PGFla/ml ajoutés tous les deux jours.
A la fin des trois semaines, on colore les.
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R- -p. : lt : t. n i L n a pé r i o cellules de sarcome ose nsemcnce'- s init : iie- ment ont des colonies établies de différentes dimensions recouvrant presque le fond entier dns récipients de culture, que ce soient les récipients témoins ou les récipients additionnes de Nazca
Les cultures additionnées d'acide linoléique atteignent environ 75% de la croissance des cultures témoins. Les cultures avec apport d'acide oléique atteignent environ la même croissance que les cultures témoins.
Les cultures au PGE et PGAj. atteignent environ de la croissance des cultures témoins.
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Les cultures à la PGFla atteignent environ la la même croissance que les cultures témoins.
Les cultures avec apport de GLA et de AA
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sont complètement dépourvues de coutes colonies, sont complèll qu e ce soit dans les cultures d'une densité de 500, de 100 ou de 2000 cellules.
Les résultats montrent que l'acide oléique n'a pas d'offet suppresseur sur les cellules cancéreuses et que l'acide linoléique, acide gras précurseur de prostaglandines, a un certain effet suppresseur de croissance sur les cellules cancéreuses en culture (à cause de son effet stimulateur sur la d-6-d). La PGE et la PGA ont un effet suppresseur de crcissance plus prononcé tandis que la PGF la nta pas d'effet du tout sur la croissance des cellules cancéreuses. Par contre, le GLA et le AA, produits
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.'"'"'./.. ;'- : : 'tr js ; "i :)''r' rn pucursurs et :"t'..'t :.
Jin, ont-un c : d : suppresseur rio- --.-.'.-'--.-t. l. t.'.'p rulLts llssricnt supposer qu'une d ion cellulaire non contrôlée de cellulr cancér'. : p. pourrait Ctre le résultat d'anomalies dans la concentration de ces des prostaglandines de ces eclltilos, prcvenant-n blocage dans leur syn-
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alèse h tartir clefs acides gras précurseurs. Ces anomalies sent évidemment éliminées par Ut : apport de GLA ou de AA aux cellules cancéreuses, le substrat à partir duquel les prostaglandines requises peuvent @tre synthétisées à leur s concentrations requises.
Une fois que ceci peut être réalisé par les cellules cancéreuses, leur division non contrôlée est apparem- ment totalement contrôlée.
Il y aurait donc de fortes présomptions pour que l'on puisse utiliser le GLA et/ou le AA comme substances prophylactiques contre le cancer.
Exemple6.
Compte tenu de l'observation surprenante rapportée dans l'exemple 5, qu'un apport d'acide arachidonique (AA) è raison de 40 g/ml de milieu de cellules de sarcome ostéogènes MG63, supprime tota- lement la prolifération et la formation de colonies des cellules en culture, on répète cette expérience afin de confirmer l'observation en question. De plus, l'effet d'un apport d'acide eicosapentaénoîque (EPA), irm0diaire d'acide gras essentiel, précurseur des prostaglandines de la série 3, de It prosta-
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c'.'cline, du thromboxane A3 et des leukotriènes, Åa des cellules cancéreuses est également examiné. L'EPA
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rovir.t.l'acideA-lincti.-ni')'.-'(CLP:), nci.J'"'tQgcnticid'ori'finnturn''.-,q'ji;i li de-1 d-G-d donnf d l'acide r-rt : adcat : t' : tr.. r.
(jlquc (C 18 : 4 3),""shit un Inngrnt de ch'nr en dcnant Cc l'arid0 iccsat6tr6norqu2 (C20 : 4 \'.'3), qui à son tour donne lieu à l'acide eicosatétraénoîque après action de la delta-5désaturase. processus :
On ensemence des cellules de sarcome ostéogènes humaines MG63 dans des récipients de culture, comme décrit dans les exemples 4 et 5. On ensemence 2000 cellules dans chaque récipient. On utilise des groupes de récipients en double pour chacun des
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acides gras essayés. Les acides gras suivants ac. dissous dans un milieu de croissance standard sont ajoutés ux cellules en culture, après une période
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1 ules, ct à de deux jours peur la fixation des cellules, et 3 -rois jours. nouveau après une nouvelle période de trois jours.
Chaque culture ne présente par conséquent que deux additions de lacide gras concerné. Les cellules sont colorées et examinées après 7 jours de culture : 1. Milieu de culture uniquement-témoin.
2. Respectivement 5, la, 20, 40, 60, 80 et 100 pug d'acide oléique/ml de milieu de culture. [L'acide
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oléique (OA) est un acide gras en C18 avec une, liaison insaturée en position oméga-9. Il est par conséquent structurellement presque identi- que à l'acide linoléique (LA) ou à l'acide alinolénique (ALA), à la seule exception du nombre de doubles liaisons contenues dans la
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' !'c !. ! l. Compte tenu de cttc différence, ''OA. l'oppose du LA et du ALA. no peut pas nnr liu ucs cicosanoîdcs (PC'S, LT, S, XA' ot prrtacyclinc). IL cs par conséquent, considéré comme étant un excellent acide gras :'1 tlLliscr comme témoin lorsque l'on examine les rffots des cicosanoides].
EMI32.2
3. Respectivement 5, 10, 20, 40, 60, 80 et 100 pg de LA/ml de milieu de culture.
4. Respectivement 5,10, 20,40, 60, 80 et 100 ug dus mol de milieu de culture.
5. Respectivemetn 5,10, 20, 4C, 60,80 et 100 ug de AA/ml de milieu de culture.
@. Respectivement 5, 10, 20, 40,60, 80 et 100 ug @@ EPA /ml de milieu de culture.
7. Respectivement 5, 10 20,40, 60, 80 et
100 . de GLA/ml de milieu de culture.
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F.'. ult-'-s : 1. Los cellules avec apport de OA atteignent des densités égales de colonies pour tous les niveaux d'apport se situant entre 5 et 100 g/ ml, comme dans le cas des témoins contenant uniquement du milieu de culture.
2. Les LA et ALA ont une activité de suppression de prolifération définie aux niveaux supérieurs
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d'port, c'est-à-dire à 80 et 100 ng/ml.
3. L EPA, AA et GLA montrent une action de suppression progressive, égale sur la proliaération et la formation de colonies des cellules de carcinome ostéogèncs.
4. Les CPA, AA et GLA suppriment totalement la
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croissance-cellulaire et la formation de colonies à des niveaux d'apport au-dessus de
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40 t-/ml de milieu de culture.
Aucune cellule ou colonie de cellules n'a pu ôtre trouvée lors de l'examen microscopique des cultures qui ont été additionnes de EA, de AA ou de GLA à des taux d'addition se situant entre 40 et 100 g/ml
Il apparait, par conséquent, que les trois intermédiaires d'acides gras précurseurs, à savoir les GLA, AA et EPA, qui donnent lieu chacun à une famill- séparée d'eicosanoïdes, ont la capacité d'arrêter individuellement et du supprimer la croissance des cellules cancéreuses. Il apparaît en outre que l'un quelconque de ces acides gras précurseurs d'eicosanoîdes pourrait être utilisé
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'h. lactproobylactiquement séparément ou en combinaison contre le cancer.
Il doit etre entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.