HUT57599A - Process for producing tgf-beta-compositions - Google Patents

Description

Találmányunk az átalakító növekedési faktor ftW/ji gyógyászati aktivitásának fokozására vonatkozik, valamely szinergetikusan hatásos mennyiségű többszörösen telítetlen zsírsavval /PUPA/ történő együttes adagolás útján· Aa átalakító növekedési faktor előnyös formája a 1 TGF-/Í vagy TGF-/31 típus·

A humán TGF-y) ismert vegyület, amelyet emberi vér lemezkékből és méhlepényből izoláltak és szekvenciális gélssUrés, kationcserélő kromatográfla és nagy teljesítőképességű, folyadék-kromatográfia /HPLC/ segítségével lényegében homogenitás eléréséig tisztítottak· A tisztított fehérje molekulatömege 25 000 dalton és két, egyenként 12 500 dalton molakúlatönaegti, biszulfid-kötések által összekapcsolt alegységből áll· A tisztított fehérje molekulatömege, alegységszerkezete és aminosav-összetétele különbözik a vérlemeskékből 1·szármáztatható növekedési faktor megfelelő értékeitől /lásd aa 1984. december 19-én kösrebocsájtott 128 849 ez· európai szabadalmi bejelentést/·

A TGF-γ* vérlemezkékből vagy kondicionált közegekből történő másik tisztítási módszere során savas-etanolos extrakeiót alkalmasnak, as extraktumot kationcserélő elválasztásnak vetik alá, majd az aktív frakciókon hidrofób szétválasztásokat végeznek el /lásd az 1989· július 12-én közrebocsájtott 323 842 sz. európai szabadalmi bejelentés/· Az irodalom szerint a tiastitott termék a sebek gyógyulásánál és szővetregenerálódáanál alkalmazható.

Rekombináns DUS-technológiákat alkalmazó TGF-^1 előállítási eljárást a 61219395 ez· japán szabadalmi bejelentés • · ·

- 3 ben /közreboosájtáe időpontja 1966· szeptember 29| amerikai egyeaÜlt államokbeli elsőbbség 1985· március 22·* elsőbbségi irat számai 85-715142; a bejelentést a Genentech· Inc· oégre ruházták át/ és a 63028366 sz· japán szabadalmi bejelentésben /közrebocsájtás napjai 1988· február 06j a bejelentést az Aeahi Ghemical Industry Oo. Ltd. oégre ruházták át/ Írtak le· Mindkét közrebocsájtett szabadalmi bejelentésben a TQP-/)l-t kődolő húsán gén klónozását és eukarióta sejtekben történő kifejezését ismertették·

A WO 8911293 ez· PCT szabadalmi bejelentésben /közrebocsájtás napjai 1989· november 30·) a bejelentést a Geaentech· Inc· oégre ruházták át/ TQF-fi és lnzulinszerü növekedési fektor-1 kombinációjónak a sebgyógyitásban történő felhasználására tettek javaslatot·

A 269 408 az. európai szabadalmi bejelentésben /közreboosájtáa napjai 1988· Július l.j a bejelentést a Genentech, Inc· oégre ruházták át/ TGP-y) gyulladásos rendellenességek /pl· reumátóid arthritis, gyulladásos bélbetegség, szisztémás lupus erythematosus stb·/ kezelésére történő felhasználását ismertették·

A TGFyj 1-tipusa /TGF-/A/ minden emlős szövetben előforduld többfunkoiós fehérje, amely a fejlődés, növekedés, az imunrendazer működése és karoinogenézis szabályozásában játszik szerepet· Bár a TGF/ίΙ in vivő serkenti a sebgyógyulást, e növekedési faktor sok sejt-típus növekedését in vitro gátolja· Ezenkívül a TGF-^l-re adott sejtnövekedési reakció in vitro mind a sejttípustól, mind a tenyésztési körülményektől függ. A TGF-/31 karcinőma és melanőma sejtek növekedését gátlő hatása különösen jelentős, minthogy

- 4 • faktor kemoterápiáa ezerként történő esetleges felhasználását sugallja· Bgy nemrég nyilvánosságra hozott tanulmány szerint a TGP^jl athyaikus egéren aa A549 tUdőkarclnŐBa tumor növekedését 60 %-ban gátolja /‘Pwardsik és teáit J. Háti· Canoer Inat. 81. 1182-1185 /1989/J· k ΪΟΙ-/31 sajtnövekedésgátló hatásának pontos mechanizmusát azonban még non tárták föl·

