JPS6070076A - α−アセトラクテ−トデカルボキシラ−ゼ酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は、新規なα−アセトラクテート　デカルボキシ
ラーゼおよびその製造方法に関する。

（２）従来技術 アルコール性飲料、例えばビールもしくはぶどう酒の発
酵中、しばしば少量のジアセチルが生成する。ジアセチ
ルの生成は最・も不利である。と葛うのは、その臭いが
強くしかも不快なものであシ更にビールの場合には、０
，１０〜０．１５■／ｌのシアセチルの少量においても
ビールの香シと味に好ましくない影響を与えるからであ
る。ビール中のジアセチルは、直接ジアセチルを生成す
る被ディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）菌株の
感染によって一部引き起こされ（Ｅ、　Ｇｅｔｇｅｔ　
、ジアセチルイン　ビア（Ｄｉａｃｅｔｙｌ　Ｉｎ　Ｂ
ｉｅｒ　）　、Ｂｒａｕｗｅｌｔ４６．１６８０〜１６
９２，１９８０）更に以下の事実によっても一部引き起
こされる。すなわち、♂ルベー）　（ｐｙｒｕｖａｔｅ
　）からのビール酵母はα−アセトラクテートを形成し
これは酵素依存反応ではなく、温度依存反応によりジア
セチルに変換される。ビールの熟火中、ジアセチルは酵
母細胞中の還元酵素によジアセトインに変換される。ア
セトインは、味と風味に関しジアセチルよシもよシ高い
濃度でビールにおいて許容できる。

ビール中のジアセチル量を減少する他の可能件は、アセ
トラクターゼ　デカルボキシラーゼによシα−アセトラ
クターテをアセトインに直接変換することにある（ＥＰ
特許出願第４６０６６号参照）。アセトラクテート　デ
カルボキシラーゼは、ビールの主発酵中又はｍＡ過程中
に添加される。

細胞内酵素は、微生物クレブシェラ　ニーーモ（３） ニア（１（Ｉｅｂｓｌａｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｌａ　
）から回収される（　Ｊｕｎｌ　Ｅ、ｅ　Ｂ、　Ｂｌｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９５　ｅ７１５−７２６（１９５
２））。クレブシェラニューモニア（Ｋｌｅｂｓｌｅｌ
ｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　）としては、疵塵微生物が
存するが、しかしこれは工業的利用しては十分適しない
。更に、該微生物により生産されたアセトラクテート　
デカルがキシラーゼは、七の企図されている使用条件中
、ビールの場合約Ｖ１４３であシかつ約１０℃である条
件下では安定性が悪い〇 （３）発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記条件のもとでよ多良好な安定性を
有し更に改善された収率で非病原微生物から回収できる
新規なアセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵素を提
供することにある。

（４）問題点を解決する手段および作用本発明は以下の
鷲くべき知見に基づく。すなわち、かかる性質を有する
新却なアセトラクテートデカルがキシラーゼがパシング
　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　）およ
びパシング　リケニ（４） フォルミス（Ｂａｏｌｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ　）種に属する微生物によシ高収率で彷られると
いう事実である。

第一の面によれば、本発明はパシング　プレビス（Ｂａ
ｃ１１１ｕｓ＋　ｂｒａｗｌｇ　）菌株ＡＴＣＣ１１０
３１又ハハシラス　リケニフオルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｌｌｅｈｅｎｉｆｏｒｍｔａ　）　菌株ＡＴＣＣ１２
７５９、Ａ’ｒＣＣ１２７１３、ＡＴＣＣ１１９４６、
ＡＴＣＣ２７３２６゜ＮＲＲＬ　Ｂ　−３７５１、ＮＣ
ＴＣ２１２０、ＮＣＴＣ８７２１、ＮＣＩＢ　６８１６
　、　ＮＣＩＢ　８５３７および、　ＮＣＩＢ　１１８
６８の適当な栄養培地中で培養することによって得られ
るα−アセトラクテートデカルボキシラーゼ酵素を提供
する。

α−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵素製品は
、固体又は液状形でオシかつ一般に固体形でタンノ９り
１ｒｎ９轟た如０．１〜１ＯＮＵ（以下に定鍍される）
の範囲内にある活性度を有する。

本発明の別の面によれば、α−アセトラクテート　デカ
ルボキシラーゼ酵素の製造方法が提供され、との方法は
、炭素および伊素源を含有する適当な栄養培地中で、ノ
々シラス　プレビス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｇ
　）およびパシング　リケニフ＜ルミス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｌｌｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ＠）からなる群から選
ばれるα−アセトラクテート　デカルがキシラーゼ生産
パシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　Ｗ株を培養し、しか
る後培地中、細胞からα−アセトラクテート　デカルボ
キシラーゼ酵素を回収することを含んでなる。

本発明の好ましい態様において、パシング　プレビス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒａｖｉｇ　）菌株がＡＴＣＣ１
１０３１であるか、又はα−アセトラクテートデカルボ
キシラー、ゼ酵素を生産するそれらの突然変異体もしく
は変異体である。

好ましいパシング　リケニフオルミス菌株は、ＡＴＣＣ
１２７５９、ＡＴＣＣ１２７１３、ＡＴＣＣ１１９４６
、ＡＴＣＣ２７３２６、ＮＲＲＬ　Ｂ−３７５１゜ＮＣ
ＴＣ２１２０、ＮＣＴＣ８７２１、ＮＣＩＢ　６８１６
゜ＮＣＩＢ　８５３７　、およびＮＣｌＢ１１８６８並
びにα−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵素を
生産するそれらの突然変異体および変異体である。

