JPH0489499A - ヒト肝実質細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒト肝実質細胞増殖因子に関する。

（従来の技術） 肝臓は、生体中唯−再生可能な臓器である。この肝再生
現象は肝移植実験や体液交流実験などから何らかの液性
因子によることが示唆されてきた。

近年、本発明者らは肝実質細胞を生体内より取り出し生
体外においてその増殖を促進させるヒト由来の蛋白性因
子すなわち、ヒト肝実質細胞増殖因子（以下ｒｈＨＧＦ
Ｊと略す。）を劇症肝炎患者血漿より見いだしくバイオ
メディカルリサーチ（Ｂｉｏｍｅｄ、Ｒｅｓ、）６巻２
３１頁（１９８５）及びエクスペリメンタルセルリサー
チ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ、Ｒｅｓ、）１６６巻１３９頁（
１９８６））、世界で初めて単一の蛋白質として精製す
ることに成功した（特開昭６３−２２５２６号公報及び
ジャーナルオプクリニカルインベスティゲーション（Ｊ
、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）８１巻４１４頁（１９８
Ｂ））。さらにｈＨＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を単
離するに至った（特許出願済（特願平１−２０９４４９
号）及びバイオケミカルバイオフィジカルリサーチコミ
ュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｕｎ、）１６３巻９６７頁（１９８９）
）。

このｈＨＧＦ蛋白質はシグナル様ペプチド配列から数え
、４９４個のアミノ酸からなるＨ鎖ペプチドと２３４個
のアミノ酸からなるＬ鎖ペプチドより構成される蛋白質
で少なくとも４箇所に糖鎖結合部位を持つことを特徴と
する。これら２つのペプチド鎖はジスルフィド結合（Ｓ
−３結合）により結合しており、肝実質細胞の増殖を生
体外に於いて促進する活性が認められている（バイオケ
ミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョン（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｕｎ、）１６３巻９６７頁（１９８９）
）。各ペプチド鎖の遺伝子はＨ２Ｎ及びＬ鎖ペプチドの
順に連なった形でコードされている。

そのため−本のＲＮＡ上に転写され、同時に一つの蛋白
質として翻訳される。その後Ｎ末端側に存在するシグナ
ル様配列の切断除去が起こりさらにそれ以降の一本の蛋
白類が二本に切断される。これによって生じた二本のペ
プチド鎖はＳ−３結合を介して機能的な蛋白質を形成す
ると考えられる。

（発明が解決しようとする問題点） このｈＨＧＦ蛋白質の生化学的ならびに生理的機能を明
らかにすることは肝再生機構の解明のみならず、生体外
における安定な肝実質細胞の供給ならびに肝疾患に対す
る治療薬の開発に重要な役割を担ってくる。しかしなが
らｈＨＧＦ蛋白質の生体における詳細な機能、あるいは
肝障害時における肝再生に対するｈＨＧＦ蛋白質の効果
等を調ペるためには多量のｈＨＧＦ蛋白質を必要とする
。

ところが現在に至るまでｈＨＧＦ蛋白質を取得する方法
としては、劇症肝炎患者血漿を材料として、その中に微
量に存在するｈＨＣ，Ｆ蛋白質の精製を行わざるをえな
かった。この方法は人的、時間的、価格的に必ずしも容
易な方法ではなく、またウィルスなどを始めとした感染
源の存在する患者血漿中から微量なｈＨＧＦ蛋白質のみ
を安定にとりだすことは困難を極める。これらの理由か
ら劇症肝炎患者血漿を材料としたｈＨＧＦ蛋白質の安定
かつ大量の精製は行われていなかった。

（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らは、ｈＨＧＦ蛋白質を組換えＤＮＡ技
術により安定かつ大量に取得するため種々の検討をした
結果、この目的に有用なｈＨＧＦ蛋白質をコードする遺
伝子を含む発現ベクターを新たに構築しｈＨＧＦ蛋白質
の発現を可能にした（特願平２−８８５９２号公報）。

更に、本発明者らは、上記発現ベクターで形質転換され
た宿主細胞を培養して得られるｈＨＧＦのアミノ酸配列
について検討した結果、分泌されたｈＨＣ；ＦのＮ末端
アミノ酸がピログルタミン酸であることを見い出し、本
発明を完成するに至った。

