DK149335B - Alpha-acetolactat-decarboxylase samt fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

i 149335

Opfindelsen angår en hidtil ukendt a-acetolactat-decarboxylase og en fremgangsmåde til dens fremstilling.

Ved fermenteringen af alkoholiske produkter, f.eks. øl eller vin, dannes der ofte små mængder diacetyl.

5 Dannelsen af diacetyl er højst ufordelagtig p.g.a. dens stærke og ubehagelige lugt, og i tilfælde af øl har selv små mængder diacetyl på ca. 0,10 - 0,15 mg/liter en negativ indflydelse på øllets aroma og smag. Diacetyl i øl forårsages delvist af en infektion med en Pediococeus stamme, der 10 direkte producerer diacetyl (E. Geiger, Diacetyl in Bier, Brauwelt 46, 1680 - 1692, 1980), og delvist af det faktum, at ølgær ud fra pyruvat danner α-acetolactat, der ved en ikke-enzymatisk, men temperaturafhængig reaktion omdannes til diacetyl. Under modningen af øl omdannes diacetyl til 15 acetoin ved hjælp af reduktaser i gærcellerne. Acetoin er med hensyn til smag og aroma acceptabel i øl i meget højere koncentrationer end diacetyl.

En anden mulighed for at reducere diacetylmængden i øl er direkte at omdanne α-acetolactat til acetoin ved 20 hjælp af acetolactatdecarboxylase, jfr. dansk fremlæggelsesskrift nr. 145.502 . Acetolactatdecarboxylasen kan tilsættes under hovedfermenteringen af øllet eller under modningsprocessen.

Enzymet, der er et intracellulært enzym, udvindes 25 ifølge den kendte teknik fortrinsvis fra mikroorganismen Klebsiella pneumonia (Juni E., J.Biol.Chem. 195, 715 - 726, 1952) . Da Klebsiella pneumonia er en patogen mikroorganisme er den imidlertid ikke velegnet til industriel anvendelse.

Den acetolactatdecarboxylase, der produceres af denne mikro-30 organisme, har desuden en dårlig stabilitet under betingelserne for dens påtænkte anvendelse, hvilket i tilfælde af øl er en pH-værdi på ca. 4,3 og en temperatur på ca. 10°C.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et hidtil ukendt a-acetolactatdecarboxylase-35 enzym, der har en bedre stabilitet under de ovennævnte betingelser, og som yderligere kan udvindes fra ikke-pato-gene mikroorganismer i forbedret udbytte.

2 149335

Opfindelsen er baseret på den overraskende erkendelse, at en hidtil ukendt α-acetolactatdecarboxylase med sådanne egenskaber fremstilles i høje udbytter af mikroorganismer, der hører til arten Bacillus brevis. Det er i 5 ovennævnte danske fremlæggelsesskrift nr. 145.502 antydet, at α-acetolactatspaltende enzymer kan fås fra andre kilder end Klebsiella pneumonia. Dette er imidlertid ikke dokumenteret, og det fremgår ikke af fremlæggelsesskriftet, at en α-acetolactatdecarboxylase med de fordelagtige egenskaber af 10 enzymet ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles i høje udbytter ud fra Bacillus brevis.

Ifølge sit første aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en hidtil ukendt, stabil a-acetolactat-decarboxylase, der er ejendommelig ved, at den har et pH-15 optimum i området 5 til 7 og et temperaturoptimum i området 35° til 55°C og er identisk med den a-acetolactatdecarboxy-lase der dannes ved dyrkning af Bacillus brevis ATCC 11031 i et egnet næringsmedium, der indeholder carbon- og nitrogenkilder og uorganiske salte.

20 Alpha-acetolactatdecarboxylasen kan være i fast eller flydende form og har sædvanligvis i fast form en aktivitet i området fra 0,1 til 10 NE (som defineret i det følgende) per mg protein.