Ismeretes, hogy · többszörösen telítetlen zsírsavak /PUFA-vegyUletok/ tumorsejtekkel szemben citotoxikus hatást fojtanak ki· YeltÓtelesésok sssrlnt a hatás a vegyöletek peroxld gyökök termelését serkentő tulajdonságán alapul· így Bogin és teái /“Journal of the Kationéi Canoer Inotitute, 80, No· 3, 188-194 /1988· április/_7 mámon 2, 4, 5 és 6 kettőskötést tartalmasé zsírsavat vizsgáltak és a gamma-linolenáttal /3 kettőskötés/ hasonlították össze· As eredmények azt mutatták, hogy a PUHA ráksejteken oitotoxioitáat előidéző hatékonysága a tiobarbltúrnavval reagáló intracelluláris anyagtartalommal függ össze· A 3 Illetve 4 kettőskötést tartalmasó gamma-linolenát és arachidonát mutatja a legmagasabb oitotoxloitást és a tiobarbitursav teást során os a két vagyölet szolgáltatja a legmagasabb összefüggést· A tanulmányban leírt valamennyi vizsgálatot TQP-/31-tartalmú szérum Jelenlétében végesték el· £ ssorsőcsoport korábbi közleményében hasonló hatásról számolt be /“Journal of the Kationéi Cancsr Instituto, 77. No. 5, 1054*1062 /1986· november/^· Aa említett tanulmány továbbá igazolta, hogy a PUFA által előidézett citotoxioitás tumoraejtekre viszonylag specifikus· A zsírsavak a tumorsejtokét elpusztító koncentrációban az átalakitatlan illetve normál sajtok növekedésére egyáltalán nem vagy csak kis mértókban hatottak·

Minthogy a TGP-/>l-re adott sajt reakció a aséruaban jelenlevő sás faktorok /pl· növekedési faktorok éa rotinoáldok/ jelenlétében változik, a TQP-/31 hatásának meghatáro* adódra irányuld vizsgálatokat széruanentes körűiményak között oélaserU elvégezni· A jelen találmány kidolgozása során aa A549 humán tudőkaroinóma, a MOP-7 humán eerőkaroinóma és Blé egér mlanóma sejtek rögzítés /anchorage/ függő növeke* dósénak visegálatáhos javított saórunaentos táptalajokat alkalmazunk· A vizsgálatok során azt találtuk, hogy a karol* néma ée melanóms sejtek növekedésének TGP-/>1 által előidézett gátlása a PUPA-vegyületek jelenlététől függ.

Találmányunk tárgya átalakító növekedési faktor /»!-» /TGP-/3I/ és valamely többszörösen telítetlen ssirsavat /PUPA/ és/vagy származékát tartalmazó kompozíciók· Találmányunk tárgya továbbá e kompozioiÓk felhasználása gyógyászati kéasitaények előállítására·

Azt találtuk, hogy egy vagy több bizonyos, as alábbiak bán meghatározott PUPA jelenléte a TQP-^1 tumornövekedést gátló tulajdonságait saínrgetikusan fokozza éa ez irreverzibilis növekedésgátláshoz valamint sejtpusztuláshoz vezet· A találmányunk alapját képező színergizmua bizonyos tumorok esetében retinoidok /pl· rétinsav vagy a 4 326 055 sz* amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismerte* tett retinoidok/ hozzáadásával továbbiokozható· A PUPA-vegyIlletek az dtalakitatlan sejtek növekedésének TGP-/J1 által történő gátlását nem potencirozzák és ez a folyamat reversibilis· A leírásban használt PUPA kifejezés egyetlen

PUPA-vegy Illatra valamint két vagy több különböző PUTA-vagy Illet keverékére egyaránt vonatkozik·

Az ábrák leírása

1. ábra· A549 sejtek rögzítés /anohorage/-függő növekedése %-os borjúszérunkán és szérunmentes táptalajban TGF-/Ó1 jelenlétében és anélkül· A sejtnövekedést szérueaeentes táptalajban TGF-/21 nélkül /Δ / vagy 200 pM TGF-/A jelenlétében /A / vagy 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban TGFfl nélkül /0/ vagy 200 pM TOP-^l jelenlétében /a / vizsgáljuk.

2. ábra Zsírsavak hatása az A549 sejtnövekedés SGP-rtl által előidézett gátlására· A sejtnövekedést szérusmentes körülmények között, a meghatározott zsírsav hozzáad ása mellett, TGF-βΙ nélkül /0/ vagy 100 pH TGF-/1 Jelenlétében /· / vizsgáljuk· A sejtszámot 5 nappal a TGP-/>1 hozzáadása után határozzuk meg· As A549 sejtek növekedésének TGF-^1 által előidézstt, PUPAfüggő gátlását 12 egymástól független kísérletben határozzuk meg·

3· ábra A549 sejtek növekedésének TGF-/31 által linolsav jelenlétében illetve távollétiben előidézett gátlásának dózis-reakció görbéje· A sejtnövekedést szórusentes körülmények között, TGF-^1 megadott konoentrá óiéban történő hozzáadása mellett, linolsav nélkül /0/ vagy 2 yug/ml linolsav jelenlétében /· / vizsgáljuk. A sejtszámot 5 nappal a TGF-^1 hozzáadása után határozzuk meg.

4. ábra Α549 sejtek nővekodását b«»utató fényképek, 1 yug/ml linolsav jelenlétében vagy anélkül, 25 pH TGF-/31 hozzáadása mellett. A sejteket szérusmentes körülmények között* a feltüntetett komponensek jelenlé* tében tenyésztjük. A felvételeket Nikon H20C0 fényképezőgéppel, 4 nappal a zsírsav és TGF-/51 hozzáadása után készítjük el.

