JPH05123197A - 核酸の検出方法 - Google Patents
核酸の検出方法Info
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- JPH05123197A JPH05123197A JP3284755A JP28475591A JPH05123197A JP H05123197 A JPH05123197 A JP H05123197A JP 3284755 A JP3284755 A JP 3284755A JP 28475591 A JP28475591 A JP 28475591A JP H05123197 A JPH05123197 A JP H05123197A
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- nucleic acid
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】目的核酸の有無を電気泳動を行わずに高感度
に、しかも短時間で行う。 【構成】少なくとも１方をラベルした２種のオリゴヌク
レオチドを鎖長反応プライマーとして用い、ＰＣＲ法に
より特定ＤＮＡを増幅させ、次いで増幅断片の１部と相
補的な配列をふくむ標識オリゴヌクレオチドに前記反応
で用いたラベル特異的な物質を固定したマイクロプレー
トに前記反応の生成物を添加して、標識より生じる信号
の測定を行うことで目的核酸の有無を検出する。
に、しかも短時間で行う。 【構成】少なくとも１方をラベルした２種のオリゴヌク
レオチドを鎖長反応プライマーとして用い、ＰＣＲ法に
より特定ＤＮＡを増幅させ、次いで増幅断片の１部と相
補的な配列をふくむ標識オリゴヌクレオチドに前記反応
で用いたラベル特異的な物質を固定したマイクロプレー
トに前記反応の生成物を添加して、標識より生じる信号
の測定を行うことで目的核酸の有無を検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は特定の塩基配列を持つＤ
ＮＡあるいはＲＮＡを検出する方法でありウイルスや細
菌による疾患、遺伝病の診断、あるいは種の同定、親子
鑑別などに用いられる方法である。
ＮＡあるいはＲＮＡを検出する方法でありウイルスや細
菌による疾患、遺伝病の診断、あるいは種の同定、親子
鑑別などに用いられる方法である。
【０００２】
【従来の技術】ハイブリダイゼーション法は遺伝子の変
異により生じる疾患やウイルスによる病気の診断に有効
である。
異により生じる疾患やウイルスによる病気の診断に有効
である。
【０００３】従来、検出の際には目的ＤＮＡやＲＮＡを
菌、ウイルス、白血球などから超音波破砕、などの物理
学的方法、プロテネースＫのような酵素やＳＤＳのよう
な界面活性剤を用いて化学的な方法で抽出する。その後
フェノール、クロロホルム処理、エタノール沈澱でＤＮ
Ａ（ＲＮＡ）を精製した後，ＮａＯＨのようなアルカリ
で変性させて１本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）にする。そしてこ
の目的の１本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）をメンブランフィルタ
ー（ニトロセルロース、ナイロン）上に固定する方法が
よく知られたフィルターハイブリダイゼーション法であ
る。
菌、ウイルス、白血球などから超音波破砕、などの物理
学的方法、プロテネースＫのような酵素やＳＤＳのよう
な界面活性剤を用いて化学的な方法で抽出する。その後
フェノール、クロロホルム処理、エタノール沈澱でＤＮ
Ａ（ＲＮＡ）を精製した後，ＮａＯＨのようなアルカリ
で変性させて１本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）にする。そしてこ
の目的の１本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）をメンブランフィルタ
ー（ニトロセルロース、ナイロン）上に固定する方法が
よく知られたフィルターハイブリダイゼーション法であ
る。
【０００４】このＤＮＡ（ＲＮＡ）を固定したフィルタ
ーに放射性同位元素、酵素、ビオチン、蛍光物質などで
ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを加えると、オ
リゴヌクレオチドが対象ＤＮＡ（ＲＮＡ）と相補的配列
を持つと両者の間に水素結合が生じて２本鎖を形成す
る。相補鎖を持たなっかたり過剰のオリゴヌクレオチド
プローブは洗浄によってフィルターから除去される。そ
の後放射活性、酵素活性、蛍光強度測定によって目的Ｄ
ＮＡ（ＲＮＡ）の検出を行う。