Ifølge et yderligere aspekt tilvejebringer den 25 foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstillingen af denne α-acetolactatdecarboxylase, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter dyrkning af en a-aceto-lactatdecarboxylase-producerende Bacillus brevis-stamme i et egnet næringsmedium, der indeholder carbon- og nitro-30 genkilder og uorganiske salte, hvorpå a-acetolactat-decarboxylasen udvindes fra cellerne i kulturvæsken.

Ifølge en foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er Bacillus brevis-stammen ATCC 11031 eller en mutant eller 35 variant heraf med væsentligt de samme egenskaber som denne. Den foretrukne mikroorganisme, der er i stand til at producere a-acetolactatdecarboxylasen ifølge opfindelsen, 149335 blev udvalgt på grundlag af dens evne til at omdanne a-acetolactat til acetoin, som derpå påvises.

Mere end 300 Bacillus stammer er blevet undersøgt ifølge den følgende procedure: 5 Stammerne blev dyrket i rystekolber ved 30°C og 37°C i 24 timer på følgende BCM-substrat: K2hpo4 1 g

NaH2P04, 2H20 1 g (NH4)2S04 2,5 g 10 NaCl 0,25 g

MgS04,7H20 0,2 g

FeCl3,6H20 0,04 g

MnS04,H20 0,25 mg

Glucose 10 g 15 Gærekstrakt 3 g

Vand op til 1000 g

Efter dyrkning blev cellerne høstet ved centrifugering, vasket i 0,03 M phosphat/citratpuffer (pH 6,0) og resuspenderet i samme puffer indtil OD(450) 40. Prøver på 2 20 ml blev derpå underkastet en ultralydbehandling eller en behandling med 1 mg lysozym per ml ved 37°C i 30 min. og blev derpå centrifugeret.

Alpha-acetolactatdecarboxylaseaktiviteten af supernatanterne blev bestemt ifølge proceduren beskrevet i 25 det følgende.

Screeningsproceduren afslørede, at kun et fåtal af de ca. 300 undersøgte mikroorganismer producerer a-acetolac-tatdecarboxylase i målelige mængder. Disse mikroorganismer er opstillet i den følgende tabel I sammen med enzymaktivi-30 teten bestemt ifølge ovennævnte procedure.

4 149335

Tabel I

Resultat af screeningsproceduren

Stamme Stamme Aktivitet Protein (NOVOsamling (NE) pr. mg/ml 5 nr.) mg protein B. brevis A 303 0,13 3“ B. coagulans A 345 0,007 3 B. pumilus A 185 0,008 2 10 B^ pumilus' A 328 0,011 3 B. pumilus A 329 0,004 2 B. subtilis A 518 0,005 3 B. subtilis C 601 0,06 1 B. licheni- 15 formxs A 446 0,11 3 B. licheni- formis C 600 0,19 2 B. licheni- formis A 88 0,15 2 20 B^ licheni- formis A 105 0,13 2 B. licheni- formis A 106 0,15 2 B. Ixcheni- 25 formis A 200 0,15 2 B. licheni- formis A 203 0,25 2 B. licheni- formis A 244 0,11 2 30 B^ licheni- formis A 248 0,14 2 B. licheni- formis A 1240 0,13 2

Stammerne C 600 og C 601 er blevet deponeret 35 af ansøgerne ved National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Scotland den 27. maj 1983 og fik referencenumrene NCIB 11868 og NCIB 11869.

De resterende stammer blev opnået fra forskellige kultursamlinger, som det fremgår af følgende liste: 5 149335 NOVO nr. Deponeringsnr.