即ち、本発明の要旨は、第２図で表わされるアミノ酸配
列を有するヒト肝実質細胞増殖因子に存する。

以下に、本発明を説明する。

ｈＨＧＦ蛋白質の工業生産のためには、その蛋白質発現
が安定した宿主−ベクター系を選択すること、さらに発
現したｈＨＧＦ蛋白質が生物学的活性すなわち肝実質細
胞の増殖活性を有している必要がある。特に天然のｈＨ
ＧＦ蛋白質が糖蛋白質であること、またｈＨＧＦ蛋白質
が多（のシスティン残基を含み、そのシスティン残基間
のチオール結合の位置および蛋白質の高次構造が活性維
持に重要であることを考慮する必要がある。

このような場合、宿主としては酵母や大腸菌例えば、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍ　　ｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
株やＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ土ＹＡ−２１株
等の微生物も使用することが出来るが、動物細胞例えば
ＣＨＯ細胞、ＣＯ８細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２
７細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞等を用いて上記遺伝子を発
現させることが望ましい。またこれらの細胞を宿主とす
る場合は、第１図に示すＤＮＡ配列中に含まれるシグナ
ル様配列すなわち１〜９３番目を含む未成熟のｈＨＧＦ
遺伝子を細胞内に導入することにより、成熟型ｈＨＧＦ
蛋白質が細胞外に分泌生産されることが期待されるとい
う利点が挙げられる。

本発明において用いられる発現ベクターは、そのプロモ
ーター下流にｈＨＧＦ蛋白質の一部または全部のアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ断片を有する。

プロモーターとしては、種々のプロモーターが報告され
ているが、本発明においては、ＳＶ４０プロモーターま
たはメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ましい
、このプロモーターの下流に前述のシグナル様配列を含
む未成熟のｈＨＧＦ遺伝子のＤＮＡ断片を転写方向に従
って挿入する。

この場合、ｈＨＧＦ遺伝子のＤＮＡ断片をタンデムに２
−３個結合したものを挿入してもよいし、また、ｈＨＧ
Ｆ遺伝子のＤＮＡ断片の５′上流側にプロモーターを結
合したＤＮＡ断片を単位とし、転写方向を揃えてタンデ
ムに２−３個結合したものを挿入してもよい。

上記ｈＨＧＦ遺伝子には、その下流にポリアデニル化部
位が存在することが必要である。例えば、５Ｖ４０ＤＮ
Ａ、β−グロビン遺伝子またはメタロチオネイン遺伝子
由来のポリアデニル化部位がｈＨＧＦ遺伝子の下流に１
つ存在することが必要である。また、ｈＨＧＦ遺伝子に
プロモーターを結合したＤＮＡ断片を２−３個タンデム
に挿入する方法を用いた場合には、各ｈＨＧＦ遺伝子の
３′側にそれぞれポリアデニル化部位を存在させること
が可能である。

上記の発現ベクターを用いて動物細胞例えばＣＨＯ細胞
を形質転換する際には、選択マーカーを用いることが望
ましい。選択マーカー遺伝子を該発現ベクターのポリア
デニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿入してお
くと、形質転換体を得る際に、選択マーカー遺伝子を含
む別のプラスミドを二重形質転換する必要がない。この
ような選択マーカーとしては、メトトレキセート耐性を
与えるＤＨＦＲ遺伝子（ジャーナル・オブ・モレキュラ
・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、）１５９巻６
０１頁（１９Ｂ２））、抗生物質Ｇ４１８耐性を与える
Ｎｅｏ遺伝子（ジャーナル・オブ・モレキュラ・アプラ
イド・ジェネテイクス（Ｊ、Ｍｏ　１．Ａｐｐ　１．Ｇ
ｅｎｅｔ、）１巻３２７頁（１９８２））、ミコフェノ
ール酸耐性を与える大腸菌由来のＥｃｏｇｐｔ遺伝子（
プロシーディング・アンド・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、
Ｓｃ　ｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）　７８巻２０７２頁
（１９８，１）　）　、抗生物質ハイグロマイシン耐性
を与えるｈｐｈ遺伝子（モレキュラ・セル・バイオロジ
ー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）５巻４１０頁（１
９８５））等が挙げられる。これらの各耐性遺伝子の５
′上流側にはプロモーター、例えば前述のＳＶ４０由来
のプロモーターが挿入されており、また、各耐性遺伝子
の３′下流側には、前述のポリアデニル化部位が含まれ
る。