ーに放射性同位元素、酵素、ビオチン、蛍光物質などで
ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを加えると、オ
リゴヌクレオチドが対象ＤＮＡ（ＲＮＡ）と相補的配列
を持つと両者の間に水素結合が生じて２本鎖を形成す
る。相補鎖を持たなっかたり過剰のオリゴヌクレオチド
プローブは洗浄によってフィルターから除去される。そ
の後放射活性、酵素活性、蛍光強度測定によって目的Ｄ
ＮＡ（ＲＮＡ）の検出を行う。
【０００５】また最近よく用いられる微量ＤＮＡを増や
す方法にポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ
（Saiki,R.K.et al,Science 239 487-491 (1988)) があ
る。この方法は、ごく微量の遺伝子（ＤＮＡ）から目的
とするＤＮＡ領域だけを数時間のうちに約１００万倍に
増幅させることができる。すなわち、増幅させたい遺伝
子領域を挟んで＋鎖、−鎖に対するＤＮＡプライマー
（１８〜３０ヌクレオチド）を合成しＤＮＡポリメラー
ゼによりＤＮＡ断片の合成を繰り返し行うと、１サイク
ルごとにＤＮＡは２倍に増幅されｎサイクル後には、２
n 倍に増幅される。この際ＤＮＡプライマーとして、目
的遺伝子に特異的な配列を選ぶことで選択性の高いポリ
メラーゼ反応が起こり２つのプライマーにはさまれた２
本鎖ＤＮＡ断片が生成する。この２本鎖断片の検出法で
は、ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡ（増幅ＤＮＡ）を先に
述べたフィルターハイブリダイゼーション法に持ち込む
のが一般的な方法である。
す方法にポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ
（Saiki,R.K.et al,Science 239 487-491 (1988)) があ
る。この方法は、ごく微量の遺伝子（ＤＮＡ）から目的
とするＤＮＡ領域だけを数時間のうちに約１００万倍に
増幅させることができる。すなわち、増幅させたい遺伝
子領域を挟んで＋鎖、−鎖に対するＤＮＡプライマー
（１８〜３０ヌクレオチド）を合成しＤＮＡポリメラー
ゼによりＤＮＡ断片の合成を繰り返し行うと、１サイク
ルごとにＤＮＡは２倍に増幅されｎサイクル後には、２
n 倍に増幅される。この際ＤＮＡプライマーとして、目
的遺伝子に特異的な配列を選ぶことで選択性の高いポリ
メラーゼ反応が起こり２つのプライマーにはさまれた２
本鎖ＤＮＡ断片が生成する。この２本鎖断片の検出法で
は、ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡ（増幅ＤＮＡ）を先に
述べたフィルターハイブリダイゼーション法に持ち込む
のが一般的な方法である。
【０００６】その他の方法としては、あらかじめ各々の
プライマーにビオチンをラベルしてＰＣＲ反応を行った
後放射性物質を標識したＤＮＡプロ−ブと液相でハイブ
リダイゼーションを行なった後アビジンを固定したアフ
ィニティマトリックスを用いて検出する方法(Ann-Chris
tine Syvanen et al,Nucl. Acids Res.16 11327-11338
(1988))、オリゴヌクレオチドプロ−ブに複数のビオチ
ンを標識し目的ＲＮＡと液相でハイブリダイゼーション
を行った後、アビジンを固定したアフィニティマトリッ
クスと酵素標識抗ＲＮＡ−ＤＮＡ抗体を添加して検出す
る方法(Clifford O.Yehle et al, Molecular and Cell
uar Probes 1,177-193(1987)) などがある。
プライマーにビオチンをラベルしてＰＣＲ反応を行った
後放射性物質を標識したＤＮＡプロ−ブと液相でハイブ
リダイゼーションを行なった後アビジンを固定したアフ
ィニティマトリックスを用いて検出する方法(Ann-Chris
tine Syvanen et al,Nucl. Acids Res.16 11327-11338
(1988))、オリゴヌクレオチドプロ−ブに複数のビオチ
ンを標識し目的ＲＮＡと液相でハイブリダイゼーション
を行った後、アビジンを固定したアフィニティマトリッ
クスと酵素標識抗ＲＮＡ−ＤＮＡ抗体を添加して検出す
る方法(Clifford O.Yehle et al, Molecular and Cell
uar Probes 1,177-193(1987)) などがある。
【０００７】また増幅ＤＮＡを直接、電気泳動法で分析
する方法が知られている。この方法は、アクリルアミド
ゲル担体中で、ラジオアイソトープでラベルした、ある
いはラベルしていないＤＮＡ断片を泳動させ、そのゲル