パシーラス　リケニフオルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｌ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｇ　）菌株を、本発明のα−アセ
トアセテート　デカルボキシラーゼ酵素の製造用に用い
る場合、栄養培地は遊離アミノ酸含垂がα−アセトラク
テート　デカルがキシラーゼ生成を抑制しないような窒
素源を好ましくは含んでなるべきであυ、好ましくは無
機窒素源を含むべきである。

パシング　プレビスが酵素源である場合、有機窒素源が
使用できる。

本発明のα−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵
素を生産する微生物は、α−アセトラクテートを次いで
検出されるアセトインに変換できるそれらの能力によっ
て選択される。

以下の手順に従い３００以上のパシング（Ｂａｅｉｌｌ
ｕｇ　）菌株を試験した：菌株を、次のＢＣＭ−基質１
振とりフラスコ内で３０℃および３７℃で２４時間培養
する。

以下余白 に２ＨＰ０４１　？ ＮａＨ２ＰＯ４，２Ｈ２０１Ｆ （ＮＨ４）２Ｓｏ４２．５　ｔｉ− ＮａＣｔ　Ｏ，２５ｆ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２００２ｆＦ ＦｅＣ４３ｔ６Ｈ２００，０４，ｆ ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ０，２５ｍｇ グルコース　１０　Ｐ 酵母エキス　３１ｉ’ 水を加えて　１００ＯＰとする 培養後、細胞を遠心分離により集め、０．０３Ｍの燐酸
塩／クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６，０）中で洗浄し次いで
０Ｄ（４５０）〜４０まで同緩衝液中で再懸濁させる。

次いで２−のアリコートを超音波処理に委ねるか又は１
ｒｖ尚たシ１■のリゾチームを用い３７℃で３０分処理
し次いで遠心分離する。

上澄み液のα−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ
活性を、節「α−アセトラクテート　デカルボキシラー
ゼ活性の決定」中で説明される手順に従って決定した。

（９） スクリーニング手段の結果、試験した約３００の微生物
の内わずか二三種の微生物が検出可能１のα−アセトラ
クテート　デカルがキシラーゼを生産することが判った
。これらの微生物を、上記手順に従って決定した酵素活
性と共に次の第１表に掲げる。　以下余白 第１表 Ｂ、プレビス　Ａ３０３　０．１３　４Ｂ、コアギユラ
ンス　Ａ３４５　０．００７　３Ｂ、パミラス　Ａｌ８
５　０．００８　２Ｂ、ノ臂ミラス　Ａ３２８　０．０
１１　３−Ｂ、／４１ミラス　Ａ３２９　０．００４　
２Ｂ、サブチリス　Ａ３１８　０．００５　３Ｂ、サブ
チリス　Ｃ６０１０，０６１ Ｂ、リケニフォルミス　Ａ４４６　０．１１　３Ｂ、リ
ケニフすルミス　Ｃ６０００，１９２Ｂ、リケニフすル
ミス　Ａ８８　０．１５　２Ｂ、リケニフすルミス　Ａ
ｌＯ３０，１３２Ｂ、リケニフｔルミス　Ａ１０６　０
．１５　２Ｂ、リケニフすルミス　Ａ２００　０．１５
　２Ｂ・　リケニフすルミス　Ａ２０３　０．２５　２
Ｂ、リケニフォルミス　Ａ２４４　０．１１　２Ｂ・　
リケニフォルミス　Ａ２４８　０．１４　２Ｂ、　リケ
ニフォルミス　Ａ１２４０　０．１３　２（１１） 菌株Ｃ６００およびＣ６０１は、１９８３年５月２７日
にナシ日ナル　コレツクジョン　オブインダストリアル
　バクテリア、トリーリサーチステージ日ン（アバディ
ーン、スコツトランド）に本出願人によシ寄託され、そ
れぞれ寄託番号ＮＣＩＢ　１１８６８およびＮＣＩＢ　
１１８６９を得た。

残シの菌株は、次のリストから明らかな如く異ったカル
チア−コレラクシ薗ンから入城した二以下余白 ＮｏＶＯ番号　寄託番号 Ａ３０３　ＡＴＣＣ１１０３１ Ａ３４５　ＮＲ８８３ Ａ１８Ｓ　ＡＴＣＣ７１ Ａ３２９　ＡＴＣＣ７０６５ Ａ５１８　ＩＡＭ　１１０９（Ｂ、ナトオ）Ａ　８８　
ＡＴＣＣ１２７５９ Ａ１０５　ＡＴＣＣ１２７１３＝ＮＲＲＬＢ−１００１
Ａ１０６　ＡＴＣＣ１１９４６ Ａ２０ＯＮ（ＪＢ　６８１６ Ａ２０３　ＮＣＩＢ　８５３７ Ａ２４４　ＮＣＴＣ２１２０ Ａ２４８　ＮＣＴＣ８７２１ Ａ１２４０　ＡＴＣＣ２７３２６ 以下余白 （１２） 先行技術（Ｊｕｎｉ　Ｅ。、同上）は以下の内容を示唆
している。すなわち、バシラス　サブチリス（Ｂａｅｌ
ｌｌｕｇ　ｓｕｂｔｉｌｌｍ　）の無細胞抽出物は、し
かし、そのような抽出物を使用することなく、α−アセ
トラクテートを脱カルデキシル化しアセトインを形成し
得る。本発明者は６９種の異ったバシラス　サブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）菌株を試験
した。これらの内、わずか５種のみがα−アセトラクテ
ート　デカルがキシラーゼ活性を示し、更にこれらの５
菌株は酵素生産が劣る。パシラスコアギュランス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）およびパシラス　
ノ（ミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ　）菌
株は又、工業的適用に対し酵素生産が非常に劣っている
ことが判明した。

