TWI619726B - 重組彈性蛋白酶蛋白質及其製備方法及用途 - Google Patents

重組彈性蛋白酶蛋白質及其製備方法及用途 Download PDF

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Abstract

本發明係關於用於製備、純化、調配及使用生物學活性重組彈性蛋白酶蛋白質之方法。本發明描述用於產生治療上適用之彈性蛋白酶蛋白質之重組方法，亦描述包含該等彈性蛋白酶蛋白質之醫藥組合物。亦揭示新穎重組彈性蛋白酶蛋白質及蛋白質製劑。描述使用含有本發明之彈性蛋白酶蛋白質的醫藥組合物治療及預防生物管道疾病之方法。

Description

重組彈性蛋白酶蛋白質及其製備方法及用途
本發明係關於製備及調配用於治療及預防生物管道疾病之彈性蛋白酶蛋白質的重組方法。本發明進一步係關於新穎重組彈性蛋白酶蛋白質及含有該等蛋白質之醫藥組合物。此外，本發明係關於包含重組彈性蛋白酶蛋白質之醫藥組合物用於治療及預防生物管道疾病之用途。
本申請案主張2007年12月4日申請之美國臨時申請案第60/992,319號之優先權，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
彈性蛋白(elastin)為一種能夠在伸展後自發彈回之蛋白質。交聯之彈性蛋白為賦予組織彈性之彈性纖維的主要結構組份。若一種蛋白酶具有使成熟交聯彈性蛋白溶解的能力，則其可稱為彈性蛋白酶(Bieth,JG "Elastases：catalytic and biological properties，"第217-320頁(Mecham Edition,Regulation of Matrix Accumulation,New York,Academic Press,1986))。若干已公開專利申請案(WO 2001/21574；WO 2004/073504；及WO 2006/036804)指示單獨及與其他藥劑組合之彈性蛋白酶有益於治療生物管道(包括正經受或易於經受阻塞及血管痙攣之生物管道)之疾病。對於人類個體之彈性蛋白酶療法而言，需要使用人類彈性蛋白酶以降低對非人類彈性蛋白酶之免疫反應的危 險。
然而，迄今為止，尚未有已知之商業可行方式來產生呈足夠純形式及足夠量用於臨床應用之生物學活性彈性蛋白酶。因為彈性蛋白酶為可水解大量除彈性蛋白以外之蛋白質的強大蛋白酶，所以彈性蛋白酶之蛋白水解活性對其重組產生造成潛在障礙。舉例而言，成熟彈性蛋白酶之活性可破壞表現其之宿主細胞，自身降解或降解用以幫助產生或表徵彈性蛋白酶之藥劑。
彈性蛋白酶通常表現為含有信號肽、活化肽及成熟活性部分之前蛋白質原。信號序列在分泌之後裂解產生蛋白質原，該蛋白質原可具有極低或不具有酶活性且其胺基酸序列含有活化肽及成熟蛋白質之胺基酸序列。一般而言，對於重組表現，可表現無活性前驅體而非成熟活性酶以防止破壞表現其之細胞。舉例而言，美國專利第5,212,068號描述人類胰腺彈性蛋白酶cDNA(其中稱為彈性蛋白酶"IIA"、"IIB"、"IIIA"及"IIIB")之選殖。各種彈性蛋白酶在哺乳動物COS-1細胞中表現為包括天然信號序列之全長cDNA。此外，含有枯草芽孢桿菌(B.subtilis)信號序列及β-半乳糖苷酶信號序列之彈性蛋白酶的工程化型式亦分別在枯草芽孢桿菌及大腸桿菌(E.coli)中表現。美國專利第5,212,068號亦提出在釀酒酵母(S.cerevisiae)中表現彈性蛋白酶。一般而言，美國專利第5,212,068號中彈性蛋白酶表現之工作實例展示經回收彈性蛋白酶之低活性或需要包含用胰蛋白酶處理之活化步驟，以產生活性彈性蛋白酶。此外，當在大腸桿菌中表現時，彈性蛋白酶大部分存在於包含體中，且僅小部分所表現之彈性蛋白酶可溶及具有活性。美國專利第5,212,068號中描述之彈性蛋白酶製劑中無一者經純化至醫藥級。
因此，此項技術中對允許產生治療量之生物學活性醫藥級彈性蛋白酶且較佳避免對於大規模製備而言成本高且可導致最終產品受到胰 蛋白酶污染之胰蛋白酶活化步驟的重組製備方法存在需要。向患者投予含有胰蛋白酶之彈性蛋白酶可引起經蛋白酶活化之受體1及2活化，此可能減少一些彈性蛋白酶治療之有益作用。
部分2或本申請案之任何其他部分中的任何參考文獻之引用或鑑別不應理解為允許該參考文獻可作為本發明之先前技術使用。
本發明提供製備重組彈性蛋白酶蛋白質之新穎有效方法及組合物(例如，醫藥組合物、彈性蛋白酶調配物或單位劑量)中該等重組蛋白質用於治療及預防生物管道疾病之用途。
本發明係針對自體活化彈性蛋白酶原蛋白質、編碼自體活化彈性蛋白酶原蛋白質之核酸、包含該等核酸之宿主細胞、製備自體活化彈性蛋白酶原蛋白質之方法及自體活化彈性蛋白酶原蛋白質在製備(例如)用於醫藥調配物中之成熟生物學活性彈性蛋白酶蛋白質的用途。本文中術語"自體活化"可與術語"自我活化"互換使用，且不欲暗指活化步驟已發生。本文中術語"活化"可與術語"轉化"互換使用且不欲暗指由"活化"產生之蛋白質必然具有酶活性。
如下文中所用且除非另外指示，否則術語"彈性蛋白酶"一般指具有彈性蛋白酶活性之成熟彈性蛋白酶蛋白質以及未成熟彈性蛋白酶蛋白質，包括未成熟彈性蛋白酶原蛋白質(本文中亦稱為彈性蛋白酶蛋白原)及未成熟前彈性蛋白酶原蛋白質(本文中亦稱為彈性蛋白酶前蛋白原)。
本發明之較佳彈性蛋白酶為I型胰腺彈性蛋白酶，例如人類I型胰腺彈性蛋白酶及豬I型胰腺彈性蛋白酶。I型胰腺彈性蛋白酶在本文中有時稱為"彈性蛋白酶-1"、"彈性蛋白酶-I"、"彈性蛋白酶1型"、"1型彈性蛋白酶"或"ELA-1"。人類I型胰腺彈性蛋白酶在本文中亦稱為hELA-1或人類ELA-1，且豬I型胰腺彈性蛋白酶本文中亦稱為pELA-1 或豬ELA-1。
本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質通常具有由天然存在之彈性蛋白酶基因編碼之胺基酸序列或該序列之變異體。本文中描述較佳序列變異體，包括含有胺基酸取代之變異體。彈性蛋白酶原蛋白質為成熟彈性蛋白酶蛋白質之基本上無活性之前驅體，且前彈性蛋白酶原蛋白質進一步含有用於蛋白質分泌之信號序列。本發明之彈性蛋白酶蛋白質之前及原序列通常不為編碼本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質之彈性蛋白酶基因所固有。因此，在某種意義上，本發明之未成熟彈性蛋白酶蛋白質為"嵌合"蛋白質，其中其成熟部分由天然存在之彈性蛋白酶基因編碼且其未成熟部分由非彈性蛋白酶基因序列編碼。
為便於參考，本發明之彈性蛋白酶蛋白質及其核心序列組份描繪於圖2中。如圖2中所示，彈性蛋白酶原序列內在裂解鍵(亦即，經裂解以產生成熟彈性蛋白酶蛋白質之鍵)之N末端的胺基酸殘基在本文中表示為PX...P5、P4、P3、P2及P1，其中P1緊靠裂解鍵之N末端，而位於成熟彈性蛋白酶蛋白質之裂解鍵之C末端(及成熟彈性蛋白酶蛋白質之N末端)的胺基酸殘基表示為P1'、P2'、P3'...PX'，其中P1'緊靠裂解鍵之C末端且表示成熟蛋白質之N末端胺基酸殘基。圖2亦展示以下組份：
(1)信號序列：增加自細胞分泌之所表現分子之比例的序列。一例示性序列為SEQ ID NO：50或51之胺基酸1-22。
(2)肽原+間隔子：可選、較佳非彈性蛋白酶之肽原序列(諸如，酵母α-因子前肽原)，其可視情況進一步包括一或多個間隔子序列(酵母α-因子肽原序列及Kex2及STE13間隔子序列描繪於圖1B中)。在一特定實施例中，肽原序列不包括間隔子。
(3)彈性蛋白酶肽原：當存在於彈性蛋白酶之N末端上時使分子無活性或如與相應成熟彈性蛋白酶蛋白質相比活性較低之肽。彈性蛋白 酶肽原可與活化肽鄰接或可含有與活化肽相關之額外胺基酸。例示性彈性蛋白酶肽原序列為SEQ ID NO：64及69之胺基酸1-10。
(4)活化肽：本文中可與"活化序列"互換使用，活化肽為彈性蛋白酶肽原之組份且可與彈性蛋白酶肽原鄰接。如圖2中所示，活化肽含有胺基酸殘基P10至P1。一例示性活化肽一致序列為SEQ ID NO：80；活化肽序列之其他實例為SEQ ID NO：23、72及73。
(5)識別序列：識別序列為彈性蛋白酶肽原之組份。如圖2中所示，識別序列含有胺基酸殘基P3至P1。例示性識別序列一致序列為SEQ ID NO：11-13及93，且一例示性識別序列為SEQ ID NO：20。
(6)裂解域：彈性蛋白酶原蛋白質中跨越裂解鍵之區域。如圖2中所示，裂解域含有胺基酸殘基P5至P3'。例示性裂解域序列為SEQ ID NO：42、43、48、49、53、53、54及55。
(7)裂解位點：彈性蛋白酶原蛋白質中亦跨越裂解鍵之另一區域。如圖2中所示，裂解位點含有胺基酸殘基P4至P4'。一例示性裂解位點序列為SEQ ID NO：27。
(8)前彈性蛋白酶原蛋白質：可包含所有組份部分之蛋白質。一例示性前彈性蛋白酶原蛋白質可相繼包含SEQ ID NO：50、51、96或97之肽及經可操作性連接之SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69之蛋白質。
(9)彈性蛋白酶原蛋白質：包含成熟彈性蛋白酶蛋白質、彈性蛋白酶肽原及可選肽原及間隔子序列之蛋白質。例示性彈性蛋白酶原序列為SEQ ID NO：64及69。
(10)成熟彈性蛋白酶蛋白質：當經適當處理時展示彈性蛋白酶活性之蛋白質。例示性成熟序列為SEQ ID NO：1(人類)及SEQ ID NO：39(豬)。
彈性蛋白酶蛋白質組份可視為彈性蛋白酶蛋白質、彈性蛋白酶原 蛋白質及前彈性蛋白酶原蛋白質之模組基本組份。舉例而言，本發明提供包含彈性蛋白酶肽原及成熟彈性蛋白酶蛋白質之序列的彈性蛋白酶原蛋白質。彈性蛋白酶肽原可含有活化肽。彈性蛋白酶肽原亦可含有彈性蛋白酶識別序列。本發明亦提供包含跨越彈性蛋白酶肽原與成熟彈性蛋白酶蛋白質之間的接點之區域中的裂解域或裂解位點之彈性蛋白酶原蛋白質。彈性蛋白酶原蛋白質可進一步包含用於分泌之信號序列。該等蛋白質被視為前彈性蛋白酶原蛋白質。前彈性蛋白酶原蛋白質可進一步包含酵母α因子肽原及視情況信號序列與彈性蛋白酶肽原之間的間隔子序列。本發明之彈性蛋白酶蛋白質亦可含有除圖2中所示核心模組組份外的組份。舉例而言，彈性蛋白酶蛋白質可含有用於純化之抗原決定基標籤或組胺酸標籤。亦應注意，雖然本發明之彈性蛋白酶蛋白質不必含有圖2中所描繪之所有組份，但一般含有圖2中所描繪之該等組份中之至少一者(包括(例如但不限於)成熟彈性蛋白酶或彈性蛋白酶原序列)。本發明之例示性彈性蛋白酶蛋白質闡述於下文部分8中之實施例1-12、28-39及68-69中，包括下文部分8中實施例13-27中所闡述之例示性I型彈性蛋白酶原蛋白質。
本文涵蓋編碼本發明之彈性蛋白酶蛋白質之核酸、產生及純化該等蛋白質之方法、重組細胞及細胞培養上清液、包含彈性蛋白酶蛋白質之組合物(例如，醫藥組合物、單位劑量、調配物)、該等蛋白質用於治療目的之用途及包含該等蛋白質、調配物、醫藥組合物及單位劑量之套組。編碼本發明之彈性蛋白酶蛋白質之核酸例示於下文部分8中之實施例40-67中，包括載體(參見例如實施例70-72)。重組細胞(參見例如實施例73-84)、含有彈性蛋白酶蛋白質之細胞上清液(參見例如實施例88)亦例示於部分8中。用於產生彈性蛋白酶蛋白質之方法例示於部分8中之實施例89-224、261-276及347-373中。用於產生彈性蛋白酶調配物之方法例示於部分8中之實施例225-260中。產生醫藥組合物 之方法例示於部分8中之實施例374-385中。包含彈性蛋白酶蛋白質之醫藥組合物例示於部分8中之實施例277-313及386中，且單位劑量例示於部分8中之實施例415-420中。彈性蛋白酶蛋白質之調配物例示於部分8中之實施例324-346中。彈性蛋白酶蛋白質用於治療目的之用途例示於部分8中之實施例387-414中。包含該等蛋白質之套組藉助於實施例421-424例示於部分8中。
關於具有SEQ ID NO：64及69之彈性蛋白酶原蛋白質的本發明之各種態樣作為特定實施例例示於下文部分8中；然而，該等實施例可應用於本文中所揭示之其他彈性蛋白酶蛋白質序列。
本文所述之產生方法通常包括活化步驟，由此將活化肽自彈性蛋白酶原序列移除/與成熟彈性蛋白酶序列分離，從而產生成熟彈性蛋白酶蛋白質。本文所述之活化步驟可為自體活化步驟，亦即藉由彈性蛋白酶活性實現，或為非自體活化步驟，亦即非彈性蛋白酶介導，例如藉由胰蛋白酶實現。
在某些態樣中，本發明提供包含編碼彈性蛋白酶蛋白質(包括(但不限於)具有SEQ ID NO：6-9、64-69、88-91或98-103中任一者之蛋白質)之核苷酸序列之核酸分子，該彈性蛋白酶蛋白質包含(i)彈性蛋白酶肽原，該彈性蛋白酶肽原包含含有可操作性連接於(ii)具有彈性蛋白酶活性之蛋白質之胺基酸序列的彈性蛋白酶識別序列之活化肽序列。該蛋白質視情況進一步包含可操作性連接於該彈性蛋白酶肽原之信號序列，諸如酵母α-因子信號肽，且由SEQ ID NO：34之胺基酸序列例示。α-因子在本文中有時稱為"α交配因子"。在某些特定實施例中，蛋白質包含非彈性蛋白酶肽原，諸如酵母α-因子肽原。在某些特定實施例中，蛋白質可包含一或多個間隔子序列。間隔子序列可包括(但不限於)Kex2及STE13蛋白酶裂解位點。在一特定實施例中，可使用Kex2間隔子。在另一實施例中，如圖1B中所示，Kex2間隔子可操 作性連接於STE13間隔子。信號肽序列及非彈性蛋白酶肽原序列由SEQ ID NO：51或97之胺基酸序列例示。含有信號肽序列、非彈性蛋白酶肽原序列及間隔子序列之肽由SEQ ID NO：50或96之胺基酸序列例示。
在其他特定實施例中，信號序列為哺乳動物分泌信號序列，諸如豬或人類I型彈性蛋白酶(可與I型胰腺彈性蛋白酶互換使用)信號序列。
彈性蛋白酶識別序列較佳為I型胰腺彈性蛋白酶識別序列。
在特定實施例中，具有I型彈性蛋白酶活性之蛋白質為成熟人類I型彈性蛋白酶，例如具有SEQ ID NO：1、4、5、84或87之胺基酸序列之蛋白質。
本發明亦提供包含編碼一種蛋白質之核苷酸序列之核酸分子，該蛋白質包含(i)在甲醇酵母(Pichia pastoris)中可操作之信號序列，該信號序列可操作性連接於(ii)活化序列(包括(但不限於)SEQ ID NO：23、72、73或80之胺基酸序列)，該活化序列包含蛋白酶識別序列(包括(但不限於)SEQ ID NO：11-23及93中任一者之胺基酸序列)，該蛋白酶識別序列又可操作性連接於(iii)成熟人類I型彈性蛋白酶之胺基酸序列。在一較佳實施例中，蛋白酶識別序列為人類I型彈性蛋白酶識別序列，最佳為SEQ ID NO：20之彈性蛋白酶識別序列。
亦提供由本發明之核酸編碼之彈性蛋白酶原蛋白質(視情況包含信號序列且因此代表前彈性蛋白酶原蛋白質)及成熟彈性蛋白酶蛋白質，亦提供包含該等成熟彈性蛋白酶蛋白質之組合物(例如，醫藥組合物、調配物及單位劑量)。
在一較佳實施例中，彈性蛋白酶原蛋白質或成熟彈性蛋白酶蛋白質不具有N末端甲硫胺酸殘基。然而，在另一實施例中，彈性蛋白酶原蛋白質或成熟彈性蛋白酶蛋白質具有N末端甲硫胺酸殘基。
下表1概述本說明書中所用之序列識別符。本發明之較佳蛋白質包含下表1中列出之SEQ ID NO：1-32、34、37-73、77、78、82-92及98-105中任一者或由其組成，或部分或完全由SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：81之核苷酸序列編碼。
人類I型彈性蛋白酶蛋白質中在位置10(Q或H)、44(W或R)、59(M或V)、220(V或L)及243(Q或R)存在至少5個經證實之多態現象。全長(前彈性蛋白酶原)蛋白質的長度為258個胺基酸。前8個胺基酸對應於經裂解以產生無活性蛋白原之信號或"前"肽序列，且另一肽"原"序列(包含10個對應於活化肽之胺基酸或由其組成)經裂解以產生活性成熟蛋白質。因此，位置10之多態現象存在於蛋白原中而非成熟蛋白質中。
因此，在下表2中呈現人類I型彈性蛋白酶之5種多態現象之所有可能組合。本發明提供前彈性蛋白酶原及彈性蛋白酶原蛋白質(包括(但不限於)本文所述之變異型前彈性蛋白酶原及彈性蛋白酶原蛋白質)，諸如例示於實施例1-39及68-69中之蛋白質或藉由或可藉由部分8中實施例89-224、261-276及347-373中任一者之方法獲得之蛋白質，包含下表2中闡述之多態現象的任何組合。
此外，下表3中呈現可存在於成熟彈性蛋白酶蛋白質中的人類I型彈性蛋白酶之4種多態現象之所有可能組合。本發明提供成熟彈性蛋白酶蛋白質(包括(但不限於)本文所述之變異型成熟彈性蛋白酶蛋白質)，諸如藉由或可藉由部分8中實施例89-224、261-276及347-373中任一者之方法獲得之成熟彈性蛋白酶蛋白質，包含下表3中所闡述之多態現象的任何組合。
本發明之成熟I型彈性蛋白酶可經純化，例如以用於醫藥組合物中。在特定實施例中，彈性蛋白酶為至少70%、80%、90%、95%、98%或99%純。
如藉由量測藉由添加彈性蛋白酶而催化之小肽受質N-琥珀醯基-Ala-Ala-Ala-對硝基苯胺(SLAP)之水解的速率所測定，本發明之成熟I型彈性蛋白酶較佳具有每毫克蛋白質大於1、大於5、大於10、大於20、大於25或大於30U之比活性。一個活性單位定義為在30℃下每分鐘催化1微莫耳受質水解的彈性蛋白酶之量且比活性定義為每毫克彈性蛋白酶蛋白質之活性(U/mg)。成熟人類I型彈性蛋白酶較佳具有在下限為每毫克蛋白質1、2、3、4、5、7、10、15或20U且上限獨立地為每毫克蛋白質5、10、15、20、25、30、35、40或50U之範圍內的比活性。在例示性實施例中，比活性在每毫克蛋白質1至40U、每毫克蛋白質1至5U、每毫克蛋白質2至10U、每毫克蛋白質4至15U、每 毫克蛋白質5至30U、每毫克蛋白質10至20U、每毫克蛋白質20至40U或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍的範圍內。成熟豬I型彈性蛋白酶較佳具有在下限為每毫克蛋白質1、2、3、4、5、7、10、15、20、30、40、50、60或75U且上限獨立地為每毫克蛋白質5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、90、95或100U之範圍內的比活性。在例示性實施例中，豬彈性蛋白酶之比活性在每毫克蛋白質10至50U、每毫克蛋白質20至60U、每毫克蛋白質30至75U、每毫克蛋白質30至40U、每毫克蛋白質20至35U、每毫克蛋白質50至95U、每毫克蛋白質25至100U或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍的範圍內。
因此，本發明之某些態樣係關於組合物，諸如醫藥組合物、彈性蛋白酶調配物及單位劑量，諸如下文部分8中例示於實施例277-314、346、386及415-420中之彼等組合物或藉由或可藉由實施例261-276及374-385中任一者之方法獲得之彼等組合物。
在某些實施例中，本發明之組合物包含經胰蛋白酶活化之彈性蛋白酶蛋白質，例如藉由本文中所揭示之任一方法製備之經胰蛋白酶活化之蛋白質。在其他實施例中，組合物包含經自體活化彈性蛋白酶蛋白質，例如藉由本文中所揭示之任一方法製備之經自體活化彈性蛋白酶蛋白質。在某些態樣中，本發明之組合物特徵在於以下性質中之至少一者、至少兩者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者或至少七者：(a)組合物不含胰蛋白酶；(b)組合物實質上不含胰蛋白酶；(c)組合物不含由SEQ ID NO：70及71組成之任何蛋白質；(d)組合物實質上不含由SEQ ID NO：2及3組成之任何蛋白質；(e)組合物不含細菌蛋白質；(f)組合物實質上不含細菌蛋白質；(g)組合物不含除該成熟彈性蛋白酶蛋白質以外之哺乳動物蛋白質；(h)組合物實質上不含除該成熟彈性蛋白酶蛋白質以外之哺乳動物蛋白質；(i)組合物不含或實 質上不含1種、2種、3種或全部4種由SEQ ID NO：85、86、94及95組成之蛋白質；(j)組合物不含或實質上不含1種、2種或全部3種由SEQ ID NO：106、107及108組成之蛋白質；(k)組合物含有醫藥學上可接受之含量的內毒素(例如，每毫克彈性蛋白酶10EU或10EU以下或每毫克彈性蛋白酶5EU或5EU以下)；(l)組合物中之成熟彈性蛋白酶蛋白質特徵在於每毫克蛋白質1至40U或本文中所揭示之比活性之任何其他範圍內的比活性；(m)該組合物中之胰蛋白酶活性對應於每1mg成熟彈性蛋白酶蛋白質小於4ng或本文中所揭示之胰蛋白酶活性的任何其他範圍；(n)組合物包含聚山梨醇酯-80；(o)組合物包含葡聚糖；(p)組合物包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子及聚山梨醇酯-80；(q)組合物包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子及葡聚糖；(r)組合物包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子、聚山梨醇酯-80及葡聚糖；(s)該組合物中之成熟彈性蛋白酶蛋白質展示本文中所揭示之穩定性之量，例如在4℃下儲存至少一週後、在4℃下儲存至少一個月後、在4℃下儲存至少兩個月後、在4℃下儲存至少三個月後或在4℃下儲存至少六個月後保持其比活性之60%至100%；及(t)組合物包含0.0033mg至200mg該成熟彈性蛋白酶蛋白質之單位劑量或本文中所揭示之成熟彈性蛋白酶蛋白質之任何其他單位劑量。
在某些態樣中，組合物特徵在於獨立地選自以下之群(i)至(v)之至少三個特徵、至少四個特徵或五個特徵：(i) (a)、(b)或(m)
(ii) (e)或(f)
(iii) (g)或(h)
(iv) (k)
(v) (l)。
在特定實施例中，該至少三個或該至少四個特徵中之兩者係選自 群(i)及(iv)或(v)。在其他實施例中，該至少四個特徵中之三者係選自群(i)、(iv)及(v)。
在特定實施例中，本發明提供一種組合物，包括(但不限於)醫藥組合物、彈性蛋白酶調配物或單位劑量，其包含(i)治療有效量之不含胰蛋白酶之人類I型彈性蛋白酶及(ii)醫藥學上可接受之載劑。或者，本發明提供一種組合物，其包含(i)治療有效量之實質上不含胰蛋白酶之人類I型彈性蛋白酶及(ii)醫藥學上可接受之載劑。在特定實施例中，人類I型彈性蛋白酶及/或組合物包含低於5ng/ml之胰蛋白酶活性、低於4ng/ml之胰蛋白酶活性、低於3ng/ml之胰蛋白酶活性、低於2ng/ml之胰蛋白酶活性或低於1.56ng/ml之胰蛋白酶活性。在上述實例中，ng/ml胰蛋白酶活性可在含有1mg/ml人類I型彈性蛋白酶蛋白質之液體人類I型彈性蛋白酶組合物或製劑中檢定。因此，胰蛋白酶活性亦可根據彈性蛋白酶蛋白質之毫克數來描述，例如每毫克彈性蛋白酶蛋白質低於3ng胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶蛋白質低於1.56ng胰蛋白酶活性等。本發明進一步提供一種組合物，其包含(i)治療有效量之人類I型彈性蛋白酶及(ii)醫藥學上可接受之載劑，其中該組合物包含每毫克彈性蛋白酶低於5ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於4ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於3ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於2ng之胰蛋白酶活性或每毫克彈性蛋白酶低於1.56ng之胰蛋白酶活性。
本發明進一步提供改良藉由胰蛋白酶活化方法(例如，下文部分8中實施例145之方法)產生之成熟彈性蛋白酶蛋白質之品質的方法，其包含以Macro-Prep High S樹脂管柱純化成熟彈性蛋白酶蛋白質。本發明之發明者發現如與以Poros(聚(苯乙烯-二乙烯苯))管柱純化產生胰蛋白酶活性程度對應於每毫克彈性蛋白酶蛋白質約1000ng胰蛋白酶活性之彈性蛋白酶組合物相比，以Macro-Prep High S樹脂管柱純化之成 熟彈性蛋白酶蛋白質產生胰蛋白酶活性程度對應於每毫克彈性蛋白酶蛋白質20-25ng胰蛋白酶活性之彈性蛋白酶組合物。本發明進一步提供包含藉由以Macro-Prep High S樹脂管柱純化經胰蛋白酶活化之彈性蛋白酶蛋白質而產生的成熟彈性蛋白酶蛋白質之彈性蛋白酶組合物。Macro-Prep High S樹脂可購自Biorad(Hercules,CA)，根據其剛性甲基丙烯酸酯管柱支撐而很少收縮及膨脹。可使用同一類別及/或具有相同珠粒尺寸(約50μm)之其他類似陽離子交換管柱，諸如可適當使用其他甲基丙烯酸酯管柱。
本發明之其他態樣係關於包含豬I型胰腺彈性蛋白酶之組合物，包括(但不限於)醫藥組合物、彈性蛋白酶調配物或單位劑量。在特定實施例中，本發明提供一種組合物，其包含(i)治療有效量之不含胰蛋白酶之豬I型胰腺彈性蛋白酶及(ii)醫藥學上可接受之載劑。或者，本發明提供一種組合物，其包含(i)治療有效量之實質上不含胰蛋白酶之豬I型胰腺彈性蛋白酶及(ii)醫藥學上可接受之載劑。在特定實施例中，豬I型胰腺彈性蛋白酶及/或組合物包含低於100ng/ml之胰蛋白酶活性、低於75ng/ml之胰蛋白酶活性、低於50ng/ml之胰蛋白酶活性、低於25ng/ml之胰蛋白酶活性、低於15ng/ml之胰蛋白酶活性、低於10ng/ml之胰蛋白酶活性、低於5ng/ml之胰蛋白酶活性、低於4ng/ml之胰蛋白酶活性、低於3ng/ml之胰蛋白酶活性、低於2ng/ml之胰蛋白酶活性或低於1.56ng/ml之胰蛋白酶活性。在上述實例中，ng/ml胰蛋白酶活性可在含有1mg/ml豬I型胰腺彈性蛋白酶之液體豬I型胰腺彈性蛋白酶組合物或製劑中檢定。因此，胰蛋白酶活性亦可根據彈性蛋白酶蛋白質之毫克數來描述，例如每毫克彈性蛋白酶蛋白質低於25ng胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶蛋白質低於5ng胰蛋白酶活性等。本發明進一步提供一種組合物，其包含(i)治療有效量之豬I型彈性蛋白酶及(ii)醫藥學上可接受之載劑，其中該組合物包含每毫 克彈性蛋白酶低於100ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於75ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於50ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於25ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於15ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於10ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於5ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於4ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於3ng之胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶低於2ng之胰蛋白酶活性或每毫克彈性蛋白酶低於1.56ng之胰蛋白酶活性。
在其他實施例中，本發明提供彈性蛋白酶蛋白質(諸如，成熟彈性蛋白酶蛋白質)之組合物，包括(但不限於)醫藥組合物、彈性蛋白酶調配物或單位劑量，其不含對應於SEQ ID NO：70、71、104、105中之一者、兩者、三者或所有四者之N末端變異體。在某些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含(i)治療有效量之成熟人類I型彈性蛋白酶、(ii)醫藥學上可接受之載劑，該醫藥組合物不含具有SEQ ID NO：70、71、104、105之任何蛋白質。
在其他實施例中，本發明提供一種組合物，包括(但不限於)醫藥組合物、彈性蛋白酶調配物或單位劑量，其包含：(i)治療有效量之人類I型彈性蛋白酶，該人類I型彈性蛋白酶不含或實質上不含在該成熟彈性蛋白酶蛋白質之N末端上含有特定其他胺基酸之變異型蛋白質(SEQ ID NO：37、38、70、71、94、95、104、105)；及(ii)醫藥學上可接受之載劑。在其他實施例中，本發明提供一種組合物，其包含：(i)治療有效量之人類I型彈性蛋白酶，該人類I型彈性蛋白酶不含或實質上不含缺乏該成熟彈性蛋白酶蛋白質之N末端胺基酸的變異型蛋白質(SEQ ID NO：2、3、37、38、70、71、85、86、94、95、104、105、106、107、108)；及(ii)醫藥學上可接受之載劑。在特定實施例中，人類I型彈性蛋白酶及/或組合物包含少於25% N末端變異體、少 於20% N末端變異體、少於15% N末端變異體、少於10% N末端變異體、少於5% N末端變異體、少於4% N末端變異體、少於3% N末端變異體、少於2% N末端變異體、少於1% N末端變異體、少於0.5% N末端變異體、0% N末端變異體，或包含在上述百分比之任兩者之間的範圍內之量之N末端變異體(例如，2%-25% N末端變異體、0.5%-10% N末端變異體、5%-15% N末端變異體、0%-2% N末端變異體等)。如本文所用之術語"少於X% N末端變異體"係指作為總彈性蛋白酶蛋白質之百分比的N末端變異體之量。
在其他實施例中，本發明提供一種組合物，包括(但不限於)醫藥組合物、彈性蛋白酶調配物或單位劑量，其包含(i)治療有效量之成熟人類I型彈性蛋白酶、(ii)醫藥學上可接受之載劑，該醫藥組合物實質上不含細菌蛋白質及/或實質上不含除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質。在特定實施例中，人類I型彈性蛋白酶及/或組合物包含少於25%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、少於20%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、少於15%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、少於10%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、少於5%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、少於4%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、少於3%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、少於2%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、少於1%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、少於0.5%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、0%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質，或包含在上述百分 比之任兩者之間的範圍內之量之細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質(例如，2%-25%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、0.5%-10%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、5%-15%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質、0%-2%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質等)。如本文所用之術語"少於X%細菌蛋白質及/或除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質"係指作為彈性蛋白酶製劑或該組合物中總蛋白質之百分比的該等蛋白質之量。在某些實施例中，彈性蛋白酶代表該等組合物或製劑中總蛋白質之至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%。
亦提供用於治療及預防生物管道疾病之方法，其包含向有需要之患者投予包含經純化之本發明之成熟人類I型彈性蛋白酶的組合物(例如，醫藥組合物、彈性蛋白酶調配物或單位劑量)。
進一步提供包含編碼本發明之任何彈性蛋白酶蛋白質之核酸("本發明之核酸")的載體、經工程化以表現本發明之核酸的宿主細胞。在特定實施例中，載體進一步包含調控彈性蛋白酶蛋白質表現之核苷酸序列。舉例而言，編碼本發明之蛋白質的核苷酸序列可操作性連接於甲醇誘導性啟動子。其他合適啟動子例示於下文部分5.3中。
在一特定實施例中，本發明提供一種包含編碼開放閱讀框架之核苷酸序列的載體，該開放閱讀框架包含可操作性連接於人類I型彈性蛋白酶蛋白原序列之酵母α-因子信號肽或I型彈性蛋白酶信號肽(例如，豬彈性蛋白酶信號肽)。視情況，載體進一步包含可操作性連接於開放閱讀框架之甲醇誘導性啟動子。
亦提供包含本發明之核酸及載體的宿主細胞。在某些實施例中，載體或核酸係整合至宿主細胞基因組中；在其他實施例中，載體或核 酸在染色體外。一較佳宿主細胞為甲醇酵母細胞。其他合適之宿主細胞例示於下文部分5.3中。
在一特定實施例中，本發明提供一種甲醇酵母宿主細胞，其經遺傳工程化以編碼包含可操作性連接於人類I型彈性蛋白酶酶原序列之酵母α-因子信號肽或豬彈性蛋白酶信號肽的開放閱讀框架。視情況，開放閱讀框架在甲醇誘導性啟動子的控制下。
本發明進一步提供用於產生本發明之未成熟或成熟彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含在產生彈性蛋白酶原蛋白質之條件下培養經工程化以表現本發明之核酸的宿主細胞。在某些實施例中，亦產生成熟彈性蛋白酶蛋白質。
尤其對於宿主細胞甲醇酵母而言，用於產生本發明之彈性蛋白酶原及成熟蛋白質的較佳培養條件包括在低pH值下生長一段時期。通常，低pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或在任一對上述值之間的任何範圍。在特定實施例中，低pH值為在2.0至6.0、2.0至5.0、3.0至6.0、3.0至5.0、4.0至6.0或3.0至4.0之範圍內的pH值。在培養期結束時，可升高培養物之pH值，較佳升至7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0之pH值或介於任兩個上述值之間的範圍內之pH值，以達成自成熟彈性蛋白酶蛋白質分離或移除活化序列之目的。在特定實施例中，使培養物之pH值升至在7.5至10.0或8.0至9.0之範圍內之pH值且最佳升至8.0之pH值。
在本發明之彈性蛋白酶原蛋白質之表現在甲醇誘導性啟動子控制下的情況下，用於產生本發明之未成熟或成熟彈性蛋白酶蛋白質之條件亦可包含甲醇誘導時期。
本發明之彈性蛋白酶產生方法可進一步包含回收由宿主細胞表現之蛋白質的步驟。在某些實例中，所回收之蛋白質為包含活化序列之彈性蛋白酶原。在其他實例中，所回收之蛋白質為缺乏活化序列之成 熟彈性蛋白酶。在某些條件下，回收彈性蛋白酶原與成熟彈性蛋白酶蛋白質兩者。
較佳地，尤其在希望避免自體活化彈性蛋白酶原之自體活化的情況下，用於彈性蛋白酶原表現之培養條件可包含在低pH值下生長及誘導一段時期。通常，低pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0或介於任一對上述值之間的任何範圍。在特定實施例中，低pH值為在2.0至3.0、4.0至5.0、5.0至6.0或6.0至7.0之範圍內的pH值。在特定實施例中，pH值在4.0至6.0之範圍內且最佳為5.5之pH值。
較佳地，尤其在希望避免自體活化彈性蛋白酶原之自體活化的情況下，用於彈性蛋白酶原表現之培養條件可包含在檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉中生長及誘導一段時期。在特定實施例中，使用5-50mM、7.5-100mM、10-15mM、50-200mM、75-175mM、100-150mM、75-125mM或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍(例如，50-75mM、75-100mM等)的濃度。在一較佳實施例中，檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉濃度為90-110mM且最佳為100mM。
此外，尤其在希望避免自體活化彈性蛋白酶原之自體活化或成熟彈性蛋白酶自體降解作用的情況下，用於表現未成熟彈性蛋白酶蛋白質之培養條件可包含在適於所討論之宿主細胞的溫度範圍之下端下生長及誘導一段時期。舉例而言，在宿主細胞為甲醇酵母宿主細胞之情況下，較佳範圍為約22-28℃。在一特定實施例中，在28℃下培養甲醇酵母宿主細胞。
此外，尤其在希望避免宿主細胞蛋白酶使蛋白質降解的情況下，用於表現未成熟彈性蛋白酶蛋白質之培養條件可包含在適於所討論之宿主細胞的溫度範圍之下端下生長及誘導一段時期。舉例而言，在宿主細胞為甲醇酵母宿主細胞之情況下，較佳範圍為約22-28℃。在一 特定實施例中，在28℃下培養甲醇酵母宿主細胞。
可藉由添加少(催化)量外來彈性蛋白酶，啟始本發明之自體活化彈性蛋白酶原蛋白質之活化。在某些實施例中，催化量之外來彈性蛋白酶代表以莫耳濃度或分子量計，催化彈性蛋白酶所添加之樣品中之彈性蛋白酶的少於10%、少於5%、少於2%、少於1%、少於0.5%或少於0.1%。
或者或同時，可使自體活化彈性蛋白酶原經受pH 7-11(最佳pH 8)，接著移除自體活化彈性蛋白酶原活化肽而無需胰蛋白酶且產生成熟活性彈性蛋白酶。在特定實施例中，在活化步驟期間，添加Tris鹼至50-200mM、75-175mM、100-150mM、75-125mM或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍(例如，50-75mM、75-100mM等)的濃度。在一較佳實施例中，添加Tris鹼至90-110mM、最佳100mM之濃度。Tris鹼之pH值較佳為7-11；在特定實施例中，Tris鹼之pH值為7.0-11.0、7-9、7.5至9.5、7.5至10、8-10、8-9或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍。在一較佳實施例中，Tris鹼之pH值為7.5-8.5、最佳8.0。
在一些情況下，未成熟彈性蛋白酶序列之表現可產生彈性蛋白酶原蛋白質與成熟彈性蛋白酶蛋白質以及N末端變異型彈性蛋白酶蛋白質之混合物。因此，本發明提供一種包含以下各物中之至少兩者之組合物：(1)彈性蛋白酶原蛋白質、(2)成熟彈性蛋白酶蛋白質及(3)N末端變異型彈性蛋白酶蛋白質。
一旦產生成熟彈性蛋白酶，可將其凍乾，例如用於醫藥調配物。在一例示性實施例中，本發明提供分離經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶之方法，其包含以下步驟：(a)在表現開放閱讀框架之條件下培養經工程化以表現編碼前彈性蛋白酶原開放閱讀框架之核酸分子的宿主細胞，諸如甲醇酵母宿主 細胞，其中在一特定實施例中，該開放閱讀框架包含以5'至3'方向編碼以下各物之核苷酸序列：(i)信號肽，例如在甲醇酵母中可操作之信號肽；(ii)包含彈性蛋白酶識別序列之活化序列；及(iii)成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之序列，從而產生彈性蛋白酶原蛋白質；(b)使彈性蛋白酶原蛋白質經受自體活化條件，從而產生成熟I型彈性蛋白酶，其中自體活化條件包括以下條件中之任一者或組合：(i)將含有彈性蛋白酶原蛋白質之溶液(其可為細胞培養上清液)的pH值改變為(例如)6.5-11、較佳8-9之pH值；(ii)(例如)藉由離子交換層析法純化彈性蛋白酶原蛋白質且使溶液延長轉化以移除N末端變異體，從而產生成熟人類I型彈性蛋白酶；(iii)濃縮彈性蛋白酶原蛋白質(例如，2倍、3倍、5倍、8倍、10倍、12倍或上限及下限獨立地選自上述濃度水準之範圍)；(iv)使彈性蛋白酶原蛋白質經受增加之溫度(例如，29℃、30℃、32℃、35℃、40℃、45℃或40℃或上限及下限獨立地選自上述溫度之範圍)；(v)自細胞培養上清液純化彈性蛋白酶原蛋白質(例如，使用Macro-Prep High S樹脂)且在環境溫度(例如，22℃至26℃)下培育包含經純化彈性蛋白酶原蛋白質之溶液至少一天(例如，一天、兩天、三天、四天、五天或六天、上限及下限獨立地選自上述值之天數範圍)之時期(此受溶液中的檸檬酸鹽/乙酸鹽之存在、濃度、溫度及pH值的影響且可易於由熟習此項技術者確定)。
(c)視情況，純化成熟人類I型彈性蛋白酶，例如用於精煉層析之離子交換層析步驟；及(d)凍乾成熟I型彈性蛋白酶，從而分離經凍乾之成熟人類I型彈性蛋白酶。成熟I型彈性蛋白酶較佳為人類I型彈性蛋白酶。在某些態樣中，經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶較佳高於95%純；在特定實施例 中，經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶高於98%或高於99%純。
本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質可調配成醫藥組合物。因此，在例示性實施例中，本發明提供一種產生包含成熟人類I型彈性蛋白酶之醫藥組合物之方法，該方法包含：(i)根據上述方法分離經凍乾之成熟人類I型彈性蛋白酶；及(ii)在醫藥學上可接受之載劑中將經凍乾之成熟人類I型彈性蛋白酶復水。如藉由量測藉由添加彈性蛋白酶而催化之小肽受質N-琥珀醯基-Ala-Ala-Ala-對硝基苯胺(SLAP)之水解的速率所測定，本發明之成熟人類I型彈性蛋白酶較佳具有每毫克蛋白質大於1、大於5、大於10、大於20、大於25或大於30U之比活性。一個活性單位定義為在30℃下每分鐘催化1微莫耳受質水解的彈性蛋白酶之量且比活性定義為每毫克彈性蛋白酶蛋白質之活性(U/mg)。本發明之成熟人類I型彈性蛋白酶較佳具有在下限為每毫克蛋白質1、2、3、4、5、7、10、15或20U且上限獨立地為每毫克蛋白質5、10、15、20、25、30、35、40或50U之範圍內的比活性。在例示性實施例中，比活性在每毫克蛋白質1-40U、每毫克蛋白質1-5U、每毫克蛋白質2-10U、每毫克蛋白質4-15U、每毫克蛋白質5-30U、每毫克蛋白質10-20U、每毫克蛋白質20-40U或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍(例如，1-10U/mg、5-40U/mg等)的範圍內。
