FI83972B - -acetolaktatdekarboxylasenzym och deras framstaellning. - Google Patents

Description

! 83972 α-asetolaktaattidekarboksylaasientsyyxni ja sen valmistaminen

Jakamalla erotettu hakemuksesta 842203.

5 Tämä keksintö koskee uutta a-asetolaktaattidekarboksylaasia ja sen valmistusmenetelmää.

Alkoholipitoisten juomien, esim. oluen tai viinin käymisen 10 aikana muodostuu usein pieniä määriä diasetyyliä. Diasetyy-lin muodostuminen on erittäin epäedullista, koska sillä on voimakkaan epämiellyttävä haju ja kun kyseessä on olut, jopa niinkin pienet määrät diasetyyliä kuin noin 0,10-0,15 mg/litra vaikuttavat haitallisesti oluen hajuun ja makuun.

15 Diasetyylin esiintyminen oluessa aiheutuu osittain Pediococ-cus-kannasta, joka muodostaa suoraan diasetyyliä (E. Geiger, Diacetyl in Bier, Brauwelt 46, 1680-1692, 1980) ja osittain siitä syystä, että pyruvaatista saatava oluthiiva muodostaa α-asetolaktaattia, joka muuttuu ei-entsymaattisessa, mutta 20 lämpötilasta riippuvaisessa, reaktiossa diasetyyliksi. Oluen kypsymisen aikana muuttuu diasetyyli asetoniksi reduktaasien vaikutuksesta hiivasoluissa. Asetoiini voidaan makunsa ja hajunsa puolesta hyväksyä oluessa paljon korkeammissa kon-sentraatioissa kuin diasetyyli.

25

Toinen mahdollisuus vähentää diasetyylin määrää oluessa on muuttaa suoraan α-asetolaktaatti asetoiiniksi asetolaktaat-tidekarboksylaasin avulla, ks. EP-patenttihakemusta nso 46066. Asetolaktaattidekarboksylaasia voidaan lisätä oluen 30 pääasiallisen käymisen aikana tai sen kypsymisvaiheen aikana.

Tämä entsyymi on intrasellulaarinen entsyymi ja sitä saadaan mikro-organismista Klebsiella pneumonia (E. Juni, J. Biol.

35 Chem. 195, 715-726, 1952). Mutta koska Klebsiella pneumonia on patogeeninen mikro-organismi, se ei kuitenkaan ole hyvin sopiva teollisuudessa käytettäväksi. Lisäksi on tämän mikro-organismin tuottama asetolaktaattidekarboksylaasi huonosti 2 83972 säilyvää aiotuissa käyttöolosuhteissaan, eli oluen ollessa kyseessä pH-arvolla noin 4,3 ja noin 10°C:ssa.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada uusi aseto-5 laktaattidekarboksylaasientsyymi, jolla on parempi stabiilisuus edellä mainituissa olosuhteissa ja jota lisäksi voidaan saada ei-patogeenisistä mikro-organismeista ja paremmin tuotoksin.

10 Keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että uutta asetolaktaattidekarboksylaasia, jolla on tällaiset ominaisuudet, valmistaa hyvin suuria määriä mikro-organismi, joka kuuluu lajiin Bacillus licheniformis.

15 Edellä mainitussa EP-patenttihakemuksessa sanotaan, että saadaan asetolaktaattia lohkaisevia entsyymejä myös muista entsyymeistä kuin Klebsiella pneumoniasta. Tätä ei ole kuitenkaan osoitettu eikä julkaisusta ilmene, että edellä olevan keksinnön mukaista, hyviä ominaisuuksia omaavaa a-20 asetolaktaattidekarboksylaasia voitaisiin valmistaa suurin saannoin Bacillus licheniformis-kannasta.

Esillä olevan keksinnön ensimmäisen aspektin mukaan saadaan uutta stabiilia a-asetolaktaattidekarboksylaasientsyy-25 miä, jolle on tunnusomaista, että sen pH-optimi on alueella 5-6 ja että se on identtinen sen a-asetolaktaattidekarboksy-laasientsyymin kanssa, joka saadaan viljelemällä sopivassa, hiili- ja typpilähteitä sekä epäorgaanisia suoloja sisältävässä elatusaineessa Bacillus licheniformis -kantoja ATCC 30 12759, ATCC 12713, ATCC 11946, ATCC 27326, NRRL B-3751, NCTC 2120, NCTC 8721, NCIB 6816, NCIB 8537 tai NCIB 11868.

α-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymituote voi olla kiinteässä tai nestemäisessä muodossa ja sen vaikutus tavalli-35 sesti kiinteässä muodossa on suuruusluokkaa 0,1-10 NU (joka tullaan jäljessä määrittelemään) per mg proteiinia.

