JPH0518557B2 - - Google Patents
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Description
(1) 産業上の利用分野
本発明は、新規なα−アセトラクテート デカ
ルボキシラーゼおよびその製造方法に関する。 (2) 従来技術 アルコール性飲料、例えばビールもしくはぶど
う酒の発酵中、しばしば少量のジアセチルが生成
する。ジアセチルの生成は最も不利である。と言
うのは、その臭いが強くしかも不快なものであり
更にビールの場合には、0.10〜0.15mg／のジア
セチルの少量においてもビールの香りと味に好ま
しくない影響を与えるからである。ビール中のジ
アセチルは、直接ジアセチルを生成するペデイオ
コツカス（Pediococcus）菌株の感染によつて一
部引き起こされ（E.Geiger、ジアセチル イン
ビア（Diacetyl in Bier）、Brauwelt46、1680
〜1692、1980）更に以下の事実によつても一部引
き起こされる。すなわち、ピルベート
（pyruvate）からのビール酵母はα−アセトラク
テートを形成しこれは酵素依存反応ではなく、温
度依存反応によりジアセチルに変換される。ビー
ルの熟成中、ジアセチルは酵母細胞中の還元酵素
によりアセトインに変換される。アセトインは、
味と風味に関しジアセチルよりもより高い濃度で
ビールにおいて許容できる。 ビール中のジアセチル量を減少する他の可能性
は、アセトラクターゼ デカルボキシラーゼによ
りα−アセトラクテートをアセトインに直接変換
することにある（EP特許出願第46066号参照）。
アセトラクテート デカルボキシラーゼは、ビー
ルの主発酵中又は熟成過程中に添加される。 細胞内酵素は、微生物クレブシエラ ニユーモ
ニア（Klebsiella pneumonia）から回収される
（Juni E.、B.Biol.Chem.195、715−726（1952））。
クレブシエラ ニユーモニア（Klebsiella
pneumonia）としては、病原微生物が存するが、
しかしこれは工業的利用しては十分適しない。更
に、該微生物により生産されたアセトラクテート
デカルボキシラーゼは、その企図されている使
用条件中、ビールの場合約PH4.3でありかつ約10
℃である条件下では安定性が悪い。 (3) 発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記条件のもとでより良好な
安定性を有し更に改善された収率で非病原微生物
から回収できる新規なアセトラクテート デカル
ボキシラーゼ酵素を提供することにある。 (4) 問題点を解決する手段および作用 本発明は以下の驚くべき知見に基づく。すなわ
ち、かかる性質を有する新規なアセトラクテート
デカルボキシラーゼがバシラス ブレビス
（Bacillus brevis）およびバシラス リケニフオ
ルミス（Bacillus licheniformis）種に属する微
生物により高収率で得られるという事実である。 第一の面によれば、本発明はバシラス ブレビ
ス（Bacillus brevis）菌株ATCC11031又はバシ
ラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）菌株ATCC12759、ATCC12713、
ATCC11946、ATCC27326、NRRL Ｂ−3751、
NCTC2120、NCTC8721、NCIB6816、
NCIB8537および、NCIB11868の適当な栄養培地
中で培養することによつて得られるα−アセトラ
クテート デカルボキシラーゼ酵素を提供する。 α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵
素製品は、固体又は液状形でありかつ一般に固体
形でタンパク１mg当たり0.1〜10NU（以下に定義
される）の範囲内にある活性度を有する。 本発明の別の面によれば、α−アセトラクテー
ト デカルボキシラーゼ酵素の製造方法が提供さ
れ、この方法は、炭素および窒素源を含有する適
当な栄養培地中で、バシラス ブレビス
（Bacillus brevis）およびバシラス リケニ フ
オルミス（Bacillus licheniformis）からなる群
から選ばれるα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ生産バシラス（Bacillus）菌株を培養
し、しかる後培地中、細胞からα−アセトラクテ
ート デカルボキシラーゼ酵素を回収することを
含んでなる。 本発明の好ましい態様において、バシラス ブ
レビス（Bacillus brevis）菌株がATCC11031で
あるか、又はα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ酵素を生産するそれらの突然変異体もし
くは変異体である。 好ましいバシラス リケニフオルミス菌株は、
ATCC12759、ATCC12713、ATCC11946、
ATCC27326、NRRL Ｂ−3751、NCTC2120、
NCTC8721、NCIB6816、NCIB8537、および
NCIB11868並びにα−アセトラクテート デカ
ルボキシラーゼ酵素を生産するそれらの突然変異
体および変異体である。 バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）菌株を、本発明のα−アセトア
セテート デカルボキシラーゼ酵素の製造用に用
いる場合、栄養培地は遊離アミノ酸含量がα−ア
セトラクテート デカルボキシラーゼ生成を抑制
しないような窒素源を好ましくは含んでなるべき
であり、好ましくは無機窒素源を含むべきであ
る。 バシラス ブレビスが酵素源である場合、有機
窒素源が使用できる。 本発明のα−アセトラクテート デカルボキシ
ラーゼ酵素を生産する微生物は、α−アセトラク
テートを次いで検出されるアセトインに変換でき
るそれらの能力によつて選択される。 以下の手順に従い300以上のバシラス
（Bacillus）菌株を試験した： 菌株を、次のBCM−基質上振とうフラスコ内
で30℃および37℃で24時間培養する。 K2HPO4 １ｇ NaH2PO4、2H2O １ｇ （NH4）2SO4 2.5ｇ NaCl 0.25ｇ MgSO4、7H2O 0.2ｇ FeCl3、6H2O 0.04ｇ MnSO4、H2O 0.25mg グルコース 10ｇ 酵母エキス ３ｇ 水を加えて 1000ｇとする 培養後、細胞を遠心分離により集め、0.03Mの
燐酸塩／クエン酸塩緩衝液（PH6.0）中で洗浄し
次いでOD（450）〜40まで同緩衝液中で再懸濁さ
せる。次いで２mlのアリコートを超音波処理に委
ねるか又は１mg当たり１mgのリゾチームを用い37
℃で30分処理し次いで遠心分離する。 上澄み液のα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ活性を、節「α−アセトラクテート デ
カルボキシラーゼ活性の決定」中で説明される手
順に従つて決定した。 スクリーニング手段の結果、試験した約300の
微生物の内わずか二三種の微生物が検出可能量の
α−アセトラクテート デカルボキシラーゼを生
産することが判つた。これらの微生物を、上記手
順に従つて決定した酵素活性と共に次の第１表に
掲げる。
ルボキシラーゼおよびその製造方法に関する。 (2) 従来技術 アルコール性飲料、例えばビールもしくはぶど
う酒の発酵中、しばしば少量のジアセチルが生成
する。ジアセチルの生成は最も不利である。と言
うのは、その臭いが強くしかも不快なものであり
更にビールの場合には、0.10〜0.15mg／のジア
セチルの少量においてもビールの香りと味に好ま
しくない影響を与えるからである。ビール中のジ
アセチルは、直接ジアセチルを生成するペデイオ
コツカス（Pediococcus）菌株の感染によつて一
部引き起こされ（E.Geiger、ジアセチル イン
ビア（Diacetyl in Bier）、Brauwelt46、1680
〜1692、1980）更に以下の事実によつても一部引
き起こされる。すなわち、ピルベート
（pyruvate）からのビール酵母はα−アセトラク
テートを形成しこれは酵素依存反応ではなく、温
度依存反応によりジアセチルに変換される。ビー
ルの熟成中、ジアセチルは酵母細胞中の還元酵素
によりアセトインに変換される。アセトインは、
味と風味に関しジアセチルよりもより高い濃度で
ビールにおいて許容できる。 ビール中のジアセチル量を減少する他の可能性
は、アセトラクターゼ デカルボキシラーゼによ
りα−アセトラクテートをアセトインに直接変換
することにある（EP特許出願第46066号参照）。
アセトラクテート デカルボキシラーゼは、ビー
ルの主発酵中又は熟成過程中に添加される。 細胞内酵素は、微生物クレブシエラ ニユーモ
ニア（Klebsiella pneumonia）から回収される
（Juni E.、B.Biol.Chem.195、715−726（1952））。
クレブシエラ ニユーモニア（Klebsiella
pneumonia）としては、病原微生物が存するが、
しかしこれは工業的利用しては十分適しない。更
に、該微生物により生産されたアセトラクテート
デカルボキシラーゼは、その企図されている使
用条件中、ビールの場合約PH4.3でありかつ約10
℃である条件下では安定性が悪い。 (3) 発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記条件のもとでより良好な