発現ベクターに上記のような選択マーカー遺伝子が挿入
されていない場合には、形質転換体の選択のマーカーを
有するベクター例えばｐＳＶ２ｎｅｏ（ジャーナル・オ
ブ・モレキュラ・アプライド・ジエネティクス（ＪｏＭ
ｏ　１．Ａｐ　ｐ　１．Ｇｅｎｅｔ、）１巻３２７頁（
１９Ｂ２））、ｐＭＢＧ（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
２９４巻２２８頁（１９８１））、ｐＳＶ２ｇｐｔ　　
（７’０シーデイング・アンド・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス（Ｐｒｅｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃ　ｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、）　７８巻２０７２頁（
１９８１））、ｐＡｄ−Ｄ２６−１　（ジャーナル・オ
プ・モレキュラ・バイオロジー（ＪｏＭｏ　１．Ｂ１０
１．）１５９巻６０１頁（１９Ｂ２））（Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１５９，６０１　（１９Ｂ２））な
どをｈＨＧＦ遺伝子の発現ベクターと共に二重形質転換
し、選択マーカー遺伝子の表現形質により形質転換体を
容易に選択できる。

以上のような方法で、選択されるｈＨＧＦ蛋白質遺伝子
を含有する細胞について選択マーカーを変更して二重形
質転換を繰り返すと、発現量が約２０倍上昇するので好
ましい。

発現ベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法
（ピロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２巻４５６頁（１
９７３））、エレクトロポレーション法（ジャーナル・
オブ・メンブレン・バイオロジー（Ｊ９Ｍｅｍｂｒ、Ｂ
ｉｏ　１．）１０巻２７９頁（１９７２））等が挙げら
れるが、リン酸カルシウム法が一般的である。

形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮遊培養
または付着培養で行うことができる。培地としては、Ｍ
ＥＭ、ＲＰＭＩ　１６４０などを用い、５−１０％の血
清存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサメサゾ
ン、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清下にて
培養する。

ｈＨＧＦ蛋白質を産生じている動物細胞はその培養上清
中に産生されたｈＨＧＦ蛋白質を分泌することから、こ
の組換え体の培養上清を用いｈＨＧＦ蛋白質の分離精製
を行うことが可能である。

具体的には沈座されたｈＨＧＦ蛋白質を含む培養上清を
各種クロマトグラフィー、例えば、Ｓ−セファロース、
ヘパリンセファロース、ハイドロキシアパタイトもしく
は硫酸化セルロファイン等を組み合わせたクロマトグラ
フィーにて精製することにより、ｈＨＧＦ蛋白質を単離
精製することができる。

本発明においては、第２図に示されるＭｅｔからはじま
るプレｈＨＧＦがまず宿主内で発現される。次いで、宿
主内で修飾を受けて第３１番目のＧｌｙと第３２番目の
Ｇｉｎの間で加水分解されて３１個のシグナルペプチド
が切断される。次いで、Ｎ末端のＧｌｎが脱アンモニア
されてピログルタミン酸に変化したｈＨＧＦが分泌され
る。

かくして、本発明のＮ末端がピログルタミン酸に修飾さ
れたｈＨＧＦが得られる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定される
ものではない。

実施例１ （１）ｈＨＧＦ蛋白質発現プラスミドの調製第３図にｈ
ＨＧＦ蛋白質発現プラスミドの調製方法を示す。ｈＨＧ
ＦｃＤＮＡ　（バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ、Ｂ、　Ｒ，
Ｃ第１６３巻（２）９６７頁−９７３頁（１９８９））
を含むＢａｍＨＩ−に上」」断片すなわちｈＨＧＦ蛋白
翻訳開始点ＡＴＣより２７塩基上流のＢａｍＨＩ切断点
から終止コドンＴＡＧより８塩基上流αＬＩＬＩ切断点
までの領域をカバーする約２．３　ｋ　ｂのＢａｍ　Ｈ
Ｉ　−Ｋ■工Ｉ断片を含むプラスミドｐＵＣＨＧＦ　Ｉ
　ＤＮＡを常法（「モレキュラー・クローニング」、コ
ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１９３頁
（１９Ｂ２））により調製した。