本發明之醫藥組合物較佳為穩定的。在特定實施例中，醫藥組合物(例如，藉由如上所述凍乾及復水所製備之醫藥組合物)在4℃下儲存一週後保持其比活性之至少50%、更佳至少60%及最佳至少70%。在特定實施例中，醫藥組合物在復水及在4℃下儲存一週後保持其比活性之至少75%、至少80%、至少85%或至少95%。
本發明亦提供包含含有彈性蛋白酶裂解域序列之I型彈性蛋白酶蛋白原胺基酸序列的蛋白質。可用於本發明之其他裂解域為由一致裂解域序列(SEQ ID NO：74)Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8描 述之任何序列，其中Xaa1=P5，Xaa2=P4，Xaa3=P3，Xaa4=P2，Xaa5=P1，Xaa6=P'1，Xaa7=P'2，且Xaa8=P'3，其中：- Xaa1為麩胺酸、組胺酸、脯胺酸、甘胺酸、天冬醯胺、離胺酸或丙胺酸或視情況其類似物；- Xaa2為蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸或組胺酸或視情況其類似物；- Xaa3為丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、天冬醯胺或纈胺酸或視情況其類似物，但較佳不為甘胺酸或脯胺酸；- Xaa4為脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甘胺酸、纈胺酸或蘇胺酸或視情況其類似物；- Xaa5為丙胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸或絲胺酸但不為甘胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、精胺酸、麩胺酸或離胺酸，或視情況其類似物；- Xaa6為丙胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸或絲胺酸或視情況其類似物；- Xaa7為甘胺酸、丙胺酸或纈胺酸或視情況其類似物；且- Xaa8為纈胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸或視情況其類似物。
本發明亦提供一種分離成熟人類I型彈性蛋白酶之方法，其包含：(a)在培養條件下培養包含編碼包含以下各物之蛋白原的核苷酸序列之宿主細胞：(i)活化序列，其包含可操作性連接於(ii)在該等培養條件下具有彈性蛋白酶活性之蛋白質之胺基酸序列的胰蛋白酶識別序列，其中該等培養條件包含在2至6之pH值下生長或誘導一段時期；(b)回收所表現之蛋白原；(c)使經回收之蛋白質與催化量之胰蛋白酶在胰蛋白酶具活性之pH值條件下接觸；及(d)分離成熟人類I型彈性蛋白酶。在此方法中，成熟人類I型彈性蛋白酶可基本上由SEQ ID NO：1、4、5、84或87組成。在某些實施例中，該等條件可包含(a)在 4至6之pH值下生長或誘導一段時期；(b)在22℃至28℃下生長或誘導一段時期；或(c)在該等宿主細胞之培養基中檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉濃度為約50mM至約200mM或檸檬酸鈉濃度為90mM至約110mM。
應注意除非上下文另外清楚規定，否則如專利申請案中所常見，不定冠詞"一"及定冠詞"該"用於本申請案中意謂一或多個。此外，如專利申請案中所常見，術語"或"用於本申請案中意謂轉折性"或"或連接性"或"。
在本說明書中提及之所有公開案以引用的方式併入本文中。對已包括在本說明書內之文獻、法令、材料、設備、物品或其類似物的任何討論僅出於為本發明提供上下文之目的。不認為因為在本申請案之優先日期之前任何時間存在而許可任何或所有此等物質形成先前技術基礎之部分或為與本發明有關之領域中之常識。
本發明之特徵及優點將因以下對其實施例之詳細描述而進一步明顯。
1‧‧‧信號序列
2‧‧‧可選肽原/間隔子序列
2-2‧‧‧線
3‧‧‧彈性蛋白酶肽原
3-3‧‧‧線
3'-3'‧‧‧線
4‧‧‧活性肽
4'-4'‧‧‧線
5‧‧‧識別序列
6‧‧‧裂解域
7‧‧‧裂解位點
8‧‧‧前彈性蛋白酶原蛋白質
9‧‧‧彈性蛋白酶原蛋白質(缺乏信號序列)
10‧‧‧成熟彈性蛋白酶蛋白質(圖2)
10‧‧‧流體傳遞導管/導管(圖22、23)
12‧‧‧細長齒條/齒條
14‧‧‧細長齒條/齒條
15‧‧‧中心縱軸
16‧‧‧組織穿透器
18‧‧‧組織穿透器
20‧‧‧中心導管組件
22‧‧‧外部導管組份/外部防護導管
24‧‧‧內表面
26‧‧‧內表面
28‧‧‧面向外之表面
30‧‧‧面向外之表面
32‧‧‧流體傳遞管道
34‧‧‧流體傳遞管道
36‧‧‧拉鏈導軌/導軌
38‧‧‧拉鏈導軌/導軌
40‧‧‧導管引導尖端/引導尖端/尖端
42‧‧‧引導尖端出口/導線出口
44‧‧‧流體傳遞內腔
46‧‧‧流體傳遞內腔
48‧‧‧導線孔
50‧‧‧魯爾輪彀
52‧‧‧魯爾輪彀
54‧‧‧機械連接/連接
56‧‧‧拉鏈軌道
58‧‧‧導線
61‧‧‧共同儲集器
110‧‧‧流體傳遞導管
112‧‧‧中心導管組件
113‧‧‧縱軸/中心縱軸
114‧‧‧組織穿透器呈遞管
116‧‧‧組織穿透器呈遞管
118‧‧‧可撓性伸長組織穿透器/組織穿透器
120‧‧‧可撓性伸長組織穿透器/組織穿透器
122‧‧‧外部調度管/調度管
124‧‧‧近側/近側末端/中心導管近側末端
126‧‧‧遠側/遠側末端/引導尖端
128‧‧‧導線孔/孔
130‧‧‧可撓性伸長導線/導線/線
132‧‧‧中間導軌
138‧‧‧中心導管組件基底部分/基底部分
140‧‧‧組織穿透器內腔
142‧‧‧組織穿透器內腔
144‧‧‧埠/側埠
146‧‧‧埠/側埠
148‧‧‧組織穿透器管遠側末端/組織穿透器管遠側尖端/遠側末端/尖端
150‧‧‧組織穿透器管遠側末端/組織穿透器管遠側尖端/遠側末端/尖端
152‧‧‧內部孔/組織穿透器孔/孔
154‧‧‧內部孔/組織穿透器孔/孔
156‧‧‧尖端
158‧‧‧尖端
162‧‧‧人工操作移動至線性移動控制器/控制器
164‧‧‧人工操作移動至線性移動控制器/控制器
166‧‧‧輪彀
168‧‧‧輪彀
172‧‧‧管遠側末端/遠側末端
174‧‧‧近側末端
176‧‧‧機械連接
L‧‧‧左側
R‧‧‧右側
圖1A-1B：圖1A展示合成(亦即，重組)人類ELA-1.2A序列。重組人類彈性蛋白酶-1(亦即，人類I型胰腺彈性蛋白酶)序列含有750鹼基對編碼區。所選限制酶位點經加下劃線。鹼基取代經加雙下劃線、粗體字且含其之密碼子經加雙下劃線。終止密碼子經畫上陰影(而非下劃線)。肽原序列為斜體字。編碼區產生具有250個胺基酸之蛋白質。在10個胺基酸之肽原裂解後，所得成熟酶為240個胺基酸。圖1B展示pPROT24轉譯融合區。描繪載體與ELA-1編碼區之間的轉譯融合。為併入Kex2及STE13信號裂解域而提供對ELA-1序列之PCR擴增，以產生具有活化序列(斜體字)之第一胺基酸(粗體字)之預期N末端的分泌產物。
圖2：本發明之彈性蛋白酶蛋白質之(重疊)核心組件的N末端至C末端示意圖，其中該等經編號之組件描繪：(1)信號序列(縱條紋)；(2)可選肽原/間隔子序列(磚形)；(3)彈性蛋白酶肽原(組合之對角條紋、灰色填充及菱形圖案)；(4)活化肽(組合之灰色填充及菱形圖案)；(5)識別序列(菱形圖案)；(6)裂解域(灰色填充、菱形圖案及橫條紋之左側部分)；(7)裂解位點(灰色填充、菱形圖案及橫條紋之左側部分)；(8)前彈性蛋白酶原蛋白質(整個圖解)；(9)彈性蛋白酶原蛋白質(組合之對角條紋、灰色填充、菱形圖案及橫條紋)；及(10)成熟彈性蛋白酶蛋白質(橫條紋)。表展示由箭頭涵蓋之示意圖中之區域的胺基酸名稱。未按比例繪製。命名僅出於參考之目的，且不欲暗示特定功能、活性或機制。
圖3：pPROT24-V載體之圖示。"α-因子分泌"係指含有酵母α-因子信號肽及肽原、接著Kex2位點及STE13重複序列之序列盒。
圖4：對來自含有經胰蛋白酶活化之原PRT-201的201-24-266-VU培養物之捕獲層析之溶離份進行SDS-PAGE分析。泳道編號對應於溶離份編號。溶離份6-18主要由糖基化酶原(上帶)及非糖基化酶原(下帶)組成。溶離份19-35主要由非糖基化酶原組成。M=分子量標誌。FT=管柱流通。
圖5：自體活化蛋白原資料表。肽原序列列於第一行中。在誘導1、2及3天(分別為泳道1、2及3)後上清液之SDS-PAGE展示於第二行中。基於SDS-PAGE之相對蛋白原產量列於第三行中。基於SDS-PAGE經3天誘導之蛋白原的相對穩定性列於第四行中。具有42及48肽原序列之蛋白原列為具有低穩定性一類，此係因為在誘導期間存在成熟蛋白質(對於42變異體而言在1、2及3天後觀測到及對於48變異體而言在2及3天後觀測到)。如按時間測定，達到最大SLAP反應速度之蛋白原之相對轉化速率列於第5行中。包含成熟彈性蛋白酶蛋白質之N 末端變異體的經轉化蛋白質之估算百分比列於第6行中。
圖6：pPROT55M3-V選殖圖。藉由將兩個額外表現序列盒活體外連接至4.3kb pPROT55-V載體主鏈，產生總共三個串聯表現序列盒，將pPROT55M3-V工程化。使用BglII及BamHI限制消化將2.3kb表現序列盒片段自pPROT55-V釋放，且純化，接著將表現序列盒之兩個複本連接至經BamHI線性化之pPROT55-V。
圖7：純系201-55M3-006-VU之震盪瓶優化。製備標準誘導培養基BKME且補充有檸檬酸鈉以達到0、12.5、25及50mM檸檬酸鈉(pH 5.5)之最終濃度。使用1g濕細胞重量與10mL誘導培養基之比率，使用培養基來使生長期細胞小球再懸浮。將各25mL之細胞懸浮液置放於250mL無擋板燒瓶中，且在22℃或25℃下在以275rpm震盪下培育3天。每天添加甲醇兩次至0.5體積%之最終濃度。在3天時期期間取上清液等分試樣且藉由SDS-PAGE及考馬斯染色(Coomassie staining)分析其蛋白質表現。A圖展示在22℃下誘導之樣品且B圖展示在25℃下誘導之樣品。在兩幅圖中，泳道1-3為分別在誘導1、2及3天後含有0%檸檬酸鈉之上清液；泳道4-6類似，其中例外為12.5%檸檬酸鈉；泳道7-9類似，其中例外為25%檸檬酸鈉；且泳道10-12類似，其中例外為50mM檸檬酸鈉。
圖8：對201-55-001-VU及201-55M3-003-VU醱酵上清液之SDS-PAGE分析。泳道1、2：201-55-001-VU上清液；泳道3、4：201-55M3-003-VU上清液；泳道5：空；泳道6：分子量標誌。
圖9：對來自pPROT55M3-V蛋白原捕獲層析之溶離份的SDS-PAGE分析。將來自各溶離份之總共30微升與10微升補充有β-巰基乙醇之4X Laemmli加樣緩衝液混合。將蛋白質在8-16%線性梯度凝膠上電泳，接著進行考馬斯染色。觀測到PRT-201之兩種主要形式：蛋白原(溶離份15-43)及自發轉化之成熟PRT-201(溶離份15-44)。泳道編號 對應於溶離份編號。M為分子量標誌。BC為前管柱(預加樣)樣品。
圖10：對經純化蛋白原轉化的HIC-HPLC分析。使經純化之原PRT-201-55M3-003-VU在26℃下經受轉化。該圖展示在轉化期間產生之成熟(全長)PRT-201及N末端變異體的相對量。
圖11：對藉由切向流動過濾實現之醱酵上清液中蛋白原轉化之HIC-HPLC分析。使經淨化之201-55M3-003-VU醱酵上清液經受使用100mM Tris(pH 8.0)之切向流動過濾，其使用環境溫度下以再生纖維素膜進行之恆定體積透濾。該圖展示在轉化期間存在於各個時間點之蛋白原、成熟(全長)PRT-201及N末端變異體的相對量。
圖12：對來自pPROT55M3-V轉化捕獲層析之溶離份的SDS-PAGE分析。將來自各溶離份之總共30微升與10微升補充有β-巰基乙醇之4X Laemmli加樣緩衝液混合。將蛋白質以8-16%線性梯度凝膠電泳，接著進行考馬斯染色。觀測到PRT-201之兩種主要形式：糖基化成熟形式(溶離份35-70)及非糖基化成熟形式(溶離份75-160)。泳道編號對應於溶離份編號。M為分子量標誌。BC為前管柱(預加樣)樣品。
圖13：原轉化之濃度依賴性。使來自201-55M3-003-VU純系(原PRT-201-55M3-003-VU)之經純化之原PRT-201在0.2、1.0、1.6及1.8mg/mL之濃度下經受轉化。藉由HIC-HPLC即時監測轉化反應直至蛋白原為總蛋白質之1%。該圖展示在轉化期間產生之成熟(全長)PRT-201(淡陰影條形)及N末端變異體(深陰影條形)之相對量。
圖14：合成(亦即，重組)豬胰腺彈性蛋白酶1型之DNA序列。重組序列含有750鹼基對之編碼區。將呈加下劃線形式之Sacll及Xbal限制位點併入以便於選殖。突出終止密碼子。肽原序列呈粗體鉛字。
圖15：合成(亦即，重組)豬I型胰腺彈性蛋白酶之胺基酸序列。肽原區域呈粗體鉛字，同時突出胰蛋白酶裂解位點。在10個胺基酸之肽原裂解後，所得成熟酶為240個胺基酸。
圖16：豬I型胰腺彈性蛋白酶選殖至PV-1載體中之流程。在合成豬I型胰腺彈性蛋白酶蛋白原編碼區之後，將其選殖於Blue Heron pUC載體中。除擴增豬I型胰腺彈性蛋白酶之編碼序列外，亦使用PCR來併入XhoI及SacII限制位點以供選殖至PV-1載體中。將PCR產物消化，經凝膠純化且與經XhoI及SacII消化之PV-1載體連接，因此產生編碼經胰蛋白酶活化之I型胰腺彈性蛋白酶蛋白原之pPROT101-24-V表現載體。
圖17：藉由SDS-PAGE對甲醇誘導期間經自體活化pPROT101-42-V及經胰蛋白酶活化pPROT101-42-V純系進行表現分析。將誘導1天後之震盪瓶上清液以8-16%梯度凝膠分析，接著用考馬斯染色進行染色。泳道1-10含有來自10個經pPROT101-42-V轉型之不同純系的上清液。泳道11-12含有來自兩個經pPROT101-24-V轉型之不同純系的上清液。M為分子量標誌。
圖18：藉由SDS-PAGE對甲醇誘導期間經自體活化pPROT101-49-V及pPROT101-55L-V純系進行表現分析。將誘導1及2天後之震盪瓶上清液以8-16%梯度凝膠分析，接著進行考馬斯染色。泳道1-2含有來自分別誘導1及2天後之pPROT101-49-V純系的上清液。泳道3-4含有來自分別誘導1及2天後之pPROT101-55L-V純系的上清液。M為分子量標誌。
圖19：如藉由SLAP彈性蛋白酶活性所測定，藉由小規模轉化檢定進行之pPROT101-49-V及pPROT101-55L-V蛋白質之時程活化。誤差線表示平均值±SD(n=4)。
圖20：在小規模轉化檢定之前及之後對pPROT101-49-V及pPROT101-55L-V上清液之SDS-PAGE分析。在電泳之前，將樣品與檸檬酸、還原劑TCEP及LDS樣品緩衝液(Invitrogen,CA)混合。將樣品在70℃下加熱10分鐘。泳道1-2：分別為pPROT101-49-V轉化前及轉化 後檢定上清液；泳道3-4：分別為pPROT101-55L-V轉化前及轉化後檢定上清液。M為分子量標誌。
圖21：TrypZean標準曲線。
圖22：部分5.9中所描述之醫藥設備之一實施例的側面部分剖面圖。
圖23：類似於圖22之圖，其說明醫藥設備之致動器的運動。
圖24：在圖22中線2-2之平面中的末端剖面圖。
圖25：在圖22中線3-3之平面中的末端剖面圖。
圖26：圖22之醫藥設備之流動路徑的圖，經由流體傳遞管道自魯爾輪轂(Luer hub)延伸至儲集器且接著至組織穿透器。
圖27：本發明之醫藥設備之第二實施例的側面部分剖面圖，展示呈約束組態之致動器。
圖28：類似於圖27之圖，但展示呈無約束組態之致動器。
圖29：沿圖27之線3'-3'的總成之末端透視圖。
圖30：沿圖29之線4'-4'的總成之末端透視圖，其展示組織穿透器。
圖31：展示圖27及28中右側所展示之設備近側末端之詳情的側視圖。
圖32：位於約束位置之圖22之醫藥設備之外部的局部圖。
本發明係針對用於重組表現及產生成熟生物學活性彈性蛋白酶蛋白質之方法。本發明提供藉由培養包含編碼彈性蛋白酶原蛋白質及前彈性蛋白酶原蛋白質之核酸的宿主細胞，包括較佳宿主細胞甲醇酵母製備重組彈性蛋白酶蛋白質之新穎有效方法。亦提供重組蛋白質製備用於治療及預防生物管道疾病(包括動脈或靜脈)之醫藥組合物的用途。
在某些態樣中，本發明係針對重組自體活化彈性蛋白酶原蛋白質及相關核酸、宿主細胞及製備方法。該等自體活化彈性蛋白酶原蛋白質經工程化以含有緊靠成熟彈性蛋白酶蛋白質之第一殘基之N末端的彈性蛋白酶識別位點。在指定培養條件(諸如下文部分6中所述之彼等條件)下，可能需要減少自體活化，直至活化。亦可能減少自體活化，直至自細胞培養物移除彈性蛋白酶原。
本發明提供用於產生醫藥級彈性蛋白酶蛋白質之有效表現及純化方法。本發明亦提供使用本發明之彈性蛋白酶蛋白質來治療或預防生物管道疾病之方法。
本文部分5中之描述可應用於部分8之實施例。因此，例如，提及本發明之彈性蛋白酶蛋白質包括(但不限於)提及根據實施例1-39及68-69中任一者之彈性蛋白酶蛋白質或藉由或可藉由實施例89-224、261至276及347至373中任一者之方法獲得之彈性蛋白酶蛋白質。同樣，提及本發明之核酸尤其指根據實施例40-67中任一者之核酸；提及載體尤其指提及根據實施例70-72中任一者之載體；提及細胞尤其指根據實施例73-87中任一者之細胞；提及細胞培養上清液尤其指根據實施例88之細胞培養上清液；提及組合物(諸如，醫藥組合物、彈性蛋白酶調配物及單位劑量)包括(例如)例示於實施例277-314、346、386及415-420中之彼等組合物或藉由或可藉由實施例261-276及374-385中任一者之方法獲得之彼等組合物；且提及治療方法亦包括提及根據實施例387-414中任一者之治療方法；且提及套組包括尤其提及部分8之實施例421-425之套組。
5.1 彈性蛋白酶蛋白質
本發明係針對用於重組表現及產生成熟生物學活性彈性蛋白酶蛋白質之方法。彈性蛋白酶蛋白質一般表現為在序列中含有信號肽、活化肽及具有生物活性之成熟部分之前蛋白原。合適成熟彈性蛋白酶蛋 白質序列描述於下文部分5.1.1中。合適活化肽序列描述於下文部分5.1.2中。合適信號序列描述於下文部分5.1.3中。
因此，在某些態樣中，本發明之彈性蛋白酶蛋白質為前彈性蛋白酶原蛋白質。在分泌後自前蛋白原移除信號序列一般產生含有活化肽及成熟蛋白質之無活性蛋白原。短語"活化序列"及"活化肽"在本文中可互換使用。因此，在其他態樣中，本發明之彈性蛋白酶蛋白質為包含可操作性連接於成熟彈性蛋白酶蛋白質之活化肽之彈性蛋白酶原蛋白質。在一例示性實施例中，野生型人類I型胰腺彈性蛋白酶之活化肽或序列包含人類I型彈性蛋白酶蛋白原之前10個N末端胺基酸(SEQ ID NO：22)。在某些實施例中，活化肽為SEQ ID NO：80之肽。適用於實施本發明之活化肽或序列亦包括(但不限於)SEQ ID NO：23、72及73。適用於實施本發明之其他活化序列可自SEQ ID NO：64-69及98-103之N末端殘基1-10獲得。
自彈性蛋白酶原序列移除活化肽產生成熟彈性蛋白酶蛋白質。將活化肽自彈性蛋白酶原序列移除/與成熟彈性蛋白酶序列分離以產生成熟彈性蛋白酶蛋白質之步驟在本文中稱為活化步驟。因此，在其他態樣中，本發明之彈性蛋白酶蛋白質為成熟彈性蛋白酶蛋白質。
圍繞裂解鍵之構成活化肽之C末端(亦即，羧基末端)及成熟蛋白之N末端(亦即，胺基末端)的胺基酸殘基描繪於圖2中且亦在本文中鑑別如下。首先，位於活化肽之C末端的殘基表示為PX...P5、P4、P3、P2及P1，其中P1為活化肽之C末端殘基。位於成熟蛋白質之N末端的殘基表示為P1'、P2'、P3'...PX'，其中P1'為成熟蛋白質之N末端胺基酸殘基。藉由蛋白水解裂解之易裂鍵(在圖2稱為"裂解鍵")為活化肽之P1殘基與成熟蛋白質之P1'殘基之間的肽鍵。
涵蓋活化肽之C末端之4個胺基酸(殘基P4至P1)至成熟蛋白質之N末端之前4個胺基酸(殘基P1'至P4')的區域在本文中稱為"裂解位點"。
涵蓋活化肽之C末端之約5個胺基酸(亦即，殘基P5至P1)至成熟蛋白質之N末端之約前3個胺基酸(亦即，殘基P1'至P3')的區域在本文中稱為"裂解域"。可用於本發明之上下文中的裂解域之實例包括(但不限於)SEQ ID NO：42、43、48、49、52、53、54或55。可用於本發明之其他裂解域為藉由一致裂解域序列Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8描述之任何序列，其中Xaa1=P5，Xaa2=P4，Xaa3=P3，Xaa4=P2，Xaa5=P1，Xaa6=P1'，Xaa7=P2'，且Xaa8=P3'，其中：- Xaa1為麩胺酸、組胺酸、脯胺酸、甘胺酸、天冬醯胺、離胺酸或丙胺酸或視情況其類似物；- Xaa2為蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸或組胺酸或視情況其類似物；- Xaa3為丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、天冬醯胺或纈胺酸或視情況其類似物，但較佳不為甘胺酸或脯胺酸；- Xaa4為脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甘胺酸、纈胺酸或蘇胺酸或視情況其類似物；- Xaa5為丙胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸或絲胺酸但不為甘胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、精胺酸、麩胺酸或離胺酸，或視情況其類似物；- Xaa6為丙胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸或絲胺酸或視情況其類似物；- Xaa7為甘胺酸、丙胺酸或纈胺酸或視情況其類似物；且- Xaa8為纈胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸或視情況其類似物。
涵蓋活化肽之殘基P3、P2及P1的三個胺基酸區域在本文中稱為"彈性蛋白酶識別序列"。可用於本發明之上下文中的識別位點之實例包括(但不限於)SEQ ID NO：14-16及18-21。由本發明涵蓋之其他識別位點包括由SEQ ID NO：11、12、13或93之一致識別位點描述的任何 識別位點。SEQ ID NO：11一致彈性蛋白酶識別序列1由肽序列Xaa1 Xaa2 Xaa3表示，其中Xaa1=P3，Xaa2=P2，Xaa3=P1，其中：- Xaa1為丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、天冬醯胺或纈胺酸或視情況其類似物，但較佳不為甘胺酸或脯胺酸；- Xaa2為脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甘胺酸、纈胺酸或蘇胺酸或視情況其類似物；- Xaa3為丙胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸或絲胺酸或視情況其類似物，但較佳不為甘胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、精胺酸、麩胺酸或離胺酸；SEQ ID NO：12一致彈性蛋白酶識別序列2由序列Xaa1 Pro Xaa2序列表示，其中：- Xaa1為丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、離胺酸或纈胺酸或視情況其類似物，但較佳不為甘胺酸或脯胺酸；- Pro為脯胺酸或視情況其類似物；- Xaa2為丙胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸或絲胺酸或視情況其類似物，但較佳不為甘胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、精胺酸、麩胺酸或離胺酸；SEQ ID NO：13一致彈性蛋白酶識別序列3由肽序列Xaa1 Xaa2 Xaa3表示，其中Xaa1=P3，Xaa2=P2，Xaa3=P1，其中Xaa1為天冬醯胺或丙胺酸或視情況其類似物；其中Xaa2為脯胺酸或丙胺酸或視情況其類似物，且其中Xaa3為丙胺酸、白胺酸或纈胺酸或視情況其類似物。
SEQ ID NO：93一致彈性蛋白酶識別序列4由序列Xaa1 Pro Xaa2表示，其中：- Xaa1為丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、天冬醯胺或纈胺酸或視情況其類似物，但較佳不為甘胺酸或脯胺酸；- Pro為脯胺酸或視情況其類似物； - Xaa2為丙胺酸、白胺酸、纈胺酸、異白胺酸或絲胺酸或視情況其類似物，但較佳不為甘胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、精胺酸、麩胺酸或離胺酸。
提及作為"裂解序列"、"裂解域"、"活化序列"、"彈性蛋白酶識別序列"等之序列僅為便於提及，且不欲表示識別或加工序列之任何序列功能或機制。
本發明之蛋白質一般包含胺基酸且此外可包括一或多個(例如，至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15個)胺基酸類似物。一般而言，如本文所用之胺基酸係指天然存在之L立體異構體。胺基酸類似物係指D-立體異構體、經化學修飾之胺基酸或其他非天然胺基酸。舉例而言，非天然胺基酸包括(但不限於)氮雜環丁烷甲酸、2-胺基己二酸、3-胺基己二酸、β-丙胺酸、胺基丙酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-胺基庚二酸、第三丁基甘胺酸、2，4-二胺基異丁酸、鎖鏈素(desmosine)、2,2'-二胺基庚二酸、2,3-二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺、高脯胺酸、羥基離胺酸、別-羥基離胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸、異鎖鏈素、別-異白胺酸、N-甲基丙胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基戊基甘胺酸、N-甲基纈胺酸、萘丙胺酸、正纈胺酸、正白胺酸、鳥胺酸、戊基甘胺酸、哌可啉酸(pipecolic acid)及硫代脯胺酸。經化學修飾之胺基酸包括在側基、α-碳原子、末端胺基或末端羧基中之一或多者上經可逆或不可逆地化學阻斷及/或修飾之胺基酸。化學修飾包括添加化學部分、產生新鍵及移除化學部分。經化學修飾之胺基酸之實例包括(例如)甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸碸、S-(羧甲基)-半胱胺酸、S-(羧甲基)-半胱胺酸亞碸及S-(羧甲基)-半胱胺酸碸。在胺基酸側基上之修飾包括離胺酸ε-胺基之醯化、精胺酸、組胺酸或離胺酸之N-烷基化、麩胺酸或天冬胺酸羧基 之烷基化及麩胺醯胺或天冬醯胺之脫醯胺。末端胺基之修飾包括脫-胺基、N-低碳烷基、N-二低碳烷基及N-醯基修飾。末端羧基之修飾包括醯胺、低碳烷基醯胺、二烷基醯胺及低碳烷基酯修飾。低碳烷基為C1-C4烷基。此外，可將一或多個側基或端基以一般技藝之蛋白質化學家已知之保護基保護。胺基酸之α-碳可經單或二甲基化。
本發明之蛋白質可經修飾或衍生，諸如藉由磷酸化或糖基化修飾，或藉由與(例如)脂質或另一蛋白質(例如，以靶向或穩定)接合來衍生，或其類似物。
本發明通常係關於"經分離"或"經純化"彈性蛋白酶蛋白質。經分離之彈性蛋白酶蛋白質為自其細胞環境移除之蛋白質。經純化之彈性蛋白酶蛋白質實質上不含來自彈性蛋白酶蛋白質所來源之細胞或組織來源的細胞物質或其他污染蛋白質，或當化學合成時實質上不含化學前驅體或其他化學物質。措辭"實質上不含細胞物質"包括蛋白質與其所重組產生之細胞的細胞組份分離之彈性蛋白酶蛋白質製劑。因此，實質上不含細胞物質之彈性蛋白酶蛋白質包括具有少於約30%、20%、10%或5%(以乾重計)異源蛋白質(本文中亦稱為"污染蛋白質")之彈性蛋白酶蛋白質製劑。當彈性蛋白酶蛋白質係藉由使其分泌至培養基中的方法產生時，其亦較佳實質上不含培養基，亦即培養基代表彈性蛋白酶蛋白質製劑之少於約20%、10%或5%之量。
另外，在某些實施例中，經分離或經純化之彈性蛋白酶不含或實質上不含細胞DNA。在特定實施例中，在經分離或經純化彈性蛋白酶蛋白質之製劑中，或在包含經分離或經純化彈性蛋白酶蛋白質之組合物中，宿主細胞基因組DNA以每毫克彈性蛋白酶蛋白質少於10皮克、少於5皮克、少於3皮克、少於2皮克或少於1皮克DNA之量存在。在一實施例中，宿主細胞DNA為甲醇酵母DNA。
適用彈性蛋白酶蛋白質序列提供於表1中。在一特定實施例中， 本發明提供一種彈性蛋白酶原蛋白質(包括(但不限於)SEQ ID NO：6-9、64-69、88-91及98-103中任一者之蛋白質)，其包含(i)活化序列，該活化序列包含可操作性連接於(ii)具有I型彈性蛋白酶活性之蛋白質之胺基酸序列的彈性蛋白酶識別序列。已知人類I型彈性蛋白酶之若干多態現象。多態現象之任何組合涵蓋於本發明之彈性蛋白酶原蛋白質序列中，包括(但不限於)表2中所闡述之多態現象的組合。蛋白質視情況進一步包含可操作性連接於該活化序列之信號序列。在某些特定實施例中，信號序列在甲醇酵母中可操作，諸如酵母α-因子信號肽，其由SEQ ID NO：34之胺基酸序列例示。含有信號肽之替代序列例示於SEQ ID NO：50及96(含有信號肽、非彈性蛋白酶肽原及間隔子序列)及SEQ ID NO：51及97(含有信號肽及非彈性蛋白酶肽原)中。在其他特定實施例中，信號序列為哺乳動物分泌信號序列，諸如豬彈性蛋白酶信號序列。彈性蛋白酶識別序列較佳為I型彈性蛋白酶識別序列，最佳為人類I型彈性蛋白酶識別序列。
本發明進一步包含本發明之彈性蛋白酶蛋白質之變異體。變異體可含有一或多個預測非必需胺基酸殘基之胺基酸取代。變異體較佳相對於天然存在之成熟彈性蛋白酶包括不超過15個、不超過12個、不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個、不超過5個、不超過4個、不超過3個、不超過2個或不超過1個保守胺基酸取代及/或相對於天然存在之成熟彈性蛋白酶包括不超過5個、不超過4個、不超過3個或不超過2個非保守胺基酸取代或不超過1個非保守胺基酸取代。
在一特定實施例中，變異體相對於本發明之成熟彈性蛋白酶、彈性蛋白酶原或前彈性蛋白酶原，諸如相對於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：84之成熟彈性蛋白酶或SEQ ID NO：6-9、64-69、88-91及98-103之彈性蛋白酶原蛋白質，具有不超過10個或更佳不超過5個保守胺基酸 取代。SEQ ID NO：1及84之胺基酸序列含有一或多個對應於成熟彈性蛋白酶序列中位置44(W或R)、59(M或V)、220(V或L)及243(Q或R)上潛在多態現象之位置(位置係指前蛋白原)。因此，本發明包含具有在SEQ ID NO：84中鑑別出之4種多態現象之任何組合的成熟彈性蛋白酶蛋白質。該等組合各自概述於上表3中。SEQ ID NO：88-91及98-103之序列進一步含有肽原序列位置10(Q或H)上之潛在多態現象。因此，本發明包含含有在SEQ ID NOS：88-91及98-103中鑑別出之5種多態現象任何組合的前彈性蛋白酶原及彈性蛋白酶原序列。該等組合各自概述於上表2中。
"保守胺基酸取代"為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的胺基酸取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技術中予以定義。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電之極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸)。
本發明之變異型彈性蛋白酶蛋白質可包括如本文所述之胺基酸類似物以及胺基酸之胺基酸取代。
在特定實施例中，本發明之蛋白質包含成熟人類I型彈性蛋白酶之變異體或基本上由成熟人類I型彈性蛋白酶之變異體組成，例如與列於表1中之彈性蛋白酶蛋白原或成熟彈性蛋白酶蛋白質(諸如(但不限於)SEQ ID NO：6-9、64-69、88-91及98-103之彈性蛋白酶蛋白原)至少約75%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致的變異體，且當經表現以產生SEQ ID NO：1、4、5、84或87之成熟彈性 蛋白酶蛋白質時保留彈性蛋白酶活性。
為測定兩個胺基酸序列或兩個核酸之一致性百分比，出於最佳比較之目的將該等序列對準(例如，可將間隙引入第一胺基酸或核酸序列之序列中以與第二胺基酸或核酸序列最佳對準)。接著比較在相應胺基酸位置或核苷酸位置上之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則該等分子在該位置上一致。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列所共有之相同位置之數目的函數(%一致性=(相同位置數目/重疊位置總數目)×100)。在一實施例中，兩個序列長度相同。在其他實施例中，兩個序列長度相差不超過該兩個序列中較長者長度之1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。
兩個序列之間的一致性百分比之測定可使用數學演算法來實現。用於比較兩個序列之數學演算法之一較佳非限制實例為Karlin及Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268之演算法，如Karlin及Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中所修改。此類演算法已併入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410之NBLAST及XBLAST程式中。可使用NBLAST程式、評分=100、字長=12進行BLAST核苷酸搜索以獲得與本發明之核酸分子同源之核苷酸序列。可使用XBLAST程式、評分=50、字長=3進行BLAST蛋白質搜索以獲得與本發明之蛋白質分子同源之胺基酸序列。為獲得間隙對準以供比較之目的，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述利用間隙BLAST。或者，可使用PSI-Blast來進行偵測分子之間的遠緣關係之迭代搜索(同前)。當利用BLAST、間隙BLAST及PSI-Blast程式時，可使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之預設參數。參見http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用於比較序列之數學演算法之另一較佳非限制實例為Myers及 Miller,CABIOS(1989)之演算法。此類演算法已併入作為CGC序列比對套裝軟體之部分的ALIGN程式(2.0版)中。當利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120加權殘基表、12之間隙長度罰分及4之間隙罰分。用於序列分析之其他演算法在此項技術中已知且包括如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10：3-5中所述之ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-8中所述之FASTA。在FASTA中，ktup為設置搜索靈敏性及速度之控制選項。若ktup=2，則藉由審視對準殘基對發現所比較之兩個序列中之類似區域；若ktup=1，則檢查單個對準胺基酸。對於蛋白質序列而言，ktup可設為2或1，或對於DNA序列而言，可設為1至6。若ktup未指定，則對於蛋白質而言，預設值為2，且對於DNA而言，預設值為6。關於FASTA參數之進一步描述，參見http：//bioweb.pasteur.fr/docs/man/man/ fasta.1.html#sect2，其內容以引用的方式併入本文中。
在允許間隙或不允許間隙之情況下，兩個序列之間的一致性百分比可使用類似於上述彼等技術之技術來測定。在計算一致性百分比時，通常計算精確匹配。
本發明之彈性蛋白酶蛋白質可展現轉譯後修飾，包括(但不限於)糖基化(例如，N-連接型或O-連接型糖基化)、十四烷基化、棕櫚醯化、乙醯化及磷酸化(例如，絲胺酸/蘇胺酸或酪胺酸)。在一實施例中，本發明之彈性蛋白酶蛋白質相對於內源表現之彈性蛋白酶蛋白質展現降低的O連接型糖基化及/或N連接型糖基化。在另一實施例中，本發明之彈性蛋白酶蛋白質未展現O連接型糖基化及/或N連接型糖基化。
5.1.1.成熟彈性蛋白酶序列
本發明之成熟彈性蛋白酶序列較佳為哺乳動物彈性蛋白酶序列， 最佳為人類彈性蛋白酶序列。在其他實施例中，成熟哺乳動物彈性蛋白酶序列係來自其他哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、豬、母牛或馬。
在本發明之方法及組合物中，所採用之成熟彈性蛋白酶序列較佳為I型胰腺彈性蛋白酶之成熟彈性蛋白酶序列，該I型胰腺彈性蛋白酶優先裂解疏水性蛋白質序列，優先裂解小疏水性殘基(諸如，丙胺酸)之羧基側上的疏水性蛋白質序列。I型胰腺彈性蛋白酶之實例包括在皮膚中表現之人類彈性蛋白酶I酶(NCBI寄存編號NP_001962)及在胰腺中表現之豬胰腺彈性蛋白酶I酶(NCBI寄存編號CAA27670)。SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：84為成熟人類I型彈性蛋白酶序列之實例。
或者，可使用可優先裂解中等至大的疏水性胺基酸殘基之羧基側上之疏水性蛋白質序列的II型彈性蛋白酶。II型彈性蛋白酶之實例包括均在胰腺中表現之人類彈性蛋白酶IIA酶(NCBI寄存編號NP254275)及豬彈性蛋白酶II酶(NCBI寄存編號A26823)。
亦包含本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質之變異體。變異體包括包含與本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質之胺基酸序列足夠一致或來源於本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質之胺基酸序列的胺基酸序列之蛋白質且展現彈性蛋白酶生物活性。本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質之生物學活性部分可為(例如)長度為至少150、160、175、180、185、190、200、210、220、230、231、232、233、234、235、236、237、238或239個胺基酸之蛋白質。此外，蛋白質之其他區域經缺失之其他生物學活性部分可藉由重組技術製備且對其評估本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質之天然形式的一或多種功能活性。
此外，包含4種人類I型彈性蛋白酶多態現象之任何組合之成熟彈性蛋白酶蛋白質由SEQ ID NO：84代表。可能組合闡述於上表3中。
5.1.2.彈性蛋白酶原活化序列
彈性蛋白酶活化序列為自彈性蛋白酶原蛋白質移除產生生物學活 性成熟彈性蛋白酶蛋白質之任何序列。
活化序列一般含有與蛋白原裂解以產生成熟生物學活性蛋白質之位置鄰近之蛋白酶識別位點。活化序列可經工程化以添加蛋白酶或彈性蛋白酶識別位點，或其可經工程化以用另一蛋白酶識別位點置換現有蛋白酶識別位點。適用於實施本發明之活化肽或序列包括(但不限於)SEQ ID NO：23、72及73。適用於實施本發明之其他活化序列可獲自SEQ ID NO：64-68之N末端殘基1-10。在較佳態樣中，彈性蛋白酶原活化序列經工程化以含有I型或II型彈性蛋白酶之識別序列。彈性蛋白酶識別序列最佳由與其可操作地連接之成熟彈性蛋白酶識別。因此，在針對II型彈性蛋白酶之實施例中，識別序列最佳為II型彈性蛋白酶識別序列。反之，在針對I型彈性蛋白酶之實施例中，識別序列最佳為I型彈性蛋白酶識別序列。在一較佳實施例中，識別序列為人類I型彈性蛋白酶識別序列。例示性I型識別序列包括SEQ ID NO：14-16及18-21之胺基酸序列。本發明涵蓋之其他識別位點包括藉由SEQ ID NO：11、12或13之一致識別位點描述的任何識別位點。
5.1.3.信號序列
本發明之彈性蛋白酶原蛋白質可進一步含有信號序列，該信號序列增加彈性蛋白酶原蛋白質分泌至表現其之宿主細胞之培養基中。
可使用彈性蛋白酶蛋白質之天然信號序列，尤其對於在哺乳動物宿主細胞中表現而言。在其他實施例中，本發明之彈性蛋白酶蛋白質之天然信號序列可經移除且經來自另一蛋白質之信號序列(諸如，豬I型彈性蛋白酶信號序列、人類I型彈性蛋白酶信號序列或酵母α-因子信號序列)置換。在某些特定實施例中，酵母α-因子信號肽可進一步包含(1)酵母α-因子肽原或(2)酵母α-因子肽原及間隔子序列，各自分別由SEQ ID NO：50及96或SEQ ID NO：51及97之胺基酸序列例示。或者，桿狀病毒包膜蛋白之gp67分泌序列可用作異源信號序列(Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編，John Wiley & Sons,1992))。真核異源信號序列之其他實例包括蜂毒素(melittin)及人類胎盤鹼性磷酸酶之分泌序列(Stratagene；La Jolla,California)。在另一實例中，適用原核異源信號序列包括phoA分泌信號(Sambrook等人，上文)及蛋白質A分泌信號(Pharmacia Biotech；Piscataway,New Jersey)。