I! 3 83972

Esillä olevan keksinnön toisen aspektin mukaan voidaan valmistaa α-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymiä menetelmän mukaan, joka käsittää sen, että viljellään sopivassa, hiili- ja tyyppilähteet sekä epäorgaanisia suoloja sisältä-5 vässä elatusaineessa a-asetolaktaattidekarboksylaasia tuottavaa Bacillus licheniformis -kantaa, jonka jälkeen a-asetolaktaattidekarboksylaasi otetaan talteen väliaineessa olevista soluista.

10 Parhaina pidettyjä Bacillus licheniformis -kantoja ovat ATCC 12759, ATCC 12713, ATCC 11946, ATCC 27326, NRRL B-3751, NCTC 2120, NCTC 8721, NCIB 6816, NCIB 8537 ja NCIB 11868 ja niiden α-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymiä valmistavat mutantit ja variantit.

15

Kun käytetään Bacillus licheniformis-kantaa tämän keksinnön mukaisen α-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymin valmistamiseen, tulisi elatusaineen sisältää mieluimmin sellainen typpilähde, jonka vapaiden aminohappojen pitoisuus ei tukah-20 duta α-asetolaktaattidekarboksylaasin muodostumista, mieluimmin epäorgaaninen typpilähde.

Tämän keksinnön mukaisen a-asetolaktaattidekarboksylaasient-syymin valmistamiseen tarvittavat mikro-organismit on valit-25 tu niiden kyvyn mukaan muuttaa α-asetolaktaatti asetoiinik-si, joka sitten havaitaan.

On testattu yli 300 Bacillus-kantaa seuraavan menetelmän mukaan: Kantoja viljellään ravisteltavissa pulloissa 30 30°C:ssa ja 37°C:ssa 24 h ajan seuraavassa BCM-substraatis-sa: K2HP04 1 g

NaH2P04, 2H20 1 g 35 (NH4)2S04 2,5 g

NaCl 0,25 g

MgS04, 7H20 0,2 g

FeCla, 6H20 0,04 g 4 83972

MnSO*, H2O 0,25 mg

Glukoosi 10 g

Hiivauute 3 g

Vettä ad 1 000 g 5

Viljelyn jälkeen otettiin solut talteen sentrifugoimalla, pestiin ne 0,03 M fosfaatti/sitraattipuskurilla (pH 6,0) ja suspendoitiin uudelleen samaan puskuriin kunnes OD (450) 40. 2 ml:n tasamääriä käsiteltiin ultraäänikäsittelyn 10 avulla tai niitä käsiteltiin 1 mg:n kanssa lysotsyymiä per ml lämpötilassa 37°C 30 min ajan ja sitten sentrifugoitiin.

Päällä olevien nesteiden a-asetolaktaattidekarboksylaasivai-kutus määrättiin menetelmän mukaan, joka on selostettu 15 kohdassa "α-asetolaktaattidekarboksylaasivaikutuksen määrääminen " .

Seulontamenetelmän avulla kävi ilmi, että ainoastaan harvat testatuista noin 300 mikro-organismista valmistavat a-aseto-20 laktaattidekarboksylaasia havaittavissa olevia määriä. Nämä mikro-organismit on luetteloitu seuraavassa taulukossa 1 samoin kuin niiden entsyymivaikutus edellä mainitun menetelmän mukaan määrättynä.

25 Taulukko 1

Seulontamenetelmän tulos

Kanta Kanta (NOVO- Vaikutus (NU) Proteiini kokoelman n:o) per mg proteiinia mg/ml 30 B. brevis A303 0,13 4 B. coagulans A 345 0,007 3 B. pumilus A 185 0,008 2 B. pumilus A 328 0,011 3 35 B. pumilus A 329 0,004 2 B. subtilis A 518 0,005 3 B. subtilis C 601 0,06 1 B. licheniformis A 446 0,11 3 5 83972

Taulukko 1 (jatkoa)

Seulontamenetelmän tulos

Kanta Kanta (NOVO- Vaikutus (NU) Proteiini 5 kokoelman n:o) per mg proteiinia mg/ml B. licheniformis C 600 0,19 2 B. licheniformis A 88 0,15 2 B. licheniformis A 105 0,13 2 10 B. licheniformis A 106 0,15 2 B. licheniformis A 200 0,15 2 B. licheniformis A 203 0,25 2 B. licheniformis A 244 0,11 2 B. licheniformis A 248 0,14 2 15 B. licheniformis A 1240 0,13 2

Kannat C 600 ja C 601 on talletettu National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Skotlanti, 27. päivänä toukokuuta 1983 ja niille on annettu ha-20 kunumerot vastaavasti NCIB 11868 ja NCIB 11869.