次に該プラスミドＤＮＡｌ０μｇを常法に従い制限酵素
ｍｌで切断し、得られたＤＮＡ断片を常法に従いフェノ
ール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱により
該ＤＮＡ断片を精製しｌＯμｌの水に溶解した。

さらにこのＤＮＡ断片のに１エＩ切断点に第３図に示す
両末端が制限酵素に１工Ｉ切断点をもちかつ内部に終止
コドンＴＧＡ及び制限酵素ＢａｎＨ１切断点を含む３２
塩基の合成リンカ−をＭａｎｉａｔｉｓらの方法（「モ
レキュラー・クローニング」、コールド・スプリング・
）１−パー・ラボラトリ−１３９６頁−３９７頁（１９
８２））に従い導入した。

これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた
形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法（「モレキュラ
ー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−１９３頁（１９８２））により調製した
。

次に該プラスミドＤＮＡｌ０μｇを常法に従い制限酵素
ＢａｍＨＩで切断し、この制限酵素反応液Ｆ１．ｏ％ア
ガロースゲルによって電気泳動をすることにより目的の
開始コドンＡＴＧと終止コドンＴＧＡを含むｈＨＧＦＤ
ＮＡ断片をベクター等の目的以外のＤＮＡ断片と分離し
た。Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラー・クロ
ーニング」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−１６４頁（１９Ｂ２））に従いアガロースゲル断
片から目的とするｈＨＧＦ遺伝子をコードする約２、３
　ｋ　ｂのＢａｍＨＴ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を調製し
た。得られたＤＮＡ断片の末端を常法に従いＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼにて平滑末端にした後フェノール・クロロ
ホルム抽出ヲ行い、エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片
を精製し１０μｌの水に溶解した。

一方、発現ベクターｐＫＣＲ（プロシーディング・アン
ド・ナチュラル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）７８巻１５２７
頁（１９８１））０．０５μｇは予め常法に従い平滑末
端を生じる制限酵素Ｓｍａ　１で切断し、フェノール・
クロロホルム抽出を行いエタノール沈澱により精製した
。これを４００μｌの５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８）
、１ｍＭ塩化マグネシウム溶液に溶解したのちバクチリ
アルアルカリホスファターゼ（東洋紡、ＢＡＰ−１０１
）１ユニツトを添加し、６５°Ｃ下３０分の反応を施し
脱燐酸化処理を行った。次にこの反応液かラフエノール
・クロロホルム抽出とエタノール沈澱により該ＤＮＡ断
片を精製し１０μ！の水に溶解した。

上記の様に調製したｐＫＣＲベクターのＤＮＡ断片０．
０１μｇと前述の平滑末端化されたｈＨＧＦｃＤＮＡの
ＢａｍＨＩ断片０．１　ｕ　ｇを含む反応液（６６ｍＭ
）リス−塩酸ｐ　Ｈ７，６，６，６ｍ　Ｍ塩化マグネシ
ウム１０ｍＭジチオスレイトール、６６μＭＡＴＰ）２
０μ！中にて１４℃で１２時間Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（東
洋紡ＬＧＡ−１０１）による結合反応を行った。このＴ
４ＤＮＡリガーゼ反応液１０μｌを用いて大腸菌Ｈ８１
０１株（宝酒造）を説明書に従い形質転換し、アンピシ
リンを５０μｇ　／　ｍ　ｌの濃度で含む培地上で培養
することにより数十個のアンピシリン耐性株を得た。

これらの組換え体をＭａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレ
キュラ・クローニング」、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ、８６頁〜９６頁（１９８２））に従
い解析することにより、発現ベクターｐＫＣＲのプロモ
ーターとポリアゾニレ−ジョン部位の中間に存在する制
限酵素ＳｍａＩ切断部位にｈＨＧＦ遺伝子が順方向に二
連結したプラスミド、ｐＫｃＲＨＧＦ−２プラスミドを
得ることが出来た。