ＥＪＬ＊、４シラス　リケニフすルミス（Ｂａａｌｌｌ
ｕｓ　１ｉｃｂ＠ｎｌｆｏｒｍｌｓ　）菌株の内、検出
できる量のα−アセトラクテート　デカルがキシラーゼ
を生産せず、２１ｓの菌株は低レベル量で酵素を生産し
更に１１種の菌株（これらの内１０１１は本発明中に掲
げられている）は高レベル量で酵素を生産する。縦列交
差免疫電１気泳動法にょ炊以下の和実が見出された。す
なわち、掲げた全ハシラス　リケニフすルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｌｌｃｈｅｎｉｆｏｒｍｌｍ　）菌株は、ハ
シラス　リヶニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１１ｅ
ｈｅｎ１ｆｏｒｍｉｇ　）菌株Ｃ６００によって生産さ
れる酵素と免疫化学的に同一であるα−アセトラクテー
ト　デカルボキシラーゼ酵素を生産する。

ハシラス　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ
　）菌株は、振とりフラスコ中三種の異った培地で増殖
せした。わずか一種の菌株、Ａ　３０３　（ＡＴＣＣ１
１０３１）のみが、全ての三種の培地上でα−アセトラ
クテート　デカルがキシラーゼ活性を示した。残シの１
１種の菌株は、使用した三種の培地のいずれにおいても
検知できる量のα−アセトラクテート　デカルボキシラ
ーゼ活性を示さなかった。ハシラス　プレビス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｂｒｓｖｌｓ）Ａ３０３によって生産した
α−アセトラクテートデカルがキシラーゼ酵素は、免疫
化学的性質に関シ、ハシラス　リケニフォルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｌｌｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｇ　）菌株Ｃ’
６００によって生産される酵素と同一でないことが判明
した。しかし、異っり／？ハシラスリケニフォルミス（
Ｂａｏｉｌｌｕｓｌｌｃｈｅｎｉｆｏｍｉｇ　）菌株か
らのα−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵素が
免疫化学的同一性を示すという事実によυ本発明者は以
下の内容を期待する。すなわち、本発明者によって試験
された菌株以外の他のα−アセトラクテート　デカル？
キシラーゼ生産パシラス　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｍ　）　菌株ハ、ハシラス　プレビス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｌｍ　）　Ａ　３０３と実質的
に同じ酵素を生産する。「免疫化学的同一性」に関し、
Ｎ、Ｈ，アケルセン（Ａｘｅｌｓｅｎ　）等による「Ａ
Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＩｍｍ
ｕｎｏｅｌｓａｔｒｏｐｈｏｒｅｍｉｓ　Ｊ　（オス口
１９７３）第１０章を参照たい。

本発明の実施に対し、ハシラス　プレビス（Ｂａｅｌｌ
ｌｕｓ　ｂｒｓｖｉｇ　）が、ハシラス　リヶニフスル
ミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｌｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｇ
　）に比較して好ましい。と言うのは、ハシラス　プレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒ＠ｖ１ｇ　）由来のα−
アセトラクテート　デカルボキシラーゼが、好ましくな
い副活性、特に全ての試験されたハシラス　リケニフす
ルミス（Ｂａｃ目ｌｕｇ　ｌｉａｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
　）によシ得られたフェルラ酸（ｆｅｒｒｕｌｌｃ　ａ
ｃｌｄ　）デカルボキシラーゼ活性を伴うことなく生産
されるからである。フェルラ酸デカルボキシラーゼは、
発酵中のビール内に存在するフェルラ酸を脱炭酸し、非
常に非風味の化合物４−ビニルグアヤコールとなる。従
って、フェルラ酸デカルボキシラーゼは、回収過程中ハ
シラス　リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｅ
ｈｅｎｌｆｏｒｍｉｇ　）からの培養プロスから除去さ
れねばならない。

更ニ、ハシラス　プレビスは、ハシラス　リケニフすル
ミスと比較して好ましい。何故なら、ハシラス　プレビ
スは、ビール中の２．３−　ペンタンジオンの通常の前
駆物質を３−ヒドロキシ−２−〇　ｙ　ｐノンに変換し
、従って非風味のペンタンジオンの景を許容できる低レ
ベルまで減少できる。

ハシラス　リケニフすルｉス（Ｂａｃｌｌｌｕ８Ｉｔｃ
ｈ・ｎｌｆｏｒｍｌｓ　）菌株はこれらの酵素を生産し
ない。

最後に、ハシラス　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅ
ｖ％Ｂ）菌株ハ、ハシラス　リケニフォルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｌｌｃｈｅｎｉｆｏｒｍｌｇ　）に比較し
て自て分解活性が少ないので精製手順中における全収率
が良好である。