安定性を有し更に改善された収率で非病原微生物
から回収できる新規なアセトラクテート デカル
ボキシラーゼ酵素を提供することにある。 (4) 問題点を解決する手段および作用 本発明は以下の驚くべき知見に基づく。すなわ
ち、かかる性質を有する新規なアセトラクテート
デカルボキシラーゼがバシラス ブレビス
（Bacillus brevis）およびバシラス リケニフオ
ルミス（Bacillus licheniformis）種に属する微
生物により高収率で得られるという事実である。 第一の面によれば、本発明はバシラス ブレビ
ス（Bacillus brevis）菌株ATCC11031又はバシ
ラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）菌株ATCC12759、ATCC12713、
ATCC11946、ATCC27326、NRRL Ｂ−3751、
NCTC2120、NCTC8721、NCIB6816、
NCIB8537および、NCIB11868の適当な栄養培地
中で培養することによつて得られるα−アセトラ
クテート デカルボキシラーゼ酵素を提供する。 α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵
素製品は、固体又は液状形でありかつ一般に固体
形でタンパク１mg当たり0.1〜10NU（以下に定義
される）の範囲内にある活性度を有する。 本発明の別の面によれば、α−アセトラクテー
ト デカルボキシラーゼ酵素の製造方法が提供さ
れ、この方法は、炭素および窒素源を含有する適
当な栄養培地中で、バシラス ブレビス
（Bacillus brevis）およびバシラス リケニ フ
オルミス（Bacillus licheniformis）からなる群
から選ばれるα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ生産バシラス（Bacillus）菌株を培養
し、しかる後培地中、細胞からα−アセトラクテ
ート デカルボキシラーゼ酵素を回収することを
含んでなる。 本発明の好ましい態様において、バシラス ブ
レビス（Bacillus brevis）菌株がATCC11031で
あるか、又はα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ酵素を生産するそれらの突然変異体もし
くは変異体である。 好ましいバシラス リケニフオルミス菌株は、
ATCC12759、ATCC12713、ATCC11946、
ATCC27326、NRRL Ｂ−3751、NCTC2120、
NCTC8721、NCIB6816、NCIB8537、および
NCIB11868並びにα−アセトラクテート デカ
ルボキシラーゼ酵素を生産するそれらの突然変異
体および変異体である。 バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）菌株を、本発明のα−アセトア
セテート デカルボキシラーゼ酵素の製造用に用
いる場合、栄養培地は遊離アミノ酸含量がα−ア
セトラクテート デカルボキシラーゼ生成を抑制
しないような窒素源を好ましくは含んでなるべき
であり、好ましくは無機窒素源を含むべきであ
る。 バシラス ブレビスが酵素源である場合、有機
窒素源が使用できる。 本発明のα−アセトラクテート デカルボキシ
ラーゼ酵素を生産する微生物は、α−アセトラク
テートを次いで検出されるアセトインに変換でき
るそれらの能力によつて選択される。 以下の手順に従い300以上のバシラス
（Bacillus）菌株を試験した： 菌株を、次のBCM−基質上振とうフラスコ内
で30℃および37℃で24時間培養する。 K2HPO4 １ｇ NaH2PO4、2H2O １ｇ （NH4）2SO4 2.5ｇ NaCl 0.25ｇ MgSO4、7H2O 0.2ｇ FeCl3、6H2O 0.04ｇ MnSO4、H2O 0.25mg グルコース 10ｇ 酵母エキス ３ｇ 水を加えて 1000ｇとする 培養後、細胞を遠心分離により集め、0.03Mの
燐酸塩／クエン酸塩緩衝液（PH6.0）中で洗浄し
次いでOD（450）〜40まで同緩衝液中で再懸濁さ
せる。次いで２mlのアリコートを超音波処理に委
ねるか又は１mg当たり１mgのリゾチームを用い37
℃で30分処理し次いで遠心分離する。 上澄み液のα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ活性を、節「α−アセトラクテート デ
カルボキシラーゼ活性の決定」中で説明される手
順に従つて決定した。 スクリーニング手段の結果、試験した約300の
微生物の内わずか二三種の微生物が検出可能量の
α−アセトラクテート デカルボキシラーゼを生
産することが判つた。これらの微生物を、上記手
順に従つて決定した酵素活性と共に次の第１表に
掲げる。
【表】
【表】
ミス
菌株C600およびC601は、1983年５月27日にナ
シヨナル コレツクシヨン オブ インダストリ
アル バクテリア、トリーリサーチステーシヨン
（アバデイーン、スコツトランド）に本出願人に
より寄託され、それぞれ寄託番号NCIB11868お
よびNCIB11869を得た。 残りの菌株は、次のリストから明らかな如く異
つたカルチヤーコレツクシヨンから入取した：
菌株C600およびC601は、1983年５月27日にナ
シヨナル コレツクシヨン オブ インダストリ
アル バクテリア、トリーリサーチステーシヨン
（アバデイーン、スコツトランド）に本出願人に
より寄託され、それぞれ寄託番号NCIB11868お
よびNCIB11869を得た。 残りの菌株は、次のリストから明らかな如く異
つたカルチヤーコレツクシヨンから入取した：
【表】
【表】
先行技術（Juni E.、同上）は以下の内容を示
唆している。すなわち、バシラス サブチリス
（Bacillus subtilis）の無細胞抽出物は、しかし、
そのような抽出物を使用することなく、α−アセ
トラクテートを脱カルボキシル化しアセトインを
形成し得る。本発明者は69種の異つたバシラス
サブチリス（Bacillus subtilis）菌株を試験し
た。これらの内、わずか５種のみがα−アセトラ
クテート デカルボキシラーゼ活性を示し、更に
これらの５菌株は酵素生産が劣る。バシラス コ
アギユランス（Bacillus coagulans）およびバシ
ラス パミラス（Bacillus pumilus）菌株は又、
工業的適用に対し酵素生産が非常に劣つているこ
とが判明した。 試験したバシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）菌株の内、検出できる
量のα−アセトラクテート デカルボキシラーゼ
を生産せず、21種の菌株は低レベル量で酵素を生
産し更に11種の菌株（これらの内10種は本発明中
に掲げられている）は高レベル量で酵素を生産す
る。縦列交差免疫電気泳動法により、以下の事実
が見出された。すなわち、掲げた全バシラス リ
ケニフオルミス（Bacillus licheniformis）菌株
は、バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）菌株C600によつて生産される酵
素と免疫化学的に同一であるα−アセトラクテー
ト デカルボキシラーゼ酵素を生産する。 バシラス ブレビス（Bacillus brevis）菌株
は、振とうフラスコ中三種の異つた培地で増殖せ
した。わずか一種の菌株、A303（ATCC11031）
のみが、全ての三種の培地上でα−アセトラクテ
ート デカルボキシラーゼ活性を示した。残りの
11種の菌株は、使用した三種の培地のいずれにお
いても検知できる量のα−アセトラクテート デ
カルボキシラーゼ活性を示さなかつた。バシラス
ブレビス（Bacillus brevis）A303によつて生
産したα−アセトラクテート デカルボキシラー
ゼ酵素は、免疫化学的性質に関し、バシラス リ
ケニフオルミス（Bacillus licheniformis）菌株
C600によつて生産される酵素と同一でないこと
が判明した。しかし、異つたバシラス リケニフ
オルミス（Bacillus licheniformis）菌株からの
α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素
が免疫化学的同一性を示すという事実により本発
明者は以下の内容を期待する。すなわち、本発明
者によつて試験された菌株以外の他のα−アセト
ラクテート デカルボキシラーゼ生産バシラス
ブレビス（Bacillus brevis）菌株は、バシラス
ブレビス（Bacillus brevis）A303と実質的に
同じ酵素を生産する。「免疫化学的同一性」に関
し、N.H.アケルセン（Axelsen）等による「Ａ
Manual of Quantitative
Immunoelectrophoresis」（オスロ1973）第10章
を参照されたい。 本発明の実施に対し、バシラス ブレビス
（Bacillus brevis）が、バシラス リケニフオル
ミス（Bacillus licheniformis）に比較して好ま
しい。と言うのは、バシラス ブレビス
（Bacillus brevis）由来のα−アセトラクテート
デカルボキシラーゼが、好ましくない副活性、
特に全ての試験されたバシラス リケニフオルミ
ス（Bacillus licheniformis）により得られたフ