その構造を第４図に示す。

［ＩＩ）ｈＨＧＦ蛋白質を継代的に発現する細胞株の取
得 実施例１−（１）により作製された発現ベクターｐＫＣ
Ｒ（プロシーデング・アンド・ナチュラル・アカデミ−
・オブ・サイエンス（Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）７８巻（２）１５２７頁
（１９８１））の制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位にｈＨＧ
ＦｃＤＮＡが二個挿入されたプラスミドｐＫＣＲＨＧＦ
−２をＭａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラー・ク
ローニング」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−８６頁〜９６頁（１９Ｂ２））に従い組換え体
の大腸菌から回収、精製しＨＧＦ発現プラスミドＤＮＡ
を大量に得た。

一方形質転換細胞選択用のマーカーをコードするプラス
ミドｐＳＶ２ｎｅｏ　（ジャーナル・オプ・アプライド
・ジェネテイクス（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　　Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１巻３２７頁（１９８２）
）を有する組換え体の大腸菌およびｐＡｄ−Ｄ２６−１
　（ジャーナル・オプ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆ　　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）第１５９巻６０１頁（１９Ｂ２））を有する組
換え体の大腸菌から前述のＭａｎｉａｔｉｓらの方法に
従い該プラスミドＤＮＡを回収、精製した。

得られた三種のプラスミドＤＮＡを用いてＡｕ５ｕｂｅ
ｌらの方法（カレント・プロトコール・イン・モレキュ
ラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・ア
ンド・ウィリーインターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ　　
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　　　
ａｎｄ　　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒ　　５ｃｉｅｎｃｅ
）９°１１１章〜９・１・４章（１９８７））を基にＣ
ＨＯ細胞に二重形質転換してＣＨＯ細胞を形質転換した
。

即ち、まず直径９Ｃ１＋のシャーレの中でＦｅ２（牛胎
児血清）が１０％入ったＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）
中でＣＨＯ細胞をセミコンフルエントな状態になるまで
培養した。次にシャーレから培地を除きそこにＤＮＡ溶
液を滴加するが、該ＤＮＡ溶液は予め次に示す手順に従
って調製した。

まず直径９Ωのシャーレ−枚につき３００μｌの２ＸＨ
ＥＢＳ溶液（２ｘＨＥＢＳ溶液；１．６％塩化ナトリウ
ム、０．０７４％塩化カリウム、０．０５％燐酸水素二
ナトリウム１２水塩、０．２％デキストロース、１％Ｈ
ＥＰＥＳ　（ｐＨ７，０５））と１０μｇのプラスミド
ＤＮＡおよび１Ｍｇのｐｓｖ２ｎｅＯプラスミドＤＮＡ
Ｘ　１ｕｇのｐＡｄ−Ｄ２６−１プラスミドＤＮＡを加
え、滅菌された水で５７０μｌに合わせた溶液をエッペ
ンドルフ遠心管中に準備する。次に該ＤＮＡ溶液に３０
μｌの２．５Ｍの塩化カルシウム溶液を滴加しながらポ
ルテックスミキサーを用い数秒間激しく混和する。これ
を室温で３０分間放置するが、その間およそ１０分おき
にポルテックスミキサーで混和する。