A 303 ATCC 11031 A 345 NRS 83 A 185 ATCC 71 5 A 328 ATCC 4520 (B^ Mesentericus var flavus) A 329 ATCC 7065 A 518 IAM 1109 (B^ natto) A 446 NRRL B-3751 (Bestemt af ansøgerne til at være en B^ licheniformis) 10 A 88 ATCC 12759 A 105 ATCC 12713 = NRRL B-1001 A 106 ATCC 11946 A 200 NCIB 6816 A 203 NCIB 8537 15 A 244 NCTC 2120 A 248 NCTC 8721 A 1240 ATCC 27326

Ifølge den kendte teknik (Juni E., ibid.) er cellefri ekstrakter af Bacillus subtilis i stand til at 20 decarboxylere α-acetolactat til dannelse af acetoin. Den kendte teknik beskriver imidlertid ikke anvendelsen af sådanne ekstrakter. Opfinderne har undersøgt 69 forskellige Bacillus subtilis-stammer. Af disse udviste kun 5 a-aceto-lactatdecarboxylaseaktivitet, og disse 5 stammer var desuden 25 meget dårlige enzymproducenter. Bacillus coagulans og Bacillus pumilus-stammer viste sig også at være for dårlige enzymproducenter til industriel anvendelse.

Af de undersøgte Bacillus licheniformis-stammer producerede 13 ikke α-acetolactatdecarboxylase i målelige 30 mængder, 21 stammer producerede enzymet i meget lave mængder, og 11 stammer producerede enzymet i høje mængder.

Ved tandemkrydset immunoelektroforese viste det sig, at alle de nævnte Bacillus licheniformis-stammer producerer et a-acetolactatdecarboxylaseenzym, der er immunologisk identisk 35 med det enzym, der produceres af Bacillus licheniformis-stamme C 600.

Bacillus brevis-stammerne blev dyrket på tre forskellige medier i rystekolber. Kun én stamme, A 303 (ATCC 11031) udviste a-acetolactatdecarboxylaseaktivitet på alle 40 tre medier. De resterende 11 stammer udviste ikke a-aceto-lactatdecarboxylaseaktivitet i målelige mængder på nogen af 6 149335 de tre anvendte medier, a-acetolactatdecarboxylaseenzymet produceret af Bacillus brevis A 303 viste sig, m.h.t. immumokemiske egenskaber, at være ikke-identisk med det enzym, der produceres af Bacillus licheniformis-stammen C 5 600. Det faktum, at a-acetolactatdecarboxylaseenzymerne fra de forskellige Bacillus licheniformis-stammer udviser immunokemisk identitet, giver imidlertid grund til at tro, at andre a-acetolactatdecarboxylase-producerende Bacillus brevis-stammer end de undersøgte vil producere essentielt 10 det samme enzym som Bacillus brevis A 303. Med hensyn til "immunokemisk identitet" henvises der til N.H. Axelsen et al., "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis" (Oslo 1973) kapitel 10.

Bacillus brevis-stammen udmærker sig i forhold 15 til Bacillus licheniformis, ved at a-acetolactatdecarboxyla-sen.fra Bacillus brevis dannes uden uønskede bi-aktiviteter, især ferrulinsyredecarboxylaseaktivitet, der produceres af alle de undersøgte Bacillus licheniformis-stammer. Ferrulin-syredecarboxylase decarboxylerer ferrulinsyre, som findes i 20 gærende øl, til den meget ilde smagende forbindelse 4- vinylguajacol. Ferrulinsyredecarboxylase må derfor fjernes fra dyrkningsmediet fra Bacillus licheniformis under oparbej dningsproceduren.

Bacillus brevis-stammen udmærker sig desuden i 25 forhold til Bacillus licheniformis, fordi Bacillus brevis producerer et enzym, der omdanner de normale precursorer for 2,3-pentandion i øl til 3-hydroxy-2-pentanon, hvorved mængden af dårligt smagende pentandioner formindskes til et akceptabelt lavt niveau. Bacillus licheniformis-stammer 30 producerer ikke et sådant enzym.

Endelig giver Bacillus brevis-stammen bedre samlede udbytter i oprensningsproceduren på grund af mindre autolytisk aktivitet sammenlignet med Bacillus licheniformis-st ammer.