エルラ酸（ferrulic acid）デカルボキシラーゼ活
性を伴うことなく生産されるからである。フエル
ラ酸デカルボキシラーゼは、発酵中のビール内に
存在するフエルラ酸を脱炭酸し、非常に非風味の
化合物４−ビニルグアヤコールとなる。従つて、
フエルラ酸デカルボキシラーゼは、回収過程中バ
シラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）からの培養ブロスから除去され
ねばならない。 更に、バシラス ブレビスは、バシラス リケ
ニフオルミスと比較して好ましい。何故なら、バ
シラス ブレビスは、ビール中の２，３−ペンタ
ンジオンの通常の前駆物質を３−ヒドロキシ−２
−ペンタノンに変換し、従つて非風味のペンタン
ジオンの量を許容できる低レベルまで減少でき
る。バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）菌株はこれらの酵素を生産しな
い。 最後に、バシラス ブレビス（Bacillus
brevis）菌株は、バシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）に比較して自て分解活
性が少ないので精製手順中における全収率が良好
である。 α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ活性
の決定 １ ノボ（NOVO）単位（NU）は、20℃でかつ
PH6.0｛バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）酵素に対し0.03モルのシトレー
ト／ホスフエート緩衝液）並びにバシラス ブ
レビス（Bacillus brevis）酵素に対し0.05Mの
MES（２（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン
酸）、0.5ｍＭのMgCl2および0.86MのNaClの緩
衝システム｝で、酵素含有試験サンプルを次の
アツセイにおけるα−アセトラクテート基質と
共にインキユベートすることにより、毎分
1μmolを生産する酵素の量と定義される。 基質： α−アセトラクテート基質を、使用直前に、α
−アセトキシ−α−メチル−酢酸エチルエステル
を加水分解することにより調製した。 30μのジエステル（0.165ｍmol）、240μの
水および330μの1M NaOHを混合し次いで15
分間氷上で保存した。次いで5.4mlの水を添加し
更に得られた水解物を試験に対し用いた。 アツセイ： 緩衝液および約0.006〜0.3NUの酵素活性を有
する試験サンプルを混合し次いで20℃で二、三分
保持した（最終量10.0ml）。ｔが０において、
400μの水解物を添加し次いで１mlの数サンプ
ルを、ｔが３、６、９、20および50分において取
り出した。サンプルを氷上に載置し次いで200μ
の1M NaOHを添加することにより酵素反応
を停止した。 得られたアセトインの量を、W.W.ウエスター
フエルド（Westerfeld）（Ａ Colorimetric
Determination of Blood Acetoin、J.Biol.
Chem.161、495−502、1945）に従がい、0.5％ク
レアチン0.2mlおよび2.5N NaOH（新たに調製）
に溶解した５％α−ナフトール0.2mlを、上記サ
ンプル1.2mlに添加することにより測定した。60
分後、反応時間Ｅ（524）を測定した。 ブランクとして、細胞抽出物の代わりに緩衝液
を有するサンプルを用いた。 標準曲線を、アセトイン０、0.5、２および4μ
ｇ／mlを用いてプロツトする。 α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素
製品の製法 本発明のα−アセトラクテート デカルボキシ
ラーゼ酵素を生産し得るバシラス菌株を、適当な
発酵培地中、好気的条件のもとでその培養前約30
に適当な固体栄養培地上で通常増殖する。発酵培
地は、炭素の同化源（例えばデキストロース）お
よび窒素源として例えば硫酸アンモニアを含んで
なる基礎塩組成物を含有する。バシラス リケニ
フオルミス（Bacillus licheniformis）システム
中、高収率を得るためには、以下の内容が必要で
ある。すなわち、発酵培地が、α−アセトラクテ
ート デカルボキシラーゼ生産を抑制できる過剰
の遊離アミノ酸を含有しないことである。バシラ
ス ブレビス（Bacillus brevis）システムにお
いて、これは該当しない。発酵は約30℃でかつ約
PH７で行なわれ、これは自動的手段によりほぼ一
定に保たれる。通気および撹拌が正の酸素圧を得
るため調整される。 発酵後、細胞を遠心分離により集め次いで適当
な緩衝液で洗浄した。細胞を超音波処理、フレン
チプレス処理、リゾチーム処理、マントン
（Manton）−ガウリン（Gaulin）−処理又はこれ
らの組合わせにより破壊する。 遠心分離後、粗抽出物を得、これは以下の節で
説明する精製工程に委ねられる。 α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素
の精製 本発明のα−アセトラクテート カルボキシラ
ーゼ酵素は、次の工程の１又はそれ以上の組合わ
せにより粗抽出物から精製できる： (a) 硫酸アンモニウム沈殿、 (b) ポリエチレングリコール沈殿、 (c) DE−52アニオン交換クロマトグラフイーお
よび透析、 (d) 酸沈殿および透析、 (e) ヒドロキシアパタイトクロマトグラフイーお
よび透析並びに、 (f) 凍結乾燥、 (g) フエニス−セフアロースクロマトグラフイ
ー、 (h) クロマトフオーカツシング 実施例１で説明する如く培養されるバシラス
リケニフオルミス菌株を培養して得られるα−ア
セトラクテート デカルボキシラーゼの精製は次
の如く行つた： 細胞94ｇ（湿重量）を、PH6.8のＫ−燐酸塩緩
衝液20ｍＭ中に懸濁させ次いで１mg／mlのリゾチ
ームを用い37℃で30分間リゾチーム処理し更にブ
ランソン（Branson）音波発生器B12で超音波処
理した。遠心分離後、上澄みをDE52アニオン交
換樹脂に適用し、これにより酵素を完全に吸着さ
せた。カラムを20ｍＭの燐酸カリウム緩衝液（PH
6.8）で洗浄し次いでPH6.8の燐酸カリウムを用い
た勾配溶出法（20ｍＭ〜500ｍＭ）で溶出した。
先に説明した如くフラツクシヨンを酵素活性に対
し分析した。活性含有フラツクシヨンを集めた。 燐酸を添加しPHを4.5までにすることにより、
集めたフラツクシヨンを酸性沈殿化せしめた。遠
心分離後、上澄みをPH6.8の20ｍＭ燐酸カリウム
に対し透析し次いで透析物をヒドロキシアパタイ
ト（HA）カラムに適用し、PH6.8の燐酸カリウム
緩衝液で洗浄後、上記の燐酸カリウム勾配法によ
り該カラムを溶出した。 酵素活性を示すフラツクシヨンを集め次いでPH
6.8の20ｍＭ燐酸カリウムに対し一夜透析した。
最終的に、透析物を凍結乾燥した。 酵素活性および収率を次表に示す：
唆している。すなわち、バシラス サブチリス
（Bacillus subtilis）の無細胞抽出物は、しかし、
そのような抽出物を使用することなく、α−アセ
トラクテートを脱カルボキシル化しアセトインを
形成し得る。本発明者は69種の異つたバシラス
サブチリス（Bacillus subtilis）菌株を試験し
た。これらの内、わずか５種のみがα−アセトラ
クテート デカルボキシラーゼ活性を示し、更に
これらの５菌株は酵素生産が劣る。バシラス コ
アギユランス（Bacillus coagulans）およびバシ
ラス パミラス（Bacillus pumilus）菌株は又、
工業的適用に対し酵素生産が非常に劣つているこ
とが判明した。 試験したバシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）菌株の内、検出できる
量のα−アセトラクテート デカルボキシラーゼ
を生産せず、21種の菌株は低レベル量で酵素を生
産し更に11種の菌株（これらの内10種は本発明中
に掲げられている）は高レベル量で酵素を生産す
る。縦列交差免疫電気泳動法により、以下の事実
が見出された。すなわち、掲げた全バシラス リ
ケニフオルミス（Bacillus licheniformis）菌株
は、バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）菌株C600によつて生産される酵
素と免疫化学的に同一であるα−アセトラクテー
ト デカルボキシラーゼ酵素を生産する。 バシラス ブレビス（Bacillus brevis）菌株
は、振とうフラスコ中三種の異つた培地で増殖せ
した。わずか一種の菌株、A303（ATCC11031）
のみが、全ての三種の培地上でα−アセトラクテ
ート デカルボキシラーゼ活性を示した。残りの
11種の菌株は、使用した三種の培地のいずれにお
いても検知できる量のα−アセトラクテート デ
カルボキシラーゼ活性を示さなかつた。バシラス
ブレビス（Bacillus brevis）A303によつて生
産したα−アセトラクテート デカルボキシラー
ゼ酵素は、免疫化学的性質に関し、バシラス リ
ケニフオルミス（Bacillus licheniformis）菌株
C600によつて生産される酵素と同一でないこと
が判明した。しかし、異つたバシラス リケニフ
オルミス（Bacillus licheniformis）菌株からの