5. ábra Zsírsavak és prósztagiandinok hatása A549 sejtek növekedésének TQP-^1 által előidézett gátlására· A sejtnövekedést szérumnentes körülmények között, /Ug/ml feltüntetett lipid hozzáadása mellett, TGP-/J1 nélkül /-/ vagy 40 pH TGF-/31 jelenlétében /+/ vizsgáljuk. A sejtszámot 4 nappal a TGF-ól hozzáadása után határozzuk meg. Az ábrán alkalmazott rövidítések jelentése a következő: HA nem adunk hozzá adalékanyagot) LA · linolsav; LN · alfalinolénsav) DHA dokozahexaénsav; El, B2* D2,

F2A · prosztaglandin Ep Eg, Dg illetve Bg.

6. ábra Linolsav és TGP-yjl által közvetített A549 sejtnöve- kedésgátlás visszafordítása E~vltamin segítségével· A sejtnövekedést szérummentos körülmények között* yug/ml linolsav és meghatározott koncentrációjú E-vitárnin hozzáadása mellett, TGP-^1 nélkül /0/ vagy 25 pM TGP-,1 jelenlétében /· / vizsgáljuk· A sejtszámot 5 nappal a TGF-^1 és B-vitamin hozzáadása után határozzuk meg· Három egymástól független kísérletben hasonló eredményeket kaptunk.

7Α ábra Β16 msElanÓM-sejtek rügzitós/anchorage/-fUgg6 növekedése 10 %-os magzati borjúszérumban és Méru·· mentes táptalajban· A sejtnövekedést £TxlÖ^/mélyedéoyT ezérummentee táptalajban /4 / vagy 10 % mag· zati borjúszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban /· / vizsgáljuk· ábra Alfa-linolánsav és E-vitamin hatása B16 sejtek növekedésének TGF-/>1 által előidézett gátlására· A sejt· növekedést /mélyedés^ eséruBuaentes körülmények között 10 /ug/ml alfa-linoléneav, 100 pM ΤΟΡ-/;1 és/vagy 1 yuM S-vitamin jelenlétében vagy anélkül vizsgáljuk· A sejtszámot 3 nappal a zsírsav, TOT-/51 és E-vitamin hozzáadása után határozzuk meg· Három egymástól független kísérletben hasonló eredményeket kaptunk·

A találmányunk értelmében felhasznált TGP-^l vérlemezkékből vagy bármely más emlős sejtből, az irodalomból ismert mód· szerekkel származtatható le. Ismeretea továbbá, hogy tisztított TGF-/>1 rekombináns sejt tenyészetekből is készíthető és találmányunk szempontjából ez a termék is alkalmas· Mint· hogy a TGF-^1 nem fajtaspecifikus, találmányunk oltalmi köre nem csupán emberből, hanem állati forrásból /pl· sertés vagy szarvasmarha/ származó TGF-/J1 alkalmazására is kiterjed· Találmányunk tárgya továbbá gyógyászati készítmény, amely TGP-;l-t, valamely PUPA-vegy lile tét és/vagy származékát éa inért, nem-toxikus, gyógyászatilag alkalmas hordosóanyagot tartalmas· A találmányunk szerinti gyógyászati késsítmények • · ·

- 9 neopláziás betegségek - különösen melanóma és karcinóma keselésére alkalmazhatók,

A neopláziás betegségek kezelésére felhasznált TGP-/1 készítmények előállítása és adagolása a jő gyógyezergyártás /good medical practice/ követelményeinek megfelelően történik· A gyógysaerkészitmény-tipus megválasztásánál a kezelendő rendellenességet, a beteg állapotát, a TGF-/?1 alkalmazásának helyét, az alkalmasáé módját és a gyakorló orvos által ismert egyéb tényezőket veszünk figyelembe·

A gyógyászati készítmények előállítása oly módon történik, hogy a kívánt tisztaságú TGP-/51-t gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagokkal összekeverjük, £ célra olyan hordozóanyagokat alkalmazhatunk, amelyek as adott dózisban és koncentrációban nem toxikusak, ▲ TGF-^l-et általában puffé* rekkol, kis molekulatömegü /általában legfeljebb kb. 10 maradékból álló/ polipeptidőkkel, fehérjékkel, aminosavakkal, szénhidrátokkal /pl· glükóz vagy dextránok/, kelátképző szerekkel /pl* EDTA/ vagy más sapiensekkel keverjük össze, A gyógyászatban csak steril TGF-/31 alkalmazható, A sterilitást oly módon érhetjük el, hogy az e célra használatos membránokon át sterilre szűrjük· A TGF-ΛΙ általában vizes oldat formájában tárolható, minthogy ilyen alakban hó hatására és oxidativ behatásokra bekövetkező denaturálódással szemben rendkívül stabil· Ezenkívül felhasználás előtt hígítandó llofilizált készítmények is alkalmazhatók·

A TGJ-/31 dózisa a fentiekben ismertetett tényezőktől függ· Általános irányelv szerint a TGF-/91-tartal«ú készítményt olyan mennyiségben juttatjuk a megcélzott neopláziás

helyre, hogy a neoplásiás szövet ben a TGF-/>1 szint kb.