35 En NOVO enhed (NE) er defineret som den mængde enzym, der producerer et pmol acetoin pr. minut ved 20°C og pH 6.0 (pufferO,05 M MES (2(N-morpholino)-ethansul-phonsyre) , 0,05 mM MgC^ og 0,86 M NaCl) ved inkubering af 7 149335 en enzymholdig forsøgsprøve med et a-acetolactatsubstrat i følgende assay:

Substrat

Alpha-acetolactatsubstratet blev fremstillet umid-5 delbart før anvendelsen ved hydrolyse af o-acetoxy-a- methyl-acetoeddikesyreethylester. 30 μΐ af diesteren (0,165 m mol), 240 μΐ vand og 330 μΐ 1 M NaOH blev blandet og opbevaret på is i 15 minutter. Derpå blev der tilsat 5,4 ml vand, og det opnåede hydrolysat blev anvendt til prøven.

10 Assay

Puffer og forsøgsprøve med en enzymaktivitet på ca. 0,006 - 0,3 NE blev blandet og tempereret ved 20°C i nogle få minutter (rumfang 10,0 ml). Ved t = 0 blev der tilsat 400 μΐ hydrolysat, og prøver på 1 ml blev udtaget ved 15 t = 3, 6, 9, 20 og 50 minutter. Enzymreaktionen blev stoppet ved at anbringe prøverne på is og tilsætning af 200 μΐ 1M NaOH.

Den dannede mængde acetoin måles ifølge W.W.

Westerfeld (A Colorimetric Determination of Blood Acetoin, 20 J.Biol.Chem. 161, 495 - 502, 1945) ved tilsætning af 0,2 ml 0,5% creatin og 0,2 ml 5% a-naphthol i 2,5 N NaOH (frisk fremstillet) til 1,2 ml af de ovennævnte prøver. Efter 60 minutters reaktionstid blev E(524) målt. Som blindprøve blev der anvendt puffer i stedet for celleekstrakt. En standard-25 kurve aftegnes med 0, 0,5, 2 og 4 μg/ml acetoin.

En Bacillus-stamme, der er i stand til at fremstille a-acetolactatdecarboxylaseenzymet ifølge den foreliggende opfindelse, propageres sædvanligvis i et egnet fast næringsmedium ved ca. 30°C, før den dyrkes under aerobe 30 betingelser i et egnet dyrkningsmedium. Dyrkningsmediet indeholder assimilerbare carbonkilder (f.eks. glucose) og en basal saltblanding omfattende f.eks. ammoniumsulphat som nitrogenkilde. Dyrkningen udføres ved ca. 30°C og ved pH ca.

7, der holdes omtrent konstant ved hjælp af automatiske 35 hjælpemidler. Beluftning og omrøring justeres til opnåelse af et positivt oxygentryk. Efter dyrkningen høstes cellerne 8 149335 ved centrifugering og vask i en egnet puffer. Cellerne lyseres ved ultralydbehandling, behandling med en French presse, lysozymbehandling, Manton-Gaulin-behandling eller en kombination heraf.

5 Efter centrifugering opnås en rå ekstrakt, der kan underkastes et yderligere oprensningstrin som beskrevet i det følgende.

Alpha-acetolactatdecarboxylaseenzymet ifølge den foreliggende opfindelse kan oprenses fra den rå ekstrakt ved 10 en kombination af et eller flere af følgende trin: a) ammoniumsulphatudfældning b) polyethylenglycoludfældning c) DE 52-anionbytterchromatografi og dialyse, d) syrefældning og dialyse, 15 e) hydroxyapatitchromatografi og dialyse f) lyophilisering.