Muut kannat on saatu eri viljelykokoelmista, kuten käy selville seuraavasta luettelosta: 25 NOVO-n: o_Hakunumero A 303 ATCC 11031 A 345 NRS 83 A 185 ATCC 71 A 328 ATCC 4520 (B. Mesentericus var. fla- 30 vus) A 329 ATCC 7065 A 518 IAM 1109 (B. natto) A 446 NRRL B-3751 (Patentinhakijat ovat mää ritelleet sen B. licheniformikseksi) 35 A 88 ATCC 12759 A 105 ATCC 12713 = NRRL B-1001 A 106 ATCC 11946 A 200 NCIB 6816 6 83972 NOVO-n: o_Hakunumero A 203 NCIB 8537 A 244 NCTC 2120 A 248 NCTC 8721 5 A 1240 ATCC 27326

Aiemmassa tekniikassa esitetään (E. Juni, sama kuin edellä) että Bacillus subtilis -mikro-organismin solu-vapaat uutteet pystyvät dekarboksyloimaan <x-asetolaktaatin, jolloin muodos-10 tuu asetoiinia, mutta käyttämättä näitä uutteita. Sen vuoksi on testattu 69 erilaista Bacillus subtilis -kantaa. Näistä ainoastaan 5 osoitti a-asetolaktaattidekarboksylaasivaikutusta ja lisäksi nämä viisi kantaa olivat kaikki huonoja entsyymin valmistajia. Myös Bacillus coagulans- ja Bacillus pumilus 15 -kannat osoittautuivat liian huonoiksi entsyymin valmistajiksi teollisessa käytössä.

Testatuista Bacillus licheniformis -kannoista 13 ei tuottanut a-asetolaktaattidekarboksylaasia havaittavia määriä, 21 tuotti 20 entsyymiä hyvin alhaisia määriä ja 11 kantaa (joista 10 on luetteloitu tässä patenttiselityksessä) tuotti entsyymiä suuria määriä. Huomattiin peräkkäisen ristiin menevän immuno-elektroforeesin avulla, että kaikki luetteloidut Bacillus licheniformis -kannat valmistavat a-asetolaktaattidekarboksy-25 laasientsyymiä, joka on immunokemiallisesti identtinen Bacillus licheniformis -kannan C 600 valmistaman kanssa.

Bacillus brevis -kantoja on kasvatettu kolmessa eri elatusai-neessa ravistelupulloissa. Vain yksi kanta, A 303 (ATCC 11031) 30 osoitti α-asetolaktaattidekarboksylaasivaikutusta kaikissa kolmessa elatusaineessa. Muut 11 kantaa eivät osoittaneet a-asetolaktaattidekarboksylaasivaikutusta huomattavissa määrin missään näistä kolmesta käytetystä elatusaineesta. Bacillus brevis A 303:n tuottaman α-asetolaktaattidekarboksylaasient-35 syymin havaittiin olevan ei-identtinen mitä tulee immunoke- miallisiin ominaisuuksiin Bacillus licheniformis -kannan C 600 tuottamassa entsyymissä. Mutta se seikka, että eri Bacillus licheniformis -kantojen tuottamilla a-asetolaktaattidekarbok- li 7 83972 sylaasientsyymeillä on immunokemiallinen identtisyys, antaa aiheen odottaa, että muut a-asetolaktaattidekarboksylaasia tuottavat Bacillus brevis -kannat kuin tässä yhteydessä testatut tuottaisivat olennaisesti samaa entsyymiä kuin Bacillus 5 brevis A 303. Mitä tulee "immunokemialliseen identtisyyteen", viitataan teokseen N. H. Axelsen et ai. "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis" (Oslo 1973), kappale 10.

Tämän keksinnön toteutuksessa Bacillus brevis eroaa Bacillus 10 licheniformis -kannasta, koska a-asetolaktaattidekarboksylaasi Bacillus breviksestä voidaan valmistaa ilman ei-haluttuja sivuvaikutuksia, nimenomaan ferrulihappodekarboksylaasivaiku-tusta, jonka saavat aikaan kaikki testatut Bacillus licheni-formis -kannat. Ferrulihappodekarboksylaasi dekarboksyloi 15 ferrulihapon, jota on käymistilassa olevassa oluessa, erittäin pahalta maistuvaksi yhdisteeksi 4-vinyyliguajakoli. Tämän vuoksi on ferrulihappodekarboksylaasi poistettava Bacillus licheniformiksen viljelynesteestä talteenottoprosessin aikana.

20 Bacillus brevis eroaa Bacillus licheniformiksesta vielä sen vuoksi, että Bacillus brevis valmistaa entsyymiä, joka muuttaa 2,3-pentaanidionin normaalit esiasteet oluessa 3-hydroksi-2-pentanoniksi ja vähentää siten pahalta maistuvien pentaanidio-nien määrät sopivan alhaiselle tasolle. Bacillus lichenifor-25 mis -kannat eivät tuota tätä entsyymiä.