この様にしてできたＤＮＡ溶液を前述の細胞にかけて室
温で３０分間静置した。その後ＦＣ３が１０％入ったＥ
ＲＤＦ培地９培地９シｌ−レに入れて、５％ＣＯｚ存在
下、３７°Ｃで４〜５時間培養した。次にシャーレから
培地を除き５ｍｆのＩＸＴＢＳｆ十溶液（１ｘＴＢｓ＋
十溶液；２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、１４０
ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、０．６ｍＭ
燐酸水素二ナトリウム、０．０８ｍＭ塩化カルシウム、
０゜０８ｍＭ塩化マグネシウム）で細胞を洗浄し、ＩＸ
ＴＢＳ十十溶液を除去した後、グリセロールを２０％含
むＩＸＴＢＳ＋十溶液５ｍｊ！を、細胞にかけて、室温
で１〜２分間静置し、上清を除去した。その後５ｍｆの
ＩＸＴＢＳｆ十溶液で細胞を再び洗浄し、Ｆｅ２が１０
％入ったＥＲＤＦ培地１０ｍ１をシャーレに入れて５％
ＣＯ２存在下、３７°Ｃで培養した。培養後、４８時間
が経過した時点で培地を除き、５ｍ！！、のＩＸＴＢＳ
＋十溶液で細胞を洗浄した後、細胞にトリプシン−ＥＤ
ＴＡ溶液（シグマ社）２ｍｌをかけ、室温で３０秒静置
した。その後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を除き、それ
から５分後にＦｅ２が１０％入ったＥＲＤＦ培地１０ｍ
１をシャーレに入れて細胞を剥がし、９ａｉシャーレ−
枚分の細胞を９ｃｍシャーレ１０枚に分けて薬剤Ｇ４１
Ｂ（Ｇ４１８硫酸塩（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ）；ＧＩＢＣ
Ｏ社）を２゜０８ｇ　／　ｍ　ｉの濃度になるように加
えて培養を続けた。その後１０日が経過した時点で生き
残ったＧ４１８に耐性の細胞を単離し、一つの培養用の
穴がおよそ３．１ｃｍ２の２４穴の培養皿を用い、それ
ぞれＦｅ２が１０％入ったＥＲＤＦ培地１培地１中ｊ２
中そ７日間培養し直した。

以上の細胞の培地をＦｅ２を含まないＥＲＤＦ培地に代
えて培養を続け７２時間が経過した細胞の培地を個別に
２ｍｌ！集め、それをセントリコン濃縮器（ミリボア社
）で５０μｌに遠心濃縮してそのうちの約１５μｉをサ
ンプルとして、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行った。

これを常法に従いウェスタンプロット法で解析しｈＨＧ
Ｆ蛋白質の発現を確認した。

また、Ｇｏｈｄａらの方法（エクスペリメンタル・セル
・リサーチ（Ｅｘｐｅｒ　ｉｍｅｎｔａ　ｌＣｅ１ｌ　
　Ｒｅ５ｃｅｒｃｈ）１６６巻１３９頁〜１５０頁（１
９８６））によりｈＨＧＦ活性を測定し生物学的活性の
存在を確認した。

さらに得られた細胞株は個別に単離され酵素イムノアッ
セイ法を行いｈＨＧＦ蛋白質の定量を行った。

その結果、発現量の確認された細胞株Ｂ−１゜Ｂ−２７
，Ｂ−１０２を得た。

実施例２ （１）ｈＨＧＦ遺伝子を有する発現ベクターを用いて繰
り返し形質転換して得られる、ｈＨＧＦ蛋白質を継代的
に発現する細胞株の取得実施例１−［１）により取得し
た、ｈＨＧＦ遺伝子発現ベクターｐＫｃＲＨＧＦ−２及
びミコフェノール酸耐性の形質転換細胞選択用のマーカ
ーをコードするプラスミドｐＭＢＧ　（Ｎａ　ｔ　ｕ　
ｒ　ｅ２９４．２２８　（１９８１））を有する組換え
体の大腸菌から、前述のＭａｎｉａｔｉｓらの方法に従
い該プラスミドＤＮＡを回収、精製した。

得られた二種のプラスミドＤＮＡを用いてＡｕ５ｕｂｅ
ｌらの方法（カレント・プロトコール・イン・モレキュ
ラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｆａｒ　　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエイッ・ア
ンド・ウィリーインターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ　　
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　　ａ
ｎｄ　　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒ　　５ｃｉｅｎｃｅ）
９１１章〜９・１・４章（１９８７））を基に、実施例
１−　（ＩＦ）によって得られたｈＨＧＦ蛋白質を継代
的に発現する細胞株のうち、ｈＨＧＦの発現量の多いも
の３株（Ｂ−１、Ｂ−２７、Ｂ−１０２）を単離し、そ
れらを個別に二重形質転換して該細胞を形質転換した。

すなわち、まず直径９　ｃｍシャーレの中でＦｅ２が１
０％入ったＥＲＤＦ培地中で、前述のｈＨＧＦ蛋白質を
継代的に発現する細胞株を個別にセミコンフルエントな
状態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除き
そこにＤＮＡ溶液を滴加するが、該ＤＮＡ溶液は、１０
ｇｇのｐＫＣＲＨＧＦ−２プラスミドＤＮＡ及び１μｇ
のｐＭＢＧプラスミドＤＮＡを用いる以外は、実施例１
−（ＩＩ）と同様の手順で調製した。