0,25 ng/g szövet értéknél nagyobb legyen· A TGF-/U. koncentrációja a megcélzott neopláziás hely közelében előnyösen 0,25-5,0 ng/g szövet· A megadott, szöveten belüli koncentrációkat a kezelés alatt folyamatos infúzió, késleltetett hatóanyaglead ású készítmények vagy pegilácid segítségével vagy gyakorlati utón meghatározott gyakorisággal beadott injekciókkal fenn kell tartani·

Találmányunk célkitűzése, hogy a TOF-^l-el történd kezeléssel egyidejűleg ezinergetikusan hatásos mennyiségben valamely PUFA-vegyUletét is beadjunk a betegnek· Bit többféleképpen végezhetjük el· Eljárásunk egyik foganatositáai módja szerint a PUFA-vegyUletét a TGF-/31-el közösen egyetlen adagolási egységben keverjük össze olyan arányban, hogy a neopláziás helyre kb· 10-1000 yug pUFA/g szövet kerüljön· A TGF-pl koncentrációja a fentiekben megadott hatékony tartományba esik· Ebből következően a neopláziás helyen a TGP-31 : t PUFA arány 1 : 2xl0³-4xl0⁶, előnyösen 1 : 1x10⁴-5x10⁵·

A fenti kombinációs készítmény alkalmazhatósága nyilvánvalóan a hatóanyagként felhasznált vegyületek jellemsó tulajdonságaitól, oldhatóságától és/vagy a készítmény előállításánál felhasznált oldószerekkel, pufferekkel ée hordozóanyagokkal szemben mutatott kölosünös összeférhetőaégétől függ.

Találmányunk tárgya továbbá TGF-^l-t és valamely PUFA-vegyUlatét és/vagy esármasékát tartalmasó késsitmények egyidejű, különálló vagy asekvenoiália felhasználása neopláaiás betegségek gyógyítására·

Találmányunk ért·Iáéban a hatóanyagok egymástól függetlenül előállított gyógyászati késsitmények formájában is adagolhatók, éspedig egyidejűleg vagy egymásután. Ezenkívül a két hatóanyag különböző adagolási módokon is a szervezet be juttatható· így pl· eljárhatunk oly módon, hogy a TGF-^l-t parenterális oldat míg a PUFA-vegy Illetet orálisan /pl· tisztított PUFA-vegyliletat vagy PUPA-tartalul azövatextraktumot tartalmasé tabletta vagy lágyzselatinkapszula formájában/ adagoljuk· E célra állati vagy növényi eredetű /pl. hal vagy csira/ asövetek alkalmazhatók·

A találmányunk értelmében felhasználható PUFA-vegyIlletek ismertek ée 2-6 kettőskötést tartalmaznak.

Többszörösen telítetlen zsírsavként előnyösen linóisav, alfa-linolénsav, gamma-linolénsav, arachidonaav, dihomo -gamma-linolénaav, eikozapentaénsav, dokozahexaénsav és származékaik /pl· kié szénatomézárná alkil-észtereik, előnyösen metil- vagy etil-észtereik/ alkalmazhatók· Ezek ismert vegyületek. A fonti PUFA-vegy ületek közül a u>-3-PUPA-vogyületek különösen előnyösek· A PUFA-vegyUlotek származékait az oldhatóság vagy stabilitás befolyásolása céljából alkalmazzuk, különösen ha PUFA-vegyUletét a TGF-/51-el együtt közösen készítjük ki vagy késleltetett hatóanyagleadású vagy meghosszabbított felezési idejű gyógyászati készítmények előállítása esetén.

Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint a készítményhez valamely retinóidot is adunk· Retinoidként előnyösen all-transz-retineav, all-cisz-retinsav ée a 4 105 681, 4 193 931» 4 326 055, 4 396 553 ée 4 689 350 es.

amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett retinoldok alkalmazhatók. A retinóidokát as egy vagy kát hatóanyagot tartalmazó, találmányunk szerinti készítményekhez az irodalomból ismert gyógyászatilag hatásos dózisokban - pl. mintegy 0,1-10 mg/kg testtömeg/nap - adhatjuk.

Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

1. példa

A szérummentes táptalajkomponensek beszerzési forrásait ás a törzsoldatok készítését az alábbiakban ismertetjük: a kristályos zsireavmentes Bzarvasmarhaazérum-albumint £*BSAl 50 mg/ml kalcium- és magnéziummentes foszfáttal pufféról t nátrium-klorid-oldatban /PBS/JT; szójabab tripszin inhibitort; az inzulint /20 yug/ml, 6 mM HCl-ban/; transzferrint /5 ^ug/ml, PBS-ben/; a hidrokortizont /500 /Ug/ml, etanolban, sötétben argon alatt -20 ^eC-on tároljuk/; és a trijód-tironint /20 nM, 10 oM NaOH-ban/ a Sigma cégtől szereztük be. A sertés TGF-^l-t /4 mM HC 1-ben, 1 mg/ml BSA/ és a bázikus fibroblaezt növekedési faktort ffbFGR, 1 mg/ml BSA/ az R and Dⁿ /Minneapolls MS/ cégtől szereztük be· A receptor minőségű epidermális növekedési faktor /EGE, mg/ml BSA—t tartalmaz/, az B—vitamin és folyékony HPlíI 1640 táptalaj a Gibco cég terméke· A szarvasmarha plazma flbronektint a Gibco vagy Sigma cégtől szereztük be· A szarvasmarha bőr I típusú kollagén a Collagen Corp· /Palo Alto, OA/ cég terméke· A Sigma vagy Nu Cheok Prep /Elysian, MN/ oégtől beszerzett zsírsavakat etanolban argon alatt -20 °C-on vagy -90 °C-on tároltuk· A forrástól vagy tárolási hőmérséklettől függetlenül hasonló eredményeket kaptunk· A szokásos zsirsavmentes Dulbecco által módosított Sagle-féle Ham P12 táptalajt £EME/F1^T a Specialty Media Ina· Lavalette N3 oégtől szereztük be· Valamennyi kísérletnél Milli-Q /millipore/ vizet alkalmaztunk· Az összes többi anyag szövettenyészst

* 14 minőségű. - gyártó cég Sigma vagy Gibco. Minden törzsoldatot 2-3 hónaponként frissen készítettünk·

Az A549 humán tüdőkarcinóma sejteket Dr. Lawrence Levine /Brandeis Egyetem/ bocsájtóttá rendelkezésünkre vagy az American Typ Culture Collection /ATCC/ intézménytől COL 185 ATTC-számon szereztük be· A B16-F1 egér melanoma sejtek ATTC száma CRL 6323· A sejteket 10 $-os magzati bor· júszérumot /Hyolone, Logan UT/ és 15 mid hepea-t tartalmazó RPMI 1640 táptalajban 37 ^oC-on /5 % COg/ tartottuk· A B16 melanoma sejteket ezenkívül 100 egység/ml penicillin vagy ás sztreptomicin jelenlétében tároltuk· A fagyasztott törzs· tenyészetekből 2-3 havonta friss tenyészeteket készítettünk·

A549 tüdőkarcinóma sejtek szérummeutes növekedése

Az A549 sejtek növekedését Brower és tsai módszerének £~Cancer Rés· 46, 796-806 /1986/J/ módosításával végeszük el· Szövettenyéezetmélyedéseket /2 cm / egy éjjelen át 37 °0-on 0,3 ml 10 yug/ml fibronektint tartalmazó RPMI 1640 táptalajjal kezelünk, majd leszívatjuk és I típusú kollagénnel hasonlóképpen kezeljük· A mélyedéseket a sejtssólesstés előtt PBS-el egyszer átöblitjük. A549 sejteket /100 mm-ea tálban/ egyszer mossuk, majd 3 ml 0,05 %-os trípszin/0,53 mM EDTA-tartalmú PBS-el leválasztjuk} est akkor távolítjuk el araikor a sejtek még kötődnek· Tripláin inhibitort £5 ml, 1 mg/ml koncentrációjú RPMI 164CJ7 adunk hozzá, a sejteket díszpergáljuk ée RPMI 1640-el kétszer mossuk· A sejteket ^SxlO^/mélyedés^ 1 mg/ml BSA-t, 20 yug/ml ináulint, 10 ^ug/ral transzferrint, 0,5 mM piroszőlősavas nátriumáét, 5 ng/ml bPGP-t, 5 ng/ml EGP-t, 2 oM glutamint, 100 nM hidro-

-15kortizont, 50 nM nátrium-szelenitet és 3 ng/ml retinsavat tartalmazó 0,5 ml RPMI 1640-ben szőlésztjük· A szélesztés után 18*24 órával TGF-/3i-t, zsírsavat, prosztaglandínokat és E-vitamint adunk hozzá, majd a sejtszámokat további 3*> 4- vagy 5-napos inkubálás után meghatározzuk· A zsírsavakat és prosztaglandinokat 2 ml etanolban adjuk hozzá vagy újabban tömény törzeoldatok /20 mg/ml/ hígítása után adjuk az 1 mg/ml BSA-t tartalmazó sejttenyészet táptalajhoz /minden kísérlethez frissen készítjük el/· A kezelt sejteket azokkal a kontroliokkal hasonlítjuk össze, amelyekhez az összes kísérlet során csak hordozót adtunk· Minden kísérletet három ismétlésben végzünk el és az eredményeket as átlagos sejt* szám^standard eltérés formájában adjuk meg·