Alfa-asetolaktaattidekarboksvlaasivaikutuksen määrääminen Yksi NOVO-yksikkö (NU) määritellään entsyymimääräksi, joka tuottaa 1 μπιοί asetoiinia per minuutti 20°C:ssa ja pH-arvolla 30 6,0 (0,03-moolinen sitraatti/fosfaattipuskuri), kun inkuboi- daan entsyymiä sisältävää testinäytettä a-asetolaktaattisubst-raatin kanssa seuraavassa kokeessa:

Substraatti: 35 α-asetolaktaattisubstraatti valmistettiin välittömästi ennen käyttöä hydrolysoimalla alfa-asetoksi-alfa-metyyli-aseto-etikkahapon etyyliesteriä: 8 83972 30 μΐ diesteriä (0,165 mmol), 240 μΐ vettä ja 330 μΐ 1 M NaOH:ta sekoitettiin keskenään ja säilytettiin jäissä 15 min ajan. Sitten lisättiin 5,4 ml vettä ja saatua hydrolysaattia ti käytettiin testiin.

5

Koe;

Puskuri ja testinäytteet, joiden entsyymivaikutus oli noin 0,006-0,3 NU, sekoitettiin keskenään ja lämpökäsiteltiin 20°C:ssa joidenkin minuuttien ajan (lopullinen volyymi 10,0 10 ml). Hetkellä t = 0 lisättiin 400 μΐ hydrolysaattia ja otettiin 1 ml:n näytteitä hetkellä t = 3, 6, 9, 20 ja 50 min. Entsyymireaktio pysäytettiin panemalla näytteet jäihin ja lisäämällä 200 μΐ 1 M NaOHita.

^ 15 Muodostuneen asetoiinin määrä mitataan W. W. Westerfeld'in mukaan (A Colorimetric Determination of Blood Acetoin, J.

Biol. Chem. 161, 495-502, 1945) lisäämällä 0,2 ml 0,5-prosent-tista kreatiinia ja 0,2 ml 5-prosenttista alfa-naftolia 2,5 N NaOH:ssa (juuri valmistettua) 1,2 ml:aan edellä olevia 20 näytteitä. 60 min reaktioajan jälkeen mitattiin E(524).

Vertailuna käytettiin näytettä, jossa oli puskuria solu-uutteen asemesta.

25 Merkittiin standardikäyrä 0, 0,5, 2 ja 4 μΐ/ml asetoiinia.

Alfa-asetolaktaattidekarboksvlaasientsvvmintuotteen valmistaminen

Bacillus-kannan, joka pystyy tuottamaan esillä olevan keksin-30 nön mukaista α-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymiä, annetaan tavallisesti lisääntyä sopivassa kiinteässä ravinneliuok-sessa noin 30°C:ssa ennen kuin sitä viljellään aerobisissa olosuhteissa sopivassa käymisvällaineessa. Käymisväliaine sisältää assimiloituvia hiililähteitä (esim. dekstroosia) ja 35 perussuolaseoksen, jossa on mm. ammoniumsulfaattia typpiläh-teenä. Korkeiden tuotosten saamiseksi Bacillus licheniformis -systeemissä on tärkeätä, että käymisväliaine ei sisällä ylimäärää vapaita aminohappoja, jotka voivat tukahduttaa a- l! 9 83972 asetolaktaattidekarboksylaasituotannon. Käyminen suoritetaan noin 30°C:ssa ja pH-arvolla 7, joka pidetään yllä lähes vakiona automaattisin välinein. Tuuletus ja sekoittaminen säädetään niin, että aikaansaadaan positiivinen hapen paine.

5 Käymisen jälkeen solut otetaan talteen sentrifugoimalla ja pestään sopivalla puskurilla. Solut liuotetaan ultraäänikäsit-telyn avulla, ranskalaisen painekäsittelyn, lysotsyymikäsitte-lyn, Manton-Gaulin-menetelmän tai näiden menetelmien yhdistel-10 män avulla.

Sentrifugoimisen jälkeen saadaan raakauutetta, joka voi joutua puhdistusprosessiin, kuten seuraavassa kappaleessa esitetään.

15 Alfa-asetolaktaattidekarboksvlaasientsvvmin puhdistaminen

Esillä olevan keksinnön mukainen a-asetolaktaattidekarboksy-laasientsyymi voidaan puhdistaa raakauutteesta kombinoimalla yhtä tai useampia seuraavista vaiheista: 20 a) ammoniumsulfaattisaostus b) polyetyleeniglykolisaostus c) DE 52-anioninvaihtokromatografia ja dialyysi, d) happosaostus ja dialyysi, e) hydroksiapatiittikromatografia ja dialyysi ja 25 f) lyofilisoiminen g) fenyylisefaroosikromatografia h) kromatofokusointi α-asetolaktaattidekarboksylaasin puhdistaminen, jota on saatu 30 viljelemällä Bacillus licheniformis -kantaa C 600 kuten esimerkissä 1 on selostettu, suoritettiin seuraavalla tavalla: 94 g soluja (märkäpaino) suspendoitiin 20 mM K-fosfaattipusku-riin pH 6,8 ja suoritettiin lysotsyymikäsittely 30 min ajan 35 käyttäen 1 mg/ml lysotsyymiä 37°C:ssa ja käsiteltiin sitten ultraäänellä Branson B 12-laitteella. Sentrifugoimisen jälkeen päällä oleva neste pantiin DE 52-anioninvaihtopylvääseen, jolloin entsyymi adsorboitui täydellisesti. Pylväs pestiin 10 83972 20 mM kaliuxnfosfaattipuskurilla (pH 6,8) ja eluoitiin kalium-fosfaattigradientilla (20 mM - 500 mM), pH 6,8. Fraktioista analysoitiin entsyymivaikutus kuten edellä on esitetty. Vaikutuksen omaavat fraktiot yhdistettiin.