この様にしてできたＤＮＡ溶液を前述の細胞にかけて室
温で３０分間静置した。その後ＦＣ３が１０％入ったＥ
ＲＤＦ培地９培地９壱ｊ２−レに入れて、５％ＣＯ２存
在下、３７°Ｃで４〜５時間培養した。次にシャーレか
ら培地を除き５ｍｌのＩＸＴＢＳ＋＋溶液（前述）で細
胞を洗浄し、１×ＴＢＳ十十溶液を除去した後、グリセ
ロールを２０％含むＩＸＴＢＳ＋十溶液５ｍｊ２を細胞
にかけて、室温で１〜２分間静置し、上清を除去した。

その後５ｍｌのＩＸＴＢＳｆ十溶液で細胞を再び洗浄し
、Ｆ’Ｃ３が１０％入ったＥＲＤＦ培地１０ｍ１をシャ
ーレに入れて５％Ｃ○２存在下、３７°Ｃで培養し、４
８時間が経過した時点で培地を除き、５ｍｊ２の１ＸＴ
Ｂｓ＋十溶液で細胞を洗浄した後、細胞にトリプシン−
ＥＤＴＡ溶液（シグマ社）２ｍｊ！をかけ、室温で３０
秒静置した。その後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を除き
、それから５分後にＦＣＳが１０％入ったα−ＭＥＭ　
（−）培地１０ｍ１をシャーレに入れて細胞を剥がし、
９ｃｍシャーレ−枚の細胞を９ｃｍシャーレｌＯ枚に分
けて薬剤ミコフェノール酸（シグマ社製）を１μｇ　／
　ｍ　ｌ及びキサンチン（シグマ社製）を２５０μｇ　
／　ｍ　ｌの濃度になるように加えて培養を続けた。そ
の後１０日が経過した時点で生き残ったミコフェノール
酸に耐性の細胞を単離し、一つの培養用の穴がおよそ３
．１ｃｍ２の２４穴の培養皿を用い、それぞれＦＣＳが
１０％入ったＥ、ＲＤＦ培地１ｍｊ２中でおよそ７日間
培養し直した。

以上の細胞の培地をＦＣＳを含まないＥＲＤＦ培地に代
えて培養を続け７２時間が経過した細胞の培地を個別に
２ｍｌ集め、それらをセントリコン濃縮器（ミリボア社
）で５０μｌに遠心濃縮してそのうち約１５μ！をサン
プルとして５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行った。

これを常法に従いウェスタンプロット法で解析しｈＨＧ
Ｆ蛋白質の発現を確認した。

また、Ｇｏｈｄａらの方法（エクスペリメンタル・セル
・リサーチ（Ｅｘｐｅｒ　ｉｍｅｎｔａ　ｌＣｅ１ｌ　
　Ｒｅ５ｅｒｃｈ）１６６巻１３９頁〜１５０頁（１９
８６））によりｈＨＧＦ活性を測定し生物学的活性の存
在を確認した。

その結果を第５図に示す。

さらに、得られた細胞株のうちいくつかを個別に単離し
酵素イムノアッセイ法でｈＨＧＦｌ白質の発現量を確認
した結果、二重形質転換前の細胞株Ｂ−１０２の発現量
のおよそ２０倍の発現量を示す細胞株ＢＤ−２４を得た
。

実施例３ 実施例２で得たｈＨＧＦ産生株ＢＤ−２４を１０％ＦＣ
３を含むＥＲＤＦ培地（極東製薬製）で培養し、その培
養土清液５００ｍｊ２を得た。これを１０ｍｎのＳ−３
ｅｐｈａｒｏｓｅ　　ＦａｓｔＦｌｏｗ［Ｆ］（ファル
マシア社）を充填したカラムに吸着させた後、１０ｍＭ
リン酸ナトリウムを含むｐ　Ｈ７，５の緩衝液中の塩化
ナトリウム濃度を上昇させることにより吸着蛋白質を溶
出させた。組換えｈＨＧＦ蛋白質は塩化ナトリウム濃度
が約０゜７モルの両分に溶出した。このｈＨＧＦ画分を
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析
したところ、非還元条件下では、分子量約７６、０００
〜９２，０００にブロードなバンドを与えたのみであり
、還元条件下では、約６０，０００〜６５．０００にブ
ロードなハンドを、分子量約５６０００により弱いハン
ドを与え（これらはｈＨＧＦ蛋白質のＨ鎖に相当する）
、さらに分子量約３２．０００〜３５，０００に２本の
ハンドを与えた（これらはｈＨＧＦ蛋白質のし鎖に相当
する）。