5.2彈性蛋白酶核酸
本發明之一態樣係關於編碼本發明之重組彈性蛋白酶蛋白質之重組核酸分子。如本文所用之術語"核酸分子"意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)及RNA分子(例如，mRNA)及使用核苷酸類似物所產生之DNA或RNA之類似物。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但較佳為雙鏈DNA。
本發明係針對編碼本發明之彈性蛋白酶蛋白質之核酸。因此，在某些實施例中，本發明提供包含編碼彈性蛋白酶原蛋白質(包括(但不限於)SEQ ID NO：6-9、64-69、88-91或98-103中任一者之蛋白質)之核苷酸序列之核酸分子，該彈性蛋白酶原蛋白質包含(i)活化序列，該活化序列包含可操作性連接於(ii)具有I型彈性蛋白酶活性之蛋白質之胺基酸序列的彈性蛋白酶識別序列。在其他實施例中，本發明亦提供包含編碼一種蛋白質之核苷酸序列之核酸分子，該蛋白質包含(i)在甲醇酵母中可操作之信號序列，其可操作性連接於(ii)活化序列(包括(但不限於)SEQ ID NO：23、72或73之胺基酸序列)，該活化序列包含又可操作性連接於(iii)成熟人類I型彈性蛋白酶之胺基酸序列之蛋白酶識別序列。
本發明之核酸可經純化。當藉由重組技術產生時"經純化"核酸分子(諸如，cDNA分子)可實質上不含其他細胞物質或培養基，或當化學合成時實質上不含化學物質前驅體或其他化學物質。
在核酸分子為cDNA或RNA(例如，mRNA)分子之情況下，該等分 子可包括聚腺苷酸(poly A)"尾"或可缺乏此類3'尾。
可根據標準PCR擴增技術，使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板及合適寡核苷酸引子來擴增本發明之核酸分子。可將如此擴增之核酸選殖至合適載體中且藉由DNA序列分析加以表徵。此外，對應於本發明之核酸分子之全部或一部分的寡核苷酸可藉由標準合成技術(例如)使用自動DNA合成儀來製備。
5.3重組表現載體及宿主細胞
進一步提供包含任何本發明之核酸之載體或經工程化以表現本發明之核酸之宿主細胞。在特定實施例中，載體包含調控由本發明之核酸編碼之蛋白質表現的核苷酸序列。舉例而言，編碼本發明之蛋白質的核苷酸序列可與甲醇誘導性啟動子可操作性連接。
亦提供包含本發明之核酸及載體的宿主細胞。在某些實施例中，載體或核酸係整合至宿主細胞基因組中；在其他實施例中，載體或核酸在染色體外。一較佳宿主細胞為甲醇酵母細胞。
如本文所用之術語"載體"係指能夠輸送其所連接之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為"質體"，其係指可將其他DNA區段連接進來之環形雙鏈DNA環。另一類型載體為病毒載體，其中可將其他DNA區段連接至病毒基因組中。某些載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞後整合至宿主細胞基因組中，且由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體表現載體能夠指導與其可操作性連接之編碼序列的表現。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體通常呈質體(載體)形式。
本發明之重組表現載體包含編碼本發明之成熟彈性蛋白酶、彈性蛋白酶原或前彈性蛋白酶原的呈適於在宿主細胞中表現之形式之核苷酸序列。此意謂重組表現載體包括一或多個基於待用於表現之宿主細 胞而選擇之調控序列，其可操作性連接於待表現之核酸序列。在重組表現載體內，"可操作性連接"欲意謂所關注之核苷酸序列以允許該核苷酸序列表現(例如，在活體外轉錄/轉譯系統中或當將載體引入宿主細胞中時在宿主細胞中)之方式與調控序列連接。術語"調控序列"意欲包括啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。該等調控序列描述於(例如)Goeddel,Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,CA,1990)中。調控序列包括指導核苷酸序列在多種類型宿主細胞中組成性表現之彼等調控序列及指導核苷酸序列僅在某些宿主細胞中表現之彼等調控序列(例如，組織特異性調控序列)。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可視諸如待轉型之宿主細胞之選擇、所需彈性蛋白酶蛋白質之表現量等因素而定。可將本發明之表現載體引入宿主細胞中，由此產生由如本文所述之核酸編碼之彈性蛋白酶蛋白質。
本發明之重組表現載體可經設計以在原核細胞(例如，大腸桿菌)或真核細胞(例如，昆蟲細胞(使用桿狀病毒表現載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞)中表現本發明之彈性蛋白酶蛋白質。合適宿主細胞進一步討論於Goeddel(上文)中。或者，可(例如)使用T7啟動子調控序列及T7聚合酶，使重組表現載體在活體外轉錄及轉譯。
蛋白質在原核生物中之表現最通常使用含有指導融合或非融合蛋白質表現之組成性或誘導性啟動子之載體在大腸桿菌中進行。融合載體將大量胺基酸添加至在其中編碼之蛋白質中，通常添加至重組蛋白質之胺基末端。該等融合載體通常用於達成三個目的：1)增加重組彈性蛋白酶蛋白質之表現；2)增加重組彈性蛋白酶蛋白質之溶解性；及3)藉由充當親和力純化中之配位體，來幫助純化重組彈性蛋白酶蛋白質。通常在融合表現載體中，將蛋白水解裂解域引入融合部分與重組蛋白質之接合點以使得能夠在融合蛋白純化之後使重組蛋白質與融合 部分分離。因此，融合部分及蛋白水解裂解域可一起充當包括蛋白酶識別位點之活化序列，以重組表現彈性蛋白酶蛋白質。能夠活化該等融合蛋白及其同源識別序列之酶包括因子Xa、凝血酶及腸激酶。典型融合表現載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc.；Smith及Johnson,1988,Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)及pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，其分別將麩胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白質A與標靶重組蛋白質融合。
合適誘導性非融合大腸桿菌表現載體之實例包括pTrc(Amann等人，1988,Gene 69：301-315)及pET-11d(Studier等人，1990,Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California,185：60-89)。標靶基因自pTrc載體之表現依賴於宿主RNA聚合酶自雜交trp-lac融合啟動子之轉錄。標靶基因自pET-11d載體之表現依賴於由共表現之病毒RNA聚合酶介導的自T7 gn10-lac融合啟動子(T7 gn1)之轉錄。此病毒聚合酶藉由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)自具有在lacUV 5啟動子轉錄控制下之T7 gn1基因之固有λ原噬菌體提供。
一種最大化大腸桿菌中重組彈性蛋白酶蛋白質表現之策略為在蛋白水解裂解重組蛋白質之能力削弱的宿主細菌中表現該蛋白質(Gottesman,1990,Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California 185：119-129)。另一策略為改變待插入表現載體中之核酸的核酸序列，以使得各胺基酸之個別密碼子為在大腸桿菌中偏好使用之彼等密碼子(Wada等人，1992,Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本發明之核酸序列之該改變可藉由標準DNA合成技術進行。
在另一實施例中，表現載體為酵母表現載體。用於在酵母釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)中表現之載體的實例包括 pYepSec1(Baldari等人，1987,EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan及Herskowitz,1982,Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，1987,Gene 54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)及pPicZ(Invitrogen Corp,San Diego,CA)。對於在酵母中表現而言，較佳使用甲醇誘導性啟動子。本文中亦涵蓋改變待插入表現載體中之核酸的核酸序列，以使得各胺基酸之各別密碼子為在巴斯德畢赤酵母中偏好使用之彼等密碼子。更特定言之，SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：81之密碼子可取代在巴斯德畢赤酵母中偏好使用之密碼子。
或者，表現載體為桿狀病毒表現載體。可用於在培養昆蟲細胞(例如，Sf 9細胞)中表現蛋白質之桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人，1983,Mol.Cell Biol.3：2156-2165)及pVL系列(Lucklow及Summers,1989,Virology 170：31-39)。另一策略為改變待插入表現載體中之核酸的核酸序列，以使得各胺基酸之各別密碼子為在昆蟲細胞中偏好使用之彼等密碼子。
在另一實施例中，使用哺乳動物表現載體在哺乳動物細胞中表現彈性蛋白酶蛋白質。哺乳動物表現載體之實例包括pCDM8(Seed,1987,Nature 329(6142)：840-2)及pMT2PC(Kaufman等人，1987,EMBO J.6：187-195)。當用於哺乳動物細胞中時，表現載體之控制功能通常藉由病毒調控元件提供。例如，通常使用之啟動子來源於多形瘤、腺病毒2、細胞巨大病毒及猿猴病毒40。關於原核細胞與真核細胞之其他合適表現系統，參見Sambrook等人(上文)之第16及17章。
在另一實施例中，重組哺乳動物表現載體能夠指導核酸優先在特定細胞類型中表現(例如，使用組織特異性調控元件來表現核酸)。組織特異性調控元件在此項技術中已知。合適組織特異性啟動子的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝特異性；Pinkert等人，1987,Genes Dev.1：268-277)、淋巴特異性啟動子(Calame及Eaton,1988,Adv. Immunol.43：235-275)、尤其T細胞受體(Winoto及Baltimore,1989,EMBO J.8：729-733)及免疫球蛋白(Banerji等人，1983,Cell 33：729-740；Queen及Baltimore,1983,Cell 33：741-748)之啟動子、神經元特異性啟動子(例如，神經纖毛啟動子；Byrne及Ruddle,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)、胰腺特異性啟動子(Edlund等人，1985,Science 230：912-916)及乳腺特異性啟動子(例如，乳清啟動子；美國專利第4,873,316號及歐洲申請公開案第EP264166號)。亦包含發育調控啟動子，例如小鼠hox啟動子(Kessel及Gruss,1990,Science 249：374-379)及β-胎蛋白啟動子(Campes及Tilghman,1989,Genes Dev.3：537-546)。
在本發明之某些態樣中，本發明之蛋白質之表現可藉由增加相應基因之劑量，例如藉由使用高複本表現載體或基因擴增來增加。基因擴增可在缺乏二氫葉酸還原酶("dhfr-")之CHO細胞中藉由使所關注之基因與dhfr基因共轉染且暴露於具有逐步增加濃度之甲胺喋呤(methotrexate)的選擇培養基來實現。參見例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology Unit 16.14,(John Wiley & Sons,New York,1996)。用於增加基因複本數目之一替代性方法為在將載體引入宿主細胞之前將載體中編碼所關注之彈性蛋白酶蛋白質之表現序列盒(例如，具有編碼序列之啟動子)多聚化。已知在酵母及哺乳動物宿主細胞系統中用於實現表現序列盒多聚化之方法及載體(參見例如Monaco,Methods in Biotechnology 8：Animal Cell Biotechnology，第39-348頁(Humana press,1999)；Vassileva等人，2001,Protein Expression and Purification 21：71-80；Mansur等人，2005,Biotechnology Letter 27(5)：339-45)。此外，用於多複本基因表現之套組可購得。舉例而言，多複本畢赤酵母(pichia)表現套組可自Invitrogen(Carlsbad,California)獲得。表現序列盒之多聚化例示於下 文實例6中。
因此，本發明之其他態樣係關於已引入本發明之重組表現載體之宿主細胞。術語"宿主細胞"及"重組宿主細胞"在本文中可互換使用。應瞭解該等術語不僅指特定受檢細胞，而且亦指此類細胞之子代或潛在子代。雖然因為某些修飾由於突變或環境影響可能存在於後代中，因此該子代實際上可能與親本細胞不同，但仍包括在如本文所用之該術語之範疇內。
宿主細胞可為任何原核細胞(例如，大腸桿菌)或真核細胞(例如，昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞)。
載體DNA可經由習知轉型或轉染技術引入原核或真核細胞中。如本文所用之術語"轉型"及"轉染"欲指用於將外來核酸引入宿主細胞中之多種業內公認之技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沈澱、DEAE-葡聚糖介導之轉染、脂質轉染或電穿孔。用於轉型或轉染宿主細胞之合適方法可見於Sambrook等人(上文)及其他實驗手冊中。
為穩定轉染哺乳動物細胞，已知視所用表現載體及轉染技術而定，僅一小部分細胞可將外來DNA整合至其基因組中。為鑑別及選擇此等整合子，一般將可選擇標誌(例如，對抗生素之抗性)之編碼序列與所關注之開放閱讀框架一起引入宿主細胞中。較佳可選擇標誌包括賦予對藥物(諸如，G418、潮黴素(hygromycin)、博萊黴素(zeocin)及甲胺喋呤)之抗性的彼等標誌。經所引入之核酸穩定轉染之細胞可藉由藥物選擇來鑑別(例如，已併入可選擇標誌編碼序列之細胞將存活，而其他細胞則死亡)。
在另一實施例中，細胞、細胞株或微生物內內源性彈性蛋白酶編碼序列之表現特徵可藉由將與該彈性蛋白酶編碼序列異源之DNA調控元件插入細胞、穩定細胞株或經選殖之微生物之基因組中，以使得所插入之調控元件與內源性基因可操作性連接來修飾。
使用諸如靶向同源重組(其為熟習此項技術者所熟知且描述於(例如)Chappel之美國專利第5,272,071號；1991年5月16日公開之PCT公開案第WO 91/06667號中)之技術，可將含有調控元件之異源序列插入穩定細胞株或經選殖之微生物中，以使得其與內源性彈性蛋白酶基因可操作性連接且活化內源性彈性蛋白酶基因之表現。異源序列可進一步包括本發明之信號肽、裂解序列及/或活化序列。
5.4 製備成熟彈性蛋白酶蛋白質之方法
可使用本發明之宿主細胞(諸如，培養物中之原核或真核宿主細胞)產生本發明之彈性蛋白酶蛋白質。因此，本發明進一步提供使用本發明之宿主細胞產生本發明之彈性蛋白酶蛋白質的方法。在一實施例中，該方法包含在合適培養基中培養本發明之宿主細胞(已引入編碼本發明之彈性蛋白酶蛋白質之重組表現載體)以使彈性蛋白酶蛋白質得以產生。在另一實施例中，該方法進一步包含自培養基或宿主細胞分離彈性蛋白酶蛋白質。
本發明進一步提供用於產生本發明之未成熟彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含在產生彈性蛋白酶原蛋白質之條件下培養經工程化以表現本發明之核酸的宿主細胞。在某些實施例中，亦產生前彈性蛋白酶原蛋白質。本發明進一步提供用於產生本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含在產生彈性蛋白酶原蛋白質之條件下培養經工程化以表現本發明之核酸的宿主細胞，且使彈性蛋白酶原蛋白質經受活化條件，以使成熟彈性蛋白酶蛋白質得以產生。
尤其對於宿主細胞甲醇酵母而言，用於產生本發明之未成熟及成熟蛋白質的較佳培養條件包括在低pH值下生長一段時期。在特定實施例中，低pH值為2-6之pH值、2-5之pH值、3-6之pH值、3-5之pH值、4-6之pH值、3-4之pH值或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍。在培養期結束時，可將培養物之pH值升至較佳7-11之pH值、最 佳升至8之pH值。
在本發明之彈性蛋白酶原蛋白質之表現在甲醇誘導性啟動子控制下的情況下，用於產生本發明之未成熟或成熟彈性蛋白酶蛋白質之條件亦可包含甲醇誘導時期。
本發明之彈性蛋白酶產生方法可進一步包含回收由宿主細胞表現之蛋白質的步驟。在某些情況下，所回收之蛋白質為含有活化序列之彈性蛋白酶原。在其他情況下，所回收之蛋白質為缺乏活化序列之成熟彈性蛋白酶。在某些條件下，產生彈性蛋白酶原與成熟彈性蛋白酶蛋白質兩者。在其他情況下，產生前彈性蛋白酶原。
較佳地，尤其在希望避免自體活化彈性蛋白酶原之自體活化的情況下，用於彈性蛋白酶原表現之培養條件包含在檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉中生長一段時期。在特定實施例中，使用約5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、75-175mM、100-150mM、75-125mM或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍的濃度。在一較佳實施例中，檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉濃度為90-110mM、最佳為100mM。
此外，尤其在希望避免蛋白質降解的情況下，用於彈性蛋白酶原表現之培養條件可包含在適於所討論之宿主細胞的溫度範圍下端下生長及誘導一段時期。舉例而言，在宿主細胞為甲醇酵母宿主細胞之情況下，較佳範圍為約22-28℃。在特定實施例中，在約28℃之溫度下培養甲醇酵母宿主細胞。生長及誘導無須在相同溫度下進行；例如，在使用甲醇酵母作為宿主細胞之一實施例中，生長可在28℃下進行，而誘導可在22℃下進行。
可藉由添加少(催化)量外來彈性蛋白酶，啟始本發明之自體活化彈性蛋白酶原蛋白質之活化。或者或同時，本發明之自體活化彈性蛋白酶原蛋白質之活化可藉由升高含有自體活化彈性蛋白酶原蛋白質之 溶液的pH值來啟始。pH值較佳為7-11；在特定實施例中，溶液之pH值為7-10、7-9、8-10、8-9或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍。在一較佳實施例中，溶液之pH值為7-9，最佳為8。
在特定實施例中，在活化步驟期間，可使自體活化彈性蛋白酶原經受Tris鹼。在特定實施例中，添加Tris鹼至5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、75-175mM、100-150mM、75-125mM或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍的濃度。在一較佳實施例中，添加Tris鹼至90-110mM、最佳100mM之濃度。Tris鹼之pH值較佳為7-11；在特定實施例中，Tris鹼的pH值為7-10、7-9、8-10、8-9或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍。在一較佳實施例中，Tris鹼之pH值為7-9、最佳為8。
在本發明之某些態樣中，用於彈性蛋白酶自體活化之溫度為環境溫度，例如22℃至26℃之範圍內的溫度。在某些實施例中，彈性蛋白酶活化步驟較佳使用低初始濃度(例如，0.1-0.3mg/ml)下之彈性蛋白酶原進行，以實現裂解反應之最佳精確性且最少形成N末端變異體。
在本發明之某些實施例中，無需添加催化量之彈性蛋白酶使自體活化彈性蛋白酶原轉化為成熟彈性蛋白酶，因為彈性蛋白酶原可經歷自體蛋白水解。在某些實施例中，自體蛋白水解之速率與濃度無關。不尋求受理論限制，咸信某些自體活化彈性蛋白酶原蛋白質之與濃度無關之自體蛋白水解係經由分子內過程介導，其中彈性蛋白酶原分子經由分子內反應自身裂解。然而，在其他實施例中，自體活化彈性蛋白酶原之活化與濃度有關。不尋求受理論限制，咸信某些自體活化彈性蛋白酶原蛋白質之與濃度有關之自體蛋白水解係經由分子間反應介導，其中彈性蛋白酶原藉由另一彈性蛋白酶原及/或藉由成熟彈性蛋白酶裂解。在其他實施例中，某些自體活化彈性蛋白酶蛋白原展示與濃度有關及與濃度無關之活化的組合。在自體活化與濃度有關之彼等 情況下，蛋白原可以更稀形式維持以在必要時減少活化。包含SEQ ID NO：55之彈性蛋白酶肽原裂解域的彈性蛋白酶蛋白原(包括(但不限於)SEQ ID NO：69之蛋白原)之活化可藉由維持該等蛋白原呈稀釋形式來控制。
亦認識到成熟彈性蛋白酶之某些非所要N末端序列變異體可在產生本發明之成熟彈性蛋白酶的過程中累積。更特定言之，含有SEQ ID NO：42彈性蛋白酶肽原裂解域之彈性蛋白酶原蛋白質(包括SEQ ID NO：6之蛋白原)可產生N末端序列變異體，其中裂解已在作為位置P3或P2上任何殘基之C末端的肽鍵上發生。然而，可藉由將某些胺基酸置放於活化序列中之某些位置來減少該等非所要N末端變異體之存在。舉例而言，當脯胺酸存在於P2位置上時，具有一或兩個額外N末端胺基酸之N末端變異體的產生得以減少或消除。同樣，消除對用於活化之胰蛋白酶的需要減少或消除缺乏九個N末端殘基之變異體的產生。此外，藉由在某些條件下進行活化反應，可減少或消除非所要N末端變異體之存在。
更特定言之，在某些實施例中，活化條件包括"延長轉化"步驟，在此期間在轉化反應初始部分期間產生之N末端變異體接著經選擇性地降解。在"延長轉化"期間蛋白質物質之相對量可藉由HIC-HPLC即時監測。非所要N末端變異體之選擇性降解增加轉化反應中全長成熟PRT-201之比例且降低N末端變異體之比例。對於含有SEQ ID NO：55彈性蛋白酶肽原裂解域之彈性蛋白酶原蛋白質而言，執行延長轉化步驟4至8小時且較佳約6hr。對於其他彈性蛋白酶原蛋白質而言，視所有彈性蛋白酶原轉化後不久N末端變異體相對於成熟(全長)彈性蛋白酶之比例而定，可增加或減少延長轉化步驟。當轉化發生在複合培養基(諸如，醱酵肉湯)中時，可因溶液中之其他蛋白質及肽在成熟彈性蛋白酶之活性位點競爭而增加延長轉化時期。或者，成熟彈性蛋白酶 與N末端變異型彈性蛋白酶之混合物可在延長轉化步驟之前自複合培養基中回收，從而減少活性位點競爭及移除N末端變異型物質所需之時間。
如上所提及，在原PRT-201-55M3-003-VU之轉化反應期間，存在導致N末端變異體產生之副反應。在原PRT-201-55M3-003-VU之特定狀況下，此等N末端變異體失去前兩個纈胺酸且具有極少或不具有彈性蛋白酶活性。對於其他突變型蛋白原而言，產生其他N末端變異體，某些為添加且其他為不同缺失。已發展出N末端移除步驟，其減少N末端變異體至0-2%之範圍。此移除步驟之發展由多種實驗及觀測結果演化而來。如先前所提及，在優化使用原PRT-201-42之轉化條件實驗期間，觀測到較長轉化反應通常導致極低百分比之N末端變異體。接著確定較長轉化反應允許成熟PRT-201選擇性地降解N末端變異體。發現PRT-201在一定條件下選擇性地降解N末端變異體之能力具有巨大益處，其有助於產生具有更少N末端變異體之更純PRT-201產物。藉由建立允許原PRT-201轉化為成熟PRT-201且接著允許PRT-201降解N末端變異體的條件，將此N末端變異體移除步驟實施為大規模生產方法。
圖10中展示藉由HIC-HPLC即時監測之此類步驟的一代表性實例。在約50分鐘時，100%原PRT-201-55M3已完全轉化為約86%成熟PRT-201及14% N末端變異體。延長轉化反應，此允許成熟PRT-201選擇性地降解N末端變異體，使得變異體自14%降至2%。在較長培育之情況下，N末端變異體可經選擇性地降解至不可偵測之含量。當N末端變異體含量足夠低時，用檸檬酸鈉抑制PRT-201之活性且將反應pH值調整至5.0。
一旦獲得經純化之成熟彈性蛋白酶，則可使活性酶進入彈性蛋白酶蛋白質相對惰性之溶液中且置放於緩衝液中以進行進一步管柱層析 (例如，陽離子交換層析)純化步驟。一般而言，可將彈性蛋白酶蛋白質置放於約5至25mM之濃度及約2至5之pH值下的檸檬酸鈉中。在一特定實施例中，將彈性蛋白酶置放於pH 5之20mM檸檬酸鈉中。接著視情況藉由以下方法中之一者、一者以上或所有來分析經溶離之溶離份：(1)A280分光光度測定法以測定濃度；(2)SDS-PAGE以評估純度；(3)活性檢定，例如SLAP檢定，以評估彈性蛋白酶比活性；及(4)HIC-HPLC，以偵測成熟彈性蛋白酶及N末端變異體，且將具有合適特徵(例如，可接受之比活性、可接受低含量(較佳不存在)之可偵測糖型(glycoform)及可接受低含量(較佳不存在)之可偵測N末端變異體)之溶離份彙集。
一旦獲得經純化之成熟彈性蛋白酶，則可使活性酶進入用於凍乾之合適溶液中。一般而言，在凍乾之前，可將彈性蛋白酶蛋白質置放於1X磷酸鹽緩衝鹽水("PBS")緩衝液(137mM氯化鈉、10mM磷酸鈉、2.7mM磷酸鉀，pH 7.4)中。在某些實施例中，在凍乾之前，可將彈性蛋白酶蛋白質置放於0.1X PBS緩衝液(13.7mM氯化鈉、1.0mM磷酸鈉、0.27mM磷酸鉀，pH 7.4)中。
在一些情況下，彈性蛋白酶原序列之表現可產生彈性蛋白酶原與成熟彈性蛋白酶蛋白質之混合物。因此，本發明提供一種包含彈性蛋白酶原蛋白質與成熟彈性蛋白酶蛋白質兩者之組合物。
5.5 醫藥組合物
可將本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質併入適於投藥之醫藥組合物中。該等組合物通常包含彈性蛋白酶蛋白質及醫藥惰性成份，例如醫藥學上可接受之載劑。如本文所用之措辭"醫藥學上可接受之載劑"意欲包括與醫藥投藥相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。亦涵蓋習知賦形劑、媒劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、溶劑、增溶劑及著色劑作為醫藥惰 性成份。醫藥活性物質之該等介質及試劑之使用在此項技術中熟知。除非任何習知介質或試劑與成熟彈性蛋白酶蛋白質不相容，否則涵蓋其在組合物中之用途。亦可將補充性活性化合物併入組合物中。
因此，本發明之某些態樣係關於醫藥組合物。在特定實施例中，本發明提供一種組合物，其包含(i)治療有效量之成熟人類I型彈性蛋白酶及(ii)醫藥學上可接受之載劑。可用於組合物中之成熟人類I型彈性蛋白酶包括(但不限於)SEQ ID NO：1、4、5、84、87之蛋白質。成熟人類I型彈性蛋白酶可含有上表3中闡述之多態現象的任何組合。
在其他實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含(i)治療有效量之成熟人類I型彈性蛋白酶、(ii)醫藥學上可接受之載劑，該醫藥組合物不含胰蛋白酶或胰蛋白酶片段。在其他實施例中，醫藥組合物實質上不含胰蛋白酶或胰蛋白酶片段。如本文所用之短語"不含胰蛋白酶"係指生產過程之任何部分中未使用胰蛋白酶的組合物。如本文所用之短語"實質上不含胰蛋白酶"係指胰蛋白酶以不超過約0.0025%或更佳少於約0.001%(以重量/重量計)之最終百分比(亦即，胰蛋白酶重量/總組合物重量)存在的組合物。如本文所用之短語"不含"胰蛋白酶係指(例如)藉助於酶檢定或ELISA不可偵測到變異體之組合物。
在某些態樣中，本發明之組合物具有比如藉由BENZ檢定所量測3ng/ml胰蛋白酶當量低的胰蛋白酶活性、較佳比如藉由BENZ檢定所量測2.5ng/ml胰蛋白酶當量低的胰蛋白酶活性且甚至更佳比如藉由BENZ檢定所量測2ng/ml胰蛋白酶當量低的胰蛋白酶活性。在一特定實施例中，本發明提供包含治療有效量之彈性蛋白酶蛋白質之組合物，其中胰蛋白酶活性為低於如藉由BENZ檢定所量測1.6ng/ml胰蛋白酶之當量。下文實例8中提供具有比如藉由BENZ檢定所量測1.6ng/ml胰蛋白酶當量低的胰蛋白酶活性之彈性蛋白酶組合物之實例。在某些實施例中，ng/ml胰蛋白酶活性可在含有1mg/ml人類I型彈性蛋 白酶蛋白質之液體人類I型彈性蛋白酶組合物或製劑中檢定。因此，胰蛋白酶活性亦可根據彈性蛋白酶蛋白質之毫克數來描述，例如每毫克彈性蛋白酶蛋白質低於3ng胰蛋白酶活性、每毫克彈性蛋白酶蛋白質低於1.56ng胰蛋白酶活性等。
本發明進一步提供不含或實質上不含成熟彈性蛋白酶之非所要N末端變異體的醫藥組合物。非所要N末端變異體包括(但不限於)藉由在作為P5、P4、P3、P2、P'1、P'2、P'3、P'4、P'6及/或P'9位置上任何殘基之C末端的肽鍵裂解而產生之變異體。某些非所要N末端變異體係藉由胰蛋白酶活化產生；其他非所要N末端變異體係藉由不含經優化活化序列之彈性蛋白酶原序列的自體活化產生。
在某些實施例中，醫藥組合物不含或實質上不含包括(但不限於)SEQ ID NO：2、3、37、38、70、71、85、86、94、95、104、105、106、107、108的成熟彈性蛋白酶之一種、一種以上或全部N端變異體。在某些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含(i)治療有效量之成熟人類I型彈性蛋白酶、(ii)醫藥學上可接受之載劑，該醫藥組合物不含或實質上不含任何具有SEQ ID NO：2、3、37、38、70、71、85、86、94、95、104、105、106、107或108之蛋白質。在其他實施例中，醫藥組合物實質上不含包括(但不限於)SEQ ID NO：2、3、37、38、70、71、85、86、94、95、104、105、106、107或108的成熟彈性蛋白酶之N端變異體。如本文所用，短語"不含"特定變異體係指例如藉陽離子交換HPLC檢定、疏水性相互作用HPLC檢定或與液相層析組合之質譜分析不可偵測到該變異體之組合物。如本文所用，短語"實質上不含"係指N端變異體以至少低於約0.5%之最終百分比(亦即，N端變異體重量/總組合物重量)存在的組合物。在某些較佳實施例中，實質上不含N端變異體之組合物為N端變異體之濃度低於約0.1%或低於約0.01%或更佳甚至低於約0.001%(以重量/重量計)的 組合物。在某些態樣中，N端變異體之存在係藉陽離子交換HPLC檢定、疏水性相互作用HPLC檢定或與液相層析組合之質譜分析偵測。
在某些特定實施例中，不含SEQ ID NO：70、71、104及105之N端變異體的醫藥組合物係藉由P1位置不含精胺酸及/或P2位置不含丙胺酸之彈性蛋白酶原活化產生。
在其他實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含(i)治療有效量之成熟人類I型彈性蛋白酶、(ii)醫藥學上可接受之載劑，該醫藥組合物實質上不含細菌蛋白質及/或實質上不含該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質。如本文所用，短語"實質上不含哺乳動物蛋白質"或"實質上不含細菌蛋白質"係指該等蛋白質以至少低於約0.5%之最終百分比(亦即，哺乳動物蛋白質(除彈性蛋白酶及視情況諸如白蛋白之載體蛋白以外)或細菌蛋白質重量/總組合物重量)存在的組合物。在某些較佳實施例中，實質上不含該等蛋白質之組合物為非所要蛋白質之濃度低於約0.1%或低於約0.01%或更佳甚至低於約0.001%(以重量/重量計)的組合物。
在某些態樣中，"不含哺乳動物蛋白質"(除彈性蛋白酶以外)之醫藥組合物含有由不為哺乳動物細胞且在產生過程之任何部分中不存在具有哺乳動物序列或實質上具有哺乳動物序列之蛋白質的重組細胞株產生之彈性蛋白酶。在某些態樣中，"不含細菌蛋白質"之醫藥組合物含有由不為細菌細胞且在產生過程之任何部分中不存在具有細菌序列或實質上具有細菌序列之蛋白質的重組細胞株產生之彈性蛋白酶。
本發明之成熟人類I型彈性蛋白酶(包括變異體)最佳經純化以用於醫藥組合物中。在特定實施例中，彈性蛋白酶至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%純。在其他特定實施例中，彈性蛋白酶高達98%、98.5%、99%、99.2%、99.5%或99.8%純。
為調配成醫藥組合物，本發明之成熟人類I型彈性蛋白酶較佳具 有如藉由量測藉由添加彈性蛋白酶而催化之小肽受質N-琥珀醯基-Ala-Ala-Ala-對硝基苯胺(SLAP)水解的速率所測定，每毫克蛋白質大於1、大於5、大於10、大於20、大於25或大於30U之比活性。一個活性單位定義為在30℃下每分鐘催化1微莫耳受質水解的彈性蛋白酶之量且比活性定義為每毫克彈性蛋白酶蛋白質之活性(U/mg)。醫藥組合物較佳包含一種成熟人類I型彈性蛋白酶，其具有在下限為每毫克蛋白質1、2、3、4、5、7、10、15或20U且上限獨立地為每毫克蛋白質5、10、15、20、25、30、35、40或50U之範圍內的比活性。在例示性實施例中，比活性在每毫克蛋白質1-40U、每毫克蛋白質1-5U、每毫克蛋白質2-10U、每毫克蛋白質4-15U、每毫克蛋白質5-30U、每毫克蛋白質10-20U、每毫克蛋白質20-40U或上限及下限係選自任何上述值之任何範圍的範圍內。
本發明之醫藥組合物較佳為穩定的。在特定實施例中，醫藥組合物(例如，藉由上文凍乾法製備之醫藥組合物)在4℃下儲存一週後、更佳儲存1個月後、更佳儲存3個月後及最佳儲存6個月後保持其比活性之至少50%、更佳至少60%及最佳至少70%。在特定實施例中，醫藥組合物在4℃下儲存一週後、更佳儲存1個月後、更佳儲存3個月後且最佳儲存6個月後保持其比活性之至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。
本發明之醫藥組合物經調配以與其所欲投藥途徑相容。投予彈性蛋白酶以治療或預防生物管道疾病的方法描述於WO 2001/21574、WO 2004/073504及WO 2006/036804中。最佳投藥途徑為非經腸途徑，例如直接向血管壁投予，包括向藉由外科手術暴露之血管的外部外膜表面局部投予及使用藥物傳遞導管向血管壁局部投予。用於非經腸投藥之溶液或懸浮液可包括以下組份：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、磷酸鹽緩衝鹽水溶液、糖(諸如，蔗糖或葡聚糖)、不 揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、聚山梨醇酯-80(亦稱為tween-80)或其他合成溶液；抗菌劑，諸如對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如磷酸鹽；及用於調整張力之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。pH值可用諸如鹽酸或氫氧化鈉之酸或鹼來調整。可將非經腸製劑封裝入安瓿、拋棄式注射器或由玻璃或塑膠製成之單劑量或多劑量小瓶中。亦可將非經腸製劑亦封裝入藥物傳遞導管中。在所有狀況下，組合物必須無菌。
在特定實施例中，本發明之醫藥組合物為包含一或多種以下賦形劑之液體調配物：右旋糖(例如，2-10% w/v)；乳糖(例如，2-10% w/v)；甘露糖醇(例如，2-10% w/v)；蔗糖(例如，2-10% w/v)；海藻糖(例如，2-10% w/v)；抗壞血酸(例如，2-10mM)；氯化鈣(例如，4-20mM)；；葡聚糖-70(例如，2-10% w/v)；泊洛沙姆188(poloxamer 188)(例如，0.2-1% w/v)；聚山梨醇酯-80(例如，0.001-5% w/v，更佳為0.1-5%)；甘油(例如，0.2-5% w/v)；精胺酸(例如，2-10% w/v)；甘胺酸(例如，2-10% w/v)；葡聚糖-44(例如，2-10% w/v)；及葡聚糖-18(例如，2-10% w/v)。在某些實施例中，右旋糖、乳糖、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、葡聚糖-70、甘油、精胺酸、甘胺酸、葡聚糖-44或葡聚糖-18之濃度(單一或合計)在下限為2.5、4、5或7% w/v且上限獨立地為4、5、6、8或10% w/v之範圍內。
液體調配物可藉由將水添加至含有成熟彈性蛋白酶蛋白質、一或多種緩衝劑及/或一或多種賦形劑之無水調配物中來製備。無水調配物可藉由將包含成熟彈性蛋白酶蛋白質、一或多種緩衝劑及/或一或多種賦形劑之溶液凍乾來製備。
液體調配物可(例如)藉由用無菌水或緩衝溶液將經凍乾之本發明之彈性蛋白酶蛋白質復水來製備。緩衝溶液之實例包括生理食鹽水或 磷酸鹽緩衝鹽水之無菌溶液。在一特定實施例中，在使包含成熟彈性蛋白酶蛋白質之無水調配物復水至所需蛋白質濃度後，溶液含有約137mM氯化鈉、2.7mM磷酸鉀、10mM磷酸鈉(視為1X之磷酸鹽緩衝鹽水濃度)且溶液之pH值為約7.4。在某些態樣中，包含成熟彈性蛋白酶之無水調配物亦含有使得對於復水而言僅需水之量之鈉離子、氯離子及磷酸根離子。
液體調配物亦可(例如)藉由用含有一或多種賦形劑之緩衝溶液將經凍乾之彈性蛋白酶蛋白質復水來製備。賦形劑之實例包括聚山梨醇酯-80及葡聚糖。在一特定實施例中，在使包含成熟彈性蛋白酶蛋白質之無水調配物復水至所需蛋白質濃度後，所得溶液含有約137mM氯化鈉、2.7mM磷酸鉀、10mM磷酸鈉、0.01%聚山梨醇酯-80且溶液之pH值為約7.4。該一或多種賦形劑可在凍乾之前或在凍乾之後但在復水之前與成熟彈性蛋白酶蛋白質混合。因此，在某些態樣中，包含成熟彈性蛋白酶蛋白質之無水調配物亦含有賦形劑，諸如聚山梨醇酯-80或葡聚糖。
在某些態樣中，本發明提供一種液體調配物，其包含：於137mM氯化鈉、2.7mM磷酸鉀、10mM磷酸鈉之溶液中之0.001-50mg/ml成熟彈性蛋白酶蛋白質，且包含5-10%、更佳6-9%之選自以下各物之賦形劑：右旋糖、乳糖、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、葡聚糖-70、甘油、精胺酸、甘胺酸、葡聚糖-44或葡聚糖-18。
在一特定實施例中，本發明提供一種液體調配物，其包含：於pH值為7.4之137mM氯化鈉、2.7mM磷酸鉀、10mM磷酸鈉之溶液中之0.001-50mg/ml成熟彈性蛋白酶蛋白質。
在另一特定實施例中，本發明提供一種液體調配物，其包含：於pH值為7.4之137mM氯化鈉、2.7mM磷酸鉀、10mM磷酸鈉且包含0.01%聚山梨醇酯-80之溶液中之0.001-50mg/ml成熟彈性蛋白酶蛋白 質。
在另一特定實施例中，本發明提供一種液體調配物，其包含：於pH值為7.4之137mM氯化鈉、2.7mM磷酸鉀、10mM磷酸鈉且包含0.01%聚山梨醇酯-80及8%葡聚糖-18之溶液中之0.001-50mg/ml成熟彈性蛋白酶蛋白質。
在另一特定實施例中，本發明提供一種液體調配物，其包含：於pH值為7.4之137mM氯化鈉、2.7mM磷酸鉀、10mM磷酸鈉且包含8%葡聚糖-18之溶液中之0.001-50mg/ml成熟彈性蛋白酶蛋白質。
本發明之液體調配物較佳含有在下限為0.1、0.5、1、2.5、5、10、15或20mg/ml且上限獨立地為0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1000或1500mg/ml之範圍內的成熟彈性蛋白酶蛋白質之最終濃度。
在某些態樣中，本發明提供一種液體調配物，其包含：於0.5X PBS-1.5X PBS(更佳1X PBS)之溶液中之0.0001-500mg/ml(更佳1-100mg/ml，且更佳0.5-20mg/ml)成熟彈性蛋白酶蛋白質，該溶液包含5-10%(更佳6-9%)選自以下各物之賦形劑：右旋糖、乳糖、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、葡聚糖-70、甘油、精胺酸、甘胺酸、葡聚糖-44或葡聚糖-18，且具有6.5-8.5之pH值。在一特定實施例中，液體調配物包含於1X PBS(pH 7.4)中之0.5mg/ml成熟彈性蛋白酶蛋白質及8%葡聚糖-18。在一特定實施例中，液體調配物包含於1X PBS(pH 7.4)中之5mg/ml成熟彈性蛋白酶蛋白質及8%葡聚糖-18。
本發明之液體調配物較佳具有在下限為100、125、150、175、200、250或275mOsm/kg且上限獨立地為500、450、400、350、325、300、275或250mOsm/kg之範圍內的滲透壓度。在特定實施例中，本發明之液體調配物之容積滲透濃度較佳具有(例如)如藉由冰點下降法所量測，約125至500mOsm/kg、更佳約275至325mOsm/kg之 滲透壓度。
出於投藥便利性及劑量均一性調配呈單位劑型的諸如可製成本發明之液體調配物的組合物之非經腸組合物尤其有利。如本文所用之"單位劑型"係指適用作待治療之個體之單劑量的物理離散單位；各單位含有經計算以產生所需治療效應之預定量之成熟彈性蛋白酶蛋白質以及所需醫藥載劑。