5

Yhdistetyt fraktiot saostettiin hapolla lisäämällä fosforihap-poa pH-arvoon 4,5 asti. Sentrifugoimisen jälkeen päällä oleva neste dialysoitiin 20 mM kaliumfosfaatilla pH 6,8. Dialysaatti pantiin hydroksiapatiitti-(HA)-pylvääseen, joka pestiin ka-10 liumfosfaattipuskurilla pH 6,8 ja eluoitiin sitten kaliumfos-faattigradientilla kuten edellä.

Fraktiot, jotka osoittivat entsyymivaikutusta, yhdistettiin ja dialysoitiin yli yön 20 mM kaliumfosfaatilla, pH 6,8.

15 Lopuksi dialysaatti lyofilisoitiin.

Entsyymivaikutus ja tuotokset käyvät ilmi seuraavasta taulukosta: H 83972 tn

O

G -P

0)0 o oo *r ro «— vo

C 3 O (N ·*Τ CM OS OS O

•HE-IC^T— r— s— r- s—

E

<a -P i tn tn H 3

Ό -PC

X tn -p

3 -PO

α ό p p Tr mm m oo ·*τ »*30) * ** ^ *» v

—. CU PC r- Ό· s— CN CM CO CM

0 3 (N <n rs) es) ro

C H

•H C

G -H

Cu σι-h OEOm o r^rsj cm »to 4J u n t— corn vo as <— •P P O o t— mm mmoo CU D 1) P ^ ~ - C Z C Qj o O OO ooo

C

σ' .3 •<3· .3 σ> -p

Pi - Pi C -pcm vo ms— voom CU D 3 o oo ro r~ r-'OT— •ro 2 Λ! ro co -sr ro cm cm ro 3

M «H

M O

tn o i—i λ; C S oo S- OVO vorr p; CU coco mro cmoo 3 -P P oo -sr -sr cm cm<— •P L> L3 3 * 302:0.0 s- s- s- T- .-

3 P

E· o Ή c c

-P -P

tn -p -PQ) oo o oo s— co o .3 -P VO <— s— vo as oo co PO s— m covo sr sr ro (UPO cm co e. c. ε s— :3

-P

tn -p >s E tn •P >1 <U >. co •ei .-π o o oo mmo -- I—( OP VO C- o O CM ST ·.

-P>£co CM COCO CM CM T— > c Cl

<D PJ

O Q) 3 C I

O -P Ai -P -PO -PO

md (U^rP^tnoC >i -P C

4J 4J+j:3 iUJ OM P -P -P 3 P

U O 3 (D O-π Q)03rP ti) C CU 0 E C C tn C

P 3 -P -P +J -p tn :3 >i CL) -P -P O 3 <U >.0) 3 -P 3 tnu-)CM inu o-n >itu tn-pppo mi o -p pc p: p p; m ppcq. p pc p m p; p p; h p! x C 3 3 Ό 3 Ό 3 0. C 3-P Ό 3 I 3 *P 3 P 3 3 P 3 x p η X p 3 CU -P '-3 C P < P W -P :3 3 X C CtC >. Ui Q >. P C tn Q-co LhP X σ·η Q-ro i-j i2 83972

Entsyymin kemialliset ominaisuudet

Esillä olevan keksinnön mukaisen Bacillus licheniformis -asetolaktaattidekarboksylaasientsyymin vaikutuksen riippuvaisuus pH-arvosta määrättiin Bacillus licheniformis -kantojen 5 A 446 ja C 600 uutteista eri pH-arvoilla 0,03 M sitraatti/fos-faattipuskurissa 20°C:ssa edellä olevan a-asetolaktaattidekar-boksylaasivaikutuksen määräämismenetelmän mukaan. Viitataan mukana liitteenä oleviin piirustuksiin, joista kuvio 1 ja kuvio 2 esittävät graafisesti suhteellista vaikutusta pH-10 arvoon nähden a-asetolaktaattidekarboksylaasientsyymeillä, jotka on valmistettu vastaavasti kannoista A 446 ja C 600. Optimi-pH-arvon havaittiin olevan välillä 5-6.