α−アセトラクテート　デカルがキシラーゼ活性の決定 １　／　ｙｌｓ　（Ｎ０ＶＯ）単位（ＮＵ）は、２０℃
でかつｐＨ５，Ｑ（ハシラス　リケニフすルミス（Ｂａ
ａｌｌｌｕｓ　１ｌｅｈ＠ｎｌｆｏｒｍｉｇ　）酵素に
対し０．０３モルのシトレート／ホスフェート級衝液）
並びにハシラス　プレビス（Ｂａｅｌｌｌｕｓ　ｂｒｅ
ｖｉｇ　）酵素に対し０．０５ＭのＭＥＳ　（２（Ｎ−
モルホリノ）−エタンスルホン酸）、０．５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ２および０．８６ＭのＮａＣｔの緩衝システム）で
、酵素含有Ｆ験すンプルを次のアッセイにおけるα−ア
セトラクテート基質と共にインキエペートすることによ
υ、毎分１μｍｏｌを生産する酵素の量と定義される。

基質： α−アセトラクテート基質を、使用直前に、α−アセト
キシ−α−メチル−酢酸エチルエステルを加水分解する
ことによシ調製した。

３０μ！のジエステル（０，１６５ｍｍｏｌ　）、２４
０μＡの水および３３０μ！のＩＭ　ＮａＯＨを混合し
次いで１５分間氷上で保存した。次いで５．４−の水を
添加し更に得られた氷解物を試験に対し用いた。

アッセイ： 緩衝液および約０．００６〜０．３　ＮＵの酵素活性を
有する試験サンプルを混合し次いで２０℃で二、三分保
持した（最終量１０．０ｔｄ）。ｔがＯにおいて、４０
０μ！の氷解物を添加し次いで１ｒｎ１．の数サンプル
を、ｔが３．６．９．２０および５０分において取シ出
した。サンプルを氷上に載置し次いで２００μ！のｊＭ
　ＮａＯＨを添加することにより酵素反応を停止した。

得られたアセトインの量を、Ｗ、Ｗ、ウェスターフｘル
ド（Ｗｅｓｔｅｒｆｅｌｄ　）　（Ａ　Ｃｏｌｏｒ１ｍ
ｅｔｒｌｃＤｅｔ＠ｒｍｉｎａｔｌｏｎ　ｏｆ　Ｂｌｏ
ｏｄ　Ａｃｅｔｏｉｎ　、Ｊ。

Ｂｉｏｌ−Ｃｈ＠ｍ、１６１　＃　４９５−５０２　ｅ
　１９４５）に従がい、０．５％クレアチン０．２−お
よび２．５ＮＮａＯＨ（新たにｐ製）に溶解した５チα
−ナフトール０．２−を、上記サンプル１．２−に添加
するととによシ測定した。６０分後、反応時間Ｅ　（５
２４）を測定した。

ブランクとして、細胞抽出物の代わシに緩衝液を有する
サンプルを用いた。

標準曲線を、アセトイン０，０．５．２および４μＰ／
ｍ！を用いてプロットする。

α−アセトラクテート　デカルがキシラーゼ酵素製品の
製法 本発明のα−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵
素を生産し得るパシラス菌株を、適当な発酵培地中、好
気的条件のもとてその培養前約３０に適当な固体栄養培
地上で逆電増殖する。発酵培地は、炭素の同化源（例え
ばデキストロース）および９紫源として例えば硫酸アン
モニアを含んでなる基礎塩組成物を含有する。パシング
　リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎ
ｌｆｏｒｍｉｓ　）システム中、高収率を得るためには
、以下の内容が必要である。すなわち、発酵培地が、α
−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ生産を抑制で
きる過剰の遊離アミノ酸を含有しないことである。

パシング　プレビス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｌｇ
　）システムにおいて、これは該当しない。発酵は約３
０℃でかつ約ＰＨ７で行なわれ、これは自動的手段によ
シはぼ一定に保たれる。通気および攪拌が正の酸素圧を
得るため調整される。

発酵後、細胞を遠心分離によりｉめ次いで適当な緩衝液
で洗浄した。細胞を超音波処理、フレンチプレス処理、
リゾチーム処理、マントン（Ｍａｎｔｏｎ　）−ガラリ
ン（ＧａｕＪｉｎ　）−処理又はこれらの糾合わせによ
シ破壊する。

遠心分１１１１稜、粗抽出物を得、これは以下の節で説
明する精製工程に委ねられる。

α−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵素のｆＮ
ｌに！！ 本発明のα−アセトラクテート　カルボキシラーゼ酵素
は、次の工程の１又はそれ以上の組合わせによシ籾抽出
物から稈１製できる： ａ）硫酸アンモニウム沈殿。

ｂ）ポリエチレングリコール沈殿。

ｃ）ＤＥ−５２アニオン交換クロマトグラフイーおよび
透析。

ｄ）酸沈膜および透析。

ｅ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび透
析並びに。

ｆ）凍結乾燥。

ｇ）　フェニスーセファロースクロマトグラフィ　− ｈ）　クロマトフォーカッシング 実施例１で説明する如く培養されるパシラスリケニフォ
ルミス菌株を培養して得られるα−アセトラクテート　
デカルがキシラーゼの精製は次の如く行った： 細胞９４？（湿重量）を、ｐｉ（６，８のに一燐酸塩緩
衝液２０　ｍＭ中に懸濁させ次いで１　ｒｖ／ｍｌのす
ゾチームを用い３７℃で３０分間リゾチーム処理し更に
ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ　）音波発生器Ｂ１２で超
音波処理した。遠心分離後、上澄みをＤＥ５２アニオン
交換樹脂に適用し、これにより酵素を完全に吸着させた
。カラムを２０　ｍＭの燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，
８）で洗浄し次いでｐＨ６，８の燐酸カリウムを用いた
勾配溶出法（２０ｍＭ〜５００　ｍＭ　）で溶出した。