如本文中所定義，成熟彈性蛋白酶蛋白質之治療有效量(亦即，有效劑量)在約0.0033mg-200mg之範圍內。對於具有較小直徑及較薄壁之血管(諸如，橈頭動靜脈瘺(radiocephalic arteriovenous fistula)中之彼等血管)而言，較小劑量(諸如，0.0033mg-2.0mg)較佳。對於具有較大直徑及較厚壁之血管(諸如，股動脈)而言，較大劑量(諸如，2.05-100mg)較佳。
在某些實施例中，醫藥組合物可包括在容器、包裝、分配器或導管中。在其他實施例中，醫藥組合物可與投藥說明書一起包括在容器、包裝、分配器或導管中。投藥說明書可以印刷形式包括在容器、包裝、分配器或導管內或其上。或者，投藥說明書可以參考提供說明之另一印刷或網際網路可得文獻之形式包括在容器、包裝、分配器或導管內或其上。
在某些實施例中，醫藥組合物可包括在容器、包裝或分配器中。在其他實施例中，醫藥組合物可與投藥說明書一起包括在容器、包裝或分配器中。投藥說明書可以印刷形式包括在容器、包裝或分配器內或其上。或者，投藥說明書可以參考提供說明之另一印刷或網際網路可得文獻之形式包括在容器、包裝或分配器內或其上。
本發明包括製備醫藥組合物之方法。一旦根據本發明產生成熟彈性蛋白酶，則可將其凍乾且儲存，直至將其復水成適於投藥之醫藥調配物。在一例示性實施例中，本發明提供一種分離經凍乾之成熟人類 I型彈性蛋白酶的方法，其包含：(a)在表現前彈性蛋白酶原開放閱讀框架之條件下培養經工程化以表現編碼前彈性蛋白酶原開放閱讀框架之核酸分子的宿主細胞，諸如甲醇酵母宿主細胞，其中該開放閱讀框架包含在5'至3'方向上編碼以下各物之核苷酸序列：(i)在甲醇酵母中可操作之信號肽、(ii)包含彈性蛋白酶識別序列之活化序列及(iii)成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之序列，從而產生彈性蛋白酶原蛋白質；(b)使該彈性蛋白酶原蛋白質經受自體活化條件，從而產生成熟I型彈性蛋白酶，其中自體活化條件包括(例如)：(i)改變含有彈性蛋白酶原蛋白質之溶液的pH值，例如至6.5-11、較佳8-9之pH值；或(ii)(例如)藉由離子交換層析純化彈性蛋白酶原蛋白質，且使溶液經受延長轉化以移除N末端變異體，從而產生成熟人類I型彈性蛋白酶；(c)視情況純化成熟人類I型彈性蛋白酶，(例如)用於精煉層析之離子交換層析步驟；及(d)凍乾成熟I型彈性蛋白酶，從而分離經凍乾之成熟人類I型彈性蛋白酶。成熟I型彈性蛋白酶較佳為人類I型彈性蛋白酶。在某些態樣中，經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶較佳高於95%純；在特定實施例中，經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶高於98%或高於99%純。
可將本發明之成熟彈性蛋白酶蛋白質調配成醫藥組合物。因此，在一例示性實施例中，本發明提供一種產生包含成熟人類I型彈性蛋白酶之醫藥組合物之方法，該方法包含(i)根據上述方法(例如，在部分5.4中)分離經凍乾之成熟人類I型彈性蛋白酶；及(ii)在醫藥學上可接受之載劑中將經凍乾之成熟人類I型彈性蛋白酶復水。
5.6 有效劑量
本發明一般提供非經腸投予、較佳局部投予單獨或與用於治療或預防生物管道疾病之其他藥劑組合之重組彈性蛋白酶蛋白質的益處。
在某些實施例中，作為非經腸投藥之一替代形式，可經口投予用於治療或預防生物管道疾病之藥劑。
用於實施本發明之方法的彈性蛋白酶蛋白質之毒性及治療功效可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定，例如測定LD50(使群體之50%致死的劑量)及ED50(在群體之50%中治療有效的劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比率為治療指數且其可表示為比率LD50/ED50。該資訊可用於更精確地測定人類中之適用劑量。
5.7 投藥方法
本發明係關於包含新穎彈性蛋白酶蛋白質之醫藥組合物及使用其來預防或治療生物管道疾病之方法。可如上文部分5.5中所述，以習知方式調配該等醫藥組合物。
可藉由熟習此項技術者已知之適用於將溶液傳遞至動脈壁或靜脈壁的設備，例如注射器、藥物傳遞導管、藥物傳遞針、植人藥物傳遞聚合物(諸如，片狀或微球製劑)、可植入導管或經聚合物塗佈之血管支架，較佳自體擴展支架，向所治療之生物管道的所欲區段投予本發明之彈性蛋白酶組合物。
在某些實施例中，向所欲區段投藥可藉由直接觀測、超音波、CT、螢光鏡引導、MRI或內窺鏡引導來引導。
在本發明之某些態樣中，向生物管道投予彈性蛋白酶包含直接向藉由外科手術暴露之動脈或靜脈的外部外膜表面施用彈性蛋白酶之液體調配物。在本發明之特定態樣中，使用注射器進行投藥。
在本發明之某些態樣中，向生物管道投予彈性蛋白酶包含將傳遞裝置定位極接近待治療之生物管道之區段。在一些實施例中，在藉由傳遞裝置傳遞彈性蛋白酶蛋白質期間，可將傳遞裝置之一部分插入生物管道之壁中。在一些實施例中，可將生物管道之內腔加壓，同時將彈性蛋白酶蛋白質傳遞至生物管道之加壓區段中。在一些實施例中，藉由機械作用將生物管道之內腔加壓。在一些實施例中，藉由氣囊導管將生物管道之內腔加壓。在一些實施例中，藉由作為導管或設備之 部分的自體擴展構件將壓力施加於生物管道內壁。在一些實施例中，藉由同一設備投予彈性蛋白酶蛋白質及進行加壓。在一些實施例中，藉由外科手術暴露生物管道且將彈性蛋白酶蛋白質傳遞至內腔或施用於活體內生物管道之外表面。在包含內腔傳遞之實施例中，可使用夾子使經由血管之血流停止，或以允許彈性蛋白酶接觸血管壁較長時期，且防止血清對彈性蛋白酶之抑制。在一些實施例中，藉由外科手術移除生物管道且將彈性蛋白酶傳遞至內腔表面及/或活體外管道之外表面。在某些實施例中，接著可使所治療之管道返回身體中。
在本發明之其他態樣中，向生物管道投予彈性蛋白酶需要使用聚合物調配物，將其以支架形式置放於待治療之血管內，以夾子或條帶形式施用於生物管道之外表面，或包裹在待治療之血管上或周圍，或以其他設備形式置放於待治療之血管中、周圍或附近。
在本發明之其他態樣中，將彈性蛋白酶經皮注射至組織區域中，以達成使該區域內之動脈及/或靜脈(包括副動脈)擴大之目的。在其他態樣中，將彈性蛋白酶經皮直接注射至動脈壁或靜脈壁中或周圍組織中，以達成使血管之特定區段擴大之目的。在針對心臟血管治療之實施例中，可將彈性蛋白酶蛋白質經皮傳遞至心包空間或直接施用於藉由外科手術暴露之冠狀血管。
可用於向血管投予本發明之彈性蛋白酶蛋白質的醫藥設備描述於下文部分5.9中。
5.8 套組
本發明提供用於實施本發明之方法之套組。本發明之"治療"套組包含一或多種在一或多個容器中之本文描述適用於治療或預防生物管道疾病之藥劑以及視情況促進其傳遞之任何試劑。本發明之一替代性套組"製備"套組包含一或多種在一或多個容器中之本文描述適用於製備重組彈性蛋白酶蛋白質之試劑。
本發明之治療套組視情況可包含適用於執行本發明之方法的其他組份。舉例而言，治療套組可包含適用於調配本發明之藥劑之醫藥載劑。治療套組亦可包含用於執行本發明之治療方法的設備或設備組件，例如注射器或針頭。亦涵蓋在治療套組中包括諸如內部或血管周圍注射導管或腔內注射導管之設備。在某些實施例中，可提供呈單位劑型之本發明之藥劑。此外或替代地，本發明之套組可提供描述一或多種本發明之方法之效能的說明材料或呈由管理醫藥或生物製品製備、使用或銷售之政府機構規定形式之告示，該告示反映由該機構批准製備、使用或銷售用於人類投藥。說明材料可以印刷形式包括於一或多個套組容器中或其上。或者，說明材料可以參考提供說明材料之另一印刷或網際網路可得文獻之形式包括在一或多個套組容器內或其上。
在特定實施例中，本發明之套組包含如下文部分5.9中所述之醫藥設備。
本發明之製備套組視情況可包含適用於執行本發明之方法的其他組件。
5.9 適用於投予彈性蛋白酶蛋白質之醫藥設備
本文提供可用於向生物管道(諸如，動脈或靜脈)投予本發明之彈性蛋白酶蛋白質的醫藥設備。該等設備描述於下文及2008年1月31日申請之臨時申請案第61/025,084號、2008年2月1日申請之臨時申請案第61/025,463號及2008年6月25日申請之臨時申請案第61/075,710號中，各申請案以全文引用的方式併入本文中。亦可經由習知導管向生物管道投予本發明之彈性蛋白酶蛋白質。
在一實施例中，適用於投予彈性蛋白酶蛋白質之醫藥設備具有中心縱軸，且包含一或多個致動器，其中該一或多個致動器可以約束組態存在，其中該一或多個致動器之長度經定向實質上平行於該醫藥設 備之縱軸，且該一或多個致動器可以無約束組態存在，其中該一或多個致動器之至少一部分長度經定向實質上不平行於設備中心縱軸。在將設備定位於與生物管道之壁鄰近的目標位點後，可將一或多個致動器(及必要時所有致動器)自約束組態釋放且允許其採用無約束組態，從而與生物管道之壁接觸。一或多個致動器可為任何形狀，且在較佳實施例中，一或多個致動器自約束組態移動至無約束組態在藉由設備操作人員釋放約束力之後發生，但未由操作人員輸入任何變形力至設備或目標組織。
在圖22中展示之第一特定實施例中，設備為流體傳遞導管10，其包含一或多個經成形為一對細長齒條12、14之致動器，該等細長齒條之中間區域可在經定向實質上平行於導管總成之中心縱軸15的約束組態與該對齒條之至少一部分經定向實質上不平行於該中心縱軸的無約束組態之間移動(參見圖23中齒條長度之左側L及右側R部分)。一或多個齒條12、14可經構造為各具有相對近側及遠側末端之細長帶或線。 在一較佳實施例中，齒條具有平坦相對內表面24、26及平坦相對面向外之表面28、30。在此實施例中，如圖22及23中分別展示，齒條12、14可在約束位置與無約束位置之間移動。在一實施例中，如圖22中所示，一對齒條經背靠背定位於其約束組態中。
導管10進一步包含一或多個固定於一或多個齒條12、14之一或多個表面的組織穿透器16、18、具有伸長長度之中心導管組件20及可在導管在生物管道內移動期間防護組織穿透器或穿透器之外部導管組件22。
組織穿透器16、18可由任何合適材料構造。該等材料之較佳實例包括(但不限於)鎳、鋁、鋼及其合金。在一特定實施例中，組織穿透器由鎳鈦諾(nitinol)構造。
中心導管組件20及外部導管組件22可由通常用於構造導管之材料 構造。該等材料之實例包括(但不限於)聚矽氧、聚胺基甲酸酯、耐綸、滌綸(dacron)及PEBAXTM。
致動器較佳由可撓性彈性材料構造。在一較佳實施例中，可撓性彈性材料能夠在施加約束力之後，例如當致動器處於約束組態時，受到約束，且當移除約束力時，例如當致動器處於無約束組態時，採用其原始無約束形狀。可使用任何可撓性彈性材料，包括(但不限於)外科工具用鋼、鋁、聚丙烯、烯系材料、聚胺基甲酸酯及其他合成橡膠或塑膠材料。一或多個致動器最佳由形狀記憶材料構造。該等形狀記憶材料之實例包括(但不限於)銅-鋅-鋁-鎳合金、銅-鋁-鎳合金及鎳-鈦(NiTi)合金。在一較佳實施例中，形狀記憶材料為鎳鈦諾。在一較佳實施例中，如圖23中所示，當該對齒條採用無約束組態時，形成各齒條之材料的形狀記憶性質在不施加任何外部變形力下使齒條在單一平面中遠離彼此徑向彎曲。
如圖24中所示，一或多個齒條(及較佳每一齒條)具有沿齒條長度或在齒條內延伸之可撓性流體傳遞管道32、34。當齒條12、14自其筆直約束組態移動至其彎曲無約束組態時，流體傳遞管道32、34亦自筆直組態移動至彎曲組態。在一實施例中，流體傳遞管道32、34為沿該對齒條12、14之長度固定之分開管狀管道。在另一實施例中，流體傳遞管道為形成於齒條之材料中或內之管道。
一或多個齒條(及較佳齒條12、14中之每一者)亦藉由沿齒條長度延伸之拉鏈導軌36、38形成(圖24)。拉鏈導軌36、38由與齒條12、14相同之材料形成，或由隨齒條12、14撓曲之材料形成。
一或多個組織穿透器16、18固定於該對齒條12、14之外表面28、30(圖24)。組織穿透器16、18經連接至沿齒條12、14之長度延伸之流體傳遞管道32、34且與其連通。組織穿透器16、18經定位以自齒條12、14之外表面28、30實質上垂直突出。組織穿透器16、18具有與齒 條之流體傳遞管道32、34連通之中空內部孔。組織穿透器之遠側末端具有與組織穿透器之內部孔連通之流體傳遞埠。
該設備允許將流體傳遞至生物管道之壁(例如，血管壁)之一或多個不同層中或穿過該或該等層。血管壁包含大量結構及層，包括內皮細胞層及基底膜層(共同為內膜層)、內部彈性膜、中層及外膜層。如美國專利申請公開案第2006/0189941A1號中所述，此等層經排列以使得內皮暴露於血管之內腔，且基底膜、內部彈性膜、中層及外膜各自在內皮上連續分層。使用本發明之醫藥設備，組織穿透器16、18可穿透之厚度由各組織穿透器16、18之長度決定。舉例而言，若目標層為外膜層，則使用具有在部署設備後足以穿透至外膜層厚度之界定長度的組織穿透器16、18。同樣，若目標層為中層，則使用具有在部署設備後足以穿透至中層厚度之界定長度的組織穿透器16、18。
在特定實施例中，對於血管應用而言，組織穿透器16、18之長度可在約0.3mm至約5mm之範圍內，或對於涉及其他生物空間或管道之應用(例如，結腸應用)而言，長達約20mm或甚至30mm。組織穿透器16、18較佳具有約0.2mm(33規格)至約3.4mm(10規格)、更佳0.2mm至1.3mm(約33至21規格)之直徑。組織穿透器之遠側尖端可具有標準斜角、短斜角或正短斜角。在一替代性實施例中，雖然連接至任一齒條之組織穿透器並不具有相同長度，但其可經組態以使得當醫藥設備處於無約束位置時，例如在使用期間，其遠側末端對準，以便與生物管道之壁等距離。
圖22中左側及右側分別展示，中心導管組件20具有包含相對近側及遠側末端之伸長長度。在一實施例中，中心導管組件20具有沿其伸長長度延伸之圓筒形外表面。齒條12、14之近側末端經連接(例如，焊接或膠黏)至中心導管組件20之遠側末端，而齒條12、14之遠側末端經連接(例如，焊接或膠黏)至導管引導尖端40。尖端40具有經設計 以易於在生物管道中移動之平滑外表面。導線孔48延伸穿過中心導管20之長度及尖端40。該導線孔經定尺寸以容納經由孔滑動嚙合之導線。
一對流體傳遞內腔44、46延伸穿過中心導管組件20之內部，長達導管組件之整個長度(圖25)。在中心導管組件之遠側末端，該對流體傳遞內腔44、46與沿齒條12、14之長度延伸至組織穿透器16、18之該對流體傳遞管道32、34連通。導線孔48亦自中心導管組件之近側末端至遠側末端延伸穿過中心導管組件20之內部(圖25)。中心導管組件20之近側末端具有一對魯爾輪彀(Luer hub)50、52(圖22)。在一實施例中，各魯爾輪彀50、52與延伸穿過中心導管長度之流體傳遞內腔44、46中之一者連通。各魯爾輪彀50、52經設計以與流體傳遞來源連接以傳送流體穿過各魯爾輪彀50、52，接著穿過延伸穿過中心導管組件20之各流體傳遞內腔44、46，接著穿過沿該對齒條12、14之長度延伸的各流體傳遞管道32、34，且接著穿過固定於該對齒條中每一者之組織穿透器16、18。在另一實施例中，各魯爾輪彀50、52獨立地與延伸穿過中心導管組件之長度的兩個流體傳遞內腔44、46連通。在此組態中，第一流體可經由第一魯爾輪彀傳遞至兩個組織穿透器16、18，且第二流體可經由第二魯爾輪彀傳遞至兩個組織穿透器16、18。如圖32中所示，流體自各魯爾輪彀傳遞至兩個組織穿透器可藉由自各魯爾輪彀延伸至遠側共同儲集器61之獨立管道實現。此儲集器與兩個組織穿透器16、18連通。或者，在另一實施例中，本發明之醫藥設備僅包含單一魯爾輪彀，其連接至延伸穿過中心導管之單一流體傳遞內腔，接著附接至遠側共同儲集器，使得單一流體傳遞至兩個組織穿透器16、18。
外部導管組件22具有圍繞該對齒條12、14及大部分中心導管20之管狀組態(圖22)。導管組件22具有分別在圖22中左側及右側所示的導 管組件之相對近側與遠側末端之間延伸的伸長長度。導管組件遠側末端經定尺寸以與引導尖端40呈固定嚙合形式而嚙合，其中當導管組件遠側末端與尖端嚙合時，尖端40之外表面與導管組件22之外表面並接。導管組件22之管狀組態經定尺寸，以使得導管組件22之內表面與處於該對齒條之約束位置上的該對齒條12、14上之複數個組織穿透器16、18表面隔開。當導管組件遠側末端與導管引導尖端40嚙合時，中心導管20之近側末端延伸超出導管組件22之近側末端。
機械連接54提供於外部導管組件22近側末端與中心導管組件20近側末端之間，其使得外部導管組件能夠沿該對齒條12、14及中心導管組件20之長度向後移動，使得外部導管組件22遠側末端與引導尖端40分離且越過該對齒條12、14，且向前越過中心導管組件20之長度及該對齒條12、14之長度以使外部導管組件22遠側末端與尖端40嚙合(圖22)。機械連接54可藉由手柄或按鈕提供，其以手動方式使外部導管組件22在中心導管組件20上滑動。連接54亦可由指輪或觸發機構提供。此外，連接54可具有外部導管組件22相對於中心導管組件20增量移動的可聽或可觸指示物(諸如，發出卡嗒聲)。
在一實施例中，外部導管組件22在外部導管組件之內表面上具有沿外部導管組件22一側之整個長度延伸的單一拉鏈軌道56(圖24)。外部導管組件22內部中之拉鏈軌道56以滑動嚙合形式與各齒條12、14之一側上之拉鏈導軌36、38嚙合。外部導管組件22沿中心導管組件20及該對齒條12、14之長度向前行進至導管總成之引導尖端40引起外部導管組件之拉鏈軌道56沿該對齒條12、14之導軌36、38滑動。此將該對齒條12、14自圖23中展示之其彎曲無約束組態移動至圖22中展示之其背靠背約束組態。外部導管組件22之拉鏈軌道56中齒條導軌36、38之嚙合使該對齒條12、14保持於圖22中展示之其背靠背相對位置。在將外部導管組件22向前推過中心導管組件20及該對齒條12、14至外部導 管組件22之遠側末端與引導尖端40嚙合之處的情況下，組織穿透器16、18被覆蓋且本發明之導管總成可安全地在生物管道中向前或向後移動。外部導管組件22覆蓋自該對齒條12、14突起之組織穿透器16、18，且外部導管組件22與遠側引導尖端40之嚙合為導管總成提供便於導管總成插入及穿過生物管道(諸如，血管)之平滑外表面。在另一實施例中，外部導管組件22在內表面上具有兩個沿外部導管組件22之整個長度延伸的彼此成180°之拉鏈軌道，且齒條在兩側均具有導軌。
導線58與導管總成一起使用(圖22)。導線58延伸穿過中心導管組件導線孔48，沿齒條12、14延伸，且穿過引導尖端出口42。在某些實施例中，導線58具有實心，例如不鏽鋼或超彈性鎳鈦諾。導線之整體或其遠側部分(例如，最遠側1mm至25mm或最遠側3mm至10mm)由不透射線之材料構造。導線58視情況可塗有醫學惰性塗層，諸如TEFLON®。
在使用此設備時，藉由此項技術中熟知之方法將導線58定位於生物管道中。導線58自生物管道延伸，穿過總成之尖端40中之導線出口42，穿過外部防護導管22，越過組織穿透器16、18，且穿過中心導管20之導線孔48。在其他實施例中，導管總成為快速交換導管總成，其中導線內腔存在於導管之引導尖端40之遠側末端中，而不延伸穿過醫藥設備之整個長度。
在導線定位後，將設備沿先前定位之導線58推進至生物管道中。一或多個不透射線之標誌視情況可提供於設備上以監測設備在生物管道中之位置。防止電磁輻射通過之任何材料視為不透射線且可使用。較佳不透射線材料包括(但不限於)鉑、金或銀。可將不透射線材料塗佈於全部或一部分尖端40之表面上、全部或部分齒條12、14或其他致動器上、導線58上或上述結構之某些組合上。或者，可將不透射線材料之環附接至尖端40。設備視情況可具有機載成像，諸如血管內超音 波或光學相干斷層攝影。設備尖端視情況可具有用以測定設備位置或周圍生物管道特徵之光學裝置。
當設備處於生物管道中其所欲位置時，操作人員使用機械連接54將外部導管組件22向後縮回，遠離引導尖端40。在一較佳實施例中，當將外部導管組件22沿組織穿透器16、18撤回時，外部導管組件22之拉鏈軌道56沿該對齒條12、14之導軌36、38撤回。此移動將該對齒條12、14自圖22中展示之其約束背靠背組態釋放，且允許齒條12、14之形狀記憶材料採用圖23中展示之其無約束彎曲組態。當齒條12、14移至其無約束彎曲組態時，齒條與生物管道之壁之內表面接觸，且齒條12、14之外表面28、30上之組織穿透器16、18壓進設備位置處生物管道之內表面中。
在組織穿透器16、18進入生物管道之壁之所欲層後，流體可經傳遞穿過中心導管組件20中之流體傳遞內腔44、46，穿過該對齒條12、14上之流體傳遞管道32、34，且穿過組織穿透器16、18。當流體傳遞完成時，操作人員使用機械連接54使外部導管組件22(其亦可稱為防護組件)沿中心導管組件20且沿該對齒條12、14向前移動至引導尖端40。當外部導管組件22向前移動越過該對齒條12、14時，外部導管組件22之內部上的拉鏈軌道56越過該對齒條12、14上之導軌36、38，使齒條12、14自其無約束彎曲組態移回至其約束組態。當外部導管組件22已完全行進越過該對齒條12、14且再次與引導尖端40嚙合時，外部導管組件22中之拉鏈軌道56使齒條12、14保持於其約束組態。接著可將設備重新定位以在生物管道中之另一位置或另一生物管道釋放，或自身體退出。
齒條12、14之形狀及長度經選擇以使得設備之各種實施例可用於具有各種尺寸或直徑之生物空間或管道。在某些實施例中，齒條可為平坦形或圓形。視特定應用而定，平坦形齒條較佳具有在約0.2mm至 約20mm範圍內之寬度、約0.2mm至約5mm範圍內之高度及約10mm至約200mm範圍內之長度。視特定應用而定，圓形齒條較佳具有在約0.2mm至約20mm範圍內之直徑及約10mm至約200mm範圍內之長度。在特定實施例中，平坦形齒條寬度為3.5mm至5mm、5mm至10mm、10mm至15mm、15mm至20mm或其中任何範圍(例如，3.5mm至10mm)；高度為3.5mm至5mm、5mm至10mm、10mm至15mm、15mm至20mm或其中任何範圍(例如，3.5mm至10mm)；且長度為10mm至20mm、20mm至40mm、40mm至80mm、80mm至120mm、120mm至150mm或150mm至200mm或其中任何範圍(例如，10mm至40mm)，或上述任何變換(例如，寬度為5mm至10mm、高度為3.5至5mm且長度為20至40mm)。在其他實施例中，圓形齒條直徑為3.5mm至5mm、5mm至10mm、10mm至15mm、15mm至20mm或其中任何範圍(例如，3.5mm至10mm)且長度為10mm至20mm、20mm至40mm、40mm至80mm、80mm至120mm、120mm至150mm或150mm至200mm或其中任何範圍(例如，10mm至40mm)，或上述任何變換(例如，直徑為5mm至10mm且長度為20至40mm)。
在圖27中展示之第二特定實施例中，本發明之設備為流體傳遞導管110，其包含具有伸長長度之中心導管組件112以及縱軸113、一或多個(且較佳兩個)可撓性彈性致動器，在此特定實施例中，該一或多個致動器經成形為自中心導管組件112之遠側部分延伸之組織穿透器呈遞管114、116。組織呈遞管114、116之至少一部分可在經定向實質上平行於導管總成之中心縱軸113的約束組態與經定向實質上不平行於導管之中心縱軸113的無約束組態之間移動。
導管進一步包含一或多個(且較佳兩個)延伸穿過兩個組織穿透器呈遞管114、116之可撓性伸長組織穿透器118、120及延伸越過中心導管組件112、組織穿透器呈遞管114、116及中間導軌132之長度之部分 的外部調度管122。
中心導管組件112及外部調度管122可由適於構造導管之任何材料構造。該等材料之實例包括(但不限於)聚矽氧、聚胺基甲酸酯、耐綸、滌綸及PEBAXTM。
組織穿透器118、120連接於各自輪轂166、168(圖31)。該對組織穿透器118、120中之一或多者較佳具有約0.2mm(33規格)至約3.4mm(10規格)、更佳0.8mm至1.3mm(約18至21規格)之直徑。該對組織穿透器中之一或多者可具有標準斜角、短斜角或正短斜角。該對組織穿透器118、120較佳由允許組織穿透器沿其長度撓曲之材料構造。該等材料之實例包括(但不限於)鎳、鋁、鋼及其合金。在一特定實施例中，組織穿透器由鎳鈦諾構造。組織穿透器118、120之全長可由單一材料構造，或組織穿透器118、120包括尖端156、158之遠側末端(例如，遠側1mm至遠側20mm)可由一種材料構造且經由由不同材料(例如，塑膠)構造之管連接至各自輪轂166、168。
該對組織穿透器呈遞管114、116中之一或多者較佳由可撓性彈性材料構造。該可撓性彈性材料可(例如)在組織穿透器呈遞管114、116處於圖27之筆直約束組態時變形，但在移除變形力時，例如在組織穿透器呈遞管114、116處於圖28中所示之彎曲無約束組態時，恢復至其原始形狀。可使用任何可撓性彈性材料，包括(但不限於)外科工具用鋼、鋁、聚丙烯、烯系材料、聚胺基甲酸酯及其他合成橡膠或塑膠材料。該對組織穿透器呈遞管114、116最佳由形狀記憶材料構造。該等形狀記憶材料之實例包括(但不限於)銅-鋅-鋁-鎳合金、銅-鋁-鎳合金及鎳-鈦(NiTi)合金。在一較佳實施例中，形狀記憶材料為鎳鈦諾。
中心導管組件112具有包含相對近側124及遠側126末端之可撓性伸長長度(圖27)。中心導管組件之遠側末端126經成形為具有將引導遠側末端126穿過生物管道之外部形狀組態的引導尖端。中間導軌132 內之導線孔128自近側末端124至遠側末端126延伸穿過中心導管112之內部。導線孔128容納可撓性伸長導線130，以使孔128沿線滑動移動(圖29)。導線130用以引導導管總成穿過生物管道。在某些實施例中，導線130具有實心，例如不鏽鋼或超彈性鎳鈦諾。導線視情況可整體或其遠側部分(例如，最遠側1mm至25mm或最遠側1mm至3mm)由不透射線之材料構造。導線130視情況可塗有醫學惰性塗層，諸如TEFLON®。在其他實施例中，導管總成為快速交換導管總成，其中導線經定位於引導尖端126之遠側末端上且自其延伸。
圍繞導線孔128之狹窄中間導軌132自導管遠側末端126之引導尖端延伸至導管近側末端124。中間導軌132使引導尖端126連接至中心導管組件之基底部分138。
中心導管組件基底部分138具有沿基底部分之整個長度延伸之圓筒形外表面。基底部分138沿中心導管組件112之總體長度的大部分延伸。如圖29中所示，導線孔128延伸穿過中心導管組件基底部分138之內部。此外，一對組織穿透器內腔140、142亦延伸穿過中心導管組件基底部分138之長度，與導線孔128並排。在中心導管組件之近側末端124處，一對埠144、146使該對內腔140、142與中心導管組件112之外部連通(圖27)。
在一替代性實施例中，圖27之醫藥設備亦可包含經成形為組織穿透器呈遞管之單一可撓性彈性致動器、延伸穿過組織穿透器呈遞管且連接至輪彀之單一可撓性伸長組織穿透器及沿中心導管組件、組織穿透器呈遞管及中間導軌之長度部分延伸的外部調度管。
該對第一及第二組織穿透器呈遞管114、116自導管中心組件基底部分138突出至導管遠側末端126。各組織穿透器呈遞管經成形為具有固定於中心導管組件基底部分138之近側末端及相對遠側末端148、150之狹長管。第一及第二組織穿透器呈遞管114、116各自具有與中 心導管組件基底部分138中各自第一組織穿透器內腔140及第二組織穿透器內腔142連通的內部孔152、154。
如圖29及30中所示，使組織穿透器呈遞管114、116之外部組態與中間導軌132相匹配，以便組織穿透器呈遞管114、116之長度可並排定位於中間導軌132之對側。組織穿透器管遠側末端148、150可經成形為亦便於使導管穿過血管系統之引導尖端表面。組織穿透器管遠側末端148、150較佳在直徑上大於組織穿透器呈遞管114、116。在一特定實施例中，組織穿透器管遠側尖端148、150為圓形及球形尖端。該等尖端防止損傷且該等管不會無意刺穿生物管道之壁。尖端148、150經暴露且不向外延伸超過引導尖端126之直徑。
組織穿透器管114、116各自較佳由形狀記憶材料(諸如，鎳鈦諾)構造。管114、116經成形具有圖28中所示之彎曲無約束組態。當無約束力施加於管時，管114、116移至圖28中所示之彎曲無約束組態。為使呈遞管114、116處於沿中間導軌132之筆直約束組態，必須施加約束力至管以使其保持於圖27中所示之筆直約束位置。當管114、116各自自圖27中所示之其筆直約束組態移動至圖28中所示之其彎曲無約束組態時，延伸穿過管之組織穿透器孔152、154亦自筆直組態移動至彎曲組態。
該對組織穿透器118、120自其遠側尖端至輪轂166、168具有比延伸穿過中心導管基底部分138之組織穿透器內腔140、142與延伸穿過組織穿透器呈遞管114、116之組織穿透器孔152、154之組合長度稍長的長度。組織穿透器118、120之尖端156、158經定位與組織穿透器呈遞管114、116之遠側末端148、150相鄰且定位於呈圖27之約束組態的管之孔152、154之內部。組織穿透器118、120之相對近側末端突出穿過中心導管112之側埠144、146。該對組織穿透器118、120經定尺寸以易於滑動穿過中心導管組件112之組織穿透器內腔140、142及組織 穿透器呈遞管114、116之組織穿透器孔152、154。中心導管組件112之側埠144、146較佳與中心導管近側末端124成20°至90°之角度，最佳與中心導管近側末端124成30°至60°之角度。
一對人工操作移動至線性移動控制器162、164可經連接至組織穿透器118、120之近側末端且可固定於中心導管埠144、146(圖31)。控制器162、164可經構造以將組織穿透器118、120穿過中心導管組織穿透器內腔140、142及穿過組織穿透器呈遞管孔152、154之操作移動轉換成受控線性移動。在一實施例中，存在可朝一方向上手動移動之旋轉控制器162、164，以使得組織穿透器遠側末端處之組織穿透器注射尖端156、158可相鄰定位以自組織穿透器管遠側末端148、150處之組織穿透器管孔152、154延伸出所需長度。藉由使控制器在相反方向上旋轉，可將組織穿透器118、120退回組織穿透器管孔152、154中。操作移動至線性移動控制器162、164各自可具有與延伸穿過組織穿透器118、120之內部孔連通且可用於連接含有診斷劑或治療劑之溶液之注射器或管的輪彀166、168。
外部調度管122具有圍繞中心導管112、組織穿透器呈遞管114、116及中間導軌132之管狀長度。調度管122可安裝在中心導管組件112及該對組織穿透器呈遞管114、116上，以滑動移動至調度管之敞開遠側末端172與組織穿透器呈遞管114、116之遠側末端148、150相鄰定位之處的調度管122之前方位置(如圖27中所示)及管遠側末端172鄰接組織穿透器呈遞管114、116與中心導管組件112之連接定位之處的調度管122之後方位置(如圖28中所示)。調度管122之相對近側末端174可具有機械連接176至中心導管112。機械連接176使調度管122能夠在其相對於中心導管112及組織穿透器呈遞管114、116之前方及後方位置之間移動(圖27及28)。此類連接可藉由指輪、滑動連接、觸發器或按鈕或可手動操作以使調度管122相對於中心導管112及呈遞管114、 116移動之一些其他連接來提供。當使調度管122移至圖27中所示之其前方位置時，管遠側末端172越過組織穿透器呈遞管114、116之長度且將呈遞管移動至其沿中心導管中間導軌132之對側延伸之約束位置。當使調度管122移至圖28中所示之其後方位置時，使調度管之遠側末端172沿組織穿透器呈遞管114、116之長度退回且逐漸允許呈遞管114、116釋放其約束能量且移至圖28中所示之其彎曲無約束組態。
在使用導管110時，調度管122處於圖27中所示之前方位置。導線130以已知方式定位於生物管道(諸如，動脈或靜脈)中。接著將導管沿導線推進至生物管道中。導線130自生物管道延伸，且經由導線內腔128進入中心導管組件遠側末端126。線130通過中心導管112之長度且出現在與導管埠144、146鄰接之中心導管組件之近側末端處，其中導線130可手動操縱。
導管110可行進穿過生物管道且可由導線130引導。可視情況於總成上不透射線之標誌以監測總成於生物管道中之位置。防止電磁輻射通過之任何材料視為不透射線且可使用。適用不透射線材料包括(但不限於)鉑、金或銀。可將不透射線材料塗佈在尖端126之全部或一部分的表面上、呈遞管114、116之全部或部分上、組織穿透器118、120之全部或部分上、導線130上或上述結構之任何組合上。或者，可將不透射線材料之環附接至尖端126。總成視情況可具有機載成像，諸如血管內超音波或光學相干斷層攝影。總成尖端視情況可具有適用於測定總成位置或周圍生物管道特徵之光學裝置。當總成處於所需位置時，外部調度管122可藉由手動操縱機械連接176自圖27中所示之其前方位置移至圖28中所示之其後方位置。
當使調度管122沿該對組織穿透器呈遞管114、116撤回時，組織穿透器呈遞管114、116之約束能量釋放且管移向圖28中所示之其無約束彎曲組態。此移動使組織穿透器管遠側末端148、150上之組織穿透 器孔152、154定位抵靠經總成110插入之生物管道之內表面。
接著可手動操作操作移動至線性移動控制器162、164以使組織穿透器遠側末端156、158自組織穿透器呈遞管遠側末端148、150上之組織穿透器孔152、154延伸。一計量器可提供於各操作移動至線性移動控制器162、164上，其在控制器162、164旋轉時提供組織穿透器尖端156、158自組識穿透器管末端148、150突出程度之可見指示。控制器亦可提供可聽聲音或可觸感覺，諸如發出卡嗒聲，以指示組織穿透器移動之增量距離步進。此使組織穿透器尖端156、158部署所需距離至生物管道之壁中。
在第三特定實施例中，本發明之醫藥設備為包含一或多個由可撓性彈性材料構造之組織穿透器的流體傳遞導管。在某些態樣中，本發明之醫藥設備具有中心縱軸，且包含一或多個組織穿透器，其中該一或多個組織穿透器可以約束組態存在，在該約束組態中該一或多個組織穿透器之長度經定向實質上平行於該醫藥設備之縱軸，且該一或多個組織穿透器可以無約束組態存在，在該無約束組態中該一或多個組織穿透器之至少一部分長度經定向實質上不與設備中心縱軸平行。在設備經定位於與生物管道之壁鄰接的目標位點後，一或多個組織穿透器(及必要時所有組織穿透器)可自約束組態釋放且被允許採用無約束組態，從而與生物管道之壁接觸。一或多個組織穿透器可具有任何形狀，且在較佳實施例中，一或多個組織穿透器自約束組態移動至無約束組態在由設備操作人員釋放約束力之後發生，但未由操作人員輸入任何變形力至設備或目標組織。
在一較佳實施例中，組織穿透器由可撓性彈性材料構造，該材料能夠在施加約束力之後，例如在組織穿透器處於約束組態時，受到約束，且在移除約束力時，例如在組織穿透器處於無約束組態時，採用其原始無約束形狀。可使用任何可撓性彈性材料，包括(但不限於)外 科工具用鋼、鋁、聚丙烯、烯系材料、聚胺基甲酸酯及其他合成橡膠或塑膠材料。一或多個組織穿透器最佳由形狀記憶材料構造。該等形狀記憶材料之實例包括(但不限於)銅-鋅-鋁-鎳合金、銅-鋁-鎳合金及鎳-鈦(NiTi)合金。在一較佳實施例中，形狀記憶材料為鎳鈦諾。在一較佳實施例中，當組織穿透器採用無約束組態時，在未施加任何外部變形力之情況下形成各組織穿透器之材料之形狀記憶性質使組織穿透器自實質上平行於醫藥設備之縱軸之位置移至實質上垂直於醫藥設備之縱軸之位置。
在一較佳實施例中，藉由具有圍繞組織穿透器之管狀組態的外部導管組件使組織穿透器維持於約束組態。在外部導管組件與組織穿透器所附接之中心導管組件之間提供機械連接。機械連接使外部導管組件能夠沿中心導管組件之長度向後移動，從而揭開受約束之一或多個組織穿透器且允許該一或多個組織穿透器採用使其與目標傳遞位點接觸之無約束組態。一般技術者應瞭解，此特定實施例可易於經改適以併入不透射線標誌以便於定位設備或併入快速交換元件以便於使用設備。
本發明之醫藥設備在其各種實施例中允許將流體傳遞至血管壁之不同層中。血管壁由大量結構及層組成，包括內皮細胞層及基底膜層(共同為內膜層)、內部彈性膜、中層及外膜層。如美國專利申請公開案第2006/0189941A1號中所述，此等層經排列，以使得內皮暴露於血管之內腔，且基底膜、內膜、內部彈性膜、中層及外膜各自在內皮上連續分層。使用本發明之醫藥設備，可藉由旋轉控制器162、164來控制組織穿透器尖端156、158可刺入目標組織之厚度。舉例而言，若目標層為外膜層，則釋放管114、116之受約束能量，管採用圖28中所示之其無約束彎曲組態，且使用控制器使組織穿透器尖端156、158行進足以穿透至外膜層厚度之長度。同樣，若目標層為中層，則釋放管 114、116之受約束能量，管採用圖28中所示之其無約束彎曲組態，且使用控制器使組織穿透器尖端156、158行進足以穿透至中層厚度之長度。
隨著組織穿透器嵌入生物管道之壁之所需層中，接著可經由組織穿透器118、120傳遞流體。當流體傳遞完成時，可操作控制器162、164以將組織穿透器尖端156、158撤回至組織穿透器呈遞管114、116之內部孔152、154中。接著可將調度管122移至其前方位置，在此位置中調度管遠側末端172將組織穿透器呈遞管114、116移回至圖27中所示之其約束位置。當調度管122已移至圖27中所示之其完全前方位置時，總成可經重新定位或離開身體。
本發明之醫藥設備亦允許將流體傳遞至生物管道之壁內部或生物管道之壁中的斑塊沈積物。
本發明之醫藥設備亦允許將流體傳遞至位於生物管道之外壁外部的細胞外隙或組織(例如，傳遞至血管外表面或傳遞至與血管外表面相抵定位之肌肉，諸如心肌)。
本發明之設備之一有利特徵在於，根據致動器之設計，在其部署於生物管道中後致動器與少於全部的生物管道內壁之圓周接觸。在較佳實施例中，致動器與少於100%的其所部署之生物管道之內壁圓周接觸。更佳地，致動器與少於75%、50%或25%的其所部署之生物管道之內壁圓周接觸。最佳地，致動器與少於10%、5%、2.5%、1%、0.5%或0.1%的其所部署之生物管道之內壁圓周接觸。
可使用該等設備來將包含多種治療劑及/或診斷劑之流體傳遞至生物管道壁。治療劑包括(但不限於)蛋白質、化學物質、小分子、細胞及核酸。藉由設備傳遞之治療劑可包含微粒子或奈米粒子，與微粒子或奈米粒子錯合，或與微粒子或奈米粒子結合。蛋白質劑包括彈性蛋白酶、抗增生劑及抑制血管痙攣之藥劑。特定涵蓋該等設備用於傳 遞彈性蛋白酶之用途。若干公開專利申請案(WO 2001/21574；WO 2004/073504；及WO 2006/036804)教示單獨及與其他藥劑組合之彈性蛋白酶有益於治療生物管道之疾病(包括生物管道阻塞及血管痙攣)。診斷劑包括(但不限於)造影劑、微粒子、奈米粒子或其他成像劑。
多種不同流體傳遞方法可使用設備來實施。在某些應用中，不同流體可經由設備之各組織穿透器同時或依序傳遞。在其他應用中，同一流體可經由兩個組織穿透器同時或依序傳遞。亦涵蓋第一流體經由兩個組織穿透器傳遞接著第二流體經由兩個組織穿透器傳遞之實施例及/或方法。
亦特定涵蓋使用設備將流體傳遞至生物管道之壁中或穿過生物管道之壁的方法。此等方法包含以下步驟：將設備引入生物管道中；使設備行進至管道內之目標位點；將致動器自其約束位置釋放；視情況使組織穿透器行進穿過致動器中之內腔以穿透所需深度至生物管道之壁中；將至少一流體傳遞至壁中或穿過壁；視情況將組織穿透器返回至致動器之內腔中；將致動器收回至其約束位置；若需要，則將設備重新定位於同一或不同管道中以傳遞其他流體；及將設備自管道移除。
6.實例
此部分描述產生用於臨床用途(例如，用作擴大血管直徑及從而擴大血管內腔之藥劑)之重組I型彈性蛋白酶之方法。人類I型胰腺彈性蛋白酶展示與整個豬I型胰腺彈性蛋白酶之全長具有89%胺基酸一致性，其中"催化三元體"及受質特異性確定殘基完全保守。豬I型彈性蛋白酶最初經合成為無酶活性酶原，其經胰蛋白酶活化，產生含有4個內部二硫鍵且不含糖基化之成熟酶(參見Shotton,1970,Methods Enzymol 19：113-140,Elastase；及Hartley及Shotton,1971,Biochem.J.124(2)：289-299,Pancreatic Elastase.The Enzymes 3：323-373及其中之 參考文獻)。
以下實例示範適於用於非臨床及臨床研究及商業醫藥用途之此等酶的cGMP製備之有效及可縮放重組豬及人類I型彈性蛋白酶表現及純化流程的發展。成熟豬彈性蛋白酶稱為PRT-102。成熟人類I型彈性蛋白酶稱為PRT-201。
6.1 術語及縮寫
如本文所用之術語PRT-101、PRT-102、PRT-201及原PRT-201將意謂以下含義：PRT-101：豬胰腺彈性蛋白酶。除非另外指示，否則實例中所用之豬胰腺彈性蛋白酶為購自Elastin Products Company,Inc(Owensville,MO，目錄號EC134)之經高度純化豬胰腺彈性蛋白酶。
PRT-102：成熟重組I型豬胰腺彈性蛋白酶。應注意具有名稱"pPROT101-XXX"之載體編碼PRT-102。
PRT-201：成熟重組I型人類胰腺彈性蛋白酶。
原PRT-201：含有肽原序列之重組人類I型胰腺彈性蛋白酶之酶原形式。
以下縮寫用於申請案之部分6中：
BKGY：經緩衝之甘油複合培養基
BKME：經緩衝之甲醇複合培養基
CHO：中國倉鼠卵巢
大腸桿菌：大腸埃希氏菌(Escherichia coli)
ELA-1：I型胰腺彈性蛋白酶
HEK：人類胚腎
hELA-1：人類ELA-1
HIC：疏水性相互作用層析
MBP：麥芽糖結合蛋白
pELA-1：豬ELA-1
巴斯德畢赤酵母：甲醇酵母
PCR：聚合酶鏈反應
PMSF：苯甲基磺醯基氟
RP：逆相
釀酒酵母：啤酒酵母(saccharomyces cerevisiae)
SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳
SEC：尺寸排除層析法
USP：美國藥典
YPDS：酵母萃取物腖右旋糖山梨糖醇培養基
6.2 實例1：彈性蛋白酶DNA合成
人類彈性蛋白酶-1編碼序列獲自美國專利第5,162,205號(Takiguichi等人，1992)。進行若干序列改變以便於選殖至表現載體中(圖1A)。鹼基改變屬於遺傳密碼之簡并性範疇，因此未改變胺基酸殘基。將第二終止密碼子直接添加在天然終止密碼子後方以將潛在核糖體通讀(read through)減至最少。
藉由Blue Heron Biotechnology(Bothell,WA)使用非PCR "長寡核苷酸(long oligo)"技術在來自Amgen(Thousand Oaks,CA)之許可下合成經修飾之編碼序列。將重組DNA(稱為ELA-1.2A(SEQ ID NO：81))選殖至載體Blue Heron pUC(pUC119之衍生物)中，且所得質體稱為pPROT1。將pPROT1之兩條鏈定序以證實正確序列。兩條鏈上具有大量重疊之高品質定序資料允許明確指定整個序列上的鹼基，該整個序列由最少4個定序反應覆蓋，其中各鏈至少一個反應。