Stabiilisuus 15 Bacillus licheniformis -entsyymin raakauutteiden stabiilisuus testattiin käyttöolosuhteissa, so. 10°C:ssa ja käyneessä, mutta ei kypsyneessä oluessa.

Stabiilisuus tulee esiin seuraavasta taulukosta.

20

Taulukko III Stabiilisuustesti

Kanta Puoliintumisikä päivissä 25 A 446 21 C 600 15 A 446 11,5 (määrättynä käymisvai heessa olevasta oluesta) 30 Kun Klebsiella pneumonia -entsyymin puoliintumisikä on vain 2-3 tuntia, esillä olevan keksinnön mukainen entsyymi osoittaa huomattavasti parempaa stabiilisuutta oluen pano-olosuhteissa verrattuna tunnettuun entsyymiin.

35 pl-määritvs pl on määrätty kanta A 446:n raakauutteesta ohutlevygeeli-elektrofokusoinnin avulla noin 4,7:ksi.

i3 83972

Immunologiset ominaisuudet α-asetolaktaattidekarboksylaasin puhdistettu fraktio kannasta C 600 (Bacillus licheniformis) käytettiin immunoimaan kaneja menetelmän mukaan, jonka ovat selostaneet Harboe ja Ingild: 5 N. H. Axelsen: Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications, Lontoo 1983.

Tällä tavoin valmistettua vasta-ainetta Bacillus licheniformis -entsyymille käytettiin suorittamaan risti-immunoelektro-10 foreesi ja peräkkäinen risti-immunoelektroforeesi, kuten ovat selostaneet vastaavasti A. 0. Grubb ja J. Krtfll edellä mainitussa julkaisussa.

Kun antigeeni ei ole homogeeninen, on tuotettu vasta-aine 15 polyspesifinen ja synnyttää jopa 15 juovaa risti-immunoelekt-roforeesissa, joista yksi on a-asetolaktaattidekarboksylaasin saostus juova. Tämän juovan identifioimista varten noudatettiin entsyymin vaikutukseen perustuvaa yläkerrostekniikkaa. immunoelektroforeesin jälkeen levyä ei kiinnitetty eikä vär-20 jätty kuten tavallista, vaan sitä inkuboitiin 5 min 30 ml:ssa seuraavaa seosta 14 cmsn läpimittaisen petrimaljan kannessa: 150 μΐ etyyli-2-asetoksi-2- Sekoitettiin ja inkuboitiin metyyli-asetoasetaattia huoneenlämmössä 15 min ajan.

25 1 200 μΐ H20 Sitten lisättiin H20:ta 1 650 μΐ 1 N NaOH 30 ml:aan asti.

Inkuboinnin jälkeen seoksen annettiin tippua pois levyltä, joka kiedottiin Vitawrap-muovikaIvoon ja alumiinikalvoon ja 30 inkuboitiin 30 min huoneenlämmössä.

Levy pantiin sitten 14 cm:n läpimittaisen petrimaljan kanteen ja peitettiin seuraavalla seoksella: 35 30 ml 2-prosenttista LSA-agaroosia (HaO) 3 ml 1-prosenttista kreatiinia (Ha0) Sekoitettiin 55°C:ssa i4 83972 6 ml 5-prosenttista naftolia 2,5 N NaOH:ssa

Peitettyä levyä inkuboitiin huoneenlämmössä noin 1 h. a-aseto-5 laktaattdekarboksylaasisakan juova on väriltään punainen ja se voidaan identifioida.

Kuten edellä on mainittu, kaikkien luetteloitujen Bacillus licheniformis -kantojen entsyymien peräkkäinen risti-immuno-10 elektroforeesi C 600-a-asetolaktaattidekarboksylaasin vasta-aineen kanssa osoitti, että Bacillus licheniformis -entsyymit ovat immunokemiallisesti identtisiä, kun taas a-asetolaktaat-tidekarboksylaasi Bacillus breviksestä ei saostu C 600-a-asetolaktaattidekarboksylaasin vasta-aineen kanssa, osoittaen 15 että Bacillus licheniformis - ja Bacillus brevis -kannat tuottavat molemmat eri tyyppistä a-asetolaktaattidekarboksylaa-sientsyymiä, mutta soveltuvat hyvin aiottuun käyttötarkoitukseensa oluen valmistuksessa.

20 Seuraavat esimerkit on annettu tämän keksinnön valaisevina toteutuksina eikä niitä ole tarkoitettu sen erikoisrajoituk-seksi.

Esimerkki 1 25 Kantaa A 446 (Bacillus licheniformis, NRRL B-3751) lisäänny-tettiin TY-elatusaineessa ravistelupulloissa 30°C:ssa kunnes OD (450) oli 6.