のオートラジオグラフィーをとる、あるいは、薄層シリ
カゲルプレート上におき、ＵＶランプでゲルを照らし写
真をとる。または、アガロースゲル担体中でＤＮＡ断片
を泳動し、その後、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染
色し、泳動漕からゲルをトランスイルミネーター（紫外
光を発する）上におき、写真をとる方法である(T.Mania
tis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour
(1982)) 。
する方法が知られている。この方法は、アクリルアミド
ゲル担体中で、ラジオアイソトープでラベルした、ある
いはラベルしていないＤＮＡ断片を泳動させ、そのゲル
のオートラジオグラフィーをとる、あるいは、薄層シリ
カゲルプレート上におき、ＵＶランプでゲルを照らし写
真をとる。または、アガロースゲル担体中でＤＮＡ断片
を泳動し、その後、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染
色し、泳動漕からゲルをトランスイルミネーター（紫外
光を発する）上におき、写真をとる方法である(T.Mania
tis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour
(1982)) 。
【０００８】またＤＮＡの配列を決定できる方法として
ＤＮＡシーケンサーが知られている(Smith,L,M,et al,N
ature 321 674-679(1986))。この方法は蛍光標識したＤ
ＮＡプライマーを蛍光ラベルしてシーケンスしたいＤＮ
Ａ配列をつなぎアクリルアミドゲルに泳動しアルゴンレ
ーザーを用いてＤＮＡ由来の蛍光強度を測定する方法で
ある。
ＤＮＡシーケンサーが知られている(Smith,L,M,et al,N
ature 321 674-679(1986))。この方法は蛍光標識したＤ
ＮＡプライマーを蛍光ラベルしてシーケンスしたいＤＮ
Ａ配列をつなぎアクリルアミドゲルに泳動しアルゴンレ
ーザーを用いてＤＮＡ由来の蛍光強度を測定する方法で
ある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、フィル
ターを用いる方法では、フィルターにＤＮＡ（ＲＮＡ）
を固定するための操作、ＤＮＡ（ＲＮＡ）を熱や紫外線
によって固定する操作、及び相補鎖を形成しなかったオ
リゴヌクレオチドプロ−ブの洗浄の煩雑な操作がつきま
とう。さらにＤＮＡプロ−ブがフィルター表面に非特異
的に吸着して検出感度の低下やバックグランドの上昇を
招くという不都合もあった。
ターを用いる方法では、フィルターにＤＮＡ（ＲＮＡ）
を固定するための操作、ＤＮＡ（ＲＮＡ）を熱や紫外線
によって固定する操作、及び相補鎖を形成しなかったオ
リゴヌクレオチドプロ−ブの洗浄の煩雑な操作がつきま
とう。さらにＤＮＡプロ−ブがフィルター表面に非特異
的に吸着して検出感度の低下やバックグランドの上昇を
招くという不都合もあった。
【００１０】またＤＮＡシーケンサー方式を増幅ＤＮＡ
の検出法にそのまま適応すると検出感度の低下をもたら
すＰＣＲ反応に関与しない蛍光色素付きのＤＮＡプライ
マーが泳動ゲルに入ってくるためＤＮＡシーケンサーで
は感度を上げるために働いているレーザー光源を用いて
も十分な感度をかせぐことができない。また本方式では
電気泳動しながらデータを取り込むため数多くのサンプ
ルをこなすことができない。
の検出法にそのまま適応すると検出感度の低下をもたら
すＰＣＲ反応に関与しない蛍光色素付きのＤＮＡプライ
マーが泳動ゲルに入ってくるためＤＮＡシーケンサーで
は感度を上げるために働いているレーザー光源を用いて
も十分な感度をかせぐことができない。また本方式では
電気泳動しながらデータを取り込むため数多くのサンプ
ルをこなすことができない。
【００１１】またあらかじめ各々のプライマーにビオチ
ンをラベルしてＰＣＲ反応を行った後、放射性物質を標
識したＤＮＡプロ−ブと液相でハイブリダイゼーション
を行なった後アビジンを固定したアフィニティマトリッ
クスを用いて検出する方法(Ann-Christine Syvanen et
al,Nucl. Acids Res.16 11327-11338 (1988))では、ハ
イブリダイゼーションを行った後に担体に固定するため
操作が煩雑になる。また放射性物質を用いなければ高感
度が得られない。
ンをラベルしてＰＣＲ反応を行った後、放射性物質を標
識したＤＮＡプロ−ブと液相でハイブリダイゼーション
を行なった後アビジンを固定したアフィニティマトリッ
クスを用いて検出する方法(Ann-Christine Syvanen et
