FI83885C

FI83885C - -acetolaktatdekarboxylasenzym och dess framstaellning.

Info

Publication number: FI83885C
Application number: FI842203A
Authority: FI
Inventors: Frank Olsen; Knud Aunstrup
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1983-06-03
Filing date: 1984-06-01
Publication date: 1991-09-10
Also published as: JPS6070076A; FI842203A0; IE57708B1; CA1215661A; DK252483D0; EP0128714A2; EP0128714B1; DE3479592D1; MX7643E; JPH03172180A; FI842203A; EP0128714A3; FI83885B; IE841378L; JPH0349554B2; JPH0518557B2; US4617273A

Description

! 83885 α-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymi ja sen valmistaminen - α-acetolaktatdekarboxylasenzym och dess framställning Tämä keksintö koskee uutta a-asetolaktaattidekarboksylaasia ja sen valmistusmenetelmää.

Alkoholipitoisten juomien, esim. oluen tai viinin, käymisen aikana muodostuu usein pieniä määriä diasetyyliä. Diasetyy-lin muodostuminen on erittäin epäedullista, koska sillä on voimakkaan epämiellyttävä haju, ja kun kyseessä on olut, jopa niinkin pienet määrät diasetyyliä kuin noin 0,10-0,15 mg/litra vaikuttavat haitallisesti oluen hajuun ja makuun. Diasetyylin esiintyminen oluessa aiheutuu osittain Pediococ-cus-kannasta, joka muodostaa suoraan diasetyyliä (E. Geiger, Diacetyl in Bier, Brauwelt 46, 1680-1692, 1980) ja osittain siitä syystä, että oluthiiva muodostaa pyruvaatista a-ase-tolaktaattia, joka muuttuu ei-entsymaattisessa, mutta lämpötilasta riippuvaisessa, reaktiossa diasetyyliksi. Oluen kypsymisen aikana muuttuu diasetyyli asetoiiniksi reduk-taasien vaikutuksesta hiivasoluissa. Asetoiini voidaan makunsa ja hajunsa puolesta hyväksyä oluessa paljon korkeammissa konsentraatioissa kuin diasetyyli.

Toinen mahdollisuus vähentää diasetyylin määrää oluessa on muuttaa suoraan α-asetolaktaatti asetoiiniksi asetolaktaat-tidekarboksylaasin avulla, ks. EP-patenttihakemusta n:o 46066. Asetolaktaattidekarboksylaasia voidaan lisätä oluen pääasiallisen käymisen aikana tai sen kypsymisvaiheen aikana.

Tämä entsyymi on intrasellulaarinen entsyymi ja sitä saadaan mikro-organismista Klebsiella pneumonia (E. Juni, J. Biol. Chem. 195, 715-726, 1952). Mutta koska Klebsiella pneumonia on patogeeninen mikro-organismi, se ei kuitenkaan ole hyvin sopiva teollisuudessa käytettäväksi. Lisäksi on tämän mikro-organismin tuottama asetolaktaattidekarboksylaasi huonosti 2 83885 säilyvää aiotuissa käyttöolosuhteissaan, eli oluen ollessa kyseessä pH-arvolla noin 4,3 ja noin 10°C:ssa.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada uusi aseto-laktaattidekarboksylaasientsyymi, jolla on parempi stabiilisuus edellä mainituissa olosuhteissa ja jota lisäksi voidaan saada ei-patogeenisistä mikro-organismeista ja paremmin tuotoksin.

Keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että uutta asetolaktaattidekarboksylaasia, jolla on tällaiset ominaisuudet, valmistaa hyvin suuria määriä mikro-organismi, joka kuuluu lajiin Bacillus brevis.

Esillä olevan keksinnön ensimmäisen aspektin mukaan saadaan uutta stabiilia a-asetolaktaattidekarboksylaasientsyy-miä viljelemällä sopivassa elatusaineessa Bacillus brevis -kantaa ATCC 11031.

a-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymituote voi olla kiinteässä tai nestemäisessä muodossa ja sen vaikutus tavallisesti kiinteässä muodossa on suuruusluokkaa 0,1-10 NU (joka tullaan jäljessä määrittelemään) per mg proteiinia.

J;

Esillä olevan keksinnön toisen aspektin mukaan voidaan valmistaa α-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymiä menetelmän mukaan, joka käsittää sen, että viljellään sopivassa elatusaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteet ja epäorgaanisia suoloja, a-asetolaktaattidekarboksylaasia valmistavaa Bacillus brevis -kantaa, ja otetaan sen jälkeen talteen α-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymiä elatusaineessa olevista soluista.

Esillä olevan keksinnön parhaana pidetyssä toteutusmuodossa Bacillus brevis -kanta on ATCC 11031 tai sen a-asetolaktaat-tidekarboksylaasientsyymiä valmistava mutantti tai variantti .

3 83885

Kun käytetään Bacillus licheniformis -kantaa tämän keksinnön mukaisen a-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymin valmistamiseen, tulisi elatusaineen sisältää mieluimmin sellainen typpilähde, jonka vapaiden aminohappojen pitoisuus ei tukahduta α-asetolaktaattidekarboksylaasin muodostumista, mieluimmin epäorgaaninen typpilähde.

Kun Bacillus brevistä käytetään entsyymin valmistamiseen, voidaan käyttää orgaanista typpilähdettä.

Tämän keksinnön mukaisen a-asetolaktaattidekarboksylaasient-syymin valmistamiseen tarvittavat mikro-organismit on valittu niiden kyvyn mukaan muuttaa α-asetolaktaatti asetoiinik-si, joka sitten havaitaan.