TY-elatusaine: 30 Tryptikaasi 20 g

Hiivauute 5 g

FeCl3, 6 HaO 7 mg

MnCla, 4 HaO 1 mg

MgS04, 7 HaO 15 mg 35 Tislattua vettä ad 1 000 ml is 83972 100 ml ravistelupullojen viljelystä siirrettiin 1,5 litran

Kieler-fermentoimisastiaan, joka sisälsi epäorgaanisia suoloja sisältävää elatusainetta per litra: 5 CaCl2, 2 H20 0,5 g

MgSCU, 7 H20 0,5 g KH2P04 4,0 g (NH4)2S04 22 g

Hivenmetallien liuos * 3 ml 10 Pluroni 1 ml

Dekstroosi 150 g ♦Hivenmetallien liuos: H3BO3 500 mg/100 ml 15 CuS04, 5 H20 63 mg/100 ml KI 100 mg/100 ml

FeCl3, 6 H20 333 mg/100 ml

MnS04, H20 448 mg/100 ml

NaMo04, 2 H20 200 mg/100 ml 20 ZnS04, 7 H20 712 mg/100 ml

Viljelyn aikana pidettiin pH arvossa 7,0 lisäämällä NaOH:ta. Lämpötila oli 30°C ja tuuletus ja sekoitus säädettiin niin, että saatiin positiivinen hapen paine.

25

Solut otettiin talteen sentrifugoimalla sen jälkeen kun solu-tiheys vastasi arvoa OD (450) 34.

Käymisen edistyminen käy ilmi seuraavasta taulukosta: 30

Taulukko VI

Vaikutus mitattuna käymisen aikana Käymisaika NU/ml viljelyä OP M50^ 35 tunneissa 0 0 1,35 5 0 1,69 21 0,022 19 ie 83972

Taulukko VI (jatkoaϊ

Vaikutus mitattuna käymisen aikana Kävmisaika NU/ml viljelyä OP (450) 5 tunneissa 24 0,076 28 28 0,440 34

Esimerkki 2 10 Bacillus licheniformis -kantaa A 446 lisäännytettiin ja viljeltiin kuten on selostettu esimerkissä 1 sillä erotuksella, että käymisväliaine sisälsi 180 g dekstroosia ja että solut otettiin talteen silloin kun solutiheys vastasi arvoa OD (450) 47.

15 112 g soluja (märkä paino) suspendoitiin 20 mM K-fosfaattipus-kuriin, pH 6,8 ja käsiteltiin lysotsyymillä 30 min ajan käyttäen 1 mg/ml lysotsyymiä 37°C:ssa. Sitten liuotetut solut käsiteltiin ultraäänellä Branson-laitteella B 12. Lisättiin 20 ammoniumsulfaattia saatuun raakauutteeseen 25-prosenttiseen kyllästykseen asti ja seos pantiin jäihin 30 min ajaksi.

Sentrifugoimisen jälkeen oli entsyymivaikutus päällä olevassa nesteessä.

25

Lisättiin ammoniumsulfaattia päällä olevaan nesteeseen 70-prosenttiseen kyllästykseen asti ja seos pantiin jäihin 30 min ajaksi. Sentrifugoimisen jälkeen oli entsyymivaikutus sakassa.

30

Sakka suspendoitiin 20 mM K-fosfaattiin, pH 6,8 ja sen jälkeen lisättiin 200 mg/ml polyetyleeniglykolia (MW 6 000). Seos jätettiin 30 min ajaksi huoneenlämpöön. Vaikutus havaittiin päällä olevassa nesteessä sentrifugoimisen jälkeen.

Päällä olevan nesteen proteiinipitoisuus adsorboitiin Whatman DE 52-anioninvaihtolaitteeseen, jota pestiin sitten 20 mM K-fosfaattipuskurilla, pH 6,8 ja eluoitiin sitten K-fosfaatti- 35 i7 83972 puskurigradientilla (20 mM - 500 mM) pH 6,8. Fraktiot, joissa oli entsyyxnivaikutusta, koottiin ja dialysoitiin 20 mM K-fosfaattipuskurin kanssa, pH 6,8. Lopuksi dialysaatti lyofi-lisoitiin.

5

Puhdistumisen edistyminen käy ilmi seuraavasta taulukosta VII: ie 83972 c 0) c

•rA

:3 tn c O c -P 1) O :3 o oj o in o m o- O c o i— o <—1 o o o- E< t»— r- 04 m m t— τ- Ι

UI

3

-P C

C/5 t-* H 0 Ό 5-i lti o- Comoro -C 5-4 — ^ ^ ^ 30) -— oi m o- o -- σ Λ λ; o)