α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素
が免疫化学的同一性を示すという事実により本発
明者は以下の内容を期待する。すなわち、本発明
者によつて試験された菌株以外の他のα−アセト
ラクテート デカルボキシラーゼ生産バシラス
ブレビス（Bacillus brevis）菌株は、バシラス
ブレビス（Bacillus brevis）A303と実質的に
同じ酵素を生産する。「免疫化学的同一性」に関
し、N.H.アケルセン（Axelsen）等による「Ａ
Manual of Quantitative
Immunoelectrophoresis」（オスロ1973）第10章
を参照されたい。 本発明の実施に対し、バシラス ブレビス
（Bacillus brevis）が、バシラス リケニフオル
ミス（Bacillus licheniformis）に比較して好ま
しい。と言うのは、バシラス ブレビス
（Bacillus brevis）由来のα−アセトラクテート
デカルボキシラーゼが、好ましくない副活性、
特に全ての試験されたバシラス リケニフオルミ
ス（Bacillus licheniformis）により得られたフ
エルラ酸（ferrulic acid）デカルボキシラーゼ活
性を伴うことなく生産されるからである。フエル
ラ酸デカルボキシラーゼは、発酵中のビール内に
存在するフエルラ酸を脱炭酸し、非常に非風味の
化合物４−ビニルグアヤコールとなる。従つて、
フエルラ酸デカルボキシラーゼは、回収過程中バ
シラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）からの培養ブロスから除去され
ねばならない。 更に、バシラス ブレビスは、バシラス リケ
ニフオルミスと比較して好ましい。何故なら、バ
シラス ブレビスは、ビール中の２，３−ペンタ
ンジオンの通常の前駆物質を３−ヒドロキシ−２
−ペンタノンに変換し、従つて非風味のペンタン
ジオンの量を許容できる低レベルまで減少でき
る。バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）菌株はこれらの酵素を生産しな
い。 最後に、バシラス ブレビス（Bacillus
brevis）菌株は、バシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）に比較して自て分解活
性が少ないので精製手順中における全収率が良好
である。 α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ活性
の決定 １ ノボ（NOVO）単位（NU）は、20℃でかつ
PH6.0｛バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）酵素に対し0.03モルのシトレー
ト／ホスフエート緩衝液）並びにバシラス ブ
レビス（Bacillus brevis）酵素に対し0.05Mの
MES（２（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン
酸）、0.5ｍＭのMgCl2および0.86MのNaClの緩
衝システム｝で、酵素含有試験サンプルを次の
アツセイにおけるα−アセトラクテート基質と
共にインキユベートすることにより、毎分
1μmolを生産する酵素の量と定義される。 基質： α−アセトラクテート基質を、使用直前に、α
−アセトキシ−α−メチル−酢酸エチルエステル
を加水分解することにより調製した。 30μのジエステル（0.165ｍmol）、240μの
水および330μの1M NaOHを混合し次いで15
分間氷上で保存した。次いで5.4mlの水を添加し
更に得られた水解物を試験に対し用いた。 アツセイ： 緩衝液および約0.006〜0.3NUの酵素活性を有
する試験サンプルを混合し次いで20℃で二、三分
保持した（最終量10.0ml）。ｔが０において、
400μの水解物を添加し次いで１mlの数サンプ
ルを、ｔが３、６、９、20および50分において取
り出した。サンプルを氷上に載置し次いで200μ
の1M NaOHを添加することにより酵素反応
を停止した。 得られたアセトインの量を、W.W.ウエスター
フエルド（Westerfeld）（Ａ Colorimetric
Determination of Blood Acetoin、J.Biol.
Chem.161、495−502、1945）に従がい、0.5％ク
レアチン0.2mlおよび2.5N NaOH（新たに調製）
に溶解した５％α−ナフトール0.2mlを、上記サ
ンプル1.2mlに添加することにより測定した。60
分後、反応時間Ｅ（524）を測定した。 ブランクとして、細胞抽出物の代わりに緩衝液
を有するサンプルを用いた。 標準曲線を、アセトイン０、0.5、２および4μ
ｇ／mlを用いてプロツトする。 α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素
製品の製法 本発明のα−アセトラクテート デカルボキシ
ラーゼ酵素を生産し得るバシラス菌株を、適当な
発酵培地中、好気的条件のもとでその培養前約30
に適当な固体栄養培地上で通常増殖する。発酵培
地は、炭素の同化源（例えばデキストロース）お
よび窒素源として例えば硫酸アンモニアを含んで
なる基礎塩組成物を含有する。バシラス リケニ
フオルミス（Bacillus licheniformis）システム
中、高収率を得るためには、以下の内容が必要で
ある。すなわち、発酵培地が、α−アセトラクテ
ート デカルボキシラーゼ生産を抑制できる過剰
の遊離アミノ酸を含有しないことである。バシラ
ス ブレビス（Bacillus brevis）システムにお
いて、これは該当しない。発酵は約30℃でかつ約
PH７で行なわれ、これは自動的手段によりほぼ一
定に保たれる。通気および撹拌が正の酸素圧を得
るため調整される。 発酵後、細胞を遠心分離により集め次いで適当
な緩衝液で洗浄した。細胞を超音波処理、フレン
チプレス処理、リゾチーム処理、マントン
（Manton）−ガウリン（Gaulin）−処理又はこれ
らの組合わせにより破壊する。 遠心分離後、粗抽出物を得、これは以下の節で
説明する精製工程に委ねられる。 α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素
の精製 本発明のα−アセトラクテート カルボキシラ
ーゼ酵素は、次の工程の１又はそれ以上の組合わ
せにより粗抽出物から精製できる： (a) 硫酸アンモニウム沈殿、 (b) ポリエチレングリコール沈殿、 (c) DE−52アニオン交換クロマトグラフイーお
よび透析、 (d) 酸沈殿および透析、 (e) ヒドロキシアパタイトクロマトグラフイーお
よび透析並びに、 (f) 凍結乾燥、 (g) フエニス−セフアロースクロマトグラフイ
ー、 (h) クロマトフオーカツシング 実施例１で説明する如く培養されるバシラス
リケニフオルミス菌株を培養して得られるα−ア
セトラクテート デカルボキシラーゼの精製は次
の如く行つた： 細胞94ｇ（湿重量）を、PH6.8のＫ−燐酸塩緩
衝液20ｍＭ中に懸濁させ次いで１mg／mlのリゾチ
ームを用い37℃で30分間リゾチーム処理し更にブ
ランソン（Branson）音波発生器B12で超音波処
理した。遠心分離後、上澄みをDE52アニオン交
換樹脂に適用し、これにより酵素を完全に吸着さ
せた。カラムを20ｍＭの燐酸カリウム緩衝液（PH
6.8）で洗浄し次いでPH6.8の燐酸カリウムを用い
た勾配溶出法（20ｍＭ〜500ｍＭ）で溶出した。
先に説明した如くフラツクシヨンを酵素活性に対
し分析した。活性含有フラツクシヨンを集めた。 燐酸を添加しPHを4.5までにすることにより、
集めたフラツクシヨンを酸性沈殿化せしめた。遠
心分離後、上澄みをPH6.8の20ｍＭ燐酸カリウム
に対し透析し次いで透析物をヒドロキシアパタイ
ト（HA）カラムに適用し、PH6.8の燐酸カリウム
緩衝液で洗浄後、上記の燐酸カリウム勾配法によ
り該カラムを溶出した。 酵素活性を示すフラツクシヨンを集め次いでPH
6.8の20ｍＭ燐酸カリウムに対し一夜透析した。
最終的に、透析物を凍結乾燥した。 酵素活性および収率を次表に示す：
【表】
酵素の化学的性質
本発明のバシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）−アセトラクテート
デカルボキシラーゼ酵素の活性のPHに対する依存
性を、上記のα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ活性の測定方法により20℃の0.03Mシト
レート／ホスフエート緩衝液中種々のPH値でバシ
ラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）の抽出物について測定した。添
付図面を参照されたい。この図面において、第１
図および第２図は菌株A446およびC600からそれ
ぞれ得られたα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ酵素に対しプロツトされた相対活性を示
すグラフである。最適PHは５ないし６の範囲内に
あることが見出された。 バシラス ブレビス（Bacillus brevis）α−
アセトラクテート デカルボキシラーゼのPHおよ
び温度依存性を、0.005MのMES（２（2N−モルホ
リノ）−エタンスルホン酸）、0.5ｍＭのMgCl2お