先に説明した如くフラックシせンを酵素活性に対し分析
した。活性含有フラックションを集めた。

燐酸を添加し声を４．５″！、でにすることにより、集
めたフラックションを酸性沈殿化せしめた。遠心分離後
、上澄みをｐＨ６，８の２０　ｍＭ燐酸カリウムに対し
透析し次いで透析物をヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カ
ラムに適用し、ｐＨ６，８の燐酸カリウム緩衝液で洗浄
後、上記の燐酸カリウム勾配法により該カラムを溶出し
た。

酵弊゛活性を示すフラックシ四ンを集め次いで−６８の
２０　ｍＭ燐酸カリウムに対し一夜透析した。

最終的に、透析物を凍結乾燥した。

酵素活性および収率な次表に示す： 以下余白 酵素の化学的性質 本発明のパシング　リケニフォルミス （Ｂａａｌｌｌｕｓ　１１ｃｈ＊ｎｌｆｏｒｍｉｓ　）
−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵素の活性の
ｐＩ（に対する依存性を、上記のα−アセトラクテート
　デカルがキシラーゼ活性の測定方法によシ２０℃の０
．０３Ｍシトレート／ホスフェート緩衝液中種々の一値
でパシング　リケニフォルミス但ａｃｔ■す１１ｅｈ＠
ｎｉｆｏｒｍｉｇ　）の抽出物について測定した。

添付図面を参照されたい。この図面において、第１図お
よび第２図は菌株Ａ４４６およびＣ６００からそれぞれ
得られたα−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵
素に対しプロットされた相対活性を示すグラフである。

最適−は５ないし６の範囲内にあることが見出された。

パシング　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｓｖｉｇ
　）α−アセトラクテート　デカルボキシラーゼの−お
よび温度依存性を、０．００５ＭのＭＥＳ　（２（２Ｎ
−モルホリノ）−エタンヌルホン酸）　、０−　ｓ　、
ｍＭのＭｇＣｌ２および０．８６ＭのＮ　ａ　Ｃｌから
なる緩衝液（−６，０）を用いる点を除く外、上記と同
じ手順ヲ用いパシング　プレビス（Ｂａｃｌｌｌｕｓｂ
ｒｅｖｉｓ　）　Ａ　３０３の抽出物について測定した
。

添付図面を参照されたい。この図面において、第３図は
−に対しプロットした３０℃での相対活性を示すグラフ
であシ更に第４図は温度に対しプロットしたｐＨ６での
相対活性を示すグラフである。

パシング　プレビスの最適−は５〜７の範囲内にあるこ
とが判明し、更に最適温度は３５〜５５℃の範囲内にあ
ることが判明した。

安定性 パシング　リケニフォルミス（Ｂａｃｌｌｌｕｓｌｌｅ
ｈｅｎＩｆｏｒｍｉｍ　）の粗留出物の安定性を、使用
条件のもと、例えば１０℃でかつ発酵せしめたが、熟成
したビール中で試験した。

安定性は次の表から明らかに示される。

以下余白 第３表 安定性試験 Ａ３０３　１１ Ａ４４６　２１ Ｃ６００１５ Ａ４４６　１１．５（発酵ビール中で測定）クレブシェ
ラ・ニーーモニュ酵素は、わずか２〜３時間の半減期し
か有しないので、本発明に係る酵素は公知の酵素と比較
してビールを醸造するために使用する条件のもとて相当
に改良された安定性を示す。

パシング　プレビス（Ｂａａｌｌｌｕｓ　ｂｒｓｖｉｓ
　）Ａ３０３酵紫の安定性は次の第４表および第５表か
ら明らかである。

以下余白 第４表 種々の温度でインキュベージ冒 ンした後の残留活性（ＮＵ／ｍ／） 上記から以下の内容が明らかにされる。すなわち、パシ
ング　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　）
酵素は、２時間後その活性を約６０〜９０チ保持し、酵
素はｐＨ４，５で更に安定である。更に、Ｍｇ＋＋イオ
ンは活性に関し安定化作用を有し、一方酵素はＥＤＴＡ
によシネ活性化される。

ＰＩ−測定 薄層ダルエレクロフォカッシングによシ菌株Ａ４４６の
粗留出物についてＰＩを測定し約４．７を得た。

パシング　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒ＠ｖｉｓ
　）　Ａ３０３酵素のＰＩを、Ｐ胆犯仏ＣＩＡ（ＰＥ（
ＡＲＭＡＣＩＡＴＥＣＨＮＩＣＡＬ　ＢＵＬＩＪＴＩＮ
　：　ＣＨＲＯＲｕＴＯＦＯＣＵＳＩＮＧｗｉｔｈ　Ｐ
ＯＬＹＢＵＦＦＥＲＴＭａｎｄ　ＰＢＥＴＭ：ＰＨＡＲ
ＭＡＣＩＡ　ＦＩＮＥ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ　）によっ
て記載されたクロマトフォカッシングによって測定し７
．６および７．０であることが判明した。二種のピーク
としてα−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ活性
を示す活性溶離液は、異ったＰＩを持つ二種のタンノ臂
りからなる。