On testattu yli 300 Bacillus-kantaa seuraavan menetelmän mukaan: Kantoja viljellään ravisteltavissa pulloissa 30°C:ssa ja 37eC:ssa 24 h ajan seuraavassa BCM-substraatis-sa: K2HP04 1 g

NaH2P04, 2H20 1 g (NH4)2S04 2,5 g

NaCl 0,25 g

MgS04, 7H20 0,2 g

FeCl3, 6H20 0,04 g

MnS04, H20 0,25 mg

Glukoosi 10 g

Hiivauute 3 g

Vettä ad 1 000 g

Viljelyn jälkeen otettiin solut talteen sentrifugoimalla, pestiin ne 0,03 M fosfaatti/sitraattipuskurilla (pH 6,0) ja suspendoitiin uudelleen samaan puskuriin kunnes OD (450) -40. 2 ml:n tasamääriä käsiteltiin ultraäänikäsittelyn avulla tai niitä käsiteltiin 1 mg:n kanssa lysotsyymiä per ml lämpötilassa 37°C 30 min ajan ja sitten sentrifugoitiin.

4 83885 Päällä olevien nesteiden a-asetolaktaattidekarboksylaasiak-tiivisuus määrättiin menetelmän mukaan, joka on selostettu kohdassa "α-asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuuden määrääminen" .

Seulontamenetelmän avulla kävi ilmi, että ainoastaan harvat testatuista noin 300 mikro-organismista valmistavat a-aseto-laktaattidekarboksylaasia havaittavissa olevia määriä. Nämä mikro-organismit on luetteloitu seuraavassa taulukossa 1 samoin kuin niiden entsyymiaktiivisuus edellä mainitun menetelmän mukaan määrättynä.

Taulukko 1

Seulontamenetelmän tulos

Kanta Kanta (N0V0- Aktiivisuus (NU) Proteiini kokoelman n:o) per mg proteiinia mg/ml B. brevis A 303 0,13 4 B. coagulans A 345 0,007 3 B. pumilus A 185 0,008 2 B. pumilus A 328 0,011 3 B. pumilus A 329 0,004 2 B. subtilis A 518 0,005 3 B. subtilis C 601 0,06 1 B. licheniformis A 446 0,11 3 B. licheniformis C 600 0,19 2 B. licheniformis A 88 0,15 2 B. licheniformis A 105 0,13 2 B. licheniformis A 106 0,15 2 B. licheniformis A 200 0,15 2 B. licheniformis A 203 0,25 2 B. licheniformis A 244 0,11 2 B. licheniformis A 248 0,14 2 B. licheniformis A 1240 0,13 2

Kannat C 600 ja C 601 on talletettu National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Skot- 5 83885 lanti, 27. päivänä toukokuuta 1983 ja niille on annettu ha-kunumerot vastaavasti NCIB 11868 ja NCIB 11869.

Muut kannat on saatu eri viljelykokoelmista, kuten käy selville seuraavasta luettelosta: NOVO-n:o_Hakunumero A 303 ATCC 11031 A 345 NRS 83 A 185 ATCC 71 A 328 ATCC 4520 (B. Mesentericus var. fla- vus) A 329 ATCC 7065 A 518 IAM 1109 (B. natto) A 446 NRRL B-3751 (Patentinhakijat ovat mää ritelleet sen B. licheniformikseksi) A 88 ATCC 12759 A 105 ATCC 12713 = NRRL B-1001 A 106 ATCC 11946 A 200 NCIB 6816 A 203 NCIB 8537 A 244 NCTC 2120 A 248 NCTC 8721 A 1240 ATCC 27326

Aiemmassa tekniikassa esitetään (E. Juni, sama kuin edellä) että Bacillus subtilis -mikro-organismin soluvapaat uutteet pystyvät dekarboksyloimaan α-asetolaktaatin, jolloin muodostuu asetoiinia, mutta käyttämättä näitä uutteita. Sen vuoksi on testattu 69 erilaista Bacillus subtilis -kantaa. Näistä ainoastaan 5 osoitti a-asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivi-suutta ja lisäksi nämä viisi kantaa olivat kaikki huonoja entsyymin valmistajia. Myös Bacillus coagulans- ja Bacillus pumilus -kannat osoittautuivat liian huonoiksi entsyymin valmistajiksi teollisessa käytössä.

Testatuista Bacillus licheniformis -kannoista 13 ei tuottanut α-asetolaktaattidekarboksylaasia havaittavia määriä, 21 tuotti entsyymiä hyvin alhaisia määriä ja 11 kantaa (joista 6 83885 10 on luetteloitu tässä patenttiselityksessä) tuotti entsyymiä suuria määriä. Huomattiin peräkkäisen ristiin menevän immuno-elektroforeesin avulla, että kaikki luetteloidut Bacillus licheniformis -kannat valmistavat a-asetolaktaattidekarboksy-laasientsyymiä, joka on immunokemiallisesti identtinen Bacillus licheniformis -kannan C 600 valmistaman kanssa.

Bacillus brevis -kantoja on kasvatettu kolmessa eri elatus-aineessa ravistelupulloissa. Vain yksi kanta, A 303 (ATCC 11031) osoitti a-asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuutta kaikissa kolmessa elatusaineessa. Muut 11 kantaa eivät osoittaneet α-asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuutta huomattavissa määrin missään näistä kolmesta käytetystä elatusainees-ta. Bacillus brevis A 303:n tuottaman α-asetolaktaattidekarb-oksylaasientsyymin havaittiin olevan ei-identtinen mitä tulee immunokemiallisiin ominaisuuksiin Bacillus licheniformis -kannan C 600 tuottamassa entsyymissä. Mutta se seikka, että eri Bacillus licheniformis -kantojen tuottamilla a-asetolak-taattidekarboksylaasientsyymeillä on immunokemiallinen identtisyys, antaa aiheen odottaa, että muut a-asetolaktaattide-karboksylaasia tuottavat Bacillus brevis -kannat kuin tässä yhteydessä testatut tuottaisivat olennaisesti samaa entsyymiä kuin Bacillus brevis A 303. Mitä tulee "immunokemialliseen identtisyyteen", viitataan teokseen N. H. Axelsen et ai. "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis" (Oslo 1973), kappale 10.