こうしたハンドの多重性及びブロードさは、ｈＨＧＦ蛋
白に付加した糖鎖の不均一性によって生ずるものである
。

この精製ｈＨＧＦ蛋白質溶液の緩衝液を０．１モルの重
炭酸アンモニウム水溶液に置換したのち、ｈＨＣ，Ｆ蛋
白質量の１１５０量のスタフィロコンカス・オーレウス
（Ｓｔａ　　ｈ　　１ｏｃｏｃｃｕｓ　　Ａｕｒｅｕｓ
）ＶＢプロテアーゼ（マイルス・ラボラトリ−社製）を
加えて、３７°Ｃで一夜インキユベートしてペプチド混
合物に分解した。この混合物溶液を０８カラム（ベーカ
ーボンド社製。

４．６Ｘ２５０ｍｍ）を装着した逆相高速液体クロマト
グラフィーによって、アセトニトリル濃度を０％から６
０％に変化させ（１％／分）て、分離した。溶出した約
１０個のペプチドピークについて、アミノ酸組成分析を
行ったところ、約１８分の位置に溶出したペプチドのア
ミノ酸組成は、表１のようであった。この組成は、ｈＨ
ＧＦをコードするｃＤＮＡの塩基配列から推測されたア
ミノ酸配列のうち、読み出しのメチオニンから数えて３
２番目のグルタミンから始まり４１番目のグルタミン酸
で終わるペプチドの理論組成とは・一致した。

表　　１ ペプチドのアミノ酸組成比 このペプチドをファスト・アトム・ボンバードメント・
マススペクトロスコピー（日本電子製ＨＸ−１００）に
よって質量分析したところ、分子量１３２１の位置にピ
ークが得られ、このペプチドの分子量は１３２０である
と決定された。３２番目のグルタミンから４１番目のグ
ルタミン酸に至るペプチドの理論分子量は１３３７であ
ることから、アミノ末端のグルタミンが脱アンモニアし
てピログルタミン酸に変化したものと結論することが出
来る。即ち、分泌されたｈＨＧＦ蛋白質のＮ末端アミノ
酸は３２番目のグルタミンが修飾されて生成したピログ
ルタミン酸であることが分かった。

（発明の効果） 本発明に係わるｈＨＧＦ遺伝子を挿入された発現ベクタ
ーを宿主細胞に導入することにより、今まで困難であっ
た生物学的活性を有するｈＨＧＦ蛋白質を大量、安定か
つ容易に発現することが可能となり、その結果、Ｎ末端
がピログルタミン酸に修飾された本発明のｈＨＣ；Ｆ蛋
白質を精製・取得し得るようになった。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子の
塩基配列を表わす。 第２図はヒト肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列を示す
。 配列中、第１番目〜第３１番目（−）はシグナルペプチ
ドを表わし、Ｚは修飾される前がＧｌｎを表わし、修飾
された後はピログルタミン酸を表わす。 第３図は、ヒト肝実質細胞増殖因子を発現するベクター
を構築する工程を表わす。 第４図は、本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードす
るＤＮＡを有する発現ベクターの構造を表わす。 第５図は、本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードす
るＤＮＡを有する発現ベクターを有するＣＨＯ細胞が産
生ずるヒト肝実質細胞増殖因子を含む培養上清の生物学
的活性を示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記アミノ酸配列（配列中、Ｘａａはピログルタ
   ミン酸を表わす。）で表わされるヒト肝実質細胞増殖因
   子。 【遺伝子（アミノ酸）配列があります。】 【遺伝子（アミノ酸）配列があります。】 【遺伝子配列があります。】