6.3 實例2：PRT-201在大腸桿菌中之表現
努力嘗試多種表現策略以在大腸桿菌中獲得可溶性及酶活性人類彈性蛋白酶。
一組大腸桿菌表現載體包含人類I型胰腺彈性蛋白酶(ELA-1)與麥芽糖結合蛋白(MBP)之羧基末端之同框融合，麥芽糖結合蛋白之羧基末端又與N末端分泌肽融合。選殖呈與質體pMAL-p2G(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)之MBP編碼序列的同框C末端融合體形式之人類ELA-1成熟與酶原編碼序列兩者以產生pPROT3(成熟ELA-1)或pPROT5(ELA-1酶原)。藉由首先藉由PCR突變誘發獲得具有位於成熟人類ELA-1之N末端纈胺酸密碼子處之SnaBI位點及位於成熟ELA-1終止密碼子之3'之HindIII位點的6.6kb成熟人類ELA-1編碼片段，來實現pPROT3之構築。此PCR突變誘發使用包含ELA-1.2A編碼序列(SEQ ID NO：81)及兩個寡核苷酸引子(5' ATC TAC GTA GTC GGA GGG ACT GAG GCC，SEQ ID NO：75；及5' gtc gac aag ctt atc agt tgg agg cga t，SEQ ID NO：76)之pPROT1模板。將所得6.6kb PCR片段分離，用SnaBI及HindIII消化，且接著選殖至經XmaI/HindIII消化之pMAL-p2G載體中以產生pPROT3。藉由自pPROT1選殖ScaI/HindIII片段且連接至經SnaBI及HindIII消化之pMAL p2G載體中，來實現pPROT5之構築。在pPROT5中所得融合體使人類ELA-1酶原編碼區之N末端可操作性連接於pMAL-p2G之MBP之C末端。人類ELA-1蛋白原之胰蛋白酶裂解域保存在pPROT5中。
將大腸桿菌菌株TB1以pPROT3及pPROT5轉型且接著用IPTG誘導以確定是否可產生融合蛋白或酶活性人類ELA-1。在pPROT3之狀況下，所產生之所有MBP-ELA-1融合蛋白不可溶。在藉由滲壓衝擊經誘導之含pPROT3大腸桿菌而獲得之周質物質中，未偵測到可溶性或酶活性MBP-ELA-1融合蛋白。在pPROT5之狀況下，經由使用SDS-PAGE及考馬斯(Coomassie)染色或藉由使用用於西方墨點法之抗MBP抗體(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)，可在藉由滲壓衝擊經誘導之含pPROT5大腸桿菌而獲得之周質物質中偵測到低含量可溶性 重組MBP-proELA-1蛋白質。可將可溶性重組MBP-proELA-1蛋白質以胰蛋白酶消化以產生MBP與成熟人類ELA-1。接著使用SLAP肽受質，檢定自pPROT5誘導獲得之成熟人類ELA-1的彈性蛋白酶活性。在pPROT5周質萃取物中觀測到彈性蛋白酶活性。此彈性蛋白酶酶活性視胰蛋白酶活化而定(亦即，在胰蛋白酶不存在之情況下未觀測到活性且活性量隨胰蛋白酶活化之時期增加而增加)。此外，彈性蛋白酶活性視pPROT5而定，此係因為在用胰蛋白酶並行處理之pMAL-p2G載體對照萃取物中未觀測到活性。最終，藉由PMSF(一種已知之絲胺酸蛋白酶抑制劑)抑制pPROT5彈性蛋白酶活性。
接著將重組MBP-proELA-1融合蛋白純化且用胰蛋白酶裂解以獲得酶活性pPROT5來源之成熟人類ELA-1。首先以葡哌喃聚醣親和力層析純化融合蛋白，接著以麥芽糖溶離。接著用經固定胰蛋白酶處理經純化之MBP-proELA-1。在胰蛋白酶活化步驟之後，藉由陽離子SP瓊脂糖層析純化經裂解之MBP-proELA-1。然而，使用經親和力純化之pPROT5來源之成熟人類ELA-1的後續實驗指示僅極有限量之可溶性及酶活性彈性蛋白酶可自含有pPROT5之大腸桿菌獲得。此外，經親和力純化之pPROT5來源之成熟人類ELA-1的比活性極低，在0.27至0.38U/mg之範圍內(U=每分鐘水解之SLAP受質的微莫耳數)。
亦追求在大腸桿菌中獲得可溶性及酶活性ELA-1之一替代性策略。簡言之，構築編碼蛋白質融合體之pPROT8載體，該蛋白質融合體包含大腸桿菌lacZα次單元之前8個胺基酸殘基加上聚連接子編碼殘基之5個胺基酸，接著為人類ELA-1 N末端酶原。此載體係藉由將含有來自pPROT1(亦即，含有ELA-1.2A序列之載體；SEQ ID NO：81)之人類ELA-1編碼序列之BamHI/NcoI片段連接至經BamHI/NcoI消化之pBlueHeron pUC(Blue Heron Biotechnology,Bothell,WA,USA)中來構築。
將大腸桿菌菌株EC100(EPICENTRE Biotechnologies,Madison,WI)以pPROT8轉型且接著用IPTG誘導以確定是否可產生融合蛋白或酶活性人類ELA-1。在EC100轉型之細胞的狀況下，所有產生之pPROT8來源之LacZ-proELA-1融合蛋白均不可溶(亦即，存在於包含體中)。接著將在trxB及gor基因中含有突變之大腸桿菌菌株(OrigamiTM菌株，Takara Mirus Bio,Inc.,Madison,WI)以pPROT8轉型，此係因為已知在此等編碼序列中具有突變之大腸桿菌菌株促進可溶性及酶活性重組蛋白質之回收。雖然在用IPTG誘導後，在trxB/gor大腸桿菌菌株中回收到某些可溶性pPROT8來源之LacZ-proELA-1融合蛋白，但使用胰蛋白酶不可將其轉化為酶活性人類ELA-1。
6.4 實例3：PRT-201在哺乳動物細胞株中之表現
努力嘗試若干表現策略在哺乳動物細胞株中獲得可溶性及酶活性人類I型胰腺彈性蛋白酶(ELA-1)。含有CMV啟動子之高複本哺乳動物表現載體pcDNA3.1(Invitrogen)用作兩種人類ELA-1彈性蛋白酶表現載體pPROT30及pPROT31之主鏈。為構築pPROT30，藉由PCR將人類ELA-1酶原序列擴增且與併入正向PCR引子中之豬胰腺彈性蛋白酶信號序列融合。使用併入PCR引子中之限制位點，將PCR產物消化且使用pcDNA3.1載體中之相應限制位點進行連接。以類似方式構築pPROT31，其中例外為使用人類ELA-1成熟編碼序列而非酶原編碼序列以嘗試直接表現成熟酶。將大腸桿菌以連接反應轉型且選擇純系以供小規模製備篩檢。基於為求正確插入而預期之限制消化模式，選擇各表現載體之一個純系。針對各純系製備質體DNA且藉由DNA定序來證實表現載體編碼序列。
將哺乳動物細胞株CHO、COS、HEK293及HEK293T分別用pPROT30及pPROT31瞬間轉染。數天後，收穫細胞培養上清液且藉由西方墨點法分析其人類ELA-1蛋白原(pPROT30)或成熟蛋白質 (pPROT31)表現。抗豬胰腺彈性蛋白酶多株抗體與pPROT30上清液中人類ELA-1蛋白原及pPROT31上清液中成熟人類ELA-1蛋白質之預期分子量譜帶交叉反應。
藉由SLAP檢定分析pPROT30及pPROT31上清液之彈性蛋白酶活性。對於pPROT30而言，首先用胰蛋白酶處理上清液以將酶原轉化為成熟PRT-201。使用SLAP檢定未在任一載體之任何上清液中偵測到彈性蛋白酶活性。
6.5 實例4：胰蛋白酶活化之PRT-201在巴斯德畢赤酵母中之表現
用於巴斯德畢赤酵母分泌型表現之載體PV-1由Blue Heron合成且用以首先選殖野生型人類ELA-1編碼序列。PV-1載體經設計以供簡單選殖、選擇及高水準表現重組蛋白質。該載體含有ZeocinTM抗性基因以供直接選擇多複本整合子。彈性蛋白酶肽原之N末端與包含如圖1B中所示之酵母分泌信號、肽原及間隔子序列之酵母α-交配型序列的融合允許所表現之蛋白質分泌於培養基中。所分泌之彈性蛋白酶蛋白原可易於與細胞小球分離，此為通向純化之實質性第一步。此外，選擇含有胰蛋白酶裂解位點之人類ELA-1之酶原形式用於表現以避免直接表現成熟活化酶，該直接表現可能導致蛋白質錯誤摺疊或對表現重組酶之細胞的毒性。
選殖表現構築體pPROT24-V以指導ELA-1酶原之表現如下實現。藉由PCR(Expand高保真PCR系統，Roche,Indianapolis,IN)自Blue Heron pUC ELA-1擴增人類ELA-1編碼區(SEQ ID NO：81)。20F正向引子中併有XhoI位點(5'-ggctcgagaaaagagaggctgaagctactcaggaccttccggaaaccaatgcccgg-3；SEQ ID NO：35)。24R引子中併有SacII位點(5'-gggccgcggcttatcagttggaggcgatgacat-3'；SEQ ID NO：36)。將所得PCR產物經凝膠純化且選殖至pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。使用XhoI及 SacII將ELA-1編碼序列分離，經凝膠純化，且選殖至PV-1載體之彼等位點中以產生pPROT24-V(圖3)。
將pPROT24-V連接產物在大腸桿菌菌株TOP10中擴增。將細胞混合物塗在補充有25微克/毫升博萊黴素之低鹽LB盤上。製備DNA質體(Qiagen,Valencia,CA)且藉由限制消化鑑別人類ELA-1插入物。藉由使用多個重疊反應將經純化超純DNA之雙鏈定序來證實pPROT24編碼序列。高品質定序資料允許明確指定鹼基且證實正確編碼序列。製備pPROT24-V/TOP10之甘油儲備液且將其儲存在-80℃下。
使用自美國農業部(United States Department of Agriculture；USDA,Peoria,IL,USA)獲得之野生型NRRL Y-11430巴斯德畢赤酵母菌株以供轉型。使用SacI將來自pPROT24-V之質體DNA線性化且藉由在瓊脂糖凝膠上進行反應小等分試樣之電泳來證實完全消化。使用電穿孔以用pPROT24-V質體DNA轉型巴斯德畢赤酵母。將細胞混合物塗在含有100微克/毫升博萊黴素之YPDS盤上。三天後，菌落開始形成且經若干多天選擇用於在新鮮盤上再劃線接種。
一般而言，篩檢藥物抗性轉型體在1L擋板瓶中之表現。使用單一菌落來接種200mL BKGY培養基。BKGY溶液之組成如下：10g/L甘油、具有硫酸銨而無胺基酸之13.4g/L酵母氮鹼(Invitrogen)、20g/L大豆腖、10g/L酵母萃取物、於0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 5.0)中之0.4mg/L生物素。使培養物在以275rpm震盪下於28℃下生長2天。在室溫下藉由在650 x g下離心10min，使培養物成球團。藉由以1g濕細胞比5mL誘導培養基之比率再懸浮小球，將細胞小球用BKME誘導培養基(pH 5.0)再懸浮。將50mL細胞懸浮液置放於500mL無擋板瓶中以獲得細胞懸浮液與燒瓶體積之1：10比率。將細胞在22℃下在以275rpm震盪下培育1-3天。在誘導過程中，每天補充於誘導培養基中之甲醇兩次至0.5%之最終濃度。
為篩檢表現，獲取1mL等分試樣，將其轉移至1.5mL微量離心管且在微量離心機中在20,000 x g下離心5min。將上清液轉移至新鮮管中且儲存在-80℃下。為進行SDS-PAGE分析，將上清液等分試樣解凍且與用還原劑β-巰基乙醇補充至5體積%之4X Laemmli緩衝液混合。將樣品煮沸5min，輕輕離心，且加樣至標準電泳系統(Bio-Rad)中8-16%梯度Tris-HCl預澆鑄凝膠上。電泳後，將凝膠用考馬斯染色且分析其人類ELA-1酶原之表現。選擇純系201-24-266-VU作為用於進一步評估之高產率純系。製備由201-24-266-VU甘油儲備液組成之發育細胞庫且將其儲存在-80℃下。
對於使用純系201-24-266-VU擴大產生人類ELA-1酶原而言，一般根據下文所述之方法，執行多輪製備。適用時，注意該等方法中之批次間變化。
為進行細胞培養，將一系列含有500mL BKGY生長培養基之2L擋板震盪瓶(通常在20到40個燒瓶之範圍內)用250微升解凍201-24-266-VU甘油儲備液接種。使培養物在250-300rpm下之震盪恆溫箱中於28℃下生長2天。2天後，藉由離心使細胞成球團，且棄去上清液。 以1g重量之細胞比5mL培養基之比率，將細胞再懸浮於BKME誘導培養基(pH 5.0)中。將200-400mL體積之細胞懸浮液置放於2L無擋板瓶中且在震盪恆溫箱(250-300rpm)中於22℃下培養3天。在誘導過程中，每天補充於培養基中之甲醇兩次，至0.5%體積。在誘導結束時，將震盪瓶培養物離心以使細胞成球團。將上清液移除且即刻在室溫下經由0.22μm聚醚碸膜使用1L真空過濾單元過濾以移除任何剩餘細胞碎片。將濾液儲存在2-8℃下至多1.5個月。基於HIC-HPLC分析，經淨化上清液中自純系原PRT-201-24-266-VU產生之人類ELA-1酶原的產率通常為200至250mg/L。
自上清液捕獲原PRT-201-24-266-VU如下實現。首先，將來自多 輪震盪瓶培養物(通常4至10輪)之上清液組合(通常總共8至25L)，以水稀釋8倍且用1M HCl調整至pH 5.0。接著在2-8℃下以100mL/min之速率(線性流動速率為76cm/hr)將經稀釋上清液加樣至經平衡2L床體積Macro-Prep High S離子交換捕獲管柱上。層析程式包含以下步驟：1.以100mL/min(76cm/hr)用10L(5管柱體積[CV])緩衝液A(20mM檸檬酸鈉，pH 5.0)洗滌管柱；2.以100mL/min(76cm/hr)用4L(2 CV)形成50mM氯化鈉、20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)之最終緩衝液組成的90%緩衝液A與10%緩衝液B(500mM氯化鈉；20mM檸檬酸鈉，pH 5.0)之混合物洗滌管柱；3.以100mL/min(76cm/hr)用6L(3 CV)形成100mM氯化鈉、20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)之最終緩衝液組成的80%緩衝液A與20%緩衝液B之混合物洗滌管柱；4.以100ml/min(153cm/hr)用6L(3 CV)自75%緩衝液A及25%緩衝液B開始至68%緩衝液A及32%緩衝液B之線性梯度洗滌管柱；5.以100ml/min(76cm/hr)用30L(15 CV)自68%緩衝液A及32%緩衝液B開始至0%緩衝液A及100%緩衝液B之線性梯度溶離。溶離液收集於各為500-1000mL之溶離份中。
圖4中展示，通常相繼藉由SDS-PAGE及考馬斯染色觀測到2種主要蛋白質物質：糖基化人類ELA-1酶原及非糖基化人類ELA-1酶原，如藉由後續LC/MS分析所測定，通常在約320mM氯化鈉下溶離。在某些製備操作中，觀測到少量稍小於人類ELA-1酶原之蛋白質物質。對此等溶離份之後續LC/MS分析展示大部分蛋白質並非全長酶原，而是在N末端缺乏數個胺基酸。使此等N末端變異體經純化且經受彈性蛋白酶活性分析，此揭示其具有比全長PRT-201低之彈性蛋白酶活性。N末端變異體可由在細胞培養及捕獲層析操作期間展示低水準彈性蛋白酶活性且經由分子內反應自身裂解或經由分子間反應裂解另一人類ELA-1酶原分子之人類ELA-1酶原產生。此等操作期間之次最佳裂解條件可導致對酶原之高水準錯誤裂解(有時稱為自發或不受控轉 化)，主要產生N末端變異體而非完整全長PRT-201。
在檢查SDS-PAGE結果之後，將溶離份子集彙集以獲得經純化非糖基化原PRT-201用於進一步處理。含有糖基化酶原或全長PRT-201及/或N末端變異體之溶離份(其在SDS-PAGE上共遷移)通常排除在彙集之外。通常將經彙集之原PRT-201儲存於2-8℃下5L塑膠燒杯中，歷時數小時至隔夜，接著自酶原轉化為成熟酶。
藉由經固定胰蛋白酶將原PRT-201轉化為成熟PRT-201如下實現。將彙集之原PRT-201溶離份在20mM磷酸鈉(pH 5.0)中於2-8℃下透析隔夜。此步驟移除抑制胰蛋白酶之檸檬酸鹽。透析之後，使原PRT-201流經固定於瓊脂糖珠粒之經20mM磷酸鈉(pH 5.0)預平衡之重組胰蛋白酶(TrypZean)管柱。通常原PRT-201與經固定TrypZean之間的接觸時間在3.5至5min之間。藉由SDS-PAGE分析所得轉化後物質以證實轉化且接著將其加樣於Macro-Prep High S精煉管柱上。將管柱用5 CV 20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)、2 CV 20mM檸檬酸鈉、50mM氯化鈉(pH 5.0)及3 CV 20mM檸檬酸鈉、100mM氯化鈉(pH 5.0)依次洗滌。用於20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)中之125mM氯化鈉至160mM氯化鈉之線性梯度進一步洗滌管柱。將PRT-201以於20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)中之165mM至500mM氯化鈉之線性梯度溶離，且收集於溶離份中。相繼藉由SDS-PAGE及考馬斯染色，分析溶離份之蛋白質，且藉由SLAP檢定分析溶離份之彈性蛋白酶活性。通常，彙集具有90%比活性或大於具有最高比活性之溶離份之比活性的溶離份。在隨後LC/MS分析中，發現具有較低比活性之後期溶離溶離份富含PRT-201 N末端變異體。
將具有高比活性之經彙集溶離份滲濾至包含0.1X PBS(13.7mM氯化鈉、1mM磷酸鈉、0.27mM磷酸鉀)之調配緩衝液(pH 5.0)中。在PRT-201之濃度達到1mg/mL之後，將pH值調整至7.4。接著將溶液等分至具有彈性體塞子之玻璃血清小瓶中，且凍乾。通常使用在-30℃ 至-50℃下第一次乾燥循環及在-15℃下第二次乾燥循環進行凍乾。凍乾後，將小瓶在真空下塞住且用鋁密封件包裹。接著通常將小瓶儲存在2-8℃或-80℃下。
為評估小瓶中經凍乾PRT-201之穩定性，將製成無菌GMP藥品之兩種批料用於穩定性程式。穩定性程式由使藥品在-15℃下儲存及週期性移除小瓶子集以藉由以下指示穩定性之分析方法進行測試組成(標準在圓括號內)：經凍乾物質之外觀(白色至灰白色粉末)、復水後外觀(不含粒子之無色澄清溶液)、藉由SLAP檢定分析之比活性(25-45U/mg)、藉由RP-HPLC分析之純度(總純度：不低於93%；個別雜質：不超過2%)、藉由還原SDS-PAGE分析之純度(不低於93%)、藉由非還原SDS-PAGE分析之純度(不低於93%)、顆粒物質注射液(與USP相符)、藉由SEC-HPLC分析之聚集體(不超過3%)、每小瓶含量(4.5-5.5mg)、pH值(6.5-8.5)、水分(不超過5%)及無菌性(與USP相符)。至此為止，兩種批料已在所測試之所有時間點符合指定標準(批次C0807117經由12個月及批次C1007132經由9個月)。此等結果指示當將PRT-201在小瓶中在-15℃下凍乾儲存時，其穩定至少12個月。
在原PRT-201之捕獲層析與轉化PRT-201之精煉層析兩者期間使用檸檬酸鈉(pH 5.0)係基於資料展示檸檬酸鈉抑制經純化PRT-201之彈性蛋白酶活性，且因此亦可能抑制處理操作期間原PRT-201及PRT-201之彈性蛋白酶活性的資料。該抑制可將原PRT-201自發轉化為N末端變異體減至最少且將PRT-201之自體降解減至最少。在SLAP檢定緩衝液含有115mM檸檬酸鈉(pH 5.0)之實驗中，PRT-201之比活性被抑制91%。
有時，來自原PRT-201捕獲管柱之經溶離物質未經受如上所述胰蛋白酶轉化，而用以獲得富含各種蛋白質物質之製劑。舉例而言，主要含有糖基化原PRT-201、非糖基化原PRT-201或由自發轉化產生之蛋 白質的溶離份池係由捕獲管柱溶離液製成。通常，將此等溶離份池滲濾至10mM磷酸鈉(pH 5.0)中，凍乾，且在-80℃下儲存。
進行一項研究以測定隨著時間過去pH值及溫度對經純化原PRT-201之穩定性的影響。將經凍乾原PRT-201在3.0至8.4之範圍內pH值下的10mM磷酸鈉中復水，接著在4℃或25℃下培育7天。7天後，如SDS-PAGE及考馬斯染色所示，在pH 4.0-8.0及25℃之條件下的原PRT-201樣品展示富含成熟PRT-201，成熟PRT-201隨pH值增加而增加。在pH 8.4及25℃之條件下，觀測到原PRT-201完全轉化為成熟PRT-201。在4℃、pH 4.0至8.4下之樣品展示極少或不轉化。在pH 3.0下，在4℃及25℃任一溫度下未觀測到轉化。已在文獻(Hartley及Shotton,1971,Pancreatic Elastase.Enzymes 3：323-373)中報導豬胰腺彈性蛋白酶在低於3.0之pH值下長期儲存後不可逆地失活。因此，基於此研究之此等結果且為避免使PRT-201不可逆失活，將經純化原PRT-201之轉化減至最少的適用條件為在4℃下pH 3.0-4.0之間儲存。
6.6 實例5：自體活化之PRT-201在巴斯德畢赤酵母中之表現
為獲得能夠自體活化之變異型酶原，從而消除對胰蛋白酶活化之需要，在小規模培養及轉化實驗中構築多種彈性蛋白酶裂解域變異型載體且加以分析。藉由pPROT24-V載體及後續衍生載體之定點PCR突變誘發來產生變異型載體。定點突變誘發係使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)進行。將大腸桿菌XL10-金色菌株用所得質體轉型。將經轉型細胞混合物塗在補充有25微克/毫升博萊黴素之低鹽LB盤上。挑選藥物抗性純系且製備質體DNA(Qiagen,Valencia,CA)。藉由使用多重重疊反應將肽原區域中之質體DNA之兩條鏈定序來證實純系之預期密碼子改變。將巴斯德畢赤酵母用變異型載體轉型且如先前實例中所述，選擇純系。
對所產生的彈性蛋白酶裂解域變異體之概述提供於下表4中：
對於上表4，"肽原序列名稱"之第一行清單對應於所指示彈性蛋白酶裂解域之SEQ ID NO。因此，24對應於SEQ ID NO：24之野生型胰蛋白酶裂解域。編號40-49、52-63分別對應於SEQ ID NO：40-49及52-63之變異彈性蛋白酶裂解域。
為培養變異型純系，一般按照前述實例中所述針對胰蛋白酶活化之201-24-266-VU純系發展之震盪瓶培養條件。測試使分泌至震盪瓶 上清液中之變異型蛋白原轉化為成熟PRT-201的若干方法。第一轉化策略由首先層析純化變異型酶原，接著在特定轉化緩衝液中受控裂解組成。因為與野生型酶原相比，變異型蛋白原中之胺基酸改變僅產生小的理論等電點改變，所以一般如前述實例中所述進行陽離子交換層析。藉由一般如前述實例中所述用水稀釋，或藉由濃縮，接著使用切向流動過濾至管柱加樣緩衝液中來滲濾上清液，自變異型純系培養物製備上清液以供層析。層析純化之後，相繼藉由SDS-PAGE及考馬斯染色來分析經溶離之溶離份。凝膠分析證明與起始上清液相比，溶離份中具有更大量之蛋白原轉化之成熟蛋白質，表明已發生大量自發蛋白原轉化。在隨後純化後，藉由LC/MS測定自發轉化之蛋白質主要由N末端變異體組成，該等N末端變異體在SLAP檢定中展示極低或無彈性蛋白酶活性。
第二轉化策略由在自培養上清液純化之前轉化變異型蛋白原接著層析純化成熟酶組成。首先在小規模檢定中測試此轉化策略且接著將此轉化策略按比例增大以適應較大轉化體積。對於小規模轉化而言，通常藉由在超離心過濾設備中在2-8℃下離心，將自變異型純系培養物淨化之上清液濃縮5倍。濃縮之後，將保留物用Tris緩衝液稀釋5倍至通常在8.0至9.0之pH值範圍中之100mM Tris-HCl之最終濃度。將樣品在室溫下在搖擺平台上培育。藉由SLAP檢定監測彈性蛋白酶活性，通常直至活性反應速度達到穩定期。在一些狀況下，反應速度增加如此緩慢，以至於SLAP監測在達到穩定期之前停止。藉由SDS-PAGE，分析經轉化樣品之蛋白質物質(例如，蛋白原及PRT-201/N末端變異體)。為按比例增大此轉化策略，使用切向流動過濾，接著用pH值在6.0至9.0之範圍內之100mM Tris-HCl滲濾，將含有變異型蛋白原之上清液濃縮10倍。藉由HIC-HPLC分析轉化反應隨時間之進展，其中對蛋白原、PRT-201及N末端變異體物質加以量化。當滲濾緩衝 液之pH值在8.0與9.0之間時，一般存在較高轉化速率。
表5中所列之彈性蛋白酶蛋白原在如所述之巴斯德畢赤酵母中表現，且如上文第二轉化策略中所述，在小規模轉化檢定中測試其進行自體轉化之能力。彼等研究之結果概述於下表5中：
在上表5中，"肽原序列名稱"之第一行清單對應於所指示彈性蛋 白酶裂解域之SEQ ID NO。因此，24對應於SEQ ID NO：24之野生型胰蛋白酶活化之彈性蛋白酶裂解域。編號40-49及52-63分別對應於SEQ ID NO：40-49及52-63之變異彈性蛋白酶裂解域。標記"震盪瓶產率"之管柱對應於如SDS-PAGE分析所測定，經3天誘導之培養上清液中相應蛋白原之量。標記"震盪瓶穩定性"之管柱對應於如藉由在SDS-PAGE分析上所見PRT-201/N末端變異體之量所測定，經3天誘導之震盪瓶培養基上清液中相應蛋白原之穩定性。標記"轉化速率"之管柱對應於如藉由實現最大SLAP反應速度之時間所指示，蛋白原轉化為PRT-201之相對速率(快：少於60分鐘；中：60至120分鐘；及慢：大於120分鐘)。使用上述小規模轉化檢定測定變異型蛋白原之轉化時程，且將其與藉由使用經固定胰蛋白酶活化所測定之24蛋白原之轉化時程相比較。標記"% N末端變異體"之管柱係指包含成熟彈性蛋白酶蛋白質之N末端變異體(亦即，包含在除P1以外之任何位點的C末端之鍵處裂解之變異體)之經轉化蛋白質的百分比。為說明表5中所用之相對等級評定系統，將自體活化變異體子集之SDS-PAGE、轉化速率及N末端變異體分析之實例展示於圖5中。
對各種變異體之分析揭示包含SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：55變異型彈性蛋白酶裂解域之彈性蛋白酶蛋白原提供具有優良品質(包括中至高之震盪瓶產率及低的轉化後變異體百分比)之自體活化彈性蛋白酶。對包含SEQ ID NO：48及SEQ ID NO：55變異型彈性蛋白酶裂解域之彈性蛋白酶蛋白原之進一步分析揭示相應蛋白原(亦即，分別為SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：69之彈性蛋白酶酶原)之自體活化僅產生一類在P'2殘基之C末端的肽鍵裂解的N末端變異體。對彈性蛋白酶蛋白原之進一步分析揭示包含SEQ ID NO：55變異型彈性蛋白酶裂解域之蛋白原比包含SEQ ID NO：48變異型彈性蛋白酶裂解域之蛋白原穩定。
使用具有42肽原序列(SEQ ID NO：6)之蛋白原進行初始實驗來優化用於受控裂解經純化原PRT-201之條件。使此經純化蛋白原經受在一組包括pH值(7.7至8.9)、緩衝液組成(0.4至10mM檸檬酸鈉)、蛋白質濃度(0.14至0.23mg/mL)及反應時間(5至24小時)之條件中的轉化。在轉化期結束時，藉由添加甲酸以將pH值降至3.0，使反應中止。各反應中蛋白質物質之相對量藉由質譜分析測定。基於此等結果，產生最低百分比之N末端變異體的轉化條件包括8.3之pH值、100mM Tris及少於1mM檸檬酸鈉之緩衝液組成、0.2mg/mL之蛋白質濃度及5至24小時之反應時間。在此研究中，僅分析反應結束時點。因此，未獲得關於轉化品質之即時資料，且最終結果可能反映N末端變異體之初期產量及彼等變異體降解之實質時間量。接著發展HIC-HPLC檢定以使得能夠即時監測轉化反應。進一步轉化優化研究(包括使用即時HIC-HPLC監測之彼等研究)描述於實例6中。
6.7 實例6：使用多複本變異型載體在巴斯德畢赤酵母中表現自體活化PRT-201
巴斯德畢赤酵母中重組基因之多複本整合已用以增加所需蛋白質之表現(參見例如Sreekrishna等人，1989,Biochemistry 28：4117-4125；Clare等人，1991,Bio/Technology 9：455-460；Romanos等人，1991,Vaccine 9：901-906)。然而，在某些情況下，自單複本載體整合子獲得之表現量高效且無法藉由多複本載體整合子來改良(Cregg等人，1987,Bio/Technology 5：479-485)。在巴斯德畢赤酵母中自發多複本質體整合事件以低頻率活體內發生。為獲得基因多複本之基因組整合及可能增加蛋白質表現，可使用活體外連接法來產生基因於表現載體中之串聯插入物，接著進行巴斯德畢赤酵母轉型。
為獲得pPROT55-V變異體之多複本整合子，使用活體外連接法來構築含有隨後用於巴斯德畢赤酵母轉型之pPROT55-V之多複本的載 體。為製備多複本載體，將pPROT55-V載體用BglII及BamHI消化以釋放編碼原PRT-201基因、AOX1啟動子及AOX1轉錄終止序列之2.3kb表現序列盒。接著將表現序列盒與經BamHI線性化且經小牛小腸鹼性磷酸酶(New England Biolabs,MA,USA)處理以防止自體連接之pPROT55-V載體製劑接合。將連接混合物在16℃下培育隔夜。將大腸桿菌TOP10菌株(Invitrogen,CA,USA)用連接反應轉型。將轉型混合物塗在存在25微克/毫升博萊黴素之低鹽LB上。挑選藥物抗性轉型體且製備質體DNA。
為測定所得純系中表現序列盒的數目，將質體DNA用BglII及BamHI消化且藉由瓊脂糖凝膠電泳使用DNA尺寸標準標誌進行分析。鑑別含有尺寸與3個2.3kb表現序列盒一致之單個確定插入物譜帶的純系且將其命名為pPROT55M3-V。使用限制酶定位來證實pPROT55M3-V載體之線性頭接尾多聚體形成的取向。圖6描繪pPROT55M3-V選殖流程。
對於轉型使用野生型巴斯德畢赤酵母菌株NRRL Y-11430，該轉型係如實例4中所述進行，其中例外為在轉型之前用BglII而非SacI將pPROT55M3-V載體線性化。如實例4中所述，培養藥物抗性轉型體且關於pPROT55M3蛋白原之表現進行篩檢。
進行震盪瓶培養條件之優化以使誘導期間的自發裂解減至最少。震盪瓶優化集中在2個變數：誘導溫度及誘導培養基組成。首先，發現對於所有測試之培養基組合物而言，與25℃相比，在22℃下進行誘導使培養上清液中酶原與成熟酶之比率較高。其次，在所有所測試檸檬酸鈉濃度(12.5至50mM)範圍內，添加檸檬酸鈉以增加誘導培養基之緩衝強度使得培養上清液中不存在自發轉化之成熟酶。圖7中說明隨著時間過去此等變數對蛋白原表現產率及震盪瓶上清液中穩定性之影響。
選擇高度表現之三複本純系201-55M3-003-VU，以使用針對如下所述之201-55-001-VU純系建立之醱酵程序進行擴大醱酵分析。藉由將一個細胞庫小瓶解凍且使用其接種含有500ml BKGY生長培養基(pH 5.7)之震盪瓶，來實現201-55-001-VU純系之醱酵。使種子培養物在28℃下在震盪下生長24小時，直至濕細胞重量為約40g/L。將含有BKGY生長培養基(pH 5.7)之醱酵器在高壓釜中滅菌。在培養基冷卻至28℃後，添加包括酵母氮鹼及生物素之補充物。將醱酵器以1：33之種子培養物與BKGY生長培養基之比率接種。
醱酵程序以28℃下pH 5.7下分批饋入甘油及甘油饋料開始。藉由10%磷酸及30%硫酸銨溶液控制pH值。將培養物以300-1000rpm攪動，通氣以控制溶解氧為40%。在初始甘油批料耗盡且溶解氧形成峰值，指示甘油自系統中耗盡之後，以131g/h饋入另外50%甘油，直至濕細胞重量較佳達到200g/L至300g/L之間。在濕細胞重量達到200g/L-300g/L後，立即用每公克濕生物質量0.025mL之甲醇批料啟始誘導。在甲醇批料耗盡及溶解氧升高後，藉由以每小時每公克濕細胞重量0.0034g甲醇之恆定饋料速率添加有限量之甲醇，繼續誘導。在恆定甲醇饋料開始時，醱酵肉湯之pH值自5.7變化至5.5且溫度自28℃變化至22℃。在誘導70小時後，收穫醱酵。
為測定單複本及3複本純系之相對產率，將含有一個單複本pPROT55-V載體之基因組整合子之純系201-55-001-VU與含有一個3複本pPROT55M3-V載體之基因組整合子之純系201-55M3-003-VU並行醱酵。醱酵如上所述進行，其中例外為在整個誘導期間將培養物之pH值維持為5.7。相繼藉由梯度SDS-PAGE及膠體藍染色分析自201-55-001-VU及201-55M3-003-VU醱酵收穫之上清液(圖8)，其展示與單複本201-55-001-VU純系相比，自多複本201-55M3-003-VU純系獲得較高蛋白原表現。藉由HIC-HPLC分析醱酵上清液中之蛋白原濃度證 實SDS-PAGE結果，該分析展示201-55M3-003-VU純系產生約600mg/L分泌型蛋白原，而201-55-001-VU純系產生約400mg/L。因此，與含有單個表現序列盒之單複本201-55-001-VU純系相比，含有三個表現序列盒之多複本201-55M3-003-VU純系多產生約50%之蛋白原。
使用由醱酵產生之201-55M3-003-VU上清液測試2種轉化策略。此等策略一般按照針對實例5中其他蛋白原變異體所述之策略，其中例外為其以較大規模執行。在第一策略中，藉由陽離子交換層析自上清液捕獲蛋白原，接著轉化成成熟蛋白質及精煉層析。在第二策略中，在純化之前將蛋白原轉化為成熟蛋白質，接著使用陽離子交換層析捕獲，延長轉化以移除N末端變異體，且進一步精煉層析。兩種策略亦包括在轉化後在pH 8.0下之緩衝液中延長培育之步驟以實現N末端變異體之選擇性降解。
使用第一策略，如下實現蛋白原之捕獲，接著轉化及PRT-201精煉純化。將201-55M3-003-VU上清液自醱酵培養物收穫且在-80℃下冷凍。在2-8℃下，將約7L經冷凍淨化上清液(來自上述201-55M3-003-VU醱酵的3.5L及來自一般如實例4及5中所述製備之201-55M3-003-VU震盪瓶培養物的3.5L)解凍且用去離子水及1M檸檬酸鈉(pH 4.3)稀釋8倍以獲得25mM檸檬酸鈉之最終濃度。將溶液pH值調整至4.7。在2-8℃下以76cm/hr將溶液加樣至2.3L床Macroprep High S陽離子交換管柱上。將管柱用5 CV之25mM檸檬酸鈉(pH 4.7)、接著5 CV之160mM氯化鈉、25mM檸檬酸鈉(pH 4.7)洗滌。以87ml/min(67cm/hr)，將蛋白原用15 CV自於25mM檸檬酸鈉(pH 4.7)中之160mM氯化鈉開始至500mM氯化鈉之線性梯度溶離。溶離液收集於溶離份中。藉由SDS-PAGE分析溶離份之蛋白質含量(圖9)。藉由SDS-PAGE觀測到少量自發轉化之蛋白質。將含有蛋白原之溶離份彙集，以供進一步處理。使所彙集之物質經受HIC-HPLC分析，其展示該物質由 92%蛋白原及8%成熟PRT-201組成。
為啟始轉化，在10-12℃下，使用恆定體積滲濾，使用切向流動過濾將所彙集之物質緩衝液交換成100mM氯化鈉、20mM Tris(pH 4.0)。使用再生纖維素膜、15psi之跨膜壓力、20L/min之交叉流動速率及800mL/min之通量進行切向流動過濾。以與通量相同之速率添加2-8℃之三個置換體積(diavolume)之緩衝液。隨後，以與通量相同之速率再添加環境溫度下之三個體積之緩衝液以使轉化溶液之溫度升至目標26℃。使用15psi跨膜壓力、1.2L/min交叉流動速率及76ml/min通量之條件，使用切向流動過濾將轉化溶液濃縮至1.5mg/mL之目標。然而，在濃縮程序開始約2分鐘後，觀測到意外沈澱且停止濃縮過程。藉由280nm下UV吸收率測定570mL之體積中轉化溶液之蛋白質濃度為1.1mg/mL。為將進一步沈澱減至最少，將轉化溶液用100mM氯化鈉、20mM Tris(pH 4.0)稀釋至1mg/mL，且經由0.22微米膜過濾。將16mL 3M Tris(pH 9.0)添加至轉化溶液中。將轉化溶液置放於26℃之水浴中。藉由HIC-HPLC分析監測轉化反應。30分鐘後，HIC-HPLC展示大部分蛋白原已轉化為PRT-201及某些N末端變異體(圖10)。1小時後，轉化反應由0%蛋白原、86%全長PRT-201及14% N末端變異體組成。將轉化物質再培育4個小時，在此期間HIC-HPLC分析展示轉化物質由98%全長PRT-201及2% N末端變異體組成。
將轉化物質用去離子水及1M檸檬酸鈉(pH 4.3)稀釋4倍至25mM檸檬酸鈉之最終濃度。將溶液pH值調整至5.0以準備加樣至精煉管柱上。以27mL/min(83cm/hr)將溶液加樣至600mL床Macroprep High S陽離子交換管柱上。將管柱用5 CV之20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)、接著5 CV之160mM氯化鈉、20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)洗滌。以87ml/min(67cm/hr)，將PRT-201用15 CV自於25mM檸檬酸鈉(pH 5.0)中之160mM氯化鈉開始至500mM氯化鈉之線性梯度溶離。溶離液收集於溶離份 中。藉由SDS-PAGE分析溶離份之蛋白質含量及藉由SLAP檢定分析比活性。將含有比活性30U/mg之PRT-201的溶離份彙集。藉由切向流動過濾將彙集之PRT-201溶離份滲濾至調配緩衝液(0.1X PBS,pH 5.0)中。將經滲濾之PRT-201之pH值調整至pH 7.4，且藉由切向流動過濾將蛋白質濃度調整至1mg/mL。如實例4中針對由201-24-266-VU純系產生之PRT-201所述，將小瓶填充且凍乾。
使用第二策略，如下相繼實現蛋白原轉化及PRT-201純化。將來自上述201-55M3-003-VU醱酵之約7L經冷凍淨化上清液解凍，且藉由使用含有100mM Tris(pH 8.0)之轉化緩衝液進行切向流動過濾，在環境溫度下使用再生纖維素膜進行恆定體積滲濾，啟始轉化反應。2個置換體積之100mM Tris-HCl(pH 8.0)足以將保留物之pH值自pH 5.0改變至8.0且實現轉化。亦藉由添加Tris鹼至100mM之最終濃度，將淨化上清液之pH值直接調整至8.0，且用1N氫氧化鈉將pH值調整至8.0來進行實驗。此導致形成沈澱及渾濁上清液，此可能歸因於肉湯組份沈澱，此為不合需要的。使用切向流動過濾之較佳轉化方法未產生沈澱。
藉由即時HIC-HPLC分析監測轉化反應。在啟始轉化後，原PRT-201在開始兩個小時內緩慢轉化為成熟PRT-201，接著加速轉化(圖11)。在4.5小時，轉化反應由約4%原PRT-201、75%成熟PRT-201及21% N末端變異體組成。在6.5小時，轉化反應由約1%原PRT-201、83%成熟PRT-201及16% N末端變異體組成。雖然自4.5h至6.5h N末端變異體自21%降低至16%可能歸因於全長活性PRT-201使N末端變異體降解，但此並不完全且不如在經純化之原PRT 201轉化期間所見之N末端變異體降低得快。在此第二策略中，由於上清液中競爭蛋白質競爭彈性蛋白酶之活性位點，所以延長轉化反應可能未能完全移除N末端變異體。為改良轉化反應，如下所述，將轉化後物質捕獲，且隨 後滲濾至合適緩衝液中以在pH 8.0下啟始延長轉化以選擇性降解N末端變異體。
如下實現自轉化物質捕獲PRT-201。將轉化物質緩衝液交換為20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)且加樣至Macro-Prep High S陽離子交換層析管柱上。將管柱用5 CV之20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)、接著5 CV之20mM檸檬酸鈉、160mM氯化鈉(pH 5.0)洗滌。用於20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)中之160mM氯化鈉至500mM氯化鈉之線性梯度溶離PRT-201。藉由SDS-PAGE分析溶離份之蛋白質含量，藉由HIC-HPLC分析N末端變異體，藉由在280nm下之UV吸收率分析蛋白質濃度，且藉由SLAP檢定分析彈性蛋白酶活性。如圖12中所示，藉由SDS-PAGE偵側到2個主要蛋白質譜帶，其對應於PRT-201及PRT-201糖型。如藉由SDS-PAGE所測定含有PRT-201糖型及如藉由HIC-HPLC所測定含有N末端變異體之溶離份排除在彙集之外。如藉由SLAP檢定所測定展示相對低比活性(小於30U/mg)之溶離份亦排除在彙集之外。將含有PRT-201之剩餘溶離份彙集以供進一步處理。對所彙集之溶離份的HIC-HPLC分析展示此物質由約98%全長PRT-201及1-2% N末端變異體組成。將所彙集之物質在2-8℃下儲存12-16h。
鑒於如上所述N末端變異體似乎在延長轉化期期間降低之先前觀測結果，使所彙集之PRT-201物質經受pH 8.0下之延長培育步驟。在環境溫度下藉由使用100mM Tris、300mM氯化鈉(pH 8.0)滲濾及切向流動過濾2.5小時進行延長培育。2.5小時後，如藉由HIC-HPLC分析所示，轉化物質由100%成熟PRT-201組成。使轉化物質經受滲濾及切向流動過濾至20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)中，以抑制彈性蛋白酶活性及準備進行管柱層析。將經滲濾之PRT-201物質在2-8℃下儲存約64小時。
如下實現PRT-201之精煉層析純化。將經滲濾之PRT-201物質加樣至Macro-Prep High S陽離子交換管柱上，且用5 CV緩衝液C(20mM檸 檬酸鈉，pH 5.0)接著5 CV 160mM氯化鈉、20mM檸檬酸鈉(pH 5.0)洗滌。以50ml/min(153cm/hr)，用15 CV自68%緩衝液C及32%緩衝液D(160mM氯化鈉、25mM檸檬酸鈉，pH 5.0)至0%緩衝液C及100%緩衝液D(500mM氯化鈉、25mM檸檬酸鈉，pH 5.0)之線性梯度進行PRT-201之溶離。將溶離液收集於溶離份中。以37mS/cm(330mM氯化鈉)，PRT-201溶離為對稱峰。藉由SDS-PAGE分析溶離份之蛋白質含量，藉由280nm下UV吸收率分析蛋白質濃度，且藉由SLAP檢定分析比活性。將含有具有30.1-38.8U/mg比活性之PRT-201的溶離份彙集。藉由切向流動過濾將所彙集之PRT-201溶離份滲濾至調配緩衝液(0.1X PBS,pH 5.0)中。將經滲濾之PRT-201之pH值調整至pH 7.4，且藉由切向流動過濾將蛋白質濃度調整至1mg/mL。如實例4中針對由201-24-266-VU純系產生之PRT-201所述，將小瓶填充且凍乾。