Tämän keksinnön toteutuksessa pidetään Bacillus brevistä parempana kuin Bacillus licheniformis, koska a-asetolaktaatti-dekarboksylaasi Bacillus breviksestä voidaan valmistaa ilman ei-haluttuja sivuvaikutuksia, nimenomaan ferrulihappodekarbok-sylaasiaktiivisuutta, jonka saavat aikaan kaikki testatut Bacillus licheniformis -kannat. Ferrulihappodekarboksylaasi dekarboksyloi ferrulihapon, jota on käymistilassa olevassa oluessa, erittäin pahalta maistuvaksi yhdisteeksi 4-vinyyli-guajakoli. Tämän vuoksi on ferrulihappodekarboksylaasi poistettava Bacillus licheniformiksen viljelynesteestä talteenot-toprosessin aikana.

7 83885

Bacillus brevistä pidetään parempana Bacillus licheniformik-seen verrattuna vielä sen vuoksi, että Bacillus brevis valmistaa entsyymiä, joka muuttaa 2,3-pentaanidionin normaalit esiasteet oluessa 3-hydroksi-2-pentanoniksi ja vähentää siten pahalta maistuvien pentaanidionien määrät sopivan alhaiselle tasolle. Bacillus licheniformis -kannat eivät tuota tätä entsyymiä.

Lopuksi vielä Bacillus brevis -kanta antaa parempia kokonaistuotoksia puhdistusprosessissa johtuen pienemmästä autolyytti-sestä vaikutuksesta verrattuna Bacillus licheniformis -kantoihin.

g-asetolaktaattidekarboksylaasiaktllvisuuden määrääminen Yksi NOVO-yksikkö (NU) määritellään entsyymimääräksi, joka tuottaa 1 ymol asetoiinia per minuutti 20°C:ssa ja pH-arvol-la 6,0 (0,03-moolinen sitraatti/fosfaattipuskuri Bacillus licheniformis -entsyymille ja Bacillus brevis -entsyymille puskurisysteemi, joka sisältää 0,05 M MES (2(N-morfolino)-etaanisulfonihappoa), 0,05 mM MgCl2 ja 0,86 M NaCl), kun inku-boidaan entsyymiä sisältävää testinäytettä a-asetolaktaat-tisubstraatin kanssa seuraavassa kokeessa:

Substraatti: α-asetolaktaattisubstraatti valmistettiin välittömästi ennen käyttöä hydrolysoimalla alfa-asetoksi-alfa-metyyli-aseto-etikkahapon etyyliesteriä: 30 μΐ diesteriä (0,165 mmol), 240 μΐ vettä ja 330 μΐ 1 M NaOH:ta sekoitettiin keskenään ja säilytettiin jäissä 15 min ajan. Sitten lisättiin 5,4 ml vettä ja saatua hydrolysaattia käytettiin testiin.

Koe:

Puskuri ja testinäytteet, joiden entsyymiaktiivisuus oli noin 0,006-0,3 NU, sekoitettiin keskenään ja lämpökäsiteltiin 20°C:ssa joidenkin minuuttien ajan (lopullinen volyymi 10,0 ml). Hetkellä t = 0 lisättiin 400 μΐ hydrolysaattia ja otettiin 1 ml:n näytteitä hetkellä t = 3, 6, 9, 20 ja 50 min.

β 83885

Entsyymireaktio pysäytettiin panemalla näytteet jäihin ja lisäämällä 200 μΐ 1 M NaOH:ta.

Muodostuneen asetoiinin määrä mitataan W. W. Westerfeld'in mukaan (A Colorimetric Determination of Blood Acetoin, J.

Biol. Chem. 161, 495-502, 1945) lisäämällä 0,2 ml 0,5-pro-senttista kreatiinia ja 0,2 ml 5-prosenttista alfa-naftolia 2,5 N NaOHrssa (juuri valmistettua) 1,2 ml:aan edellä olevia näytteitä. 60 min reaktioajan jälkeen mitattiin E(524).

Vertailuna käytettiin näytettä, jossa oli puskuria solu-uutteen asemesta.

Merkittiin standardikäyrä 0, 0,5, 2 ja 4 μΐ/ml asetoiinia.

g-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymituotteen valmistaminen Bacillus-kannan, joka pystyy tuottamaan esillä olevan keksinnön mukaista a-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymiä, annetaan tavallisesti lisääntyä sopivassa kiinteässä ravin-neliuoksessa noin 30°C:ssa ennen kuin sitä viljellään aerobisissa olosuhteissa sopivassa käymisvällaineessa. Käymisvä-liaine sisältää assimiloituvia hiililähteitä (esim. dekstroo-sia) ja perussuolaseoksen, jossa on mm. ammoniumsulfaattia typpilähteenä. Korkeiden tuotosten saamiseksi Bacillus liche-niformis -systeemissä on tärkeätä, että käymisväliaine ei sisällä ylimäärää vapaita aminohappoja, jotka voivat tukahduttaa α-asetolaktaattidekarboksylaasituotannon. Bacillus brevis -systeemeissä ei näin ole laite. Käyminen suoritetaan noin 30°C:ssa ja pH-arvolla 7, joka pidetään yllä lähes vakiona automaattisin välinein. Tuuletus ja sekoittaminen säädetään niin, että aikaansaadaan positiivinen hapen paine.