脂−測定 Ａ３０３に対し、非熟成中のビール中のα−アセドラク
チ−）（ＤＬ）に関し１０℃でＫｍを測定し３．８　ｍ
Ｍを得た。

免疫学的性質 菌株ｃ６００（パシング　リケニフォルミス（ハ国助１
１ｅｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）　）生産のα−アセトラ
クテート　デカルボキシラーゼの精製フラックシ田ンを
、ＨａｒｂｏｓおよびＩｎｇｉｌｄによって記載された
方法（Ｎ、Ｈ，Ａｘｅｌｓｅｎ　：　Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｅｉｐｌｔａｔｌｏｎ−ｉｎ
−ＧｅｌＴ＠ｅｈｎｉｑｕ＊ａ　、　Ｂｌａａｋｗｓｌ
ｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｌｅＰｕｂｌｌｃａｔｉｏｎｓロ
ンドン　１９８３年）に従って家兎を免疫するために用
いた。

パシング　リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｌｅ
ｈ・ｎｌｆｏｒｍｉｍ　）酵素に対しこのようにして得
られた抗体を、Ａ、ｏ、　ＧｒｕｂｂおよびＪ、　Ｋｒ
ｏｌｌによって上記文献中にそれぞれ記載されている如
き交差免疫電気泳動法および縦列免疫電気泳動法を実施
するため使用した。

抗原は均質でないので、生産した抗体は多管異的であ如
かつ交差免疫電気泳動において１５個のバンドを出現さ
せ、その内の一つはα−アセトラクテート　デカルがキ
シラーゼ沈降帯である。この帯を同定するために、酵素
活性を基にしたオーバレーヤー手法が適用された：免疫
電気泳動後、プレートを通常の如くには固定しそして染
色せず、直径１４ｃｒｎのペトリー皿のふた内で次の混
合物３０−中５分間インキエペートした： １５０μ！のエチル−２−アセトキシ−２−メチルーア
七トアセテート、１２００μ！のＨ２Ｏ、および１６５
０μｊのＩ　Ｎ　ＮａＯＨを混合し次いで室温で１５分
間インキュベートした。次いで水を加え３０−とした。

インキュベーション後、混合物をグレートに滴下させた
、これをビタラップ（ｖｉｔａｗｒａｐ　）　７’ラス
チツク箔およびアルミ箔で包みそして室温で３０分間イ
ンキュベートし九〇 次いでプレートを、直径１４ｔＭのペトリー皿のふた内
に置き、次の混合物で覆った： ３０ｍ／！の２％ＬＳＡアガロース（Ｈ２Ｏ）、３ｔｎ
ｌの１チクレアチンＨ２０、および２．５　Ｎ　ＮａＯ
Ｈ中の５チナフ）−Ａ／６ｍ７！を５５℃で混合した。

被覆しだプレートを室温で約１時間インキュベートした
。α−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ沈降物を
有するバンドは、赤色を示し、かつ同定できる。

Ｃ６００α−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ抗
体に対し、全ての掲げられたパシラスリケニフスルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｇ）由
来の酵素を先に説明した如き縦列交差免疫電気泳動に委
ねた場合、バシラス　リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｌＩｌｌｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ２　）酵素は免疫化学
的に同一であることが判明したが、一方パシラスプレビ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｍ　）由来のα−ア
セトラクテート　デカルボキシラーゼはＣ６００α−ア
セトラクテート　デカルがキシラーゼ酵体では沈殿せず
、従ってパシラス　リケニフオルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ａすｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｍ　）およびパシラスブレビ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔ７ｒｅｖｉｓ　）は異ったタ
イプのα−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵素
を生産することを示すが、しかし双方ともビール生産に
おいて意図した使用に対しては十分適合する。

（ジ）実施例 以下に本発明の実施例を非制限的に説明する。

例１ 菌株Ａ４４６（Ｂ、リケニフォルミス、ＮＲＲＬＢ−３
７５１）を、０Ｄ（４５０）６まで振とりフラスコ内で
３０℃でＴＹ−培地上で増殖させた。

ＴＹ−培地： トリプカーゼ　２０？ 酵母エキス　５デ ＦｅＣＬｓ　−６Ｈ２０７■ ＭｎＣＬ２．４Ｈ２０１ｍ９ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２０１５ｍ９ 蒸留水を加えて１０００−とする 感とう培養物１０００−を、１！尚たシ次の組成を有す
る無機塩培地を含有するキラー（Ｋｉｅｌｅｒ）−発酵
器１，５Ｉ／に移す： ＣａＣｌ２．２Ｈ２００，５Ｆ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２００，５１１” ＫＷ２ＰＯ４４，ＯＳ’ （ＮＨ４）２Ｓ０４２２ｆ／− 微量金属ゾル＊　３− プルラニック　１づ デキストロース　１５０ｆ ＊微量金属ゾル： Ｈ３Ｂ０．　５００ダ／１００− ＣｕＳＯ４，５Ｈ２０６３ｒｖ／１００ｒｎｅＫＩ　１
０　Ｑ１ｎ９／ｉ　００７！ Ｆａｃｔ、　、　６Ｈ２０３３３１ｎ９／１００ｍ７！
ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ４４８■／１００ｔｎｌＭａＭｏ０
４　ｐ　２Ｈ２０２００ｍ９／　１００　ｔｒｉＺｎＳ
Ｏ４，７Ｈ２０７１２ｍｆ；’／１００ｍＩ！培養中、
水酸化ナトリウムを添加して−を７．０に保った。温度
は３０℃であシ更に通気および攪拌を調整し正の酸素圧
を得た。