基於檢查蛋白質濃度、溫度、緩衝液組成、置換體積及pH值變數之轉化優化研究，選擇上述轉化程序之條件。在第一研究中，分析轉化期間蛋白原濃度對產生N末端變異體之影響。將來自起始濃度為於20mM磷酸鈉(pH 5.0)中0.2mg/mL之201-55M3-003-VU純系(原PRT-201-55M3-003-VU)的經純化原PRT-201等分且使用離心濃縮設備，如藉由280nm下UV吸收率測定，濃縮為1.0mg/mL、1.6mg/mL及1.8mg/mL。藉由對於4個濃度樣品之每一者，將Tris及氯化鈉添加至100mM，將pH值自5.0調整至8.0，且在環境溫度下培育樣品，來實現蛋白原轉化。藉由HIC-HPLC即時監測轉化反應直至蛋白原1%之總蛋白質(圖13)。在此終點，0.2mg/mL樣品由約8% N末端變異體組成，而1.0mg/mL、1.6及2.0mg/mL樣品分別由約14%、19%及29% N末端變異體組成。各樣品中蛋白質之剩餘部分由全長PRT-201組成。此等結果證明在轉化期間增加濃度之原PRT-201-55-003-VU導致形成更多N末端變異體及更少全長PRT-201。其他研究已表明，原PRT-201- 55M3-003-VU轉化經由分子內及分子間反應發生。因此，對於此變異型蛋白原而言，有可能在更稀蛋白原溶液中有利之分子內反應引起更精確之轉化，而在更濃蛋白原溶液中有利之分子間反應引起較不精確轉化，亦即相對於全長PRT-201形成較高百分比之N末端變異體。
在第二研究中，分析轉化期間溫度對產生N末端變異體之影響。使以1.6mg/mL之濃度自201-55M3-003-VU純系(稱為原PRT-201-55M3-003-VU)產生之經純化原PRT-201經受如上所述15℃或26℃下之轉化。藉由HIC-HPLC即時監測轉化反應且允許進展直至蛋白原佔總蛋白質之<1%。在26℃下達到此蛋白原減少所需之時間為約30分鐘，且在15℃下為約90分鐘。在此等時間，對於兩種溫度而言，觀測到類似百分比之N末端變異體(約總蛋白質之20%)。因此，與15℃之較低溫度相比，26℃之較高溫度引起更快轉化反應，而產生基本上相同之反應產物概況。
第三研究檢查轉化反應期間緩衝液組成對蛋白原溶解性之影響。使濃度為1.0mg/mL之經純化原PRT-201(原PRT-201-55M3-003-VU)經受表6中所列條件下之轉化。在環境溫度下進行轉化反應，其中例外為一個轉化反應在2至8℃下進行(緩衝液組成為20mM Tris-HCl、100mM氯化鈉，pH 4.0)。關於沈澱，目測檢查轉化反應。如表6中說明，未引起沈澱之緩衝液組成包括：100mM Tris-HCl，pH 8.0；100mM Tris-HCl，100mM氯化鈉，pH 5.0；及100mM Tris-HCl，300mM氯化鈉，pH 8.0。在較低pH值(亦即，pH 5.0)下具有較低濃度之Tris或無氯化鈉之緩衝液組成展現沈澱。
在第四研究中，分析在含有蛋白原(原PRT-201-55M3-003-VU)之上清液轉化期間切向流動過濾置換體積數對沈澱之影響。用於緩衝液交換之溶液為100mM Tris-HCl、100mM氯化鈉(pH 8.0)。此外，測試在不進行切向流動過濾情況下將上清液之pH值直接自pH 5.0調整至8.0。如表7中說明，對上清液之直接pH值調整導致大量沈澱。使用1置換體積進行交換，觀測到一些沈澱。當使用2至5置換體積時，未觀測到沈澱。
在第五研究中，分析pH值對成熟PRT-201之彈性蛋白酶活性的影響。設計此研究以鑑別用於轉化之適用pH值範圍，該pH值範圍不會導致成熟PRT-201轉化產物之彈性蛋白酶活性不可逆地喪失。製備pH值為1至14之1mg/mL PRT-201於20mM Tris-HCl、20mM磷酸鉀中之溶液。使溶液保持在環境溫度下0.5、2、24及48小時。在指定時間點，在SLAP檢定中測試溶液之彈性蛋白酶活性。在所有時間點，彈性蛋白酶活性自pH 3至8基本上穩定。在小於3及大於8之pH值下，彈性蛋白酶活性在所有時間點降低，其中較長時間點與較低彈性蛋白酶 活性之間具有相關性。此等結果指示在3至8之pH值範圍外進行的轉化反應可負面影響PRT-201轉化產物之彈性蛋白酶活性。
6.8 實例7：自體活化之重組豬I型胰腺彈性蛋白酶之產生
在巴斯德畢赤酵母中表現編碼自體活化豬ELA-1酶原之載體。將所得自體活化豬ELA-1與表現為胰蛋白酶活化之野生型蛋白原的豬ELA-1蛋白質相比較。
為構築胰蛋白酶活化豬ELA-1載體，藉由Blue Heron Biotechnology(Bothell,WA)使用非PCR"長寡核苷酸"技術在來自Amgen(Thousand Oaks,CA)之許可下合成豬ELA-1編碼區。將重組基因選殖至Blue Heron pUC載體(一種pUC119之衍生物)中。對兩條鏈的豬ELA-1基因進行定序以證實正確序列。如圖14中所示，SacII及Xbal限制位點作為側接豬ELA-1基因的潛在選殖位點併入。第二終止密碼子亦直接添加在天然終止密碼子後方以將潛在核糖體通讀減至最少。圖15展示豬ELA-1酶原之天然一致胺基酸序列，其含有胰蛋白酶活化位點。
藉由PCR使用一對含有便於選殖之XhoI及SacII限制位點之寡核苷酸將豬ELA-1之編碼區擴增。將PCR產物用XhoI及SacII消化且藉由瓊脂糖凝膠電泳純化。將豬ELA-1片段選殖至PV-1載體之XhoI及SacII限制位點中。將大腸桿菌TOP10菌株用連接混合物轉型。將細胞混合物塗在補充有25mg/mL博萊黴素之低鹽LB盤上。挑選藥物抗性純系且製備質體DNA(Qiagen,CA)。基於限制分析，鑑別含有豬ELA-1基因插入物之純系且該載體命名為pPROT101-24-V。藉由DNA定序證實此載體之編碼序列。pPROT101-24-V之選殖流程描繪於圖16中。
使用胰蛋白酶活化pPROT101-24-V載體，藉由將豬ELA-1肽原區域中之胰蛋白酶裂解位點改變為彈性蛋白酶裂解位點，將三個不同自體活化純系工程化。一般如實例4中所述，使用含有如表8中所述之所 需突變的合成寡核苷酸引子，進行定點突變誘發。肽原區域中之所有突變藉由雙鏈DNA定序證實。
如實例3中所述，將野生型NRRL Y-11430巴斯德畢赤酵母菌株轉型且培養藥物抗性轉型體且關於豬ELA-1蛋白原之表現加以篩檢。基於SDS-PAGE及考馬斯染色之分析(參見圖17及圖18)，野生型胰蛋白酶活化pPROT101-24-V純系與自體活化純系相比具有最高表現量。在自體活化純系中，pPROT101-49-V純系具有最高表現量，接著為pPROT101-55L-V純系，且接著為pPROT101-49-V純系。自體活化pPROT101-42-V及pPROT101-55L-V蛋白原在誘導期間展現實質性自發轉化，而胰蛋白酶活化pPROT101-24-V及自體活化pPROT101-49-V蛋白原在誘導培養基中展示更大穩定性。
如下表9中所示，對藉由胰蛋白酶活化自pPROT101-24-V表現之彈性蛋白酶原蛋白質而產生的PRT-102之彈性蛋白酶活性之研究展示比PRT-201高之比活性：
使用小規模轉化實驗來判定pPROT101-55L-V及pPROT101-49-V蛋白原是否可轉化為展現彈性蛋白酶活性之成熟酶。將pPROT101-55L-V及pPROT101-49-V震盪瓶上清液用離心過濾單元濃縮10倍，且用100mM Tris-HCl(pH 9.0)稀釋5倍。使轉化在室溫下進行且藉由SLAP檢定監測隨時間之彈性蛋白酶活性。自每一時間點測定每分鐘吸收率之平均變化，且報導為未正規化反應速度(圖19)。pPROT101-49-V與pPROT101-55L-V上清液之轉化使得彈性蛋白酶活性增加。相繼藉由SDS-PAGE及考馬斯染色對來自各純系之最終時間點樣品加以分析，且將其與轉化前樣品相比較(圖20)。SDS-PAGE結果證實，幾乎所有pPROT101-49-V蛋白原到轉化檢定結束時均轉化為成熟蛋白質。SDS-PAGE結果亦展示，幾乎所有pPROT101-55L-V在轉化檢定之前已自發轉化為成熟蛋白質。
pPROT101-24-V及pPROT101-49-V蛋白原及成熟酶之經純化製劑已提交給丹福斯植物科學中心(Danforth Plant Science Center，MO)進行完整分子量分析。藉由陽離子交換層析(Macroprep High S,Bio-Rad)純化蛋白原。為進行成熟酶分析，首先將來自兩種純系之蛋白原處理以產生成熟酶且接著藉由陽離子交換層析進行純化。將胰蛋白酶活化蛋白原用胰蛋白酶處理，而自體活化蛋白原在100mM Tris- HCl(pH 9.0)存在下轉化，接著進行陽離子交換層析。自質譜分析獲得之主要峰列於表10中。
SDS-PAGE、彈性蛋白酶活性及質譜分析結果證明，I型豬胰腺彈性蛋白酶之自體活化形式可藉由將肽原序列工程化以用彈性蛋白酶裂解位點置換胰蛋白酶裂解位點來產生。I型豬胰腺彈性蛋白酶之此等自體活化形式之表現量低於野生型胰蛋白酶活化形式。在所測試之自體活化純系中，具有pPROT101-49-V肽原序列之彼等純系展示最高表現量及最少自發轉化。pPROT101-49-V及pPROT101-55L-V純系之轉化使得產生具有實質性彈性蛋白酶活性之成熟蛋白質。質譜分析展示pPROT101-49-V蛋白原及成熟豬I型之分子量與預期質量相符。
6.9 實例8：藉由BENZ比色肽受質檢定對成熟重組人類彈性蛋白酶-1進行胰蛋白酶活性分析
使用小肽受質N-苯甲醯基-Phe-Val-Arg-對硝基苯胺(BENZ)進行比色水解檢定以判定由自體活化純系201-55M3-003-VU產生之經純化成熟彈性蛋白酶蛋白質是否具有胰蛋白酶活性。將自純系201-55M3-003-VU純化之經凍乾PRT-201之三個小瓶自-80℃儲存取回，且用水復水以獲得於0.1X PBS(pH 7.4)中之1mg/mL PRT-201。藉由量測280nm下之UV吸收率來證實蛋白質濃度。使用TrypZean儲備溶液(10mg/mL)來產生胰蛋白酶活性之標準曲線。包括先前測試之胰蛋白酶活化PRT-201樣品作為陽性對照。此外，一些實驗及對照樣品加料 TrypZean以確定胰蛋白酶活性在PRT-201存在下恢復。將加料及未加料樣品之子集用大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)處理以測定SBTI抑制任何固有或加料胰蛋白酶活性的能力。亦用SBTI處理TrypZean標準以證實該抑制劑之有效性。關於此研究中所包括之樣品概述，參見下表11。
製備受質溶液(0.1M Tris(pH 8.3)中0.4mg/mL N-苯甲醯基-Phe-Val-Arg-對硝基苯胺，貨號7733)且在水浴中預溫至30℃。一式三份，將100微升各樣品以吸管移至96孔微量培養盤中。使用多通道移液器，將200微升受質溶液移至各孔中，且將微量培養盤立即置於預熱至30℃之微量培養盤讀數器中。微量培養盤讀數器每一分鐘記錄各孔 405nm之吸收率，歷時60分鐘。
亦在SLAP檢定中測試PRT-201樣品之彈性蛋白酶活性。製備SLAP受質溶液(0.1M Tris(pH 8.3)中4.5mg/mL SLAP)且在水浴中預溫至30℃。1mg/mL PRT-201樣品用水稀釋20倍至0.05mg/mL。一式三份，將10微升各樣品稀釋液以吸管移至96孔微量培養盤中。使用多通道移液器，將300微升SLAP受質溶液移至各孔中，且將微量培養盤立即置於預熱至30℃之微量培養盤讀數器中。微量培養盤讀數器每一分鐘記錄各孔405nm之吸收率，歷時5分鐘。
BENZ及SLAP活性檢定之結果分別呈現於下表11及12中。
在胰蛋白酶活性檢定中純系201-55M3-003-VU之PRT-201的胰蛋白酶活性程度低於標準曲線範圍(<1.56ng/mL)。此外，三份水解反應之回歸係數不佳(<0.8)，進一步證明此自體活化成熟彈性蛋白酶蛋白質中不存在胰蛋白酶活性。相比之下，測定對照胰蛋白酶活化樣品之胰蛋白酶活性程度為8.7ng/mL。
7.序列表
8.特定實施例，引用參考文獻
本發明由下文特定實施例例示。
1.一種蛋白質，其包含(i)彈性蛋白酶活化序列，該彈性蛋白酶活化序列包含可操作性連接於(ii)成熟彈性蛋白酶之胺基酸序列的彈性蛋白酶識別序列。
2.實施例1之蛋白質，其中該彈性蛋白酶識別序列包含SEQ ID NO：11。
3.實施例1之蛋白質，其中該彈性蛋白酶識別序列包含SEQ ID NO：12。
4.實施例1之蛋白質，其中該彈性蛋白酶識別序列包含SEQ ID NO：13。
5.實施例1之蛋白質，其中該彈性蛋白酶識別序列包含SEQ ID NO：93。
6.實施例1、實施例2或實施例4之蛋白質，其中該彈性蛋白酶識別序列包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21中之任一者。
7.實施例1之蛋白質，其中該活化序列包含SEQ ID NO：80。
8.實施例1或實施例7之蛋白質，其中該活化序列包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73。
9.實施例1之蛋白質，其中該蛋白質包含含有SEQ ID NO：74之裂解域。
10.實施例1或實施例9之蛋白質，其中該裂解域包含SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55中之任一者。
11.實施例1至5及7中任一者之蛋白質，其包含SEQ ID NO：64。
12.實施例1至5及7中任一者之蛋白質，其包含SEQ ID NO：69。
13.一種I型彈性蛋白酶原蛋白質，其包含SEQ ID NO：74之裂解域序列。
14.實施例13之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其中該裂解域包含SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：55中之任一者。
15.實施例13或實施例14之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其中該成熟彈性蛋白酶序列包含與SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1之位置6(例如，根據本文中彈性蛋白酶胺基酸名稱之P5'殘基之C末端)至末端之胺基酸序列具有至少85%序列一致性的序列。
16.實施例13或實施例14之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其包含與SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1之位置6(例如，根據本文中彈性蛋白酶胺基酸名稱之P5'殘基之C末端)至末端之該胺基酸序列具有至少95%序列一致性的序列。
17.實施例13或實施例14之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其包含與SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1之位置6至末端之該胺基酸序列具有至少98%序列一致性的序列。
18.實施例13或實施例14之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其中該成熟彈性蛋白酶包含相對於SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1之位置6至末端之該胺基酸序列具有至多10個保守胺基酸改變的序列。
19.實施例13或實施例14之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其包含相對於SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1之位置6至末端之該胺基酸序列具有至多7個保守胺基酸改變的序列。
20.實施例13或實施例14之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其包含相對於SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1之位置6至末端之該胺基酸序列具有至多5個保守胺基酸改變的序列。
21.實施例13至20中任一者之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其中SEQ ID NO：74中由"Xaa1"表示之胺基酸殘基為麩胺酸或組胺酸。
22.實施例13至21中任一者之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其中SEQ ID NO：74中由"Xaa4"表示之胺基酸殘基為脯胺酸。
23.實施例13至22中任一者之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其中SEQ ID NO：74中由"Xaa5"表示之胺基酸殘基為丙胺酸。
24.實施例13至23中任一者之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其中SEQ ID NO：74中由"Xaa1"表示之該胺基酸殘基為組胺酸，SEQ ID NO：74中由"Xaa4"表示之該胺基酸殘基為脯胺酸，且SEQ ID NO：74中由"Xaa5"表示之該胺基酸殘基為丙胺酸。
25.實施例13至24中任一者之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列。
26.實施例25之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列。
27.實施例25之I型彈性蛋白酶原蛋白質，其包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列。
28.實施例1至27中任一者之蛋白質，其係經分離。
29.實施例1至27中任一者之蛋白質，其包含信號序列。
30.一種蛋白質，其包含(i)信號序列；(ii)包含彈性蛋白酶識別序列之彈性蛋白酶活化序列；及(iii)成熟彈性蛋白酶之胺基酸序列。
31.實施例30之蛋白質，其中該信號序列在甲醇酵母中可操作。
32.實施例30之蛋白質，其中該信號序列為酵母α-因子信號肽。
33.實施例32之蛋白質，其中該酵母α-因子信號肽包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列。
34.實施例30之蛋白質，其中該信號序列為哺乳動物分泌信號序列。
35.實施例34之蛋白質，其中該哺乳動物分泌信號序列為豬I型彈性蛋白酶信號序列。
36.實施例34之蛋白質，其中該哺乳動物分泌信號序列為人類I型彈性蛋白酶信號序列。
37.實施例1或實施例30之蛋白質，其中該彈性蛋白酶識別序列為I型人類彈性蛋白酶識別序列。
38.實施例1或實施例30之蛋白質，其中該成熟彈性蛋白酶為人類I型彈性蛋白酶。
39.實施例1或實施例30之蛋白質，其中該成熟彈性蛋白酶為豬I型彈性蛋白酶。
40.一種核酸，其編碼實施例1至39中任一者之蛋白質。
41.一種核酸分子，其包含編碼蛋白質之核苷酸序列，該蛋白質包含(i)活化序列，該活化序列包含可操作性連接於(ii)彈性蛋白酶之胺基酸序列的彈性蛋白酶識別序列。
42.實施例41之核酸分子，其中該蛋白質進一步包含可操作性連接於該活化序列之信號序列。
43.實施例41或實施例42之核酸分子，其中該信號序列在甲醇酵母中可操作。
44.實施例41至43中任一者之核酸，其中該彈性蛋白酶識別序列為I型彈性蛋白酶識別序列。
45.實施例41至44中任一者之核酸，其中該彈性蛋白酶識別序列為I型人類彈性蛋白酶識別序列。
46.實施例41至45中任一者之核酸分子，其中該彈性蛋白酶識別序列包含SEQ ID NO：11。
47.實施例41至45中任一者之核酸分子，其中該彈性蛋白酶識別序列包含SEQ ID NO：12。
48.實施例41至45中任一者之核酸分子，其中該彈性蛋白酶識別序列包含SEQ ID NO：13。
49.實施例41至45中任一者之核酸分子，其中該彈性蛋白酶識別序列包含SEQ ID NO：93。
50.實施例41至46及48中任一者之核酸，其中該彈性蛋白酶識別序列包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21中之任一者。
51.實施例41至50中任一者之核酸分子，其中該活化序列包含SEQ ID NO：80。
52.實施例41至45及51中任一者之核酸分子，其中該活化序列包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73。
53.實施例41至46中任一者之核酸分子，其中該蛋白質包含含有SEQ ID NO：74之裂解域。
54.實施例41至46及53中任一者之核酸分子，其中該裂解域包含SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55中之任一者。
55.實施例41至54中任一者之核酸，其中該彈性蛋白酶為成熟人類I型彈性蛋白酶。
56.實施例41至54中任一者之核酸，其中該彈性蛋白酶為成熟豬 I型彈性蛋白酶。
57.實施例41至54中任一者之核酸，其中該彈性蛋白酶包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：39中任一者之胺基酸序列。
58.實施例57之核酸，其中該彈性蛋白酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之胺基酸序列。
59.實施例42至58中任一者之核酸分子，其中該信號序列為酵母α-因子信號肽。
60.實施例59之核酸分子，其中該蛋白質包含SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：96及SEQ ID NO：97中任一者之胺基酸序列。
61.實施例42及44至58中任一者之核酸分子，其中該信號序列為哺乳動物分泌信號序列。
62.實施例61之核酸分子，其中該哺乳動物分泌信號序列為豬I型彈性蛋白酶信號序列。
63.實施例61之核酸分子，其中該哺乳動物分泌信號序列為人類I型彈性蛋白酶信號序列。
64.實施例41至63中任一者之核酸分子，其中該蛋白質包含SEQ ID NO：88至91及98至103中任一者之胺基酸序列。
65.實施例64之核酸分子，其中該蛋白質包含SEQ ID NO：6至9及64至69中任一者之胺基酸序列。
66.實施例64之核酸分子，其中該蛋白質包含表2中闡述之彈性蛋白酶多態現象之任何組合。
67.實施例64之核酸分子，其中該蛋白質包含表3中闡述之彈性蛋白酶多態現象之任何組合。
68.一種蛋白質，其係由實施例41至67中任一者之核酸分子編 碼。
69.實施例68之蛋白質，其係經分離。
70.一種載體，其包含實施例41至67中任一者之核酸分子。
71.實施例70之載體，其進一步包含控制基因表現之核苷酸序列，該核苷酸序列可操作性連接於編碼該蛋白質之核苷酸序列。
72.實施例70或實施例71之載體，其中編碼該蛋白質之該核苷酸序列係經多聚化。
73.一種宿主細胞，其包含實施例70至72中任一者之載體。
74.實施例73之宿主細胞，其中該載體之至少一個複本整合至該宿主細胞基因組中。
75.實施例74之宿主細胞，其中該載體之1個複本整合至該宿主細胞基因組中。
76.實施例74之宿主細胞，其中該載體之2至5個複本整合至該宿主細胞基因組中。
77.實施例74或76之宿主細胞，其中該載體之2個複本整合至該宿主細胞基因組中。
78.實施例74或76之宿主細胞，其中該載體之3個複本整合至該宿主細胞基因組中。
79.一種宿主細胞，其包含整合至其基因組中的實施例41至67中任一者之核酸分子的至少一個複本。
80.實施例79之宿主細胞，其中該核酸分子之1個複本整合至其基因組中。
81.實施例79之宿主細胞，其中該核酸分子之2至5個複本整合至其基因組中。
82.實施例79之宿主細胞，其中該核酸分子之2個複本整合至其基因組中。
83.實施例79之宿主細胞，其中該核酸分子之3個複本整合至其基因組中。
84.一種細胞，其經遺傳工程化以表現實施例41至67中任一者之核酸分子。
85.實施例84之細胞，其中該核苷酸序列可操作性連接於甲醇誘導性啟動子。
86.一種甲醇酵母細胞，其經遺傳工程化以表現實施例41至67中任一者之核苷酸序列。
87.實施例87之甲醇酵母細胞，其中該核苷酸序列可操作性連接於甲醇誘導性啟動子。
88.一種細胞培養上清液，其包含實施例1至27或實施例68中任一者之蛋白質。
89.一種產生彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含在產生該蛋白質之條件下培養實施例84之宿主細胞。
90.一種產生彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含在產生該蛋白質之條件下培養實施例85之宿主細胞。
91.一種產生彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含在產生該蛋白質之條件下培養實施例86之宿主細胞。
92.一種產生彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含在產生該蛋白質之條件下培養實施例87之宿主細胞。
93.實施例91或實施例92之方法，其中該等條件包括在2至6之pH值下生長或誘導一段時期。
94.實施例91或實施例92之方法，其中該等條件包含在22℃至28℃之溫度下生長或誘導一段時期。
95.實施例89至92中任一者之方法，其中在複合培養基中培養該宿主細胞。
96.實施例95之方法，其中該複合培養基為經緩衝之甲醇複合培養基或經緩衝之甘油複合培養基。
97.實施例89至96中任一者之方法，其中在檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下培養該宿主細胞。
98.實施例97之方法，其中該檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物分別為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉。
99.實施例97或實施例98之方法，其中一檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物以5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM之濃度存在於該培養物中。
100.實施例97或實施例98之方法，其中一種以上檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在於該培養物中，且其中該溶液中檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物之總濃度為5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM。
101.實施例89至100中任一者之方法，其進一步包含回收該蛋白質。
102.實施例95之方法，其中該蛋白質係藉由回收該上清液來回收。
103.實施例95之方法，其中該蛋白質係自該上清液回收。
104.實施例95至104中任一者之方法，其中所回收之該蛋白質缺乏信號序列。
105.實施例95至104中任一者之方法，其中所回收之該蛋白質缺乏該信號序列與該活化序列兩者。
106.實施例89至92及93至105中任一者之方法，其進一步包含將含有該蛋白質之溶液的pH值升高至6至12之pH值。
107.實施例89至92及93至106中任一者之方法，其進一步包含使該蛋白質與催化量之彈性蛋白酶接觸。
108.實施例89至92及93至106中任一者之方法，其進一步包含使該蛋白質經受自體活化條件，使該蛋白質與催化量之彈性蛋白酶接觸，或兩者。
109.實施例108之方法，其中使該蛋白質經受自體活化條件。
110.實施例109之方法，其中該蛋白質當經受自體活化條件時處於該上清液中。
111.一種產生彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含： (a)在第一檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下培養能夠表現重組彈性蛋白酶原蛋白質之宿主細胞； (b)自該宿主細胞培養物回收該重組彈性蛋白酶原蛋白質；及 (c)視情況使該重組彈性蛋白酶原蛋白質暴露於活化條件以產生成熟彈性蛋白酶蛋白質，由此產生彈性蛋白酶蛋白質。
112.實施例111之方法，其中該方法包含使該重組彈性蛋白酶原蛋白質暴露於活化條件以產生成熟彈性蛋白酶蛋白質的步驟。
113.實施例112之方法，其中該重組彈性蛋白酶原蛋白質在該暴露於活化條件之前經純化。
114.實施例113之方法，其中在第二檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下純化該重組彈性蛋白酶原蛋白質，以使得產生包含該經純化之彈性蛋白酶原蛋白質及第二檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物的溶液。
115.實施例111至114中任一者之方法，其中該第一檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物分別為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉。
116.實施例114或實施例115之方法，其中該第二檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物分別為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉。
117.實施例114至116中任一者之方法，其中該第一檸檬酸鹽、 琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物與該第二檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物相同。
118.實施例114至116中任一者之方法，其中該第一檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物與該第二檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物不同。
119.實施例114至118中任一者之方法，其中一檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物以5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM之濃度存在於該培養物中。
120.實施例114至118中任一者之方法，其中一種以上檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在於該培養物中，且其中該培養物中檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物之總濃度為5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM。
121.實施例111至120中任一者之方法，其中一檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物以5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM之濃度存在於該溶液中。
122.實施例111至120中任一者之方法，其中一種以上檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在於該溶液中，且其中該溶液中檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物之總濃度為5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM。
123.實施例111至122中任一者之方法，其中在複合培養基中培養該宿主細胞。
124.實施例123之方法，其中該複合培養基為經緩衝之甲醇複合培養基或經緩衝之甘油複合培養基。
125.實施例111至124中任一者之方法，其中該彈性蛋白酶原蛋白質係自該宿主細胞之上清液回收。
126.實施例111至125中任一者之方法，其中該等活化條件包含暴露於胰蛋白酶。
127.實施例111至125中任一者之方法，其中該等活化條件為自體活化條件。
128.實施例111至127中任一者之方法，其進一步包含分離該成熟彈性蛋白酶蛋白質之步驟。
129.實施例111至128中任一者之方法，其中該成熟彈性蛋白酶蛋白質為成熟I型彈性蛋白酶蛋白質。
130.實施例129之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為人類I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
131.實施例129之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為豬I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
132.一種產生成熟彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含：(a)將彈性蛋白酶原蛋白質凍乾；(b)儲存該經凍乾之彈性蛋白酶原蛋白質； (c)將該經凍乾之彈性蛋白酶原蛋白質復水；及 (d)使該經復水之彈性蛋白酶原蛋白質活化，由此產生成熟彈性蛋白酶蛋白質。
133.實施例132之方法，其中該彈性蛋白酶原蛋白質為重組彈性蛋白酶原蛋白質。
134.實施例133之方法，其中該彈性蛋白酶原蛋白質係藉由包含以下步驟之方法製備或可藉由包含以下步驟之方法獲得：(i)在表現該彈性蛋白酶原蛋白質之條件下培養能夠表現該彈性蛋白酶原蛋白質之宿主細胞；及(ii)回收該彈性蛋白酶原蛋白質。
135.實施例134之方法，其中在複合培養基中培養該宿主細胞。
136.實施例135之方法，其中該複合培養基為經緩衝之甲醇複合培養基或經緩衝之甘油複合培養基。
137.實施例132至136中任一者之方法，其中在檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下培養該宿主細胞。
138.實施例137之方法，其中該檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物分別為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉。
139.實施例137或實施例138之方法，其中一檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物以5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM之濃度存在於該培養物中。
140.實施例137或實施例138之方法，其中一種以上檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在於該培養物中，且其中該溶液中檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物之總濃度為5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM。
141.實施例132至140中任一者之方法，其中該彈性蛋白酶原蛋白質係自該宿主細胞之上清液回收。
142.實施例132至141中任一者之方法，其中該彈性蛋白酶原蛋白質在凍乾之前經純化。
143.實施例132至142中任一者之方法，其中將該經凍乾之彈性蛋白酶原蛋白質儲存至少一天、至少一週、至少一個月或至少三個月之時期。
144.實施例132至143中任一者之方法，其中該彈性蛋白酶原蛋白質儲存在-80℃至+4℃之溫度下。
145.實施例132至144中任一者之方法，其中該活化步驟包含胰蛋白酶活化。
146.實施例132至144中任一者之方法，其中該活化步驟包含自體活化。
147.實施例132至146中任一者之方法，其進一步包含分離該成熟彈性蛋白酶蛋白質之步驟。
148.實施例132至147中任一者之方法，其中該成熟彈性蛋白酶蛋白質為成熟I型彈性蛋白酶蛋白質。
149.實施例148之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為人類I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
150.實施例148之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為豬I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
151.一種產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含使重組自體活化I型彈性蛋白酶原蛋白質經受自體活化條件，使重組自體活化I型彈性蛋白酶原蛋白質與催化量之彈性蛋白酶接觸，或兩者，由此產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質。
152.實施例151之方法，其中該重組自體活化I型彈性蛋白酶原蛋白質係藉由或可藉由包含以下步驟之方法獲得： (a)在表現該蛋白質之條件下培養實施例84或86之宿主細胞；及(b)回收所表現之蛋白質， 由此產生重組自體活化I型彈性蛋白酶原蛋白質。
153.實施例152之方法，其中在複合培養基中培養該宿主細胞。
154.實施例153之方法，其中該複合培養基為經緩衝之甲醇複合培養基或經緩衝之甘油複合培養基。
155.實施例152至154中任一者之方法，其中在檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下培養該宿主細胞。
156.實施例155之方法，其中該檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化 合物分別為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉。
157.實施例155或實施例156之方法，其中一檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物以5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM之濃度存在於該培養物中。
158.實施例155或實施例156之方法，其中一種以上檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在於該培養物中，且其中該溶液中檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物之總濃度為5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM。
159.實施例152至158中任一者之方法，其中回收該所表現之蛋白質包含回收該上清液。
160.實施例159之方法，其中該自體活化步驟在該上清液中進行。
161.實施例152至154中任一者之方法，其中該所表現之蛋白質係自該上清液回收。
162.實施例161之方法，其中該自體活化步驟在該上清液中進行。
163.實施例161之方法，其進一步包含純化該所表現之蛋白質之步驟。
164.實施例151至163中任一者之方法，其中使該重組自體活化I型彈性蛋白酶原蛋白質經受自體活化條件包含升高含有該所回收之蛋白質之溶液的pH值。
165.實施例164之方法，其中使該溶液之pH值升高至鹼性pH值。
166.實施例165之方法，其中該鹼性pH值在7至9之範圍內。
167.實施例166之方法，其中該鹼性pH值為8。
168.實施例164至167中任一者之方法，其中該經回收之蛋白質在該溶液中之濃度為10mg/ml或10mg/ml以下。
169.實施例164至167中任一者之方法，其中該經回收之蛋白質在該溶液中之濃度為5mg/ml或5mg/ml以下。
170.實施例164至167中任一者之方法，其中該經回收之蛋白質在該溶液中之濃度為2mg/ml或2mg/ml以下。
171.實施例164至167中任一者之方法，其中該經回收之蛋白質在該溶液中之濃度為1mg/ml或1mg/ml以下。
172.實施例164至167中任一者之方法，其中該經回收之蛋白質在該溶液中之濃度為0.5mg/ml或0.5mg/ml以下。
173.實施例164至167中任一者之方法，其中該經回收之蛋白質在該溶液中之濃度為0.25mg/ml或0.25mg/ml以下。
174.實施例165至173中任一者之方法，其中該經回收之蛋白質在該溶液中之濃度為至少0.1mg/ml。
175.實施例165至173中任一者之方法，其中該經回收之蛋白質在該溶液中之濃度為至少0.2mg/ml。
176.實施例165至175中任一者之方法，其中使該經回收之蛋白質暴露於該鹼性pH值歷時0.5至8小時之時期。
177.實施例174之方法，其中使該經回收之蛋白質暴露於該鹼性pH值歷時2至7小時之時期。
178.實施例177之方法，其中使該經回收之蛋白質暴露於該鹼性pH值歷時6小時之時期。
179.實施例165至178中任一者之方法，其中該暴露於鹼性pH值在22℃至28℃之溫度下進行。
180.實施例179之方法，其中該暴露於鹼性pH值在26℃之溫度下進行。
181.實施例152至180之方法，其中該經回收之蛋白質在自體活化之前經儲存。
182.實施例181之方法，其中該經回收之蛋白質在儲存之前經凍乾。
183.實施例182之方法，其中該經回收之蛋白質在凍乾之前經純化。
184.實施例181至183中任一者之方法，其中將該經回收之蛋白質儲存至少一天、至少一週、至少一個月或至少三個月之時期。