Käymisen jälkeen solut otetaan talteen sentrifugoimalla ja pestään sopivalla puskurilla. Solut liuotetaan ultraäänikä-sittelyn avulla, ranskalaisen painekäsittelyn, lysotsyymikä-sittelyn, Manton-Gaulin-menetelmän tai näiden menetelmien yhdistelmän avulla.

9 83885

Sentrifugoimisen jälkeen saadaan raakauutetta, joka voi joutua puhdistusprosessiin, kuten seuraavassa kappaleessa esitetään.

g-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymin puhdistaminen Esillä olevan keksinnön mukainen a-asetolaktaattidekarboksy-laasientsyymi voidaan puhdistaa raakauutteesta kombinoimalla yhtä tai useampia seuraavista vaiheista: a) ammoniumsulfaattisaostus b) polyetyleeniglykolisaostus c) DE 52 -anioninvaihtokromatografia ja dialyysi, d) happosaostus ja dialyysi, e) hydroksiapatiittikromatografia ja dialyysi ja f) lyofilisoiminen g) fenyylisefaroosikromatografia h) kromatofokusointi α-asetolaktaattidekarboksylaasin puhdistaminen, jota on saatu viljelemällä Bacillus licheniformis -kantaa C 600 kuten esimerkissä 1 on selostettu, suoritettiin seuraavalla tavalla: 94 g soluja (märkäpaino) suspendoitiin 20 mM K-fosfaattipus-kuriin pH 6,8 ja suoritettiin lysotsyymikäsittely 30 min ajan käyttäen 1 mg/ml lysotsyymiä 37°C:ssa ja käsiteltiin sitten ultraäänellä Branson B 12 -laitteella. Sentrifugoimisen jälkeen päällä oleva neste pantiin DE 52 -anioninvaihtopylvää-seen, jolloin entsyymi adsorboitui täydellisesti. Pylväs pestiin 20 mM kaliumfosfaattipuskurilla (pH 6,8) ja eluoitiin kaliumfosfaattigradientilla (20 mM - 500 mM), pH 6,8. Fraktioista analysoitiin entsyymiaktiivisuus kuten edellä on esitetty. Aktiivisuuden omaavat fraktiot yhdistettiin.

Yhdistetyt fraktiot seostettiin hapolla lisäämällä fosfori-happoa pH-arvoon 4,5 asti. Sentrifugoimisen jälkeen päällä oleva neste dialysoitiin 20 mM kaliumfosfaatilla, pH 6,8. Dialysaatti pantiin hydroksiapatiitti-(HA)-pylvääseen, joka pestiin kaliumfosfaattipuskurilla, pH 6,8, ja eluoitiin sitten kaliumfosfaattigradientilla kuten edellä.

10 83 885

Fraktiot, jotka osoittivat entsyymivaikutusta, yhdistettiin ja dialysoitiin yli yön 20 mM kaliumfosfaatilla, pH 6,8. Lopuksi dialysaatti lyofilisoitiin.

Entsyymivaikutus ja tuotokset käyvät ilmi seuraavasta taulukosta: 11 83885 tn

O

G -P

ΦΟ o oo ττγο <— o p p o (N rj<rsi o en o •p £-1 ÖP τ— 1— 1— 1— 1 e d -P i tn tn

•P P

T) -PC

jp tn h P ho

Dj Ό P

,C p mm m oo p· ΡΦ - - - —. &( ϋ <- t— cn <n m es o K3 CM CN (N CM n

G -H

H C

(ΰ ή

Dj tn -h O E 0) o o cm cn^to +j +jcn 1— m o o σι τ— -P P O o 1— ldlti m m oo (1) Γ0 d) P *· * *- - - -- CZDDuo o o o ooo

C

tn m (0

(Ti -P

AI

- λ: e H (N O lOt- O O m d) D <ö o oo m r'cnr- n g ,¾ m on -<3· m cm cm m

P

H i—I

H O

in

0 H

Ai G E oo i— oo o

Aid) non mm cm oo P -p p CO ^ *3· CM (N r- H > P (P - - - P 0) 2 Dj o 1- T-1- Π3 i—t

Eh 0

•H

e e

Ή -H

en -p •PO) oo o oo t— oo <t +j o 1— o en oo oo PO 1— o ooo 0) p tn c\j m

Dj CP E 1-

:nJ

-P

in -p >i g tn r-H ^ Q) >1 00 o t-π o o oo mmo •—I o i—I o r- oo m p* ~ •p > E m cm mm cm cn >

e C I

.. o a;

O <D 3 C I

O -P Ai -P -P d) -PO

o <i)>irP>itna)G >i-P e

-P -μ -P :rä -P -P 0 Ai -p -p-p(0 -P

O O P (1)0-m 1) O «!H in G d) O E G G tn G

-P p -P -P -P -p en :p >, (D -p -P O <0 d) >,d) rö -P (0 tn -p (N tn +J O ·η >, d) tn+Jp-Pd) >, d) d)

-P Ai Ai -P Ai O -P Ai Dj rHAi -PAiAi'WAi P M JP

e p p p ui p « ac id p ΌΡΐΡ-ρ m p p

its P (tS Ji P H .G p <β <D -P :(0 .G P < P :ιβ P :<Ö P

« fcj (¾ x P Q >( P G ra Q-r-1 X P K Οΐ'Π Q-Γ-ι P) i2 83885

Entsyymin kemialliset ominaisuudet

Esillä olevan keksinnön mukaisen Bacillus licheniformis -asetolaktaattidekarboksylaasientsyymin aktiivisuuden riippuvaisuus pH-arvosta määrättiin Bacillus licheniformis -kantojen A 446 ja C 600 uutteista eri pH-arvoilla 0,03 M sitraat-ti/fosfaattipuskurissa 20°C:ssa edellä olevan a-asetolaktaat-tidekarboksylaasiaktiivisuuden määräämismenetelmän mukaan. Viitataan mukana liitteenä oleviin piirustuksiin, joista kuvio 1 ja kuvio 2 esittävät graafisesti suhteellista aktiivisuutta pH-arvoon nähden a-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymeillä, jotka on valmistettu vastaavasti kannoista A 446 ja C 600. Optimi-pH-arvon havaittiin olevan välillä 5-6.