al,Nucl. Acids Res.16 11327-11338 (1988))では、ハ
イブリダイゼーションを行った後に担体に固定するため
操作が煩雑になる。また放射性物質を用いなければ高感
度が得られない。
【００１２】放射性物質を用いる場合は特殊な施設を必
要としかつ高価となる。また彼らはＰＣＲ終了後１時間
半以上の時間を要する。また検出の際に遠心操作が必要
である。また彼らは放射性物質のかわりに蛍光色素をも
ちいた方法でも同様な方法を行っているが感度が従来法
（たとえば電気泳動法）に較べて劣るため目的の感度が
得られていない。
要としかつ高価となる。また彼らはＰＣＲ終了後１時間
半以上の時間を要する。また検出の際に遠心操作が必要
である。また彼らは放射性物質のかわりに蛍光色素をも
ちいた方法でも同様な方法を行っているが感度が従来法
（たとえば電気泳動法）に較べて劣るため目的の感度が
得られていない。
【００１３】そこで、本発明はこれら課題を克服し、放
射性同位元素を用いずに短時間に高感度な多検体処理を
可能とし、手間をかけずに客観的な出力結果を出す核酸
（ＤＮＡ，ＲＮＡ）の検出方法を提供することである。
射性同位元素を用いずに短時間に高感度な多検体処理を
可能とし、手間をかけずに客観的な出力結果を出す核酸
（ＤＮＡ，ＲＮＡ）の検出方法を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、少なくとも１方をラベルした２種のオリゴ
ヌクレオチドを鎖長反応プライマーとして機能させ標的
ＤＮＡ中の特定のＤＮＡをＤＮＡ合成酵素を用いて選択
的に増幅させる行程（第１反応）、次いであらかじめ増
幅断片の１部と相補的な配列をふくむ標識オリゴヌクレ
オチドに第１反応で用いたラベル特異的な物質を固定し
たマイクロプレートに第１反応の生成物を添加する工程
（第２反応）、その後第２反応に用いた標識より生じる
信号を測定を行う（第３反応）ことで目的核酸の有無を
検出することを特徴とする。
決するため、少なくとも１方をラベルした２種のオリゴ
ヌクレオチドを鎖長反応プライマーとして機能させ標的
ＤＮＡ中の特定のＤＮＡをＤＮＡ合成酵素を用いて選択
的に増幅させる行程（第１反応）、次いであらかじめ増
幅断片の１部と相補的な配列をふくむ標識オリゴヌクレ
オチドに第１反応で用いたラベル特異的な物質を固定し
たマイクロプレートに第１反応の生成物を添加する工程
（第２反応）、その後第２反応に用いた標識より生じる
信号を測定を行う（第３反応）ことで目的核酸の有無を
検出することを特徴とする。
【００１５】ここで、少なくとも１方をラベルしたオリ
ゴヌクレオチドのラベル体としては、ビオチンを挙げる
ことができるが、これには限定されない。また、標識オ
リゴヌクレオチドの標識体としては、アルカリフォスフ
ァターゼ、ペルオキシダーゼを挙げることができる。更
に、酵素基質としては、標識体がアルカリフォスファタ
ーゼの場合には、４−メチルウンベリフェリル燐酸を、
ペルオキシダーゼの場合はパラヒドロキシフェニルプロ
ピオン酸を用いる。
ゴヌクレオチドのラベル体としては、ビオチンを挙げる
ことができるが、これには限定されない。また、標識オ
リゴヌクレオチドの標識体としては、アルカリフォスフ
ァターゼ、ペルオキシダーゼを挙げることができる。更
に、酵素基質としては、標識体がアルカリフォスファタ
ーゼの場合には、４−メチルウンベリフェリル燐酸を、
ペルオキシダーゼの場合はパラヒドロキシフェニルプロ
ピオン酸を用いる。
【００１６】なお、標的核酸がＲＮＡのときは、逆転写
酵素を用いＤＮＡに転写して前記反応を行う。
酵素を用いＤＮＡに転写して前記反応を行う。
【００１７】
【作用】本発明によれば、目的核酸の有無を電気泳動を
行わずに高感度に、しかも短時間でできるようになる。
また多穴マイクロプレートのような一度に大量のサンプ
ルを処理できる道具を用いると、対象となる核酸の検出
を自動装置化することが可能となる。
行わずに高感度に、しかも短時間でできるようになる。
また多穴マイクロプレートのような一度に大量のサンプ
ルを処理できる道具を用いると、対象となる核酸の検出
を自動装置化することが可能となる。
【００１８】
（実施例１）第１反応 神奈川現象陽性株であるビブリオ・パラヘモリティカス
WP1 株を液体培養しフェノール、クロロホルムを用いる
常法でトータルＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡを紫外可
視吸光光度計を用いて260nm の値からＤＮＡ量を定量し
た。この溶液を段階希釈し0.4fg,4fg,40fg,400fg,4000f
g/3ul ＴＥ溶液にしてＰＣＲに用いた。ＰＣＲ反応条件
は，１０ｘバッファー10μl 、ｄＮＴＰ4.8 μl （各1.