よび0.86MのNaClからなる緩衝液（PH6.0）を用
いる点を除く外、上記と同じ手順を用いバシラス
ブレビス（Bacillus brevis）A303の抽出物に
ついて測定した。 添付図面を参照されたい。この図面において、
第３図はPHに対しプロツトした30℃での相対活性
を示すグラフであり更に第４図は温度に対しプロ
ツトしたPH６での相対活性を示すグラフである。
バシラス ブレビスの最適PHは５〜７の範囲内に
あることが判明し、更に最適温度は35〜55℃の範
囲内にあることが判明した。 安定性 バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）の粗留出物の安定性を、使用条
件のもと、例えば10℃でかつ発酵せしめたが、熟
成したビール中で試験した。 安定性は次の表から明らかに示される。 第３表 安定性試験 菌 株 半減期（日） A303 11 A446 21 C600 15 A446 11.5（発酵ビール中で測定） クレブシエラ・ニユーモニユ酵素は、わずか２
〜３時間の半減期しか有しないので、本発明に係
る酵素は公知の酵素と比較してビールを醸造する
ために使用する条件のもとで相当に改良された安
定性を示す。 バシラス ブレビス（Bacillus brevis）A303
酵素の安定性は次の第４表および第５表から明ら
かである。
（Bacillus licheniformis）−アセトラクテート
デカルボキシラーゼ酵素の活性のPHに対する依存
性を、上記のα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ活性の測定方法により20℃の0.03Mシト
レート／ホスフエート緩衝液中種々のPH値でバシ
ラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）の抽出物について測定した。添
付図面を参照されたい。この図面において、第１
図および第２図は菌株A446およびC600からそれ
ぞれ得られたα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ酵素に対しプロツトされた相対活性を示
すグラフである。最適PHは５ないし６の範囲内に
あることが見出された。 バシラス ブレビス（Bacillus brevis）α−
アセトラクテート デカルボキシラーゼのPHおよ
び温度依存性を、0.005MのMES（２（2N−モルホ
リノ）−エタンスルホン酸）、0.5ｍＭのMgCl2お
よび0.86MのNaClからなる緩衝液（PH6.0）を用
いる点を除く外、上記と同じ手順を用いバシラス
ブレビス（Bacillus brevis）A303の抽出物に
ついて測定した。 添付図面を参照されたい。この図面において、
第３図はPHに対しプロツトした30℃での相対活性
を示すグラフであり更に第４図は温度に対しプロ
ツトしたPH６での相対活性を示すグラフである。
バシラス ブレビスの最適PHは５〜７の範囲内に
あることが判明し、更に最適温度は35〜55℃の範
囲内にあることが判明した。 安定性 バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）の粗留出物の安定性を、使用条
件のもと、例えば10℃でかつ発酵せしめたが、熟
成したビール中で試験した。 安定性は次の表から明らかに示される。 第３表 安定性試験 菌 株 半減期（日） A303 11 A446 21 C600 15 A446 11.5（発酵ビール中で測定） クレブシエラ・ニユーモニユ酵素は、わずか２
〜３時間の半減期しか有しないので、本発明に係
る酵素は公知の酵素と比較してビールを醸造する
ために使用する条件のもとで相当に改良された安
定性を示す。 バシラス ブレビス（Bacillus brevis）A303
酵素の安定性は次の第４表および第５表から明ら
かである。
【表】
【表】
上記から以下の内容が明らかにされる。すなわ
ち、バシラス ブレビス（Bacillus brevis）酵
素は、２時間後その活性を約60〜90％保持し、酵
素はPH4.5で更に安定である。更に、Mg++イオン
は活性に関し安定化作用を有し、一方酵素は
EDTAにより不活性化される。 PI−測定 薄層ゲルエレクロフオカツシングにより菌株
A446の粗留出物についてPIを測定し約4.7を得
た。 バシラス ブレビス（Bacillus brevis）A303
酵素のPIを、PHARMACIA（PHARMACIA
TECNICAL BULLETIN：
CHROMATOFOCUSING with
POLYBUFFERTM and PBETM；
PHARMACIA FINE CHEMICALS）によつて
記載されたクロマトフオカツシングによつて測定
し7.6および7.0であることが判明した。二種のピ
ークとしてα−アセトラクテート デカルボキシ
ラーゼ活性を示す活性溶離液は、異つたPIを持
つ二種のタンパクからなる。 Km−測定 A303に対し、非熟成中のビール中のα−アセ
トラクテート（DL）に関し10℃でKmを測定し
3.8ｍＭを得た。 免疫学的性質 菌株C600（バシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）生産のα−アセトラク
テート デカルボキシラーゼの精製フラツクシヨ
ンを、HarboeおよびIngildによつて記載された
方法（N.H.Axelsen：Handbook of
Immunoprecipitation−in−Gel Techniques、
Blackwell Scientific Publications ロンドン
1983年）に従つて家兎を免疫するために用いた。 バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）酵素に対しこのようにして得ら
れた抗体を、A.O.GrubbおよびJ.Krollによつて
上記文献中にそれぞれ記載されている如き交差免
疫電気泳動法および縦列免疫電気泳動法を実施す
るため使用した。 抗原は均質でないので、生産した抗体は多特異
的でありかつ交差免疫電気泳動において15個のバ
ンドを出現させ、その内の一つはα−アセトラク
テート デカルボキシラーゼ沈降帯である。この
帯を同定するために、酵素活性を基にしたオーバ
レーヤー手法が適用された：免疫電気泳動後、プ
レートを通常の如くには固定しそして染色せず、
直径14cmのペトリー皿のふた内で次の混合物30ml
中５分間インキユベートした： 150μのエチル−２−アセトキシ−２−メチ
ル−アセトアセテート、1200μのH2O、および
1650μの1N NaOHを混合し次いで室温で15分
間インキユベートした。次いで水を加え30mlとし
た。 インキユベーシヨン後、混合物をプレートに滴
下させた、これをビタラツプ（vitawrap）プラ
スチツク箔およびアルミ箔で包みそして室温で30
分間インキユベートした。 次いでプレートを、直径14cmのペトリー皿のふ
た内に置き、次の混合物で覆つた： 30mlの２％LSAアガロース（H2O）、３mlの１
％クレアチンH2O、および2.5N NaOH中の５％
ナフトール６mlを55℃で混合した。 被覆したプレートを室温で約１時間インキユベ
ートした。α−アセトラクテート デカルボキシ
ラーゼ沈降物を有するバンドは、赤色を示し、か
つ同定できる。 C600α−アセトラクテート デカルボキシラー
ゼ抗体に対し、全ての掲げられたバシラス リケ
ニフオルミス（Bacillus licheniformis）由来の
酵素を先に説明した如き縦列交差免疫電気泳動に
委ねた場合、バシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）酵素は免疫化学的に同
一であることが判明したが、一方バシラス ブレ
ビス（Bacillus brevis）由来のα−アセトラク
テート デカルボキシラーゼはC600α−アセトラ
クテート デカルボキシラーゼ酵体では沈殿せ
ず、従つてバシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）およびバシラス ブレ
ビス（Bacillus brevis）は異つたタイプのα−
アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素を生
産することを示すが、しかし双方ともビール生産
において意図した使用に対しては十分適合する。 分子量 α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ
を、減圧条件下、グラジエント ゲル中、SDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により他の蛋白質
から分離した。分子量は、フアルマシア フアイ
ン ケミカルカルズAB（スフエーデン）市販の
分子量マーカーと比較することによりブリリアン
トブルー染色ゲルから概算した。その結果、バシ
ラス ブレビス由来のα−アセトラクテート デ
カルボキシラーゼ酵素の分子量は35000D（SDS−
PAGEによる測定）であり、バシラス リケニフ
オルミス由来のα−アセトラクテート デカルボ
キシラーゼ酵素の分子量は30000D（SDS−PAGE
による測定）であつた。 (5) 実施例 以下に本発明の実施例を非制限的に説明する。 例 １ 菌株A446（B.リケニフオルミス、NRRL Ｂ−
3751）を、OD（450）６まで振とうフラスコ内で