•rA

c

r·I

CP-H

EOJ'i» ο σ rr ld ro rr

•P -— -r m 04 IOOOT

P Ο Ο Ο Ο T- r-

00)5-4 - «. ·. -- v ^ V

2 Oi ft o O O O Ooo c 05 05

•H

Λί

•H 00 *3- -T vo CP -a· VO

O 04 oo oo ,— 04 m o- 04 T VO O' CM 04 ,—

M rH

-Hg vo m O' i— un^r > σ m oo o in m 5-1 ·=τ ο -τ m σ σ 0 D 0) - - - .. _

P2 ϋι O ,— t— ,— OO

3

3 -H

id c

E-< -H

*H

0) vo o oo moitnoo -p m σ n m σν 0 IA t— VO O' 00 04 04 5-iCp ·*τ (N i— m

Cu E -- -- Γ Η

E

>1 CP

5>-i Ή Ο Ο Ο Ο Ο Ο τ- Ο 1 I vo vo vo in rr in * >E -u· 'ϊ· -<r in 040404

I III

II El C .22 I ft) Λί

H U)C I « 3 «1 C I Q) .3 04-* 3 C

II :3 103 W -H O 3 >p U) 5-4)-4 4-1 5-4 -H

C 3 3 E E 3 3 3 C 3 3 3 -PH Λ5 Vi Λ -h U-iU) ο ή ί> E 3 ιλ λ; m n o tn m > an 3 wc >- H 3 -H -h I I—I WEIH 3 >1 O -P -P 04 :3 3 -P >, 3 Jp r-twc-H:3 C E -η :3 ρηλ oi >,m ^ "j >,h -P-P3 OCO-P-r-i 3 3 3 -P -ro O 0 >ί O -P -P3

0 3C-P 3E-P 3-P -P Oi-H3C 3 W · H 3 -PC

•H 3 3 U) :3 E 3 C iH-HC3C :3 CP U) 3 -PQP:3 -ΡΌ3 P· 3 U) -H rH 3 3 3 3 I—I 0 3 3 3 rP 3 -H 3 u) Cn-ro U) 3 3

X M E H 4J 1*PU) 3 Ό U) U-ι U) H44 C03i Η-Ρ0 -Η-ΡΛί JZ

3 3 C --4 3 in c η Λί d C ·4 h m :3 tn 3 O -H Ό 0 -p C 3 O h 3 P 3 3 0 :3 3 3 3 3 3 3 0 3 3 :3 3 3 O :3 -C -H 3 >t -C Ή :3 3 [p CXCCP O-CWW-P DCL-PWP t< C H « n >- +J c H >i -M -r—i 03

Claims (6)

1. 2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen a-asetolak- taattidekarboksylaasientsyymin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään sopivassa, hiili- ja typpilähteet sekä epäorgaanisia suoloja sisältävässä elatusaineessa α-asetolaktaattidekarboksylaasia tuottavaa Bacillus lich-15 eniformis -kantaa, minkä jälkeen a-asetolaktaattidekarboksy-laasientsyymi otetaan talteen väliaineessa olevista soluista.
2. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu 20 siitä, että Bacillus licheniformis -kanta valitaan ryhmästä, jonka muodostavat ATCC 12759, ATCC 12713, ATCC 11946, ATCC 27326, NRRL B-3751, NCTC 2120, NCTC 8721, NCIB 6816, NCIB 8537, NCIB 11868 tai näiden mutantit tai variantit, joilla on oleellisesti samat ominaisuudet. 25
3. 4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että elatusaine käsittää typpilähteen, jonka vapaiden aminohappojen pitoisuus ei tukahduta a-asetolak-taattidekarboksylaasin muodostumista. 30
4. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että typpilähde on epäorgaaninen typpilähde. 20 83972 1. α-asetolaktatdekarboxylasenzym, kännetecknat av att det har ett pH-optimum i omrädet 5-6 och kan framställas genom odling av stammen Bacillus licheniformis ATCC 12759,
5. 5 ATCC 12713, ATCC 11946, ATCC 27326, NRRL B-3751, NCTC 2120, NCTC 8721, NCIB 6816, NCIB 8537 eller NCIB 11868 i ett lämpligt näringsmedium innehällande koi- och kvävekällor och oorganiska salter. 10 2. Förfarande för framställning av ett a-asetolaktatde- karboxylasenzym enligt patentkravet 1, kännetecknat av att en a-asetolaktatdekarboxylas producerande Bacillus licheniformis -stam odlas i ett lämpligt näringsmedium innehäl-lande koi- och kvävekällor samt oorganiska salter, varefter 15 a-asetolaktatdekarboxylasenzymet tillvaratages ur cellerna i mediet.
6. 3. Förfarande enligt patentkravet 2, kännetecknat av att Bacillus licheniformis -stammen är valt ur en grupp som 20 bestär av ATCC 12759, ATCC 12713, ATCC 11946, ATCC 27326, NRRL B-3751, NCTC 2120, NCTC 8721, NCIB 6816, NCIB 8537, NCIB 11868 eller mutanter eller varianter därav med väsent-ligen samma egenskaper. 25 4. Förfarande enligt patentkravet 2 eller 3, kännetecknat av att näringsmediet innehäller en kvävekälla, vars innehäll av fria aminosyror undertrycker inte bildning av a-asetolaktatdekarboxylas . 30 5. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknat av att kvävekällan är en oorganisk kvävekälla.