25mM)、ビブリオ・パラヘモリティカスtdh 遺伝子特異
的な配列をもつプライマー（ａ）及び（ｂ）各0.75μl
(25nmol/ml)、ノニデットP-40、ツイーン20各0.5 ％3u
l、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ 0.15μl( 5unit/ul)を
加えて反応液10μl を調製した。この反応液の入った容
器に、ミネラルオイル（SIGMA 社）を50μl 加えて反応
液を調製した。各バッファーの組成を次に示す。１０ｘ
バッファー： 500mM KCl 100mM Tris HC1 15mM MgC
l2 、0.1 ％ゼラチン）、ｄＮＴＰ溶液：ｄＡＴＰ ｄ
ＣＴＰ ｄＧＴＰ ｄＴＴＰの混合物をさす。反応条件
は、以下に示す通りである。
WP1 株を液体培養しフェノール、クロロホルムを用いる
常法でトータルＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡを紫外可
視吸光光度計を用いて260nm の値からＤＮＡ量を定量し
た。この溶液を段階希釈し0.4fg,4fg,40fg,400fg,4000f
g/3ul ＴＥ溶液にしてＰＣＲに用いた。ＰＣＲ反応条件
は，１０ｘバッファー10μl 、ｄＮＴＰ4.8 μl （各1.
25mM)、ビブリオ・パラヘモリティカスtdh 遺伝子特異
的な配列をもつプライマー（ａ）及び（ｂ）各0.75μl
(25nmol/ml)、ノニデットP-40、ツイーン20各0.5 ％3u
l、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ 0.15μl( 5unit/ul)を
加えて反応液10μl を調製した。この反応液の入った容
器に、ミネラルオイル（SIGMA 社）を50μl 加えて反応
液を調製した。各バッファーの組成を次に示す。１０ｘ
バッファー： 500mM KCl 100mM Tris HC1 15mM MgC
l2 、0.1 ％ゼラチン）、ｄＮＴＰ溶液：ｄＡＴＰ ｄ
ＣＴＰ ｄＧＴＰ ｄＴＴＰの混合物をさす。反応条件
は、以下に示す通りである。
【００１９】熱変性 ９４℃ １分 アニーリング ５５℃ １分 重合反応 ７２℃ １分 とし３５サイクルおこなった。
【００２０】各プライマーの配列は第６４回日本細菌学
会( 多田他 J.J.Bacteriol 199146 281) に報告した配
列である。配列はプライマー(a)5'dGGTACTAAATGGCTGACA
TC3' (b)5'dCCACTACCACTCTCATATGC3'でありビブリオ・
パラヘモリティカスtdh 遺伝子を特異的に検出できるプ
ライマーでありM.Nishibuchi et al. (1990) Mol.Micro
biology 4 87-99 に記載されているtdh2遺伝子の配列中
の配列を用いている。 プライマー(a)(b)ともミリジェ
ン社製ＤＮＡ合成装置で作製した。(a) は通常の合成の
最終ステップでモノメトキシトリチルアミンリンカーを
反応させて５' 末端にヘキサノールアミン（アミノ基）
を結合させた。脱保護の操作の後C18逆相カラムを備え
た高速液体クロマトグラフィーで精製した。その後(a)
(1OD,5nmol ）150 ulを１ＸＰＢＳ(PH7.4) に溶解し15m
M N- ヒドロキシスクシンイミドビオチン(DMF溶液)150
ul と反応させた。室温で１晩反応させた後ゲル濾過カ
ラム（G-25、ファルマシア）で精製しフラクションを減
圧下振とう濃縮し逆相高速液体クロマトグラフィーで精
製してＰＣＲに用いた。プライマー(b) は脱保護後、逆
相高速液体クロマトグラフィーで精製した。ＰＣＲ終了
後各々2ul ずつを以降の反応に用いた。
会( 多田他 J.J.Bacteriol 199146 281) に報告した配
列である。配列はプライマー(a)5'dGGTACTAAATGGCTGACA
TC3' (b)5'dCCACTACCACTCTCATATGC3'でありビブリオ・
パラヘモリティカスtdh 遺伝子を特異的に検出できるプ