B16 melanoma sejtek szérummentes növekedése

Sejttenyészetmélyedéseket zsírsavmentes

DME/F12/RPMI 1640 táptalajban £“1/1/27 a fentiekben as A549 sejtekre leírt módon 3 /Ug fibronektinnel vonunk be· A sejteket nem-enzimetíkus PBS-alapú sejt-leválaeztó oldattal /Sigma/ inkubáljuk, majd DUE/F12/RBÍI 1640 táptalajban diszpergáljuk ée utána ugyanezzel a táptalajjal egyezer nosA ~ suk.VPemandez-Pol és teái £ Cancer Res. 46, 5153*5161 /1986/J7 által leírt táptalaj módosításával készített növekedési táptalajt alkalmazunk· A sejteket 1 mg/ml BSA-t, 5 yug/ml inzulint, 5 /Ug/ml transzferrint, 2 mM glutamint, 5 pH trijód-trironint, 10 nM nátrium-szelenitet és 50 nM hidrokortizont tartalmazó 0,5 ml zsírsavmentes

EME/P12/RIMI 1640 táptalajban szőlésztjUk· Az összes többi ¹ · · · adagolást és meghatározást a fentiekben as A549 sej teltre megadott módon végezzük el·

2·

TGF-/1 hatása A549 sajtok növekedésére azéruntartalnú és azérvwnontes táptalajokban

Az A549 tüdőkarcinóma sejtek növekedését a célra elkészített javított széruunentes táptalajban vizsgáljuk /1« ábra/· A táptalaj a Brower és teái /lásd fonti irodalmi hely/ által kidolgozott ACL-3 táptalajon alapul· A módosítások során több faktor koncentrációját változtattuk, a trijód-tironlnt elhagytuk éa bázlkus FGF-t és rőtinsavat adtunk hozzá· Az A549 sejteknek a módosított ACL-3 táptalajban történő tenyésztése során pihenő /lag/ periódust non tapasztalunk és a kétszoroződési idő 27,1 óra - szénben a fenti sejtek ACL-3 táptalajban történő növekedésénél megadott 36 órás kétszereződés! idővel· A ezérumtartalnú táptalajben mért kétszereződés! idő /16,7 óra/ a Brower és teái fentidézett közleményében megadottaknak felel neg.

A TGF-^l /60 plí/ az A549 sejtek rögzítés /anchorago/ függő gátlását 2 % magzati borjúszérumot tartalmazó táptalajban 70 %-ban reverzibilisen gátolja· £”Roberta és teáit Proc. Natl· Acad. Sci· USA 82. 119-123 /1985/JT· A Jelen tanulmány szerint 200 pM TCF-fíl 10 % magzati borjúzz ér un Jelenlétében a részlegesen összefüggő A549 sejtnövekedést 33 %-al gátolja. A TGF-/'l e sejtek szérummentes növekedését csak 18-20 %-kal gátolja /1· ábra/·

3· példa

4549 sejtek növekedésének gátlása exogén PUFA-vegyUlet_ek jelenlétében /Ug/ml értéknél kisebb koncéntrációban hozzáadott PUFA as A549 sejtek ssérunnentes növekedését osak kevéssé befolyásolja· Eszel ssenben a TGF-/)1 által előidézett sejtnövekedésgát láa linolsav vagy alfa-linolénsav Jelenlétében szignifikáns mértékben emelkedik· A TGF-/91 - a 2· ábra tanúsága ezerint - 1-3yug/ml linolsav vagy alfa-linóIánsav jelenlétében az a549 sejtek növekedését majdnem 100 %-ban gátolja· Arachidonsav, elkozapentaénsav és dokozahexánaav jelenlétében hasonló eredményeket kapunk· A TGF-^1 által előidézett szignifikáns PUFA növekedéegátlás elérése céljából a táptalajnak rétinsavat kell tartalmaznia /adatokig nem közlUnk/· Telítetlen és egyszeresen telítetlen zsírsavak a TGF-/51 által előidézett A549 sejtnövekedésgátlást nem fokozzák /2. ábra/· Kaprilsav, laurineav, palmitinsav és elaidinsav alkalmazása esetén hasonló eredményeket kapunk·

TGF-^1 titrálás ezerint as A549 sejtek erre a faktorra két fázisban reagálnak· A TGF-^fll szub-pikomólos koncentrációkban linolsav jelenlétében vagy anélkül a sejtnövekedést reprodukálható módon kis mértékben serkenti· Núgent és Kewtnan Bioi. Chem. 264. 18060-18067 /1989/.7 korábban azt találták, hogy a TGF-^jl széruseentes körülmények között szub-pikomólos koncentrációban normál patkányvesesejtek növekedését hasonlóképpen serkenti· A TGF-/3L pikomólos koncentrációkban linolsav nélkül az A549 sejtek növekedését legfeljebb 20 %-kal gátolja /lásd fentiek/·

TGF-/31-el 0,5 és 10 pM /0,0125-0,25 ng/ml/ közötti koncentrációtartományban elvégzett titrálások eredménye szerint 2 /Ug/ml linolsav Jelenlétében a sejtnövekedés dózisfüggő 95-100 %-os gátlása lép fel /3· ábra/, TGF-/)1 jelenlétében a végső sejtszám alacsonyabb mint a TGF-^1 hozzáadásának időpontjában mért kezdeti szélesztéses sűrűség·

4« példa

A549 sejtek növekedésének TGf-/)l által előidézett irreverzibilis gátlása PUFA-vegyületek Jelenlétében