Bacillus brevis α-asetolaktaattidekarboksylaasin aktiivisuuden pH- ja lämpötilariippuvaisuus määrättiin Bacillus brevis -kannan A 303 uutteesta saman menetelmän mukaan kuin on esitetty edellä sillä ainoalla poikkeuksella, että käytetty pusku-risysteemi muodostuu seuraavista: 0,005 M MES (2(N-morfolino)-etaanisulfonihappoa) 0,5 mM MgCl2 0,86 M NaCl pH 6,0

Viitataan liitteenä oleviin piirustuksiin, joista kuvio 3 esittää graafisesti kannan A 303 suhteellista aktiivisuutta 30°C:ssa pH:n suhteen ja kuvio 4 esittää graafisesti suhteellista aktiivisuutta pH-arvolla 6 lämpötilan suhteen.

Bacillus brevis -entsyymin optimi-pH:n havaittiin olevan välillä 5-7 ja lämpötilaoptimin välillä 35-55°C.

Stabiilisuus

Bacillus licheniformis -entsyymin ja Bacillus brevis -entsyymin raakauutteiden stabiilisuus testattiin käyttöolosuhteissa, so. 10°C:ssa ja käyneessä, mutta ei kypsyneessä, oluessa.

Stabiilisuus tulee esiin seuraavasta taulukosta.

i3 83885

Taulukko III Stabiilisuustesti

Kanta Puoliintumisaika päivissä A 303 11 C 446 21 C 600 15 A 446 11,5 (määrättynä käymisvai- heessa olevasta oluesta)

Kun Klebsiella pneumonia -entsyymin puoliintumisaika on vain 2-3 tuntia, esillä olevan keksinnön mukainen entsyymi osoittaa huomattavasti parempaa stabiilisuutta oluen pano-olosuhteissa verrattuna tunnettuun entsyymiin.

Bacillus brevis A 303 -entsyymin stabiilisuus käy ilmi seuraa-vista taulukoista IV ja V:

Taulukko IV

Jäännösaktiivisuus (NU/ml) inkuboinnin jälkeen eri lämpötiloissa

Inkubointiaika Jäännösaktiivisuus (NU/ml) (tunteja) lämpötila

_30°C 40°C 50 °C

0,05 M MES, pH 6,4 0 5,3 + 10-3 M Mg++ 1 5,2 4,8 4,1 2 4,8 5,3 3,4 4 4,7 4,0 0,2 0 5,1 0,05 M asetaatti 1 4,9 4,4 3,6 pH 4,8 + 10-3 M Mg++ 2 5,5 3,7 3,9 4 5,8 3,3 3,7 83885

Taulukko V

Jäännösaktiivisuus NU/ml inkuboinnin jälkeen 50°C:ssa vaih-televilla Mg++-konsentraatioilla

Inkubointi- Jäännösaktiivisuus aika (NU/ml)

(tunteja) Ilman 10"3 M 10"^ M 10“^ M

Mg++ Mg++ Mg++ EDTA lisäys- _tä_ 0 5,7 6,2 5,8 5,8 0,05 M MES, pH 6,5 1 4,8 5,2 5,0 1,4 2 4,2 4,6 3,3 0,3 4 0,5 0,4 0,2 0 0 6,0 6,2 6,5 5,8 0,05 M asetaatti, 1 5,3 5,6 5,8 0,1 pH 4,5 2 5,2 5,0 5,3 0 4 4,9 5,1 5,8 0

Edellä olevasta käy ilmi, että Bacillus brevis -entsyymi säilyttää noin 60-90 % aktiivisuudestaan 2 h kuluttua ja entsyymi on stabiilimpi pH-arvolla 4,5. Mg++-ioneilla on lisäksi stabiloiva vaikutus entsyymiaktiivisuuteen, mutta EDTA inaktivoi entsyymin.

pl-määritys pl on määritetty kannan A 446 raakauutteesta ohutlevygeeli-elektrofokusoinnin avulla noin 4,7:ksi.

Bacillus brevis A 303 -entsyymin plrksi saatiin 7,6 ja kroma-tofokusointitekniikan avulla 7,0, jonka menetelmän on selostanut PHARMACIA (PHARMACIA TECHNICAL BULLETIN: CHR0MAT0F0CUSING with POLYBUFFER™ and PBE™; PHARMACIA FINE CHEMICALS). Vaikutus eluoituu kahtena huippuna, mikä osoittaa, että a-asetolak-taattidekarboksylaasiaktiivisuus voi olla peräisin kahdesta proteiinista, joilla on eri pl.

is 83885

Km-määritys

Km on määritetty kannalle A 303 α-asetolaktaatista (DL) ei-kypsyneestä oluesta 10eC:ssa 3,8 mM:ksi.

Immunologiset ominaisuudet α-asetolaktaattidekarboksylaasin puhdistettu fraktio kannasta C 600 (Bacillus licheniformis) käytettiin immunisoimaan kaneja menetelmän mukaan, jonka ovat selostaneet Harboe ja Ingild: N. H. Axelsen: Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Technigues, Blackwell Scientific Publications, Lontoo 1983.