g) phenyl-sepharose chromatografi h) chromatofocusering pH- og temperaturafhængigheden af aktiviteten 20 af Bacillus brevis a-acetolactatdecarboxylasen blev bestemt på ekstrakter af Bacillus brevis-stamme A 303 ved forskellige pH-værdier og temperaturer ved hjælp af metoden til bestemmelse af a-acetolactatdecarboxylaseaktivitet beskrevet ovenfor, idet der anvendtes følgende puffersystem: 25 0,005 M MES (2(N-morpholino)-ethansulphonsyre 0,5 mM MgCl2 0,85 M NaCl pH 6.0 På tegningen viser fig. 1 grafisk den relative 30 aktivitet afbildet ved 30°C mod pH, og fig. 2 viser grafisk den relative aktivitet ved pH 6 afbildét mod temperaturen.

Bacillus brevis-enzymets 'pH-optimum viste sig at ligge i området fra 5 til 7, og temperaturoptimet fandtes at ligge i området fra 35 til 55°C. 1

Stabiliteten af en rå,ekstrakt af Bacillus brevis- enzymet blev undersøgt under anvendelsesbetingelserne, d.v.s.

9 149335 ved 10°C og i fermenteret, men ikke modnet øl. Stabiliteten fremgår af følgende tabel.

Tabel II

Stabilitetstest 5 Stamme Halveringstid i dage A 303 11

Da Klebsiella pneumonia-enzymet har en halveringstid på kun 2-3 timer udviser enzymet ifølge den foreliggen-10 de opfindelse en betydelig forbedret stabilitet under anvendelsesbetingelserne for ølbrygning i forhold til det kendte enzym.

Stabiliteten af Bacillus brevis A 303 enzymet fremgår desuden af følgende tabeller III og IV:

15 Tabel III

Restaktivitet (NE/ml) efter inkubering ved forskel- lige temperaturer __

Inkuberings- Restaktivitet (NE/ml) tid (timer) Temperatur

20 _ 30°C 40°C 50°C

0,05 M MES, pH 6,4 0 5,3 + 10“3M Mg++ 1 5,2 4,8 4,1 2 4,8 5,3 3,4 _4_4,7 4,0 0,2 25 0 5,1 0,05 M acetat, 1 4,9 4,4 3,6 pH 4,8 + 10"3M Mg++ 2 5,5 3,7 3,9 4 5,8 3,3 3,7 ίο 149335

Tabel IV

Restaktivitet i NE/ml efter inkubering ved 50°C med -H- varierende Mg -koncentrationer_

Inkuberings- Restaktivitet (NU/ml) 5 tid (timer) Ingen 10 ^M 10 ^M 10 tilsæt- Mg++ Mg++ EDTA ning __afs Mg+*___ 0 5,7 6,2 5,8 5,8 10 0,05 M MES, pH 6,5 1 4,8 5,2 5,0 1,4 2 4,2 4,6 3,3 0,3 _4_0^5_0,4 0,2 0 0 6,0 6,2 6,5 5,8 0,05 M acetat, pH 4,5 1 5,3 5,6 5,8 0,1- 15 2 5,2 5,0 5,3 0 4 4,9 5,1 5,8 0

Det fremgår af det ovennævnte, at Bacillus brevis-enzymet bevarer fra ca. 60 - 90% af sin aktivitet efter 2 timers forløb, idet enzymet er mere stabilt ved en 20 pH-værdi på 4,5. Desuden har Mg++ ioner en stabiliserende effekt på aktiviteten, medens enzymet inaktiveres af EDTA.

pi-bestemmelse pi af Bacillus brevis A 303-enzymet fandtes at være 7,6 og 7,0 bestemt ved chromatofocuseringstekn-iken 25 beskrevét af PHARMACIA (PHARMACIA TECHNICAL BULLETIN:

TM TM

CHROMATOFOCUSING with POLYBUFFER and PBE ; PHARMACIA FINE CHEMICALS)..Aktiviteten elueres som to toppe, hvilket indicerer, at «-acetolactatdecarboxylaseaktiviteten kan bestå af to proteiner med forskellig pi.