30℃でTY−培地上で増殖させた。 TY−培地： トリプカーゼ 20ｇ 酵母エキス ５ｇ FeCl3、6H2O ７mg MnCl2、4H2O １mg MgSO4、7H2O 15mg 蒸留水を加えて1000mlとする 振とう培養物1000mlを、１当たり次の組成を
有する無機塩培地を含有するキラー（Kieler）−
発酵器1.5に移す： CaCl2、2H2O 0.5ｇ MgSO4、7H2O 0.5ｇ KH2PO4 4.0ｇ （NH4）2SO4 22ｇ 微量金属ゾル* ３ml プルラニツク １ml デキストロース 150ｇ ＊ 微量金属ゾル： H3BO3 500mg／100ml CuSO4、5H2O 63mg／100ml KI 100mg／100ml FeCl3、6H2O 333mg／100ml MnSO4、H2O 448mg／100ml NaMoO4、2H2O 200mg／100ml ZnSO4、7H2O 712mg／100ml 培養中、水酸化ナトリウムを添加してPHを7.0
に保つた。温度は30℃であり更に通気および撹拌
を調整し正の酸素圧を得た。 OD（450）34に相当する細胞密度に達した後細
胞を遠心分離により集めた。 発酵の過程は次の表から明らかである。 第２表 発酵中に測定した活性 発酵時間（時） NU／培養物１ml OD(450) ０ ０ 1.35 ５ ０ 1.69 21 0.022 19 24 0.076 28 28 0.440 34 例 ２ バシラス菌株A446を増殖させ次いで例１と同
様に培養した。但し、発酵培地は180ｇのデキス
トロースを含有しており更に細胞は、OD（450）
〜47に相当する細胞密度に達した時採取した。 112ｇの細胞（湿重量）を、PH6.8の20ｍＭ Ｋ
−燐酸塩緩衝液中に懸濁させ次いで１mg／mlのリ
ゾチームを用い37℃で30分間リゾチーム処理し
た。次いで、溶解した細胞を、ブランソン
（Branson）音波発生器B12で超音波処理に委ね
た。得られた粗留出物に25％の飽和に達するまで
硫酸アンモニウムを添加し次いで混合物を氷上に
30分載置した。 遠心分離後、上澄み中において活性物が見出さ
れた。 70％飽和に達するまで上澄みに硫酸アンモニウ
ムを添加し次いで混合物を30分間氷上に載置し
た。遠心分離後、沈殿物中に活性が見出された。 沈殿物を20ｍＭのＫ−リン酸塩（PH6.8）に懸
濁させ次いで200mg／mlのポリエチレングリコー
ル（分子量6000）を添加した。混合物を室温で30
分間放置した。遠心分離後上澄み中に活性が見出
された。 上澄み中のタンパク含量を、ワトマン
（Whatman）DE52アニオン交換剤に吸収させ次
いで20ｍＭのＫ−リン酸塩（PH6.8）で洗浄し更
にPH6.8のＫ−リン酸塩勾配緩衝液（20ｍＭ〜500
ｍＭ）で溶出させた。酵素活性を有するフラツク
シヨンをプールし次いで20ｍＭ Ｋ−リン酸塩
（PH6.8）に対し透析した。最後に透析物を凍結乾
燥した。 精製手順の過程は、第７表から明らかである。
ち、バシラス ブレビス（Bacillus brevis）酵
素は、２時間後その活性を約60〜90％保持し、酵
素はPH4.5で更に安定である。更に、Mg++イオン
は活性に関し安定化作用を有し、一方酵素は
EDTAにより不活性化される。 PI−測定 薄層ゲルエレクロフオカツシングにより菌株
A446の粗留出物についてPIを測定し約4.7を得
た。 バシラス ブレビス（Bacillus brevis）A303
酵素のPIを、PHARMACIA（PHARMACIA
TECNICAL BULLETIN：
CHROMATOFOCUSING with
POLYBUFFERTM and PBETM；
PHARMACIA FINE CHEMICALS）によつて
記載されたクロマトフオカツシングによつて測定
し7.6および7.0であることが判明した。二種のピ
ークとしてα−アセトラクテート デカルボキシ
ラーゼ活性を示す活性溶離液は、異つたPIを持
つ二種のタンパクからなる。 Km−測定 A303に対し、非熟成中のビール中のα−アセ
トラクテート（DL）に関し10℃でKmを測定し
3.8ｍＭを得た。 免疫学的性質 菌株C600（バシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）生産のα−アセトラク
テート デカルボキシラーゼの精製フラツクシヨ
ンを、HarboeおよびIngildによつて記載された
方法（N.H.Axelsen：Handbook of
Immunoprecipitation−in−Gel Techniques、
Blackwell Scientific Publications ロンドン
1983年）に従つて家兎を免疫するために用いた。 バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）酵素に対しこのようにして得ら
れた抗体を、A.O.GrubbおよびJ.Krollによつて
上記文献中にそれぞれ記載されている如き交差免
疫電気泳動法および縦列免疫電気泳動法を実施す
るため使用した。 抗原は均質でないので、生産した抗体は多特異
的でありかつ交差免疫電気泳動において15個のバ
ンドを出現させ、その内の一つはα−アセトラク
テート デカルボキシラーゼ沈降帯である。この
帯を同定するために、酵素活性を基にしたオーバ
レーヤー手法が適用された：免疫電気泳動後、プ
レートを通常の如くには固定しそして染色せず、
直径14cmのペトリー皿のふた内で次の混合物30ml
中５分間インキユベートした： 150μのエチル−２−アセトキシ−２−メチ
ル−アセトアセテート、1200μのH2O、および
1650μの1N NaOHを混合し次いで室温で15分
間インキユベートした。次いで水を加え30mlとし
た。 インキユベーシヨン後、混合物をプレートに滴
下させた、これをビタラツプ（vitawrap）プラ
スチツク箔およびアルミ箔で包みそして室温で30
分間インキユベートした。 次いでプレートを、直径14cmのペトリー皿のふ
た内に置き、次の混合物で覆つた： 30mlの２％LSAアガロース（H2O）、３mlの１
％クレアチンH2O、および2.5N NaOH中の５％
ナフトール６mlを55℃で混合した。 被覆したプレートを室温で約１時間インキユベ
ートした。α−アセトラクテート デカルボキシ
ラーゼ沈降物を有するバンドは、赤色を示し、か
つ同定できる。 C600α−アセトラクテート デカルボキシラー
ゼ抗体に対し、全ての掲げられたバシラス リケ
ニフオルミス（Bacillus licheniformis）由来の
酵素を先に説明した如き縦列交差免疫電気泳動に
委ねた場合、バシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）酵素は免疫化学的に同
一であることが判明したが、一方バシラス ブレ
ビス（Bacillus brevis）由来のα−アセトラク
テート デカルボキシラーゼはC600α−アセトラ
クテート デカルボキシラーゼ酵体では沈殿せ
ず、従つてバシラス リケニフオルミス
（Bacillus licheniformis）およびバシラス ブレ
ビス（Bacillus brevis）は異つたタイプのα−
アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素を生
産することを示すが、しかし双方ともビール生産
において意図した使用に対しては十分適合する。 分子量 α−アセトラクテート デカルボキシラーゼ
を、減圧条件下、グラジエント ゲル中、SDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により他の蛋白質
から分離した。分子量は、フアルマシア フアイ
ン ケミカルカルズAB（スフエーデン）市販の
分子量マーカーと比較することによりブリリアン
トブルー染色ゲルから概算した。その結果、バシ
ラス ブレビス由来のα−アセトラクテート デ
カルボキシラーゼ酵素の分子量は35000D（SDS−
PAGEによる測定）であり、バシラス リケニフ
オルミス由来のα−アセトラクテート デカルボ
キシラーゼ酵素の分子量は30000D（SDS−PAGE
による測定）であつた。 (5) 実施例 以下に本発明の実施例を非制限的に説明する。 例 １ 菌株A446（B.リケニフオルミス、NRRL Ｂ−
3751）を、OD（450）６まで振とうフラスコ内で
30℃でTY−培地上で増殖させた。 TY−培地： トリプカーゼ 20ｇ 酵母エキス ５ｇ FeCl3、6H2O ７mg MnCl2、4H2O １mg MgSO4、7H2O 15mg 蒸留水を加えて1000mlとする 振とう培養物1000mlを、１当たり次の組成を
有する無機塩培地を含有するキラー（Kieler）−
発酵器1.5に移す： CaCl2、2H2O 0.5ｇ MgSO4、7H2O 0.5ｇ KH2PO4 4.0ｇ （NH4）2SO4 22ｇ 微量金属ゾル* ３ml プルラニツク １ml デキストロース 150ｇ ＊ 微量金属ゾル： H3BO3 500mg／100ml CuSO4、5H2O 63mg／100ml KI 100mg／100ml FeCl3、6H2O 333mg／100ml MnSO4、H2O 448mg／100ml NaMoO4、2H2O 200mg／100ml ZnSO4、7H2O 712mg／100ml 培養中、水酸化ナトリウムを添加してPHを7.0
に保つた。温度は30℃であり更に通気および撹拌
を調整し正の酸素圧を得た。 OD（450）34に相当する細胞密度に達した後細