Tällä tavoin valmistettua vasta-ainetta Bacillus licheniformis -entsyymille käytettiin suorittamaan risti-immunoelekt-roforeesi ja peräkkäinen risti-immunoelektroforeesi, kuten ovat selostaneet vastaavasti A. 0. Grubb ja J. Kr011 edellä mainitussa julkaisussa.

Kun antigeeni ei ole homogeeninen, on tuotettu vasta-aine polyspesifinen ja synnyttää jopa 15 juovaa risti-immunoelekt-roforeesissa, joista yksi on a-asetolaktaattidekarboksylaasin saostusjuova. Tämän juovan identifioimista varten noudatettiin entsyymin vaikutukseen perustuvaa yläkerrostekniikkaa: immunoelektroforeesin jälkeen levyä ei kiinnitetty eikä värjätty kuten tavallista, vaan sitä inkuboitiin 5 min 30 ml:ssa seuraavaa seosta 14 cm:n läpimittaisen petrimaljan kannessa: 150 μΐ etyyli-2-asetoksi-2- Sekoitettiin ja inkuboitiin metyyli-asetoasetaattia huoneenlämmössä 15 min ajan.

1 200 μΐ H2O Sitten lisättiin H20:ta 1 650 μΐ 1 N NaOH 30 ml:aan asti.

Inkuboinnin jälkeen seoksen annettiin tippua pois levyltä, joka kiedottiin Vitawrap-muovikalvoon ja alumiinikalvoon ja inkuboitiin 30 min huoneenlämmössä.

Levy pantiin sitten 14 cm:n läpimittaisen petrimaljan kanteen ja peitettiin seuraavalla seoksella: i6 83885 30 ml 2-prosenttista LSA-agaroosia (H2O) 3 ml 1-prosenttista kreatiinia (H2O) Sekoitettiin 55°C:ssa 6 ml 5-prosenttista naftolia 2,5 N NaOH:ssa

Peitettyä levyä inkuboitiin huoneenlämmössä noin 1 h. a-aseto-laktaattidekarboksylaasisakan juova on väriltään punainen ja se voidaan identifioida.

Kuten edellä on mainittu, kaikkien luetteloitujen Bacillus licheniformis -kantojen entsyymien peräkkäinen risti-immuno-elektroforeesi C 600-a-asetolaktaattidekarboksylaasin vasta-aineen kanssa osoitti, että Bacillus licheniformis -entsyymit ovat immunokemiallisesti identtisiä, kun taas a-asetolaktaat-tidekarboksylaasi Bacillus breviksestä ei saostu C 600-a-asetolaktaattidekarboksylaasin vasta-aineen kanssa, osoittaen että Bacillus licheniformis - ja Bacillus brevis -kannat tuottavat molemmat eri tyyppistä a-asetolaktaattidekarboksylaa-sientsyymiä, mutta soveltuvat hyvin aiottuun käyttötarkoitukseensa oluen valmistuksessa.

Seuraavat esimerkit on annettu tämän keksinnön valaisevina toteutuksina eikä niitä ole tarkoitettu sen erikoisrajoituk-seksi.

Esimerkit 1 ja 2 eivät esitä esillä olevaa keksintöä, vaan ainoastaan keksinnössä käytettyä menetelmää.

Esimerkki 1

Kantaa A 446 (Bacillus licheniformis, NRRL B-3751) lisäänny-tettiin TY-elatusaineessa ravistelupulloissa 30°C:ssa kunnes OD (450) oli 6.

i7 83 8 85 TY-elatusaine:

Tryptikaasi 20 g

Hiivauute 5 g

FeCl3, 6 H20 7 mg

MnCl2, 4 H20 1 mg

MgS04, 7 H20 15 mg

Tislattua vettä ad 1 000 ml 100 ml ravistelupullojen viljelystä siirrettiin 1,5 litran Kieler-fermentoimisastiaan, joka sisälsi epäorgaanisia suoloja sisältävää elatusainetta per litra:

CaCl2, 2 H20 0,5 g

MgS04, 7 H20 0,5 g KH2P04 4,0 g (NH4)2S04 22 g

Hivenmetallien liuos * 3 ml

Pluroni 1 ml

Dekstroosi 150 g ♦Hivenmetallien liuos: H3BO3 500 mg/100 ml

CuS04, 5 H20 63 mg/100 ml KI 100 mg/100 ml

FeCl3, 6 H20 333 mg/100 ml

MnS04, H20 448 mg/100 ml

NaMo04, 2 H20 200 mg/100 ml

ZnS04, 7 H20 712 mg/100 ml

Viljelyn aikana pidettiin pH arvossa 7,0 lisäämällä NaOH:ta. Lämpötila oli 30°C ja ilmastus ja sekoitus säädettiin niin, että saatiin positiivinen hapen paine.

Solut otettiin talteen sentrifugoimalla sen jälkeen kun solu-tiheys vastasi arvoa OD (450)-34.

Käymisen edistyminen käy ilmi seuraavasta taulukosta: ie 83885

Taulukko VI

Aktiivisuus mitattuna käymisen aikana Käymlsaika NU/ml viljelyä OP (450) tunneissa 0 0 1,35 5 0 1,69 21 0,022 19 24 0,076 28 28 0,440 34

Esimerkki 2

Bacillus licheniformis -kantaa A 446 lisäännytettiin ja viljeltiin kuten on selostettu esimerkissä 1 sillä erotuksella, että käymisväliaine sisälsi 180 g dekstroosia ja että solut otettiin talteen silloin kun solutiheys vastasi arvoa OD (450)-47.