ライマーでありM.Nishibuchi et al. (1990) Mol.Micro
biology 4 87-99 に記載されているtdh2遺伝子の配列中
の配列を用いている。 プライマー(a)(b)ともミリジェ
ン社製ＤＮＡ合成装置で作製した。(a) は通常の合成の
最終ステップでモノメトキシトリチルアミンリンカーを
反応させて５' 末端にヘキサノールアミン（アミノ基）
を結合させた。脱保護の操作の後C18逆相カラムを備え
た高速液体クロマトグラフィーで精製した。その後(a)
(1OD,5nmol ）150 ulを１ＸＰＢＳ(PH7.4) に溶解し15m
M N- ヒドロキシスクシンイミドビオチン(DMF溶液)150
ul と反応させた。室温で１晩反応させた後ゲル濾過カ
ラム（G-25、ファルマシア）で精製しフラクションを減
圧下振とう濃縮し逆相高速液体クロマトグラフィーで精
製してＰＣＲに用いた。プライマー(b) は脱保護後、逆
相高速液体クロマトグラフィーで精製した。ＰＣＲ終了
後各々2ul ずつを以降の反応に用いた。
【００２１】第２反応 ＰＣＲ終了後のサンプルを2ul ずつとり１ｘＴＥ50ulに
溶解し95℃５分加熱後ただちに氷水中に急冷し、１本鎖
ＤＮＡに変性した。
溶解し95℃５分加熱後ただちに氷水中に急冷し、１本鎖
ＤＮＡに変性した。
【００２２】その後あらかじめストレプトアビジンを固
定した９６穴マイクロプレート(Nunc 社）のウエルに
５’位にアルカリフォスファターゼを標識したオリゴヌ
クレオチド(C) 5'dCCAAATCACTTTTACTTGG3' 100pmol/ml
を20ulを含む、2XSSC,（2.5 ＸＳＳＣ、１％ツイーン20
溶液を30ul、１ＸＴＥを50ul、蒸留水50ulを添加してお
いた状態にしておいた９６穴マイクロプレートに変性し
たサンプル45ulを添加し室温で15分間放置した。
定した９６穴マイクロプレート(Nunc 社）のウエルに
５’位にアルカリフォスファターゼを標識したオリゴヌ
クレオチド(C) 5'dCCAAATCACTTTTACTTGG3' 100pmol/ml
を20ulを含む、2XSSC,（2.5 ＸＳＳＣ、１％ツイーン20
溶液を30ul、１ＸＴＥを50ul、蒸留水50ulを添加してお
いた状態にしておいた９６穴マイクロプレートに変性し
たサンプル45ulを添加し室温で15分間放置した。
【００２３】反応に用いたアルカリフォスファターゼを
標識したオリゴヌクレオチドの作製方法はMurakami,A.e
t al,Nucl.Acid Res.1989.17.5587-5595) 及び多田他、
日本化学会第５８春季年会(1989)3IIG31に報告した方法
でおこなった。
標識したオリゴヌクレオチドの作製方法はMurakami,A.e
t al,Nucl.Acid Res.1989.17.5587-5595) 及び多田他、
日本化学会第５８春季年会(1989)3IIG31に報告した方法
でおこなった。
【００２４】またストレプトアビジン固定化９６穴マイ
クロプレートの作製は次のように行った。すなわち牛血
清アルブミン（ＢＳＡ、フラクショＶ、Sigma 社) 700n
molを1XPBS,500ul に溶解し4.6mg のビオチンアミドカ
プロンサン（Sigma 社、ジメチルアミド溶液）を加え室
温で2-3 時間反応させた。
クロプレートの作製は次のように行った。すなわち牛血
清アルブミン（ＢＳＡ、フラクショＶ、Sigma 社) 700n
molを1XPBS,500ul に溶解し4.6mg のビオチンアミドカ
プロンサン（Sigma 社、ジメチルアミド溶液）を加え室
温で2-3 時間反応させた。
【００２５】反応溶液をG-25ゲルろかカラム(PD-10、フ
ァルマシア）で精製した。その溶液を1XPBS に280nm の
吸光度が0.5OD/mlになるように溶解し９６穴マイクロプ
レートに200ul ずつ添加した。４℃で１晩放置したのち
溶液を捨て去り１％ＢＳＡ、200 ulを各ウエルに添加し
ブロッキングを４℃で１晩行った。溶液を捨て去り、0.