胞を遠心分離により集めた。 発酵の過程は次の表から明らかである。 第２表 発酵中に測定した活性 発酵時間（時） NU／培養物１ml OD(450) ０ ０ 1.35 ５ ０ 1.69 21 0.022 19 24 0.076 28 28 0.440 34 例 ２ バシラス菌株A446を増殖させ次いで例１と同
様に培養した。但し、発酵培地は180ｇのデキス
トロースを含有しており更に細胞は、OD（450）
〜47に相当する細胞密度に達した時採取した。 112ｇの細胞（湿重量）を、PH6.8の20ｍＭ Ｋ
−燐酸塩緩衝液中に懸濁させ次いで１mg／mlのリ
ゾチームを用い37℃で30分間リゾチーム処理し
た。次いで、溶解した細胞を、ブランソン
（Branson）音波発生器B12で超音波処理に委ね
た。得られた粗留出物に25％の飽和に達するまで
硫酸アンモニウムを添加し次いで混合物を氷上に
30分載置した。 遠心分離後、上澄み中において活性物が見出さ
れた。 70％飽和に達するまで上澄みに硫酸アンモニウ
ムを添加し次いで混合物を30分間氷上に載置し
た。遠心分離後、沈殿物中に活性が見出された。 沈殿物を20ｍＭのＫ−リン酸塩（PH6.8）に懸
濁させ次いで200mg／mlのポリエチレングリコー
ル（分子量6000）を添加した。混合物を室温で30
分間放置した。遠心分離後上澄み中に活性が見出
された。 上澄み中のタンパク含量を、ワトマン
（Whatman）DE52アニオン交換剤に吸収させ次
いで20ｍＭのＫ−リン酸塩（PH6.8）で洗浄し更
にPH6.8のＫ−リン酸塩勾配緩衝液（20ｍＭ〜500
ｍＭ）で溶出させた。酵素活性を有するフラツク
シヨンをプールし次いで20ｍＭ Ｋ−リン酸塩
（PH6.8）に対し透析した。最後に透析物を凍結乾
燥した。 精製手順の過程は、第７表から明らかである。
【表】
例 ３
菌株A303｛バシラス ブレビス（Bacillus
brevis）、ATCC11031｝を、細胞がミツド−ロガ
リスミツク（mid−logariithmic）層内に存する
まで、振とうフラスコ中36℃でTY培地（例１参
照）上で増殖させた。この培養物600mlを、以下
の組成を有する培地８を含有するバイオテツク
（Biotec）−発酵器内に移した。 （NH4）2SO4 2.5ｇ／ K2HPO4 １− NaH2PO4、2H2O １− NaCl 0.25− ZnSO4、7H2O 0.125− MgSO4、7H2O 0.125− 微量金属ゾル* 0.7ml／ 酵素エキス ６ｇ／ プルラニツク 0.13ml／ デキストロース 31.25ｇ／* ）例１に記載されている意味に同じ 培養中、水酸化ナトリウムを添加してPHを7.0
に保つた。温度は30℃であり更に通気および撹拌
を調整し正の酵素圧を得た。 最適時に細胞を遠心分離により集めた。 発酵の過程は次の表から明らかである。 第８表 発酵中に測定された活性 発酵時間（時） NU／培養物１ml OD450 １ 0.005 2.4 ２ 0.01 4.1 ３ 0.02 7.5 ４ 0.18 15.3 ５ 0.47 17.5 ６ 0.41 22.2 ７ 0.17 24.0 ８ 0.13 24.0 例 ４ 菌株A303（バシラス ブレビス）を増殖させ、
次いで例３で説明した如く増養した。細胞を、
OD450＝8.0の際に採取した。 細胞を、20ｍＭのＫ−燐酸塩緩衝液（PH6.8）
中に懸濁させ、次いで約400バールの圧力でマン
トン−ガウリン（Manton−Ganlin）タイプのホ
モジナイザー内を通過させた。硫酸アンモニウム
を用いた活性物の分別沈殿は例２で説明した如く
行つた。 沈殿物を含有する活性物を、先に述べたＫ−燐
酸塩緩衝液に溶解し、該緩衝液に対し透析し次い
でアミコン（Amicon）加圧透析セル中で約10
mg／mlのタンパク濃度に最終的に濃縮した。 この抽出物の150mlは、第９表に示す如く次の
精製手続に対する出発物質であつた。 20ｍＭのＫ−燐酸塩緩衝液（PH6.8）中で平衡
化し予備循環させたDE52イオン交換体150mlを抽
出物に添加した。 スラリーをブフナー漏斗でろ過した。活性物は
ろ液中に存し、これを25ｍＭのヒスチジン−HCl
緩衝液（PH6.2）に対し透析した。 この抽出物に、先に説明したヒスチジン
（Histidine）緩衝液中で平衡化した40mlのPBE94
（フアルマシア、クロマトフオーカツシング剤）
を添加した。スラリーをブフナー漏斗でろ過し
た。活性物はろ液中に存し、これを20ｍＭのＫ−
燐酸塩（PH6.8）に対し透析し、硫酸アンモニウ
ムで20％に飽和する。該緩衝液中で平衡化した
200mlのフエニルセフアワースでカラムを充填し
た。透析したろ液中に存する活性物をカラムに適
用し次いで硫酸アンモニウム20％飽和から０％飽
和に変化させ並びにエチレングリコール０％から
50％に変化させながら20ｍＭのＫ−燐酸塩（PH
6.8）中勾配法により溶出した。 活性物のピーク部分を見出し、プールし、濃縮
し、次いで20ｍＭのＫ−燐酸塩（PH6.8）に対し
透析し、更に凍結保存した。
brevis）、ATCC11031｝を、細胞がミツド−ロガ
リスミツク（mid−logariithmic）層内に存する
まで、振とうフラスコ中36℃でTY培地（例１参
照）上で増殖させた。この培養物600mlを、以下
の組成を有する培地８を含有するバイオテツク
（Biotec）−発酵器内に移した。 （NH4）2SO4 2.5ｇ／ K2HPO4 １− NaH2PO4、2H2O １− NaCl 0.25− ZnSO4、7H2O 0.125− MgSO4、7H2O 0.125− 微量金属ゾル* 0.7ml／ 酵素エキス ６ｇ／ プルラニツク 0.13ml／ デキストロース 31.25ｇ／* ）例１に記載されている意味に同じ 培養中、水酸化ナトリウムを添加してPHを7.0
に保つた。温度は30℃であり更に通気および撹拌
を調整し正の酵素圧を得た。 最適時に細胞を遠心分離により集めた。 発酵の過程は次の表から明らかである。 第８表 発酵中に測定された活性 発酵時間（時） NU／培養物１ml OD450 １ 0.005 2.4 ２ 0.01 4.1 ３ 0.02 7.5 ４ 0.18 15.3 ５ 0.47 17.5 ６ 0.41 22.2 ７ 0.17 24.0 ８ 0.13 24.0 例 ４ 菌株A303（バシラス ブレビス）を増殖させ、
次いで例３で説明した如く増養した。細胞を、
OD450＝8.0の際に採取した。 細胞を、20ｍＭのＫ−燐酸塩緩衝液（PH6.8）
中に懸濁させ、次いで約400バールの圧力でマン
トン−ガウリン（Manton−Ganlin）タイプのホ
モジナイザー内を通過させた。硫酸アンモニウム
を用いた活性物の分別沈殿は例２で説明した如く
行つた。 沈殿物を含有する活性物を、先に述べたＫ−燐
酸塩緩衝液に溶解し、該緩衝液に対し透析し次い
でアミコン（Amicon）加圧透析セル中で約10
mg／mlのタンパク濃度に最終的に濃縮した。 この抽出物の150mlは、第９表に示す如く次の
精製手続に対する出発物質であつた。 20ｍＭのＫ−燐酸塩緩衝液（PH6.8）中で平衡
化し予備循環させたDE52イオン交換体150mlを抽
出物に添加した。 スラリーをブフナー漏斗でろ過した。活性物は
ろ液中に存し、これを25ｍＭのヒスチジン−HCl
緩衝液（PH6.2）に対し透析した。 この抽出物に、先に説明したヒスチジン
（Histidine）緩衝液中で平衡化した40mlのPBE94
（フアルマシア、クロマトフオーカツシング剤）
を添加した。スラリーをブフナー漏斗でろ過し
た。活性物はろ液中に存し、これを20ｍＭのＫ−
燐酸塩（PH6.8）に対し透析し、硫酸アンモニウ
ムで20％に飽和する。該緩衝液中で平衡化した
200mlのフエニルセフアワースでカラムを充填し
た。透析したろ液中に存する活性物をカラムに適
用し次いで硫酸アンモニウム20％飽和から０％飽
和に変化させ並びにエチレングリコール０％から
50％に変化させながら20ｍＭのＫ−燐酸塩（PH
6.8）中勾配法により溶出した。 活性物のピーク部分を見出し、プールし、濃縮
し、次いで20ｍＭのＫ−燐酸塩（PH6.8）に対し
透析し、更に凍結保存した。
第１図および第２図は菌株A446およびC600か
らそれぞれ得られたα−アセトラクテート デカ
ルボキシラーゼ酵素に対しプロツトされた相対活
性を示すグラフであり、第３図はPHに対しプロツ
トした30℃での相対活性を示すグラフであり、第
４図は温度に対しプロツトしたPH６での相対活性
を示すグラフである。
らそれぞれ得られたα−アセトラクテート デカ
ルボキシラーゼ酵素に対しプロツトされた相対活
性を示すグラフであり、第３図はPHに対しプロツ
トした30℃での相対活性を示すグラフであり、第
４図は温度に対しプロツトしたPH６での相対活性
を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 至適PH５〜６、pI4.7および分子量30000D
（SDS−PAGEにより測定）を有することを特徴
とする、α−アセトラクテート デカルボキシラ
ーゼ酵素。 ２ バシラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）から産生できる特許請求の範囲
に第１記載のα−アセトラクテート デカルボキ
シラーゼ酵素。 ３ 至適PH５〜６、pI4.7および分子量30000D
（SDS−PAGEにより測定）を有することを特徴
とするα−アセトラクテート デカルボキシラー
ゼ酵素の製造方法であつて、炭素および窒素源並