185.實施例184之方法，其中將該經回收之蛋白質儲存在80℃至+4℃之溫度下。
186.實施例150至185中任一者之方法，但該等實施例不附屬於實施例160或162，其中該重組自體活化I型彈性蛋白酶原在使其經受自體活化條件之前經純化。
187.實施例150至186中任一者之方法，其進一步包含分離該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之步驟。
188.實施例150至187中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為人類I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
189.實施例150至187中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為豬I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
190.一種產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含：(a)在表現該蛋白質之條件下培養實施例84或86之宿主細胞；(b)回收所表現之蛋白質；(c)純化經回收之蛋白質；(d)升高含有該蛋白質之溶液的pH值或使該經回收之蛋白質與催化量之彈性蛋白酶接觸以產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質，由此產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質。
191.實施例190之方法，其中在複合培養基中培養該宿主細胞。
192.實施例191之方法，其中該複合培養基為經緩衝之甲醇複合培養基或經緩衝之甘油複合培養基。
193.實施例190至192中任一者之方法，其中在檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下培養該宿主細胞。
194.實施例193之方法，其中該檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物分別為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉。
195.實施例193或實施例194之方法，其中一檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物以5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM之濃度存在於該培養物中。
196.實施例193或實施例194之方法，其中一種以上檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在於該培養物中，且其中該溶液中檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物之總濃度為5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM。
197.實施例190至196中任一者之方法，其進一步包含(e)純化該成熟I型彈性蛋白酶之步驟。
198.實施例190至197中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為人類I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
199.實施例190至197中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為豬I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
200.一種產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含：(a)在表現該蛋白質之條件下培養實施例84或86之宿主細胞；(b)回收所表現之蛋白質；及(c)將經回收之蛋白質暴露於鹼性pH值，直至產生成熟蛋白質； 由此產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質。
201.實施例200之方法，其中在複合培養基中培養該宿主細胞。
202.實施例201之方法，其中該複合培養基為經緩衝之甲醇複合培養基或經緩衝之甘油複合培養基。
203.實施例200至202中任一者之方法，其中在檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下培養該宿主細胞。
204.實施例203之方法，其中該檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物分別為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉。
205.實施例203或實施例204之方法，其中一檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物以5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM之濃度存在於該培養物中。
206.實施例203或實施例204之方法，其中一種以上檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在於該培養物中，且其中該溶液中檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物之總濃度為5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM。
207.實施例200至206中任一者之方法，其中該鹼性pH值為7至9。
208.實施例207之方法，其中該鹼性pH值為8。
209.實施例200至208中任一者之方法，其中當暴露於該鹼性pH值時，經回收之蛋白質之濃度為10mg/ml或10mg/ml以下。
210.實施例200至208中任一者之方法，其中當暴露於該鹼性pH值時，經回收之蛋白質之濃度為5mg/ml或5mg/ml以下。
211.實施例200至208中任一者之方法，其中當暴露於該鹼性pH值時，經回收之蛋白質之濃度為2mg/ml或2mg/ml以下。
212.實施例200至208中任一者之方法，其中當暴露於該鹼性pH 值時，經回收之蛋白質之濃度為1mg/ml或1mg/ml以下。
213.實施例200至208中任一者之方法，其中當暴露於該鹼性pH值時，經回收之蛋白質之濃度為0.5mg/ml或0.5mg/ml以下。
214.實施例200至208中任一者之方法，其中當暴露於該鹼性pH值時，經回收之蛋白質之濃度為0.25mg/ml或0.25mg/ml以下。
215.實施例209至214中任一者之方法，其中當暴露於該鹼性pH值時，經回收之蛋白質之濃度為至少0.1mg/ml。
216.實施例209至214中任一者之方法，其中當暴露於該鹼性pH值時，經回收之蛋白質之濃度為至少0.2mg/ml。
217.實施例200至214中任一者之方法，其中使該經回收之蛋白質暴露於該鹼性pH值歷時0.5至8小時之時期。
218.實施例217之方法，其中使該經回收之蛋白質暴露於該鹼性pH值歷時2至7小時之時期。
219.實施例218之方法，其中使該經回收之蛋白質暴露於該鹼性pH值歷時6小時之時期。
220.實施例200至219中任一者之方法，其中該暴露於鹼性pH值在22℃至28℃之溫度下進行。
221.實施例220之方法，其中該暴露於鹼性pH值在26℃之溫度下進行。
222.實施例200至221中任一者之方法，其進一步包含(d)分離該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之步驟。
223.實施例150至222中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶為成熟豬I型彈性蛋白酶。
224.實施例150至222中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶為成熟人類I型彈性蛋白酶。
225.一種產生成熟彈性蛋白酶蛋白質之調配物的方法，其包 含：(a)使自體活化彈性蛋白酶原蛋白質經受自體活化條件以產生成熟彈性蛋白酶蛋白質；及(b)調配該成熟彈性蛋白酶蛋白質， 由此產生成熟彈性蛋白酶蛋白質之調配物。
226.實施例225之方法，其中該自體活化彈性蛋白酶原蛋白質為重組彈性蛋白酶原蛋白質。
227.實施例226之方法，其進一步包含在步驟(a)之前，自能夠表現該自體活化彈性蛋白酶原蛋白質在表現該彈性蛋白酶原蛋白質之條件下生長的宿主細胞之培養物回收該彈性蛋白酶原蛋白質。
228.實施例225或實施例226之方法，其進一步包含在步驟(b)之前純化該成熟彈性蛋白酶蛋白質。
229.實施例225至228中任一者之方法，其中該調配步驟包含凍乾該成熟彈性蛋白酶蛋白質。
230.實施例229之方法，其中該成熟彈性蛋白酶蛋白質在凍乾之前並不與緩衝液或緩衝成份混合。
231.實施例230之方法，其中使該成熟彈性蛋白酶蛋白質在凍乾之後與一或多種緩衝成份混合。
232.實施例229之方法，其中使該成熟彈性蛋白酶蛋白質在凍乾之前與緩衝液或一或多種緩衝成份混合。
233.實施例231或232之方法，其中該緩衝液為磷酸鹽緩衝鹽水("PBS")緩衝液或該緩衝成份為PBS緩衝成份。
234.實施例231至233中任一者之方法，其中該緩衝液包含葡聚糖或其中該緩衝成份包含葡聚糖。
235.實施例234之方法，其中該葡聚糖為葡聚糖-18。
236.實施例230至235中任一者之方法，其中該緩衝液包含聚山 梨醇酯80。
237.實施例229至236中任一者之方法，其中該調配步驟進一步包含以液體將該經凍乾之成熟彈性蛋白酶蛋白質復水。
238.實施例237之方法，其中該液體為水。
239.實施例237之方法，其中該液體為緩衝液。
240.實施例239之方法，其中該緩衝液為全強度緩衝液、大於全強度之緩衝液或小於全強度之緩衝液。
241.實施例237至240中任一者之方法，其中在復水之後，產生成熟彈性蛋白酶蛋白質於全強度緩衝液、大於全強度之緩衝液或小於全強度之緩衝液中之溶液。
242.實施例241之方法，其中緩衝成份存在於該凍乾物中，在復水之後添加，或兩者。
243.實施例240至242中任一者之方法，其中全強度緩衝液包含1X PBS。
244.實施例240或241之方法，其中該小於全強度之緩衝液包含0.1X PBS至0.5X PBS。
245.實施例244之方法，其中該小於全強度之緩衝液包含0.1X PBS。
246.實施例244之方法，其中該小於全強度之緩衝液包含0.5X PBS。
247.實施例240或241之方法，其中該大於全強度之緩衝液包含1.1X PBS至3X PBS。
248.實施例247之方法，其中該大於全強度之緩衝液包含1.5X PBS至2X PBS。
249.實施例241至248中任一者之方法，其中該緩衝液包含葡聚糖。
250.實施例249之方法，其中該葡聚糖為葡聚糖18。
251.實施例241至250中任一者之方法，其中該緩衝液包含聚山梨醇酯80。
252.實施例241至251中任一者之方法，其中該緩衝液之pH值為7至8。
253.實施例252之方法，其中該緩衝液之pH值為7.4。
254.實施例237至253中任一者之方法，其中使該成熟彈性蛋白酶蛋白質復水至0.001mg/ml至50mg/ml之濃度。
255.實施例254之方法，其中使該成熟彈性蛋白酶蛋白質復水至0.1mg/ml至40mg/ml之濃度。
256.實施例255之方法，其中使該成熟彈性蛋白酶蛋白質復水至5mg/ml至30mg/ml之濃度。
257.實施例256之方法，其中使該成熟彈性蛋白酶蛋白質復水至10mg/ml至20mg/ml之濃度。
258.實施例225至257中任一者之方法，其中該調配物為包含該成熟彈性蛋白酶蛋白質之醫藥組合物。
259.實施例225至258中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為人類I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
260.實施例225至258中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為豬I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
261.一種產生經凍乾成熟I型彈性蛋白酶之方法，其包含：(a)根據實施例151至181中任一者之方法產生成熟I型彈性蛋白酶；(b)分離成熟I型彈性蛋白酶；及(c)凍乾該經分離之成熟I型彈性蛋白酶，由此產生經凍乾成熟I型彈性蛋白酶。
262.實施例261之方法，其中該經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶為95%至100%純。
263.實施例261或實施例262之方法，其中該經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶為至少95%純。
264.實施例261或實施例262之方法，其中該經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶為至少98%純。
265.實施例261至264中任一者之方法，其中將該經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶純化至均質。
266.實施例261至265中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為人類I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
267.實施例261至265中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為豬I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
268.實施例130、149、188、198、223、259及267中任一者之方法，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87組成。
269.實施例268之方法，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4組成。
270.實施例131、150、189、199、224、260及268中任一者之方法，其中該成熟豬I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：39組成。
271.實施例111至128、132至148、151至197及225至257中任一者之方法，其中該彈性蛋白酶原蛋白質為實施例13至27中任一者之蛋白質。
272.實施例200至222中任一者之方法，其中該所表現之蛋白質為實施例13至27中任一者之蛋白質。
273.一種成熟人類I型彈性蛋白酶，其係藉由實施例149、188、 198及223中任一者之方法產生或可藉由實施例149、188、198及223中任一者之方法獲得。
274.實施例273之成熟人類I型彈性蛋白酶，其具有每毫克蛋白質1至40U之比活性。
275.一種成熟豬I型彈性蛋白酶，其係藉由實施例150、189、199及224中任一者之方法產生或可藉由實施例150、189、199及224中任一者之方法獲得。
276.實施例275之成熟人類I型彈性蛋白酶，其具有每毫克蛋白質10至100U之比活性。
277.一種醫藥組合物，其包含治療有效量之(a)實施例273或實施例274之成熟人類I型彈性蛋白酶或(b)藉由實施例259之方法產生或可藉由實施例259之方法產生獲得之成熟人類I型彈性蛋白酶調配物。
278.實施例277之醫藥組合物，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87組成。
279.實施例278之醫藥組合物，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4組成。
280.一種醫藥組合物，其包含治療有效量之(a)實施例275或實施例276之成熟豬I型彈性蛋白酶或(b)藉由實施例260之方法產生或可藉由實施例260之方法獲得之成熟豬I型彈性蛋白酶調配物。
281.實施例280之醫藥組合物，其中該成熟豬I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：39組成。
282.一種醫藥組合物，其包含(i)治療有效量之成熟人類I型彈性蛋白酶及(ii)醫藥學上可接受之載劑，該醫藥組合物特徵在於以下性質中之至少一者：(a)該組合物不含胰蛋白酶；(b)該組合物實質上不含胰蛋白酶； (c)該組合物不含由SEQ ID NO：2、3、37、38、70及/或71組成之任何蛋白質；(d)該組合物實質上不含由SEQ ID NO：2、3、37、38、70及/或71組成之任何蛋白質；(e)該組合物不含細菌蛋白質；(f)該組合物實質上不含細菌蛋白質；(g)該組合物不含除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質；(h)該組合物實質上不含除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質。
283.一種醫藥組合物，其包含(i)治療有效量之成熟人類I型彈性蛋白酶及(ii)醫藥學上可接受之載劑，該醫藥組合物特徵在於以下性質中之至少一者：(a)該組合物不含胰蛋白酶；(b)該組合物實質上不含胰蛋白酶；(c)該組合物不含由SEQ ID NO：70及71組成之任何蛋白質；(d)該組合物實質上不含由SEQ ID NO：2及3組成之任何蛋白質；(e)該組合物不含細菌蛋白質；(f)該組合物實質上不含細菌蛋白質；(g)該組合物不含除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質；(h)該組合物實質上不含除該成熟人類I型彈性蛋白酶以外之哺乳動物蛋白質。
284.實施例282或實施例283之醫藥組合物，其特徵在於該等性質(a)至(h)中之至少兩者。
285.實施例284之醫藥組合物，其中該至少兩種性質包括(a)及(c)。
286.實施例284之醫藥組合物，其中該至少兩種性質包括(b)及(d)。
287.實施例282或實施例283之醫藥組合物，其特徵在於該等性質(a)至(h)中之至少三者。
288.實施例284之醫藥組合物，其中該至少三種性質包括(a)、(c)及(e)。
289.實施例284之醫藥組合物，其中該至少三種性質包括(b)、(d)及(f)。
290.實施例282或實施例283之醫藥組合物，其特徵在於該等性質(a)至(h)中之至少四者。
291.實施例284之醫藥組合物，其中該至少四種性質包括(a)、(c)、(e)及(g)。
292.實施例284之醫藥組合物，其中該至少四種性質包括(b)、(d)、(f)及(h)。
293.實施例282或實施例283之醫藥組合物，其特徵在於該等性質(a)至(h)中之至少五者。
294.實施例282或實施例283之醫藥組合物，其特徵在於該等性質(a)至(h)中之至少六者。
295.實施例282或實施例283之醫藥組合物，其特徵在於該等性質(a)至(h)中之至少七者。
296.實施例282或實施例283之醫藥組合物，其特徵在於(a)至(h)之所有性質。
297.實施例282至296中任一者之醫藥組合物，其不含或實質上不含1種、2種、3種或全部4種由SEQ ID NO：85、86、94及95組成之 蛋白質。
298.實施例282至297中任一者之醫藥組合物，其不含或實質上不含由SEQ ID NO：85及SEQ ID NO：86組成之蛋白質。
299.實施例282至297中任一者之醫藥組合物，其不含或實質上不含由SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：95組成之蛋白質。
300.實施例282至297中任一者之醫藥組合物，其不含或實質上不含1種、2種或全部3種由SEQ ID NO：106、107及108組成之蛋白質。
301.實施例282至300中任一者之醫藥組合物，其含有醫藥學上可接受之含量的內毒素。
302.實施例301之醫藥組合物，其中該醫藥組合物為液體組合物且其中該醫藥學上可接受之含量的內毒素為8EU/ml或8EU/ml以下。
303.實施例302之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之含量的內毒素為5EU/ml或5EU/ml以下。
304.實施例301之醫藥組合物，其中該醫藥組合物為固體組合物且其中該醫藥學上可接受之含量的內毒素為每公克成熟人類I型彈性蛋白酶10EU或10EU以下。
305.實施例304之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之含量的內毒素為每公克成熟人類I型彈性蛋白酶5EU或5EU以下。
306.實施例282至305中任一者之醫藥組合物，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶特徵在於每毫克蛋白質1至40U之比活性。
307.實施例306之醫藥組合物，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶特徵在於每毫克蛋白質25至35U之比活性。
308.實施例306之醫藥組合物，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶特徵在於每毫克蛋白質大於10U之比活性。
309.實施例306之醫藥組合物，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶 特徵在於每毫克蛋白質大於20U之比活性。
310.實施例282至309中任一者之醫藥組合物，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶基本上由SEQ ID NO：5、84或87組成。
311.實施例310之醫藥組合物，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4組成。
312.實施例282至311中任一者之醫藥組合物，其中該胰蛋白酶活性對應於每1mg成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質小於4ng。
313.實施例312之醫藥組合物，其中該胰蛋白酶活性對應於每1mg成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質小於2ng。
314.一種基本上由SEQ ID NO：5、84或87組成之蛋白質的經凍乾調配物，其在復水後達到1mg/ml之該蛋白質濃度，該胰蛋白酶活性對應於小於2ng/ml胰蛋白酶。
315.實施例314之經凍乾調配物，其中水分含量小於5%。
316.實施例315之經凍乾調配物，其包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子及氯離子。
317.實施例315之經凍乾調配物，其包含聚山梨醇酯-80。
318.實施例315之經凍乾調配物，其包含葡聚糖。
319.實施例318之經凍乾調配物，其中該葡聚糖為葡聚糖-18。
320.實施例311之經凍乾調配物，其包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子及聚山梨醇酯-80。
321.實施例314之經凍乾調配物，其包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子及葡聚糖。
322.實施例321之經凍乾調配物，其中該葡聚糖為葡聚糖-18。
323.實施例314之經凍乾調配物，其包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子、聚山梨醇酯-80及葡聚糖。
324.實施例323之經凍乾調配物，其中該葡聚糖為葡聚糖-18。
325.一種液體調配物，其包含至少0.1mg/ml之基本上由SEQ ID NO：5、84或87組成之蛋白質的溶液，其中該胰蛋白酶活性對應於小於2ng/ml胰蛋白酶。
326.實施例325之液體調配物，其中該溶液為經緩衝溶液。
327.實施例326之液體調配物，其中該溶液經緩衝至7至8之pH值。
328.實施例326之液體調配物，其中該溶液為PBS。
329.實施例328之液體調配物，其中該溶液包含137mM氯化鈉、2.7mM磷酸鉀及10mM磷酸鈉。
330.實施例325至329中任一者之液體調配物，其進一步包含一或多種賦形劑。
331.實施例330之液體調配物，其中該一或多種賦形劑包含葡聚糖-18。
332.實施例331之液體調配物，其中該葡聚糖-18為每一體積該溶液8重量%之量。
333.實施例330之液體調配物，其中該一或多種賦形劑包含聚山梨醇酯-80。
334.實施例333之液體調配物，其中該聚山梨醇酯-80為每一體積該溶液0.01重量%之量。
335.實施例325至334中任一者之液體調配物，其中該溶液中該蛋白質之濃度在0.001mg/ml至40mg/ml之範圍內。
336.實施例335之液體調配物，其中該溶液中該蛋白質之濃度在0.1mg/ml至20mg/ml之範圍內。
337.實施例325至336中任一者之液體調配物，其進一步包含防腐劑、增溶劑及著色劑中之一或多者。
338.實施例325至337中任一者之液體調配物，其實質上不含除 SEQ ID NO：5、84或87之該蛋白質以外的哺乳動物蛋白質。
339.實施例325至338中任一者之液體調配物，其實質上不含細菌蛋白質。
340.一種調配物，其係藉由實施例225至258中任一者之方法製備或可藉由實施例225至258中任一者之方法獲得。
341.實施例340之調配物，其為液體調配物。
342.實施例340或341之調配物，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為人類I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
343.實施例342之調配物，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87組成。
344.實施例342之調配物，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4組成。
345.實施例340或341之調配物，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質為豬I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
346.實施例345之調配物，其中該成熟豬I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：39組成。
347.一種自正確與不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質之混合物移除一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質的方法，該方法包含：(a)使包含正確與不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質之混合物的組合物經受該正確加工之成熟酶具有活性之pH值；(b)維持該pH值直至使得該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解的時間，由此自正確與不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質之混合物移除該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質。
348.實施例347之方法，其中該一或多種不正確加工之成熟彈性 蛋白酶蛋白質相對於正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質在N-末端含有至少一個額外或較少胺基酸。
349.實施例347或348之方法，其中該pH值在5與12之間。
350.實施例347至349中任一者之方法，其中使該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解50%至100%。
351.實施例348之方法，其中使該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解50%至99%。
352.實施例348之方法，其中使該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解50%至98%。
353.實施例348之方法，其中使該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解50%至95%。
354.實施例348之方法，其中使該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解50%至90%。
355.實施例350至354中任一者之方法，其中使一種以上不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解至少50%。
356.實施例355之方法，其中使該混合物中之所有不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解至少50%。
357.實施例350至354中任一者之方法，其中使至少一種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解至少75%。
358.實施例357之方法，其中使一種以上不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解至少75%。
359.實施例357之方法，其中使該混合物中之所有不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解至少75%。
360.實施例350至354中任一者之方法，其中使至少一種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解至少90%。
361.實施例360之方法，其中使一種以上不正確加工之成熟彈性 蛋白酶蛋白質降解至少90%。
362.實施例360之方法，其中使該混合物中之所有不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解至少90%。
363.實施例347至362中任一者之方法，其中該組合物為該總彈性蛋白酶蛋白質之濃度為10mg/ml或10mg/ml以下的液體組合物。
364.實施例347至362中任一者之方法，其中該組合物為該總彈性蛋白酶蛋白質之濃度為5mg/ml或5mg/ml以下的液體組合物。
365.實施例347至362中任一者之方法，其中該組合物為該總彈性蛋白酶蛋白質之濃度為2mg/ml或2mg/ml以下的液體組合物。
366.實施例347至362中任一者之方法，其中該組合物為該總彈性蛋白酶蛋白質之濃度為1mg/ml或1mg/ml以下的液體組合物。
367.實施例347至362中任一者之方法，其中該組合物為該總彈性蛋白酶蛋白質之濃度為0.5mg/ml或0.5mg/ml以下的液體組合物。
368.實施例347至362中任一者之方法，其中該組合物為該總彈性蛋白酶蛋白質之濃度為0.25mg/ml或0.25mg/ml以下的液體組合物。
369.實施例363至368中任一者之方法，其中該組合物為該總彈性蛋白酶蛋白質之濃度為至少0.1mg/ml的液體組合物。
370.實施例363至368中任一者之方法，其中該組合物為該總彈性蛋白酶蛋白質之濃度為至少0.2mg/ml的液體組合物。
371.實施例347至370中任一者之方法，其中該組合物中之胰蛋白酶活性為每毫克總彈性蛋白酶蛋白質小於4ng/ml胰蛋白酶。
372.實施例347至370中任一者之方法，其中該組合物中之該胰蛋白酶活性為每毫克總彈性蛋白酶蛋白質小於2ng/ml胰蛋白酶。
373.實施例347至372中任一者之方法，其中該組合物不含或實質上不含由SEQ ID NO：104組成之蛋白質及/或不含或實質上不含由 SEQ ID NO：105組成之蛋白質。
374.一種產生包含成熟I型彈性蛋白酶之醫藥組合物之方法，該方法包含(i)藉由實施例261至265中任一者之方法產生經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶；及(ii)在水或醫藥學上可接受之載劑中將該經凍乾之成熟I型彈性蛋白酶復水，由此產生包含成熟人類I型彈性蛋白酶之醫藥組合物。
375.一種產生包含成熟I型彈性蛋白酶之醫藥組合物之方法，該方法包含在水或醫藥學上可接受之載劑中將實施例314至324中任一者之凍乾調配物復水，由此產生包含成熟I型彈性蛋白酶之醫藥組合物。
376.實施例374或實施例375之方法，其中該醫藥組合物包含磷酸鹽。
377.實施例374至376中任一者之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶為成熟人類I型彈性蛋白酶。
378.實施例377之方法，其特徵在於每毫克蛋白質1至40U之比活性。
379.實施例377之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶特徵在於每毫克蛋白質25至35U之比活性。
380.實施例377至379中任一者之方法，其中該醫藥組合物中之該成熟人類I型彈性蛋白酶在4℃下儲存至少一週後、在4℃下儲存至少一個月後、在4℃下儲存至少兩個月後、在4℃下儲存至少三個月後或在4℃下儲存至少六個月後保持其比活性之60%至100%。
381.實施例377至379中任一者之方法，其中該醫藥組合物中之該成熟人類I型彈性蛋白酶在4℃下儲存至少一週後、在4℃下儲存至少一個月後、在4℃下儲存至少兩個月後、在4℃下儲存至少三個月後或在4℃下儲存至少六個月後保持其比活性之60%至98%。
382.實施例377至379中任一者之方法，其中該醫藥組合物中之該成熟人類I型彈性蛋白酶在4℃下儲存至少一週後、在4℃下儲存至少一個月後、在4℃下儲存至少兩個月後、在4℃下儲存至少三個月後或在4℃下儲存至少六個月後保持其比活性之60%至95%。
383.實施例377至379中任一者之方法，其中該醫藥組合物中之該成熟人類I型彈性蛋白酶在4℃下儲存至少一週後、在4℃下儲存至少一個月後、在4℃下儲存至少兩個月後、在4℃下儲存至少三個月後或在4℃下儲存至少六個月後保持其比活性之60%至90%。
384.實施例377至379中任一者之方法，其中該醫藥組合物中之該成熟人類I型彈性蛋白酶在4℃下儲存至少一週後、在4℃下儲存至少一個月後、在4℃下儲存至少兩個月後、在4℃下儲存至少三個月後或在4℃下儲存至少六個月後保持其比活性之60%至80%。
385.實施例377至384中任一者之方法，其中該醫藥組合物中之該成熟人類I型彈性蛋白酶在4℃下儲存一週後保持其比活性之至少70%。
386.一種醫藥組合物，其係藉由實施例374至385中任一者之方法製備或可藉由實施例374至385中任一者之方法獲得。
387.一種在治療上增加有需要之人類個體中之動脈或靜脈之直徑的方法，該方法包含：向該人類個體中之該動脈或靜脈之壁局部投予足以增加該動脈或靜脈之直徑之量的(a)實施例277至313及386中任一者之醫藥組合物、(b)實施例325至339中任一者之液體調配物或(c)實施例341之調配物。
388.實施例387之方法，其中該血管之直徑、該血管之內腔直徑或兩者得以增加。
389.一種用於預防或治療有需要之人類個體中動脈或靜脈之血管痙攣的方法，該方法包含：向該人類個體中之該動脈或靜脈之壁局 部投予足以預防或治療該動脈或靜脈之血管痙攣之量的(a)實施例277至313及386中任一者之醫藥組合物、(b)實施例325至339中任一者之液體調配物或(c)實施例341之調配物。
390.一種用於治療需要該治療之人類個體中受阻塞動脈或靜脈的方法，該方法包含：向該人類個體中之該動脈或靜脈之壁局部投予(a)實施例277至313及386中任一者之醫藥組合物、(b)實施例325至339中任一者之液體調配物或(c)實施例341之調配物，其中該投藥使得該動脈或靜脈之壁中之彈性蛋白發生蛋白水解，引起該動脈或靜脈之直徑擴大。
391.一種用於治療在需要該治療之人類個體中連接至動靜脈血液透析移植物或動靜脈瘺之動脈或靜脈的方法，該方法包含：向該人類個體中之該動脈或靜脈之壁局部投予(a)實施例277至313及386中任一者之醫藥組合物、(b)實施例325至339中任一者之液體調配物或(c)實施例341之調配物，其中該投藥使得該動脈或靜脈之壁中之彈性蛋白發生蛋白水解，引起該動脈或靜脈之直徑擴大。
392.一種用於治療人類個體中供血液透析用之靜脈的方法，該方法包含：向該人類個體中之該靜脈之壁局部投予(a)實施例277至313及386中任一者之醫藥組合物、(b)實施例325至339中任一者之液體調配物或(c)實施例341之調配物，其中該投藥使得該靜脈之壁中之彈性蛋白發生蛋白水解，引起該靜脈之直徑擴大。
393.實施例387至392中任一者之方法，其進一步包含將傳遞裝置之一部分插入該動脈或靜脈之壁中以將彈性蛋白酶傳遞至該動脈或靜脈之壁。
394.實施例387至393中任一者之方法，其中該醫藥組合物或該液體調配物係藉由導管來投予。
395.實施例387至394中任一者之方法，其中該醫藥組合物或該 液體調配物係直接投至該動脈或靜脈之壁中。
396.實施例387至395中任一者之方法，其中該動脈或靜脈受阻塞。
397.實施例396之方法，其中該動脈或靜脈因狹窄而受阻塞。
398.實施例397之方法，其中該阻塞在治療之前允許不足量之血液通過。
399.實施例398之方法，其中該阻塞為狹窄。
400.實施例399之方法，其中該動脈或靜脈因內膜增生而受阻塞。
401.實施例387至400中任一者之方法，其中向受阻塞冠狀或外周動脈投予該醫藥組合物或該液體調配物。
402.實施例387至395中任一者之方法，其中該動脈或靜脈易因內膜增生而受阻塞。
403.實施例387至400及402中任一者之方法，其中向該靜脈壁投予該組合物。
404.實施例403之方法，其中該靜脈係連接至動靜脈血液透析移植物或動靜脈瘺。
405.實施例404之方法，其中該靜脈係用於血液透析。
406.實施例405之方法，其進一步包含將該靜脈直接連接至動脈或將該靜脈經由移植物連接至動脈。
407.實施例387至394中任一者之方法，其中向由外科手術暴露之動脈或靜脈之外膜表面投予該組合物。
408.實施例387至407中任一者之方法，其中該醫藥組合物、該液體調配物或該調配物中之該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質分別為人類I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
409.實施例408之方法，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質 基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87組成。
410.實施例408之方法，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4組成。
411.實施例387至407中任一者之方法，其中該醫藥組合物、該液體調配物或該調配物中之該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質分別為豬I型成熟彈性蛋白酶蛋白質。
412.實施例411之方法，其中該成熟豬I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：39組成。
413.一種單位劑量，其包含0.0033mg至200mg之(a)實施例273或實施例274之成熟人類I型彈性蛋白酶或(b)藉由實施例259之方法產生或可藉由實施例259之方法獲得之成熟人類I型彈性蛋白酶調配物。
414.實施例413之單位劑量，其中該成熟人類I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87組成。
415.一種單位劑量，其包含0.0033mg至200mg之(a)實施例275或實施例276之成熟豬I型彈性蛋白酶或(b)藉由實施例260之方法產生或可藉由實施例260之方法獲得之成熟豬I型彈性蛋白酶調配物。
416.實施例415之單位劑量，其中該成熟豬I型彈性蛋白酶蛋白質基本上由SEQ ID NO：39組成。
417.實施例413至416中任一者之單位劑量，其包含0.5mg至50mg之該成熟I型彈性蛋白酶。
418.實施例417之單位劑量，其包含1mg至20mg之該成熟I型彈性蛋白酶。
419.實施例418之單位劑量，其包含5mg至10mg之該成熟I型彈性蛋白酶。
420.實施例413至419中任一者之單位劑量，其處於容器、包裝、分配器或導管中。
421.一種套組，其包含實施例1至39及68至69中任一者或藉由或可藉由實施例89至224、261至276及347至373中任一者之方法獲得之彈性蛋白酶蛋白質、實施例40至67中任一者之核酸、實施例70至72中任一者之載體、實施例73至87中任一者之細胞、實施例88之細胞培養上清液、實施例314至346中任一者或藉由或可藉由實施例261至276中任一者之方法獲得之彈性蛋白酶調配物、實施例277至313及386中任一者或藉由或可藉由實施例374至385中任一者之方法獲得之醫藥組合物或實施例415至420中任一者之單位劑量。