1%ツイーン20を含む1XPBS で２回ウエルを洗浄した後20
ug/ml のストレプトアビジン（BRL 社）を各ウエルに添
加し室温で２−３時間放置させた。次に0.5%ツイーン20
を含む1XPBS で２回ウエルを洗浄して調整したものを用
いた。
ァルマシア）で精製した。その溶液を1XPBS に280nm の
吸光度が0.5OD/mlになるように溶解し９６穴マイクロプ
レートに200ul ずつ添加した。４℃で１晩放置したのち
溶液を捨て去り１％ＢＳＡ、200 ulを各ウエルに添加し
ブロッキングを４℃で１晩行った。溶液を捨て去り、0.
1%ツイーン20を含む1XPBS で２回ウエルを洗浄した後20
ug/ml のストレプトアビジン（BRL 社）を各ウエルに添
加し室温で２−３時間放置させた。次に0.5%ツイーン20
を含む1XPBS で２回ウエルを洗浄して調整したものを用
いた。
【００２６】室温で１５分放置の後、ウエル中の溶液を
捨て去りその後プレートを0.5 ％ツィーン20を含む１Ｘ
ＰＢＳ200ul で室温で１分間２回、予め５０℃に暖めた
0.5％ツィーン20を含む１ＸＰＢＳ 200ulで１分間１
回、再び室温で１分間１回洗浄した後さらに１ＸＰＢＳ
200ul 、次いで1mM 塩化マグネシウムを含む0.2M トリ
ス塩酸緩衝液(PH9.5)200ulでウエル中の溶液を置換し
た。
捨て去りその後プレートを0.5 ％ツィーン20を含む１Ｘ
ＰＢＳ200ul で室温で１分間２回、予め５０℃に暖めた
0.5％ツィーン20を含む１ＸＰＢＳ 200ulで１分間１
回、再び室温で１分間１回洗浄した後さらに１ＸＰＢＳ
200ul 、次いで1mM 塩化マグネシウムを含む0.2M トリ
ス塩酸緩衝液(PH9.5)200ulでウエル中の溶液を置換し
た。
【００２７】第３反応 各ウエルに0.01mM ４−メチルウンベリフェリル燐酸
（Sigma社) 、及び1mM塩化マグネシウムを含む0.2M ト
リス塩酸緩衝液(PH9.5) を200ul 添加し３７℃で１５分
酵素反応を行った。反応液 150ulをとり400ul の50mM
EDTAを添加し酵素反応を停止させた。その溶液を島津蛍
光分光光度計(RF5000)で励起波長360nm、蛍光波長450nm
で測定した。結果を添付のグラフに示した。本法の結
果を図１に記載した。
（Sigma社) 、及び1mM塩化マグネシウムを含む0.2M ト
リス塩酸緩衝液(PH9.5) を200ul 添加し３７℃で１５分
酵素反応を行った。反応液 150ulをとり400ul の50mM
EDTAを添加し酵素反応を停止させた。その溶液を島津蛍
光分光光度計(RF5000)で励起波長360nm、蛍光波長450nm
で測定した。結果を添付のグラフに示した。本法の結
果を図１に記載した。
【００２８】その結果、１０コピー以下のビブリオ・パ
ラヘモリティカスWP1 株のＤＮＡをＰＣＲ終了後約４５
分という短時間で検出できた(S/N=2) 。この結果は，従
来法の電気泳動法に比べ約１−２桁高感度であった。
ラヘモリティカスWP1 株のＤＮＡをＰＣＲ終了後約４５
分という短時間で検出できた(S/N=2) 。この結果は，従
来法の電気泳動法に比べ約１−２桁高感度であった。
【００２９】また本法ではハイブリダイゼーションと９
６穴マイクロプレートへの標的核酸の固定が同時におこ
るがそのことに伴う悪影響は認められなかった。
６穴マイクロプレートへの標的核酸の固定が同時におこ
るがそのことに伴う悪影響は認められなかった。
【００３０】（実施例２）この方法の特異性をしらべる
ために臨床分離株２３株（ビブリオ・パラヘモリティカ
スWP1 株を含む）を用いて実施例（１）に記載した方法
で行った。
ために臨床分離株２３株（ビブリオ・パラヘモリティカ
スWP1 株を含む）を用いて実施例（１）に記載した方法
で行った。
【００３１】各菌株がｔｄｈ遺伝子を有しているかどう
かはＤＮＡコロニーハイブリダイゼーションで白井ら
（1989、日本細菌学会誌 44:196）により調べられてい
る。またｔｄｈ遺伝子と約８３％、６８％と高いＤＮＡ
ホモロジーを持つ耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒ
ｈ１遺伝子、及びｔｒｈ２遺伝子）の有無も同時に記載
した。
かはＤＮＡコロニーハイブリダイゼーションで白井ら
（1989、日本細菌学会誌 44:196）により調べられてい
る。またｔｄｈ遺伝子と約８３％、６８％と高いＤＮＡ
ホモロジーを持つ耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子（ｔｒ
ｈ１遺伝子、及びｔｒｈ２遺伝子）の有無も同時に記載
した。
【００３２】ｔｒｈ遺伝子の有無は岸下ら（1990、日本
細菌学会誌45:350）によりＤＮＡコロニーハイブリダイ
ゼーションで調べられた。
細菌学会誌45:350）によりＤＮＡコロニーハイブリダイ
ゼーションで調べられた。
【００３３】その結果を図２にプロットした。ｔｄｈ陽
性株ではすべて蛍光光度（シグナル）が140 以上であっ
た。１方ｔｄｈ陰性株（ｔｒｈ陰性でｔｒｈ１あるいは
ｔｒｈ２陽性株を含む）ではいずれの場合でも蛍光強度
は11以下であった。本法では非常にＤＮＡホモロジー
（相同性）の高いｔｒｈ遺伝子と交差反応することなく
ｔｄｈ遺伝子特異的な検出ができた。
性株ではすべて蛍光光度（シグナル）が140 以上であっ