０Ｄ（４５０）３４に相当する細胞密度に達した後細胞
を遠心分離によシ集めた。

発酵の過程は次の表から明らかである。

第６表 発酵中に測定した活性 発酵時間（時）　ＮＵ／培養物１ｍＡ　０Ｄ（４５０）
０　０　１．３５ ５　０　１．６９ ２１　０．０２２　１９ ２４　０．０７６　２８ ２８　０．４４０　３４ 例２ パシラス菌株Ａ４６６を増殖させ次いで例１と同様に培
養した。但し、発酵培地は１８０？のデキストロースを
含有しておシ更に細胞は、０Ｄ（４５０）〜４７に相当
する細胞密度に達した時採取した。

１１２ｙ−の細胞（湿重量）を、ｐＨ６，８の２０ｍＭ
Ｋ−燐酸塩緩衝液中に懸濁させ次いで１　ｒｖ／　ｎｒ
ｔのリゾチームを用い３７℃で３０分間リゾチーム処理
した。次いで、溶解した細胞を、ブランソン（Ｂｒａｎ
ｓｏｎ　）音波発生器Ｂ１２で超音波処理・に委ねた。

得られた粗留出物に２５チの飽和に達するまで硫酸アン
モニウムを添加し次いで混合物を氷上に３０分載置した
〇 遠心分離後、上澄み中において活性物が見出された。

７０チ飽和に達するまで上澄みに硫酸アンモニウムを添
加し次いで混合物を３０分間氷上に載置した。遠心分離
後、沈殿物中に活性が見出された。

沈殿物を２０　ｍＭのに一リン酸塩（ｔ！６．８）Ｋ懸
濁させ次いで２００７Ｑ／−のポリエチレングリコール
（分子ｚ６ｏｏｏ）を添加した。混合物を室温で３０分
間放領した。遠心分離後上澄み中に活性が見出された。

上澄み中のタンパク含量を、ワトマン （Ｗｈａｔｍａｎ　）　Ｄ　Ｅ　５２アニオン交換剤に
吸収させ次いで２０　ｍＭのに一リン酸塩（ｐＨ６，８
）で洗浄し更に−６，８０に一リン酸塩勾配緩衝液（２
０ｍＭ〜５００　ｍＭ　）で溶出させた。酵素活性を有
するフラックションをプールし次いで２０　ｍＭ　Ｋ　
−リン酸塩（ｐ）（６，８）に対し透析した。最後に透
析物を凍結乾燥した。

精製手順の過程は、第７表から明らかである。

以下余白 例３ 菌株Ａ３０３（パシラス　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉａ　）、ＡＴＣＣ１１０３１）を、細胞がミ
ツド−ロガリスミック（皿屁−し」１工ｉ　ｔｈｍｌ　
ｃ　）層内に存するまで、振とうフラスコ中３６℃でＴ
Ｙ培地（例１参照）上で増殖させた。この培養物６０９
ｍｌを、以下の組成を有する培地８１を含有するバイオ
チック（Ｂｉｏｔａｃ　）−発酵器内に移した。

（ＮＨ４）２８０４２．５ｇ／１ Ｋ２ＨＰＯ４１− ＮａＨ２ＰＯ４，２Ｈ２０１− ＮａＣｔＯ，２５− ＺｎＳＯ４，７Ｈ２００，１２５− ＭｇＳＯ４，７Ｈ２００，１２５− 微量金属ゾル＊０．７　ｍｌ／ｌ 酵素エキス　６　ｇ／ｌ プルラニック　０．１３　ｍｌ／１ デキストロース　３１．２５　ｇ／ｌ ＊）例１に記載されている意味に同じ 培養中、水酸化ナトリウムを添加して−を７．０に保っ
た。温度は３０℃であり更に通気および攪拌を調整し正
の酵素圧を得た。

０Ｄ（４５０）３４に相当する細胞密度に達した後細胞
を遠心分離により集めた。

発酵の過程は次の表から明らかである。

第８表 発酵中に測定された活性 発酵時間（時）　ＮＴＪ／培養物１　ｍｌ　０Ｄ４５０
１０．００５　２．４ ２　０．０１　４．１ ３　０．０２　７．５ ４　０．１８　１５．３ ５　０．４７　１７．５ ６　０．４１　２２．２ ７　０．１７　２４．０ ８　０．１３　２４．０ 例４ 菌株Ａ３０３（パシラス　プレビス）を増殖すせ、次い
で例３で説明した如く増養した。細胞を、０Ｄ４５ｏ＝
８．０の際に採取した。

細胞を、２０　ｍＭのに一燐酸塩緩衝液（ｐＨ６，８）
中に懸濁させ、次いで約４００パールの圧力でマントン
−ガラリン（Ｍａｎｔｏｎ　−Ｇａｎ１ｉｎ　）タイプ
のホモ・ゾナイザー内を通過させた。硫酸アンモニウム
を用いた活性物の分別沈殿は例２で説明した如く行った
。

沈殿物を含有する活性物を、先に述べたに一燐酸塩緩衝
液に溶解し、該緩衝液に対し透析し次いでアミコン（Ａ
ｍ１ｃｏｎ　）加圧透析セル中で約１０ｍ９７ｍ１のタ
ンパク濃度に最終的に濃縮した。