112 g soluja (märkä paino) suspendoitiin 20 mM K-fosfaattipus-kuriin, pH 6,8 ja käsiteltiin lysotsyymillä 30 min ajan käyttäen 1 mg/ml lysotsyymiä 37°C:ssa. Sitten liuotetut solut käsiteltiin ultraäänellä Branson-laitteella B 12. Lisättiin ammoniumsulfaattia saatuun raakauutteeseen 25-prosenttiseen kyllästykseen asti ja seos pantiin jäihin 30 min ajaksi.

Sentrifugoimisen jälkeen oli entsyymiaktiivisuus päällä olevassa nesteessä.

Lisättiin ammoniumsulfaattia päällä olevaan nesteeseen 70-pro-senttiseen kyllästykseen asti ja seos pantiin jäihin 30 min ajaksi. Sentrifugoimisen jälkeen oli entsyymiaktiivisuus sakassa.

Sakka suspendoitiin 20 mM K-fosfaattiin, pH 6,8 ja sen jälkeen lisättiin 200 mg/ml polyetyleeniglykolia (MW 6 000). Seos jätettiin 30 min ajaksi huoneenlämpöön. Aktiivisuus havaittiin päällä olevassa nesteessä sentrifugoimisen jälkeen.

i9 83885 Päällä olevan nesteen proteiinipitoisuus adsorboitiin Whatman DE 52 -anioninvaihtolaitteeseen, jota pestiin sitten 20 mM K-fosfaattipuskurilla, pH 6,8, ja eluoitiin sitten K-fosfaatti-puskurigradientilla (20 mM - 500 mM), pH 6,8. Fraktiot, joissa oli entsyymiaktiivisuutta, koottiin ja dialysoitiin 20 mM K-fosfaattipuskurin kanssa, pH 6,8. Lopuksi dialysaatti lyofi-lisoitiin.

Puhdistumisen edistyminen käy ilmi seuraavasta taulukosta VII: g 20 83 8 85

G

•H

:G

03 G

O G

-P 0) O :G o cm o ui o ro o~ G G O r- O r- O O O'

Em tfP t- CN ΓΟ Γ0 t— !— 03

G

P G 03 H •H O

r^}_| lo o- ooro^o rGG ' ' ' ' ' ' G (D *- oj ro o~ o t— <T\ CU X *- r-

G

•H

G

•H

tP-rl g dl vo o o τ* Loro^ +Jr- τί< LO (N LO 00 ^ MO O O O T-r-T- P G p ' ' ' *> ' ' '

gflifio O O O O O O

G

•H

λ: λ; -h oo τι» 'a* vo <τ\ <ω P G CM CO 00 T- (Nroo- ^ χ cm tj> lo θ' cncmt- H Ή h E lo ro θ' »— u"> ^ > σ> uo oo o lo ro ρ τι» O ^» ro o σ\ ΟΡΟ) ' ' ' ' ' X Z CU o »- T- r- oo a;

G

p-H

G -H

G G

H -H

•H

Φ lo o oo ro cm uo oo +j ro o ro ιηοο'τ—

O LO «— LO θ' ro CM CN

p !jl »d» CM »— U0 r-r-τ— ft g r- »“ τ- Ή H m >i Cp H O O O O O O r- o H LO LO LO uo TfUO'

!>g ti» Tl» Tl* U0 CM CN CM

I III

Il ei G a: I 03 A! -r-t ui g i g g ui g i a> m o +j g g Il :ιβ i O φ oi AI -H O 0) >i oi P P -p ph GG G 6 E G G G A! G G d) G -P -H At P A! -H moi G m > g 3 tn A ui G O oi AI > (liri G ui c >» •H m -H -H M U3 i I H G >i O -P -p CM :G G -P >i G p rl oi c -H m G E -H :G h h M m >»ip A (1) >ι·Η

4-> -P G O G O -P -n G G G -P -ro O O >i O -P AI -P G

O GG-P G E -P G -P -P ftH G G tl W Ή G -H G

-H 3 tl dl :G E G G »H -M G G G :G tP ui G -P Q P :G -Ρ T3 G

-P G G H rH G G G G »-I O d) G <1) H G Ή G 01 tX>TO 01 G QJ

X g rH-P m ui tl G M P m rl +J COAI H -PO -h -P A! Λ

G G G -H :G (D C H A OG-HHAI :G Ui G o r-l TO O -P G 'G O »H G

p G G O :G G G G G G G 0 G G :G G G O :G Λ -H G >i .G -H :G G

pL, 0SGCP Pi c ID ID +J P Oj -P UI -P ft C H (O -Π tH-PErH t* -P to p 2i 8 3 8 85

Esimerkki 3

Kantaa A 303 (Bacillus brevis, ATCC 11031) lisäännytettiin TY-elatusaineessa (ks. esimerkki 1) ravistelupulloissa 30°C:ssa kunnes solut olivat keskilogaritmisessa vaiheessa. 600 ml tätä viljelyä siirrettiin Biotec-käymislaitteeseen, joka sisälsi 8 litraa seuraavaa elatusainetta: (NH4)2S04 2,5 g/litra K2HP04 1

NaH2P04, 2H20 1

NaCl 0,25

ZnS04, 7H20 0,125 "

MgS04, 7H20 0,125 "

Hivenmetallien liuos* 0,7 ml/litra Hiivauute 6 g/litra

Pluroni 0,13 ml/litra

Dekstroosi 31,25 g/litra *) kuten on selostettu esimerkissä 1

Viljelyn aikana pidettiin pH arvossa 7,0 lisäämällä NaOH:ta. Lämpötila oli 35°C ja sekoittaminen ja ilmastus säädettiin niin, että saatiin positiivinen happipaine. Sopivalla hetkellä solut otettiin talteen sentrifugoimalla.