PUFA-vegyületek és TGF-^1 jelenlétében felvett A549 tenyésztési görbék azt mutatják, hogy a TGF-/H által közvetített sejtnövekedésgátlás az első két napon csekély· A 3· napon azonban a PUFA és TGF-^1 jelenlétében végzett kezelés hatására a növekedés teljesen leáll és a soronkövetkező inkubálás alatt a kötődött sejtek felbomlanak és elpusztulnak· A 4· ábra tanúsága szerint a linolsavval és TGF-^l-el végzett kezelés a sejtnövekedést gátolja, majd a sejteket tönkreteszi· Ezt a megfigyelést a kezeletlen és TGF-^l-el kezelt sejtek tripán kék kizárásos analízise is megerősíti· A linolsav és TGF-pl jelenlétében történő sejtnövekedés után megmaradó sejtek kb* 80 %-a a tripán kék felvétel alapján nem életképes. Ezeket az eredményeket a sejtek közvetlen újraszélesztése is alátámasztja· A sejteket 1 /Ug/ml linolsav jelenlétében TGF-/51 hozzáadása mellett vagy anélkül 4 napon át tenyésztjük· A kezeletlen mélyedések átlagosan 10,24x10^ sejtet míg a TGF-^l-el kezelt mélyedések 0,27x10^ sejtet tartalmaznak. Tripszines kezelés és a •9 ·*·· * 19 TGF-/íl-el kezelt sejteknek 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó táptalajban történő újraszéleeztése után csak néhány telepet izolálunk· A kezeletlen aejtek magas hatásfokkal könnyen újraszéleszthetők. sejtek

Eemtranszforrnált fibroblasztok és epitéliásYszérummentes körülmények között és PUFA-vegy Illetek jelenlétében történő növekedése a TGF-/& által előidézett gátlásra kevésbé érzékeny mint a tumorsejtek növekedése· Ezenkívül PUFA-vegy Illetek a nemtranszformált aejtek TGF-/51 által előidézett növekedésgátlását nem potencirozzák és ez a növekedés általában reverzibilis /adatokat nem közöltünk/.

5· példa

PUFA-vegyületek szerepe A549 sejtnövekedés TGF-/31 által előidézett gátlásában

Megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy az A549 sejtnövekedés TGF-^1 által előidézett gátlásában valamely PUFA-metabolit közvetítő lehet-e. Az 5· ábra bizonyltja, hogy bár 1 yug/ml linolsav, ji-linolénsav vagy dokozahexaénsav a TGF-jl által előidézett sejtnövekedésgátlás közvetítésére képes, az Ej-, Eg-, Dg- és Fg- prosztaglandlnok hasonló koncentrációban nem szinergizálják a TGF-/51 A549 sejtnövekedésgátló hatását·

A linolsav /egy -zsírsav/, alfa-linolénsav és dokozahexaénsav /<v-3 zsírsav/ különböző ciklooxigenáz és lipoxigenáz termékek bioszintézisének prekurzorai· A fenti eredmények arra utalnak, hogy maguk a PUFA-vegy lile tok vagy az összes többszörösen telítetlen zsírsavval rokon bizonyos termékek felelősek a TGF-/31 által kifejtett sejtnövekedés-

gátlás közvetítéséért· A többszörösen telítetlen zsírsavak /PUFA-vegyIlletek/ toxikus lebomlási termékek keletkezését eredményező peroxidációra hajlamosak· Így 1 yug/ml linolsav és 25 pM TGF-y)l által előidézett sejtnövekedésgátlást az antioxidáns hatású E-vitamin jelenlétében és anélkül vizsgáljuk. A 6. ábra adataiból kitűnik, hogy az E-vitamin a TGF-01 által előidézett A549 sejtnövekedésgátláat linolsav jelenlétében meggátolni képes· Az E-vitamin a TGF-/T1 által közvetített növekedésgátlást nem véd teljesen ki·

6· példa

B16 melanoma sejtnövekedés TGF-/31 által előidézett· többszörösen telítetlen zsírsav függő gátlása

A többszörösen telítetlen zsírsavaknak a TGF-^1 által előidézett tumorseJtnövekedésgátlásban kifejtett általános szerepének meghatározása céljából a vizsgálatokat egy második sejttípuson is elvégezzük· Azért választottuk B16 egér melanoma sejtvonalat, mert e sejttípus rögzítés /anchorage/ független növekedését szérum jelenlétében a TGF-^l gátolja, mig a B16 sejtek rögzítéstől /anchorage/ független növekedését szárusmentes táptalajban a TGF-/>1 serkenti· Az eredmények arra utalnak, hogy a B16 sejtnövekedés TGF-/31 által előidézett gátlása a szérumban levő azonositatlan faktoroktól /pl· PUFA-vegy Illetek/ függhet·

Mint az A549 sejttel kapcsolatban a korábbiakban kifejtettük, a jelen találmány szerinti kísérletek során a B16 melanoma sejtek rögzítés /anchorage/ függő növekedésének vizsgálatához javított szérummentee táptalajt fejlesztettünk ki· Ez a táptalaj a Fernandez- Föl és teái által ·« ····