30 Km-bestemmelse

Km blev bestemt for A 303 på α-acetolactat (DL) i ikke-modnet øl ved 10°C til at være 3,8 mM.

11 149335

Immunologiske egenskaber

En oprenset fraktion af a-acetolactatdecarboxy-lasen fra stamme C 600 (Bacillus licheniformis) blev anvendt til at immunisere kaniner ifølge proceduren beskrevet af 5 Harboe og Ingild i: N.H. Axelsen: Handbook of Immunoprecipi-tation-in-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications. London 1983.

Det antistof, der blev produceret på denne måde. imod Bacillus licheniformis-enzymet, blev anvendt til at 10 udføre krydset immunoelektroforese og tandemkrydset immuno-elektroforese som beskrevet af A.O. Grubb og J. Krøll, i den ovennævnte publikation.

Da antigenet er inhomogent, er det dannede antistof polyspecifikt og producerer op til 15 bånd ved 15 krydset immunoelektrophorese, af hvilket ét er a-acetolac-tatdecarboxylaseudfældningsbåndet. For at identificere dette bånd blev der anvendt en overlægningsteknik baseret på enzymaktiviteten: efter immunoelektroforesen blev pladen ikke fikseret og farvet som sædvanlig, men blev inkuberet i 20 5 minutter i 30 ml af den følgende blanding i låget af en petriskål med en diameter på 14 cm: 150 μΐ ethyl-2-acetoxy-2-methyl-acetoacetat, 12 00 μΐ og 1650 μΐ IN NaOH blev blandet og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter. Derpå blev der fyldt op med vand til 30 ml.

25 Efter inkubering fik blandingen lov til at dryppe af fra pladen, som blev vredet i en Vita-Wrap plastfolie og i aluminiumfolie og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur.

Pladen blev derpå anbragt i låget af en petriskål 30 med en diameter på 14 cm og dækket med følgende blanding: 30 ml 2% LSA-agarose (H2o) 3 ml 1% kreatin (H^O) 6 ml 5% naphten i 2,5 N NaOH (blandet ved 55°C) 35 Den overdækkede plade blev inkuberet ved stuetem peratur i ca. 1 time. Båndet med a-acetolactatdecarboxy-laseudfældningeri viste en rød farve og kunne identificeres.

12 149335

Som nævnt ovenfor viste tandemkrydset immunoelek-troforese af enzymet fra alle de omtalte Bacillus licheni-formis-stammer mod C 600 a-acetolactatdecarboxylase-antistof, at Bacillus licheniformisenzymerne er immunokemisk 5 identiske, medens a-acetolactatdecarboxylasen fra Bacillus brevis ikke krydsbinder med C 600 a-acetolactatdecarboxy-laseantistoffet, hvilket viser, at Bacillus licheniformis-og Bacillus brevis-stammerne producerer forskellige typer af a-acetolactatdecarboxylaseenzymet.

10 Opfindelsen skal forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Stamme A 303 (Bacillus brevis, ATCC 11031) blev propageret på et TY-medium (20 g trypticase, 5 g gæreks-. 15 trakt, 7 mg FeCl3, 6h20, 1 mg MnCl2, 4H20, 15 mg MgS04, 7H20 og destilleret vand op til 1000 ml) i rystekolber ved 30°C, indtil cellerne var i den midterste logaritmiske fase. 600 ml af denne kultur blev overført til en Biotec-gærings-beholder, der indeholdt 8 liter af følgende medium: 20 (NH4)2S04 2,5 g/liter k2hpo4 1

NaH2P04,2H20 1

NaCl 0,25 -

ZnS04,7H20 0,125 - 25 MgS04,7H20 0,125 -

Spormetalopl. * 0,7 ml/liter Gærekstrakt 6 g/liter

Pluronic 0,13 ml/liter

Dextrose 31,25 g/liter 30 *Spormetalopl.: H3B03 500 mg/100 ml

CuS04, 5H20 63 mg/100 ml

Kl 100 mg/100 ml

FeCl3,6H20 333 mg/100 ml 35 MnS04,H20 448 mg/100 ml

NaMo04,2H20 200 mg/100 ml

ZnS04,7H20 712 mg/100 ml 13 149335

Under dyrkningen blev pH holdt ved 7,0 ved tilsætning af NaOH, temperaturen var 35°C, og omrøring og beluft-ning blev indstillet til opnåelse af et positivt oxygentryk.