びに無機塩を含有する適当な栄養培地中で、α−
アセトラクテート デカルボキシラーゼ生産バシ
ラス リケニフオルミス（Bacillus
licheniformis）菌株を培養し、しかる後培地中、
細胞からα−アセトラクテート デカルボキシラ
ーゼ酵素を回収することを含んでなる、前記方
法。 ４ 前記バシラス リケニフオルミス菌株が、
ATCC12759、ATCC12713、ATCC11946、
ATCC27326、NRRL Ｂ−3751、NCTC2120、
NCTC8721、NCIB6816、NCIB8537、
NCIB11868並びにα−アセトラクテート デカ
ルボキシラーゼ酵素を生産するそれらの突然変異
体および変異体からなる群から選ばれる、特許請
求の範囲第３項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK2524/83 | 1983-06-03 | ||
| DK2524/83A DK252483D0 (da) | 1983-06-03 | 1983-06-03 | Alpha-acetolactate decarboxylaseemzymprodukt og fremstilling deraf |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59112230A Division JPS6070076A (ja) | 1983-06-03 | 1984-06-02 | α−アセトラクテ−トデカルボキシラ−ゼ酵素およびその製造方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03172180A JPH03172180A (ja) | 1991-07-25 |
| JPH0518557B2 true JPH0518557B2 (ja) | 1993-03-12 |
Family
ID=8112977
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59112230A Granted JPS6070076A (ja) | 1983-06-03 | 1984-06-02 | α−アセトラクテ−トデカルボキシラ−ゼ酵素およびその製造方法 |
| JP2234616A Granted JPH03172180A (ja) | 1983-06-03 | 1990-09-06 | α―アセトラクテート デカルボキシラーゼ酵素およびその製造方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59112230A Granted JPS6070076A (ja) | 1983-06-03 | 1984-06-02 | α−アセトラクテ−トデカルボキシラ−ゼ酵素およびその製造方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4617273A (ja) |
| EP (1) | EP0128714B1 (ja) |
| JP (2) | JPS6070076A (ja) |
| CA (1) | CA1215661A (ja) |
| DE (1) | DE3479592D1 (ja) |
| DK (1) | DK252483D0 (ja) |
| FI (1) | FI83885C (ja) |
| IE (1) | IE57708B1 (ja) |
| MX (1) | MX7643E (ja) |
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| JPH0614865B2 (ja) * | 1985-12-13 | 1994-03-02 | 麒麟麦酒株式会社 | α―アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質転換された酵母 |
| US5043276A (en) * | 1988-04-22 | 1991-08-27 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | DNA strand coding for alpha-acetolactate decarboxylase and yeast transformed with the DNA strand |
| US5096720A (en) * | 1988-08-31 | 1992-03-17 | National Starch And Chemical Investment Holding Corporation | Method for enhancing desirable physical and organoleptic properties of food products |
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| JP3824326B2 (ja) * | 1995-02-17 | 2006-09-20 | サントリー株式会社 | ビールの製造法 |
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| EP2041256B1 (en) * | 2006-07-13 | 2017-08-30 | DSM IP Assets B.V. | Improved brewing process |
| DE102011003383A1 (de) | 2011-01-31 | 2012-08-02 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol |
| EP2794641B1 (en) | 2011-12-22 | 2016-12-07 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Polypeptides having glucoamylase activity and method of producing the same |
| MX2015002099A (es) | 2012-08-22 | 2015-05-11 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Variantes que tienen actividad glucoamilasa. |
| CN107636151B (zh) * | 2015-05-22 | 2023-04-04 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 乙酰乳酸脱羧酶 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPS4844494A (ja) * | 1971-10-11 | 1973-06-26 |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
| DK145502C (da) * | 1980-08-07 | 1983-05-02 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til fremstilling af fermenterede alkoholiske produkter |
-
1983
- 1983-06-03 DK DK2524/83A patent/DK252483D0/da unknown
-
1984
- 1984-06-01 IE IE1378/84A patent/IE57708B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-06-01 EP EP84303710A patent/EP0128714B1/en not_active Expired
- 1984-06-01 MX MX84924U patent/MX7643E/es unknown
- 1984-06-01 DE DE8484303710T patent/DE3479592D1/de not_active Expired
- 1984-06-01 CA CA000455709A patent/CA1215661A/en not_active Expired
- 1984-06-01 FI FI842203A patent/FI83885C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-06-01 US US06/616,191 patent/US4617273A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-02 JP JP59112230A patent/JPS6070076A/ja active Granted
-
1990
- 1990-09-06 JP JP2234616A patent/JPH03172180A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4844494A (ja) * | 1971-10-11 | 1973-06-26 |
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| IE841378L (en) | 1984-12-03 |
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