この抽出物の１５（１／は、第９表に示す如く次の精製
手続に対する出発物質であった。

２０　ｍＭのＫ　−ｔａ酸塩緩衝液（ｐＨ６，８）中で
平衡化し予備循環させ九ＤＥ５２イオン交換体１５０ｍ
ｅを抽出物に添加した。

スラリーをブフナー漏斗でろ過した。活性物はろ液中に
存し、これを２５ｍＭのヒスチジン−ＨＣｔ緩衝液（ｐ
Ｈ６，２）に対し透析した。

この抽出物に、先に説明したヒスチジン（Ｈｌｓｔｉｄ
ｉｎｅ　）緩衝液中で平衡化した４Ｑ’ｍｌのＰＢＥ９
４（ファルマシア、クロマトフォーカッシング剤）を添
加した。スラリーをブフナー漏斗でろ過した。活性物は
る液中に存し、これを２０ｍＭのに一燐酸塩（ｐＨ６，
８）に対し透析し、硫酸アンモニウムで２０俤に飽和す
る。該緩衝液中で平衡化シタ２００１１Ｌｌのフェニル
セフアロースでカラムを充填した。透析したろ液中に存
する活性物をカラムに適用し次いで硫酸アンモニウム２
０％飽和からＯチ飽和に変化させ並びにエチレングリコ
ールＯ％から５０チに変化させながら２０ｍＭのに一燐
酸塩（ｐＨ６，８）中勾配法により溶出した。

活性物のピーク部分を見出し、プールし、濃縮し、次い
で２０ｍＭのに一燐酸塩（ｐＨ６，８）ｌ／ｌｔＬ透析
し、更に凍結保存した。　以工余。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は菌株Ａ４４６およびＣ６００から
それぞれ得られたα−アセトラクテート　デカルぎキシ
ラーゼ酵素に対しプロットされた相対活性を示すグラフ
であり、 第３図は−に対しプロットした３０℃での相対活性を示
すグラフであり、 第４図は温度に対しプロットしたＰＨ６での相対活性を
示すグラフである。 特許出願人 ノ？　インダストリ　アクテイーゼルスカブ特許出願代
理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　内　１）　幸　男 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也 図面の浄書（内容に物更なし） 第１図 １０ 手続補正書（方式） 昭和５９年１り月♂日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１１２２３０号 ２、発明の名称 α−アセトラクテートデカル？キシラーゼ酵素およびそ
の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ノブ　インダストリ　アクティービルスカブ４
、代理人 住　所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号靜
光虎ノ門ビル　電話（５０４）０７２１氏名弁理士（６
５７９）青　木　朗 （外４名） ５、補正命令の日付 昭和５９年９月２５日（発送日） ６、補正の対象 （１）願書の「出願人の代表者」の欄 （２）委任状 （３）図面 ７、補正の内容 （１）（２）　別紙の通シ （３）図面の浄書（内容に変更なし） ８、添附書類の目録 （１）訂正願書　１通 （２）委任状及び訳文　各１通 （３）浄書図面　１通 （２）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バシラス　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖ
   ｉｓ）菌株ＡＴＣＣ１１０３１又はバシラス　リヶニフ
   ォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｅｈｅｎｉｆｏｒｍ
   ｉｓ　）菌株ＡＴＣＣ１２７５９、ＡＴＣＣ１２７１３
   ，Ａ’ｒＣＣ１１９４６゜ＡＴＣＣ２７３２６、ＮＲＲ
   Ｌ　Ｂ　−３７５１、ＮＣＴＣ２１２０、ＮＣＴＣ８７
   ２１、ＮＣＩＢ　６８１６　。 ＮＣＩＢ　８５３７および、ＮＣｌＢ１１８６８の適当
   な栄養培地中で培養することによって得られるα−アセ
   トラクテート　デカルボキシラーゼ酵素。 ２、前記α−アセトラクテート　デカルがキシラーゼ活
   性がタンパク１■尚たｊＤ　０．１〜ｌ０ＮＩＪの範囲
   にある、特許請求の範囲第１項記載のα−アセトラクテ
   ート　デカルがキシラーゼ酵素。 ３、　α−アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵素
   の製造方法であって、炭素および９紫源を含有する適当
   な栄養培地中で、バシラス　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕ
   ｓ　ｂｒｅｖｉｇ　）およびパシラス　リケニフｒｋミ
   ス（Ｂａｅｉｌｌｕｓ＋　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｇ
   　）からなる群から選ばれるα−アセトラクテート　デ
   カルがキシラーゼ生産バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）
   　菌株を培養し、しかる後培地中、細胞からα−アセト
   ラクテート　デカルボキシラーゼ酵素を回収することを
   含んでなる、前記方法。 ４、前記パシラス　プレビス（Ｂａａ目１ｕｓｂｒｅｖ
   ｉｓ　）菌株がＡＴＣＣ１１０３１であるか、又はα−
   アセトラクテート　デカルボキシラーゼ酵素を生産する
   それらの突然変異体もしくは変異体である、特許請求の
   範囲第３項記載の方法。 ５、前記パシラス　リケニフすルミス菌株が、ＡＴＣＣ
   １２７５９、ＡＴＣＣ１２７１３、ＡＴＣＣ１１９４６
   、ＡＴＣＣ２７３２６、ＮＲＲＬ　Ｂ　−３７５１、Ｎ
   ＣＴＣ２１２０、ＮＣＴＣ８７２１。 ＮＣＩＢ６８１６　、ＮＣＩＢ８５３７．ＮＣｌＢ１１
   ８６８並びにα−アセトラクテート　デカルボキシラー
   ゼ酵素を生産するそれらの突然変異体および変異体から
   女る群から選ばれる、特許請求の範囲第３項記載の方法
   。 ６、前記栄養培地が、遊離アミノ酸含量がα−アセトラ
   クテート　デカルボキシラーゼ形成を抑制しないような
   ９素源を含んでなる、特許請求の範囲第５項記載の方法
   。 ７、前記穿索源が無機仝素源である、特許請求の範囲第
   ６項記載の方法。