- 21 leírt /lásd fentiekben idézett közlemény/ 1Ε£Β/ΙΊ24Η«-Ε táptalajon alapul· Az alábbi módosításokat végeztük élt a eejtkötődés elősegítése céljából szérum helyett íibronektint alkalmaztunk, az Ej-prosztaglandlnt elhagytuk és kristályos zsiraevwantea BSA-t adtunk hozzá· As alaptáptalajt is megváltoztattuk és DKE, Ham FI 2 és RPMI keverékéből álló táptalajt alkalmaztunk· A B16 sejt kétazereződési ideje a szérum jelenlétében és szérummentes táptalajban 13,4 illetve 15»8 óra /7A ábra/·

B16 sejtek 100 pM TGF-^-el ssérummentes rögzítés /anchorage/ függő körülmények között elvégzett kezelése 10-15 %-os nőve kedéagátlást eredményez /lásd a korábbiakban az A549 sejtekkel kapcsolatban közöltek/·

Az eredményeket a 7B ábrán tüntetjük fel· Alfa-linolánaav 10 yUg/ml mennyiségben önmagában csak kevéssé befolyásolja a sejtnövekedést, azonban a TQF-1 alfa-linolénsav jelenlétében 85 %-kal gátolja a sejtek növekedését· Linolsavval, gamma-linólénsavval, arachidonsavval és dokozahexaénsavval hasonló eredményeket kapunk· A549 sejtek TGP-^l-el és többszörösen telítetlen zsírsavakkal hosszú időn át történő kezelése a B16 sejtnövekedés irreverzibilis gátlását eredményezi· B16 sejtnövekedés TGF-/>1 által alfa-linolénsav jelenlétében előidézett gátlását az E-vitamin kivédi, es a hatás azonban alfa-linolénsav nélkül nem lép fel /7B ábra/· Az alfa-linolénsav továbbá szérum jelenlétében növeli a B16 sejteknek a TGE-/31 növekedésgátlő hatásával szemben mutatott érzékenységét· A TGF-%1 és többszörösen

- 22 ·.

telítetlen zsírsavak ezinergetikus gátló hatása szérűn jelenlétében rétinsav hozzáadásától függ» és ezt a hatást E-vitanin és aátrium-szelenit hozzáadása nagymértékben kivédi·

Claims (11)

1. Szabadalmi igénypontok

   1· Sí Járás átalakító növekedési faktor /31-t /TQF-/>1/ éa valamely többszörösen telítetlen zsírsavat /PUFA/ és/vagy származékát tartalmazó, egyidejűleg, külön-külön vagy szekvenciálisán adagolható kombinált gyógyászati készítmények előállítására· azsal jellemezve, hogy a TGF-/31—t ás a többszörösen telítetlen zsírsavat és/vagy származékát külön-külön vagy együtt egy vagy több inért ηβα-toxlkua gyógyászatilag alkalmas hordozóanyaggal összekeverjük éa galeníkus formára hozzuk·
2. 2· Az 1· igénypont szerinti eljárás, azzal je 1 1 e m ez v e, hogy az ily módon előállított galeníkus készítményt neoplázlás betegségek kezelésével közvetlenül kapcsolatos információval látjuk el·
3. 3· Az 1· vagy 2· igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy TGLF-^l-ként rekombináns humán TGF- .l-t alkalmazunk·
4. 4. Az 1-3· igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy két vagy több kettőskötést tartalmazó többszörösen telítetlen zsírsavat alkalmazunk·
5. 5· Az 1-4· igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy többszörösen telítetlen zsírsavként linoleavat, alfa-linolénsavat, gamma-lino1énsavat, arachldonsavat, dihorao-gamma-linolénsavat, eikosapentaénsavat és/vagy dokozahexaénaavat vagy többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmazó szövetextraktumokat alkalmasunk·
6. 6· As 1-5 · igénypontok bármelyike sserinti ti járás, azzal jellemezve, hogy a készítményhez valamely retinoidot is adunk·
7. 7· A 6· igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy retinoidként retinsavat alkalmazunk· β· TGP-^1 és valamely többszörösen telítetlen zsír* sav és/vagy származéka felhasználása egyidejű, külön-külön vagy szekvenciálisán történő adagolással neopláziás betegségek kezelésére alkalmas kombinált gyógyászati készítmények előállítására·
8. 9· a8· igénypont szerinti felhasználás, azzal jellemezve, hogy a kombinált készítmény valamely retinoidot is tartalmaz·
9. 10· Eljárás neopláziás betegségek - különösen karcin óma és melanőma - kezelésére, azzal j e Ile m e s v 0| hogy hatékony mennyiségű TGF-yH-t valamely többszörösen telítetlen zsírsavval és/vagy származékával kombinálva egyidejűleg, kUlön-kUlön vagy bizonyos időközönként beadunk·
10. 11· A 10· igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelés során hatékony mennyiségben valamely retinoidot is beadunk·
11. 12· A jelen szabadalmi leírásban foglalt találmány, különös hivatkozással a példákra·