Käymisen edistyminen käy ilmi seuraavasta taulukosta:

Taulukko Vili

Aktiivisuus mitattuna käymisen aikana Käymisaika tunneissa NU/ml viljelyä 25450 1 0,005 2,4 2 0,01 4,1 3 0,02 7,5 4 0,18 15,3 5 0,47 17,5 6 0,41 22,2 7 0,17 24,0 8 0,13 24,0 22 83 885

Esimerkki 4

Kantaa A 303 (Bacillus brevis) lisäännytettiin ja viljeltiin kuten on selostettu esimerkissä 3. Solut otettiin talteen, kun oli saavutettu 0Ö4gQ = 8,0.

Solut suspendoitiin 20 mM K-fosfaattipuskuriin pH 6,8 ja käytettiin ne Manton-Gaulin-tyyppisessä homogenoimislaitteessa noin 400 baarin paineessa. Entsyymiaktiivisuus saostettiin fraktioiden ammoniumsulfaatilla, kuten on selostettu esimerkissä 2.

Sakka, joka sisälsi entsyymiaktiivisuuden, liuotettiin edellä mainittuun K-fosfaattipuskuriin, dialysoitiin saman puskurin avulla ja lopuksi konsentroitiin Amicon-painedialyysikennos-sa proteiinikonsentraatioon noin 10 mg/ml.

150 ml tätä uutetta oli lähtöaineena seuraavassa puhdistus-menetelmässä, kuten on esitetty taulukossa IX.

Uutteeseen lisättiin 150 ml DE 52 esisyklisoitua ioninvaihto-ainetta, joka oli tasapainotettu 20 mM K-fosfaattipuskurissa pH 6,8.

Liete suodatettiin BUchner-suppilossa. Entsyymivaikutus oli suodoksessa, joka dialysoitiin 25 mM histidiini-HCl-puskurilla pH 6,2.

Tähän uutteeseen lisättiin 40 ml PBE 94 (Pharmacian kromatofo-kusointiainetta), joka oli tasapainotettu edellä mainitulla histidiinipuskurilla. Liete suodatettiin Biichner-suppilossa. Entsyymiaktiivisuus oli suodoksessa, joka dialysoitiin 20 mM K-fosfaatilla, pH 6,8, joka oli kyllästetty 20-prosenttisesti ammoniumsulfaatilla. Pylvääseen pakattiin 200 ml fenyylisefa-roosia, joka oli tasapainotettu tässä puskurissa. Entsyymiaktiivisuus dialysoidussa suodoksessa pantiin pylvääseen ja eluoitiin gradientilla 20 mM K-fosfaatissa, pH 6,8, ammonium-sulfaatin 20 %:n kyllästyksestä 0 %:n kyllästykseen ja 0 %:sta etyleeniglykolia 50 %:iin etyleeniglykolia.

23 83 8 85

Entsyymiaktiivisuuden huippu löydettiin, fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja dialysoitiin 20 mM K-fosfaatin kanssa, pH 6,8, ja varastoitiin pakastettuna.

24 83885

Taulukko IX

Fraktio Vo- Prote- Vaikutus NU Puh- Tuotos lyymi iini NU NU per mg distus- % ml mg per ml kaik- prote- kerroin (näen- _ _ _ _ kiaan iinia _ näinen)

Uute 150 1890 2,4 365 0,19 1 100

Suodos DE 52 -käsittelyn jälkeen 140 510 1,9 262 0,51 2,7 72

Suodos PBE 94 -käsittelyn jälkeen 135 263 2,02 273 1,04 5,4 75

Yhdistetyt fraktiot fenyyli-sefaroosi-käsittelyn jälkeen 165 25 0,95 157 6,3 32 43

Yhdistetyt fraktiot konsentroin-nin ja dialyysin jälkeen 34 4,8 4,7 158 33 171 43 t 1

Claims

25 83885 1. α-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymi, tunnettu siitä, että sen pH-optimi on alueella 5-7 ja sen lämpötilaoptimi on alueella 35-55°C ja että se voidaan valmistaa viljelemällä sopivassa, hiili- ja typpilähteitä sekä epäorgaanisia suoloja sisältävässä elatusaineessa Bacillus brevis -kantaa ATCC 11031.
2. Förfarande för framställning av ett a-asetolaktatdekarboxylasenzym enligt patentkravet 1, kännetecknat av att en a-asetolaktatdekarboxylas producerande Bacillus brevis -stam odlas i ett lämpligt näringsmedium innehällande koi- och kvävekällor samt oorganiska salter, varefter a-asetolaktatde-karboxylasenzymet tillvaratages ur cellerna i mediet.

2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen a-asetolaktaat-tidekarboksylaasientsyymin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään sopivassa elatusaineessa, joka sisältää hiili-ja typpilähteet sekä epäorgaanisia suoloja, a-asetolaktaatti-dekarboksylaasia tuottavaa Bacillus brevis -kantaa, minkä jälkeen a-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymi otetaan talteen väliaineessa olevista soluista.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Bacillus brevis -kanta on ATCC 11031 tai sen mutantti tai variantti, jolla on oleellisesti samat ominaisuudet. 1. a-asetolaktatdekarboxylasenzym, kännetecknat av att det har ett pH-optimum i omrädet 5-7 och ett temperaturoptimum i omrädet 35-55°C och kan framställas genom odling av stam-men Bacillus brevis ATCC 11031 i ett lämpligt näringsmedium innehällande koi- och kvävekällor och oorganiska salter.
3. Förfarande enligt patentkravet 2, kännetecknat av att Bacillus brevis -stammen är ATCC 11031 eller en mutant eller variant därav med väsentligen samma egenskaper.