På det optimale tidspunkt blev cellerne høstet ved 5 centrifugering.

Forløbet af gæringen fremgår af følgende tabel V.

Tabel V

Aktivitet målt under gæringen

Gæringstid i timer_NE/ml kultur_OD45Q

10 1 0,005 2,4 2 0,01 4,1 3 0,02 7,5 4 0,18 15,3 5 0,47 17,5 15 6 0,41 22,2 7 0,17 24,0 8 0,13 24,0

Eksempel 2

Stamme A 303 (Bacillus brevis) blev propageret og 20 dyrket som beskrevet i eksempel 1. Cellerne blev høstet ved OD45 0 = 8,°*

Cellerne blev suspenderet i 20 mM K-phosphat-puffer, pH 6,8 og ledt gennem en Manton-Gaulin-type homo-genisator ved et tryk på ca. 400 Bar. En fraktioneret 25 fældning af aktiviteten med ammoniumsulfat blev udført som beskrevet i eksempel 1.

Det aktivitetholdige bundfald blev opløst i den ovennævnte K-phosphatpuffer, dialyseret mod den samme puffer og til slut koncentreret i en Amicon-trykdialyserende celle 30 til en proteinkoncentration på ca. 10 mg/ml.

150 ml af denne ekstrakt var udgangsmaterialet for den følgende oprensningsprocedure, som vist i tabel IX.

150 ml DE 52 forcirkuleret ionbytter ækvilibreret i 20 mM K-phosphatpuffer, pH 6,8 blev sat til ekstrakten.

35 Opslemningen blev filtreret på en Buchnertragt.

Aktiviteten fandtes i filtratet, der blev dialyseret mod 25 mM histidin-HClpuffer, pH 6,2.

14 149335

Til denne ekstrakt blev der sat 40 ml PBE94 (Pharmacia chromatofocusing agent) ækvilibreret i den ovennævnte histidinpuffer. Opslemningen blev filtreret på en Buchnertragt.

5 Aktiviteten fandtes i filtratet, der blev dialyse ret mod 20 mM K-phosphat, pH 6,8, 20% mættet med ammonium-sulphat. En kolonne blev pakket med 200 ml phenylsepharose, der var ækvilibreret i denne puffer. Aktiviteten i det dialyserede filtrat blev tilledt kolonnen og elueret med en 10 gradient i 20 mM K-phosphat, pH 6,8 gående fra 20%'s mætning til 0%'s mætning med ammoniumsulphat og fra 0% ethylenglycol til 50% ethylenglycol.

Aktivitetstoppen blev fundet, samlet, koncentreret og dialyseret mod 20 mM K-phosphat, pH 6,8, og blev 15 opbevaret i frossen tilstand.

Tabel VI

149335 15

Fraktion Rumfang Protein Aktivitet NE pr. Oprens- Udbytte ml mg NE pr. NE mg pro- nings- % (til- ml total tein faktor synela-5 _dende)

Ekstrakt 150 1890 2,4 365 0,19 1 100

Filtrat efter 140 510 1,9 262 0,51 2,7 72 DE52-be-10 handling

Filtrat efter 135 263 2.02 273 1,04 5,4 75 PBE94- behandling 15 Pool efter phenylse- 165 25 0,95 157 6,3 32 43 pharosebe- handling

Pool efter 20 koncentre- 34 4,8 4,7 158 33 171 43 ring og dialyse