た。１方ｔｄｈ陰性株（ｔｒｈ陰性でｔｒｈ１あるいは
ｔｒｈ２陽性株を含む）ではいずれの場合でも蛍光強度
は11以下であった。本法では非常にＤＮＡホモロジー
（相同性）の高いｔｒｈ遺伝子と交差反応することなく
ｔｄｈ遺伝子特異的な検出ができた。
【００３４】以上より、本法は実施例（１）及び（２）
に示したように高感度かつ高特異的にビブリオ・パラヘ
モリティカスｔｄｈ遺伝子を特異的に検出できることが
わかった。
に示したように高感度かつ高特異的にビブリオ・パラヘ
モリティカスｔｄｈ遺伝子を特異的に検出できることが
わかった。
【００３５】
【発明の効果】本発明によれば、目的核酸の有無を電気
泳動を行わずに高感度に、しかも検出を約４５分という
短時間でできるようになる。また９６穴マイクロプレー
トのような一度に大量のサンプルを処理できる道具を用
いるため、対象となる核酸の検出を自動装置化すること
が可能となる。
泳動を行わずに高感度に、しかも検出を約４５分という
短時間でできるようになる。また９６穴マイクロプレー
トのような一度に大量のサンプルを処理できる道具を用
いるため、対象となる核酸の検出を自動装置化すること
が可能となる。
【図１】ビブリオ・パラヘモリティカスWP1 株のＤＮＡ
を本発明により検出した図
を本発明により検出した図
【図２】臨床分離株２３株のＤＮＡを本発明により検出
した図
した図
Claims (1)
- 【請求項１】 少なくとも１方をラベルした２種のオリ
ゴヌクレオチドを鎖長反応プライマーとして機能させ標
的ＤＮＡ中の特定のＤＮＡをＤＮＡ合成酵素を用いて選
択的に増幅させる行程（第１反応）、 次いであらかじめ増幅断片の１部と相補的な配列をふく
む標識オリゴヌクレオチドに第１反応で用いたラベル特
異的な物質を固定したマイクロプレートに第１反応の生
成物を添加する工程（第２反応）、 その後第２反応に用いた標識より生じる信号を測定を行
う（第３反応）ことで目的核酸の有無を検出する核酸の
検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28475591A JP3146565B2 (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | 核酸の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28475591A JP3146565B2 (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | 核酸の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05123197A true JPH05123197A (ja) | 1993-05-21 |
| JP3146565B2 JP3146565B2 (ja) | 2001-03-19 |
Family
ID=17682587
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28475591A Expired - Fee Related JP3146565B2 (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | 核酸の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3146565B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997035970A1 (fr) * | 1996-03-26 | 1997-10-02 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Oligonucleotides utilises pour detecter vibrio parahaemolyticus et procede de detection |
-
1991
- 1991-10-30 JP JP28475591A patent/JP3146565B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997035970A1 (fr) * | 1996-03-26 | 1997-10-02 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Oligonucleotides utilises pour detecter vibrio parahaemolyticus et procede de detection |
| US6048697A (en) * | 1996-03-26 | 2000-04-11 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Oligonucleotides used for detecting vibrio parahaemolyticus and method of detection therewith |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3146565B2 (ja) | 2001-03-19 |
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