422.實施例421之套組，其為治療套組。
423.實施例422之套組，其包含容器、包裝、分配器或導管。
424.實施例423之套組，其為製備套組。
本發明進一步由關於SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：69之彈性蛋白酶原蛋白質之以下特定實施例例示：
1.一種蛋白質，其包含SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69之胺基酸序列。
2.特定實施例1之蛋白質，其係經分離。
3.一種核酸分子，其包含編碼特定實施例1之蛋白質之核苷酸序列。
4.特定實施例3之核酸分子，其中該蛋白質包含可操作性連接於SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69之該胺基酸序列之信號序列。
5.特定實施例4之核酸分子，其中該信號序列在甲醇酵母中可操作。
6.特定實施例5之核酸分子，其中該信號序列為酵母α-因子信號肽。
7.一種載體，其包含特定實施例4之核酸分子。
8.特定實施例7之載體，其中該核苷酸序列係經多聚化。
9.一種宿主細胞，其包含特定實施例7之載體。
10.特定實施例9之宿主細胞，其中該載體之至少一個複本整合至該宿主細胞基因組中。
11.特定實施例10之宿主細胞，其中該載體之2至5個複本整合至該宿主細胞基因組中。
12.特定實施例9之宿主細胞，其中該核苷酸序列係經多聚化。
13.特定實施例12之宿主細胞，其中該載體包含該核苷酸序列之2至5個複本。
14.一種細胞，其經遺傳工程化以表現特定實施例3之核酸分子。
15.特定實施例14之細胞，其為甲醇酵母細胞。
16.特定實施例15之細胞，其中該核苷酸序列可操作性連接於甲醇誘導性啟動子。
17.一種細胞培養上清液，其包含特定實施例1之蛋白質。
18.一種產生彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含在表現SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69之蛋白質的條件下培養特定實施例15之細胞。
19.特定實施例18之方法，其中該等條件包括以下方面中之一者、兩者、三者或全部四者：(i)在2至6之pH值下生長或誘導一段時期；(b)在22℃至28℃之溫度下生長或誘導一段時期；(iii)在複合培養基中培養；或(iv)在檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下培養。
20.特定實施例18之方法，其進一步包含回收該蛋白質。
21.特定實施例18之方法，其進一步包含使SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69之該蛋白質暴露於活化條件以產生成熟彈性蛋白酶蛋白質。
22.特定實施例21之方法，其中該蛋白質在該暴露於活化條件之前經純化。
23.特定實施例22之方法，其中在檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下純化該蛋白質。
24.特定實施例21之方法，其進一步包含純化該成熟彈性蛋白酶蛋白質。
25.特定實施例24之方法，其進一步包含凍乾該經純化之成熟彈性蛋白酶蛋白質。
26.一種製備成熟彈性蛋白酶蛋白質之方法，其包含使特定實施例17之細胞培養上清液經受自體活化條件，由此產生成熟彈性蛋白酶蛋白質。
27.特定實施例26之方法，其進一步包含純化該成熟彈性蛋白酶蛋白質。
28.特定實施例27之方法，其進一步包含凍乾該經純化之成熟彈性蛋白酶蛋白質。
29.一種製備包含成熟彈性蛋白酶蛋白質之醫藥組合物之方法，其將包含藉由特定實施例25或特定實施例28之方法產生之經凍乾彈性蛋白酶原蛋白質的凍乾物復水。
30.特定實施例29之方法，其中該凍乾物(a)包含一或多種緩衝成份或(b)不包含緩衝成份。
31.特定實施例30之方法，其中將該凍乾物以水或緩衝液復水。
32.特定實施例31之方法，其中在復水之後，產生成熟彈性蛋白酶蛋白質於全強度緩衝液、大於全強度之緩衝液或小於全強度之緩衝液中之溶液。
33.特定實施例32之方法，其中該緩衝液為磷酸鹽緩衝鹽水。
34.特定實施例29之方法，其中將該成熟彈性蛋白酶蛋白質復水至0.001mg/ml至50mg/ml之濃度。
35.特定實施例29之方法，其中該成熟彈性蛋白酶蛋白質具有每 毫克蛋白質1至40U之比活性。
36.一種醫藥組合物，其係藉由特定實施例29之方法產生。
37.特定實施例36之醫藥組合物，其特徵在於以下性質中之至少一者、至少兩者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者或至少七者：(a)該組合物不含胰蛋白酶；(b)該組合物實質上不含胰蛋白酶；(c)該組合物不含由SEQ ID NO：70及71組成之任何蛋白質；(d)該組合物實質上不含由SEQ ID NO：2及3組成之任何蛋白質；(e)該組合物不含細菌蛋白質；(f)該組合物實質上不含細菌蛋白質；(g)該組合物不含除該成熟彈性蛋白酶蛋白質以外之哺乳動物蛋白質；(h)該組合物實質上不含除該成熟彈性蛋白酶蛋白質以外之哺乳動物蛋白質；(i)該組合物不含或實質上不含1種、2種、3種或全部4種由SEQ ID NO：85、86、94及95組成之蛋白質；(j)該組合物不含或實質上不含1種、2種或全部3種由SEQ ID NO：106、107及108組成之蛋白質；(k)該組合物含有醫藥學上可接受之含量的內毒素；(l)該組合物中之成熟彈性蛋白酶蛋白質特徵在於每毫克蛋白質1至40U之比活性；(m)該組合物中之該胰蛋白酶活性對應於每1毫克成熟彈性蛋白酶蛋白質小於4ng；(n)該組合物包含聚山梨醇酯-80； (o)該組合物包含葡聚糖；(p)該組合物包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子及聚山梨醇酯-80；(q)該組合物包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子及葡聚糖；(r)該組合物包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子、聚山梨醇酯-80及葡聚糖；(s)該組合物中之成熟彈性蛋白酶蛋白質在4℃下儲存至少一週後、在4℃下儲存至少一個月後、在4℃下儲存至少兩個月後、在4℃下儲存至少三個月後或在4℃下儲存至少六個月後保持其比活性之60%至100%；及(t)該組合物包含0.0033mg至200mg之該成熟彈性蛋白酶蛋白質之單位劑量。
38.特定實施例37之醫藥組合物，其中該醫藥組合物特徵在於獨立地選自以下之群(i)至(v)之至少三個特徵、至少四個特徵或五個特徵：(i) (a)、(b)或(m)(ii) (e)或(f)(iii) (g)或(h)(iv) (k)(v) (l)。
39.38之醫藥組合物，其中該至少三個或該至少四個特徵中之兩者係選自群(i)及(iv)或(v)。
40.38之醫藥組合物，其中該至少四個特徵中之三者係選自群(i)、(iv)及(v)。
41.一種自正確與不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質之混合物 移除一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質的方法，該方法包含：(a)使包含正確與不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質之混合物的組合物經受該正確加工之成熟酶具有活性之pH值；(b)維持該pH值直至使得該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解的時間，由此自正確與不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質之混合物移除該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質。
42.特定實施例41之方法，其中該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質相對於正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質在N-末端含有至少一個額外或較少胺基酸。
43.特定實施例41之方法，其中該pH值在5與12之間。
44.特定實施例41之方法，其中使該一或多種不正確加工之成熟彈性蛋白酶蛋白質降解50%至100%。
45.一種在在治療上增加有需要之人類個體中之動脈或靜脈之直徑的方法，該方法包含：向該人類個體中之該動脈或靜脈之壁局部投予足以增加該動脈或靜脈之直徑之劑量的特定實施例36之醫藥組合物。
46.特定實施例45之方法，其中血管直徑、血管之內腔直徑或兩者得以增加。
47.一種用於預防或治療有需要之人類個體中動脈或靜脈之血管痙攣的方法，該方法包含：向該人類個體中之該動脈或靜脈之壁局部投予足以預防或治療該動脈或靜脈之血管痙攣之劑量的特定實施例36之醫藥組合物。
48.一種用於治療需要該治療之人類個體中受阻塞動脈或靜脈的方法，該方法包含：向該人類個體中之該動脈或靜脈之壁局部投予特 定實施例36之醫藥組合物，其中該投藥使得該動脈或靜脈之壁中之彈性蛋白發生蛋白水解，引起該動脈或靜脈之直徑擴大。
49.一種用於治療在需要該治療之人類個體中連接至動靜脈血液透析移植物或動靜脈瘺之動脈或靜脈的方法，該方法包含：向該人類個體中之該動脈或靜脈之壁局部投予特定實施例36之醫藥組合物，其中該投藥使得該動脈或靜脈之壁中之彈性蛋白發生蛋白水解，引起該動脈或靜脈之直徑擴大。
50.一種用於治療人類個體中供血液透析用之靜脈的方法，該方法包含：向該人類個體中之該靜脈之壁局部投予特定實施例36之醫藥組合物，其中該投藥使得該靜脈之壁中之彈性蛋白發生蛋白水解，引起該靜脈之直徑擴大。
51.一種套組，其包含特定實施例36之醫藥組合物。
52.特定實施例51之套組，其中該醫藥組合物處於容器、包裝、分配器或導管中。
2007年12月4日申請之美國臨時申請案第60/992,319號之申請專利範圍以全文引用的方式併入本文中，且該申請專利範圍中闡述之各實施例以引用為特定實施例的方式併入本文中。
本發明在範疇上不受本文所述之特定實施例限制。實際上，除本文所述之彼等修改形式外的本發明之各種修改形式對熟習此項技術者而言將自上文描述及附圖而變得明顯。意欲該等修改形式在隨附申請專利範圍之範疇內。
本文中引用各種參考文獻，包括專利申請案、專利及科學出版物；因此，各參考文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
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<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<400> 63
<210> 64
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對 該等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 64
<210> 65
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 65
<210> 66
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 66
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<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
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<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
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<400> 67
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<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 68
<210> 69
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 69
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<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (204)..(204)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(204)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 70
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<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (203)..(203)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (203)..(203)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 71
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<400> 72
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<400> 73
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> /置換=“His”或“Pro”或“Gly”或“Asp”或 “Lys”或“Ala”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“Ala”或“Pro”或“His”
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> /置換=“Leu”或“異白胺酸”或“Met”或“Lys” 或“Asp”或“Val”
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> /置換=“Ala”或“Leu”或“異白胺酸”或“Glv” 或“V/al”或“Thr”
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(6)
<223> /置換=“Leu”或“Val”或“異白胺酸”或“Ser”
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> /置換=“Leu”或“Val”
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> /置換=“Thr”或“苯丙胺酸”或“Tyr”或“Trp”
<220>
<221> misc_fealure
<222> (1)..(8)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 74
<210> 75
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成寡核苷酸”
<400> 75
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成寡核苷酸”
<400> 76
<210> 77
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
<210> 78
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (26)..(26)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (41)..(41)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (202)..(202)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (202)..(202)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (225)..(225)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (225)..(225)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 78
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 79
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> /置換=“His”或“Pro”或“Gly”或“Asp”或“Lys”或“Ala”
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> /置換=“Ala”或“Pro”或“His”
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> /置換=”Leu”或“異白胺酸”或“Met”或“Lys”或“Asp”或“Val”
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> /置換=“Ala”或“Leu”或“異白胺酸”或“Gly”或“Val”或“Thr”
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /置換=“Leu”或“Val”或“異白胺酸”或“Ser”
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(10)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 80
<210> 81
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成聚核苷酸”
<400> 81
<210> 82
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<400> 82
<210> 83
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 83
<210> 84
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (26)..(26)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (41)..(41)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (202)..(202)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (202)..(202)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (225)..(225)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (225)..(225)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 84
<210> 85
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (25)..(25)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (40)..(40)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (201)..(201)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (201)..(201)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (224)..(224)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (224)..(224)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 85
<210> 86
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (24)..(24)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (39)..(39)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (200)..(200)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (200)..(200)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (223)..(223)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (223)..(223)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 86
<210> 87
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (26)..(26)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (41)..(41)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (202)..(202)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (202)..(202)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (225)..(225)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (225)..(225)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 87
<210> 88
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 88
<210> 89
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 89
<210> 90
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 90
<210> 91
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 91
<210> 92
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 92
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> /置換=“Leu”或“異白胺酸”或“Met”或“Lys”
或“Asp”或“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> /置換=“Leu”或“Val”或“異白胺酸”或“Ser”
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 93
<210> 94
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (43)..(43)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (204)..(204)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(204)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (227)..(227)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (227)..(227)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 94
<210> 95
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (27)..(27)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (203)..(203)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (203)..(203)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (226)..(226)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (226)..(226)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 95
<210> 96
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<400> 96
<210> 97
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<400> 97
<210> 98
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 98
<210> 99
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 99
<210> 100
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 100
<210> 101
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 101
<210> 102
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 102
<210> 103
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換=“His”
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (51)..(51)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (212)..(212)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (212)..(212)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (235)..(235)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 103
<210> 104
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (43)..(43)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (204)..(204)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(204)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (227)..(227)
<223> /置換= Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (227)..(227)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 104
<210> 105
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (27)..(27)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (203)..(203)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (203)..(203)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (226)..(226)
<223> /置換="Arg"
<220>
<221> misc_feature
<222> (226)..(226)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 105
<210> 106
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (22)..(22)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (37)..(37)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該
<222> (37)..(37) 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (198)..(198)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (198)..(198)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (221)..(221)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該
<222> (221)..(221) 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 106
<210> 107
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (35)..(35)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (196)..(196)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (196)..(196)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (219)..(219)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (219)..(219)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 107
<210> 108
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (17)..(17)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (32)..(32)
<223> /置換=“Val”
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (193)..(193)
<223> /置換=“Leu”
<220>
<221> misc_feature
<222> (193)..(193)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<220>
<221> VARIANT
<222> (216)..(216)
<223> /置換=“Arg”
<220>
<221> misc_feature
<222> (216)..(216)
<223> /注意=“序列中給出之殘基並不優先於針對該 等位置之註釋中的彼等殘基”
<400> 108
<210> 109
<211> 781
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成聚核苷酸”
<400> 109
<210> 110
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
<400> 110
<210> 111
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成聚核苷酸”
<400> 111
<210> 112
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<400> 112
<210> 113
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成聚核苷酸”
<400> 113
<210> 114
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成多肽”
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<400> 115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<400> 116
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<400> 117
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> source
<223> /注意=“對人工序列之描述：合成肽”
<400> 118

Claims (58)

  1. 一種自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其包含(i)包括彈性蛋白酶活化肽序列的肽原(propeptide)序列，該彈性蛋白酶活化肽序列包含P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1之胺基酸，其中P3-P2-P1之胺基酸經工程化以形成彈性蛋白酶識別序列，該肽原序列可操作性連接於(ii)成熟I型彈性蛋白酶之胺基酸序列，其3個N端胺基酸為P1'-P2'-P3'，其中(a)該肽原序列相對該成熟I型彈性蛋白酶並非天然的，且(b)當處於自體活化條件時，產生成熟I型彈性蛋白酶。
  2. 如請求項1之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其中：(a)具有位於P2位置之脯胺酸殘基；(b)P3至P1之胺基酸由下列胺基酸序列所組成：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：93；(c)P5至P3'之胺基酸由下列胺基酸序列所組成：SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60；或(d)P10至P1之胺基酸由下列胺基酸序列所組成：SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：80。
  3. 如請求項1或2之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其中：(a)該自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質包含SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：68之胺基酸序列；(b)該成熟I型彈性蛋白酶為成熟人類I型彈性蛋白酶；或(c)該成熟I型彈性蛋白酶為成熟豬I型彈性蛋白酶。
  4. 如請求項3之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其中該成熟I型彈性蛋白酶為成熟人類I型彈性蛋白酶，其包含具有以下之胺基酸序列(i)與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：84之胺基酸序列具有至少85%序列一致性、至少95%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性或100%序列一致性；或(ii)相對於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：84之胺基酸序列具有不超過15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個保守胺基酸取代，及/或相對於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：84之胺基酸序列具有不超過5、4、3、2或1個非保守胺基酸取代。
  5. 如請求項3之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其中該成熟I型彈性蛋白酶為成熟豬I型彈性蛋白酶，其包含具有以下之胺基酸序列(i)與SEQ ID NO：39之胺基酸序列具有至少85%序列一致性、至少95%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性或100%序列一致性；或(ii)相對於SEQ ID NO：39之胺基酸序列具有不超過15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個保守胺基酸取代，及/或相對於SEQ ID NO：39之胺基酸序列具有不超過5、4、3、2或1個非保守胺基酸取代。
  6. 如請求項1或2之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其：(a)缺乏信號序列；(b)包含信號序列；(c)包含酵母α-因子肽原；(d)包括一或多個間隔子序列；(e)缺乏N端甲硫胺酸殘基；或(f)包括N端甲硫胺酸殘基。
  7. 如請求項6之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其包含在甲醇酵母(Pichia pastoris)中可操作之信號序列。
  8. 如請求項7之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其中該信號序列為酵母α-因子信號序列，及/或包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列。
  9. 如請求項6之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其包含信號序列，其中該信號序列為哺乳動物分泌信號序列。
  10. 如請求項9之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其中該哺乳動物分泌信號序列為人類I型彈性蛋白酶信號序列或豬I型彈性蛋白酶信號序列。
  11. 如請求項6之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質，其包含間隔子序列，該間隔子序列為Kex2序列及/或STE13序列。
  12. 一種細胞培養上清液，其包含如請求項1至11中任一項之自體活化的I型彈性蛋白酶原蛋白質。
  13. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至11中任一項之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質。
  14. 一種載體，其包含如請求項13之核酸分子。
  15. 如請求項14之載體，其中：(a)該編碼自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質之序列係多聚化；(b)該編碼自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質之序列使用在甲醇酵母(Pichia pastoris)中偏好使用之密碼子；或(c)該載體包含對Zeocin抗性之可選擇標誌。
  16. 一種宿主細胞，其：(a)經基因工程化以表現如請求項13之核酸分子；或(b)包含如請求項14或15之載體。
  17. 如請求項16之宿主細胞，其中(i)該核酸之一複本嵌入宿主細胞基因體；(ii)該核酸之超過一個複本嵌入宿主細胞基因體；(iii)該載體之一複本嵌入宿主細胞基因體；或(iv)該載體之超過一個複本嵌入宿主細胞基因體。
  18. 如請求項17之宿主細胞，其中該核酸之2-5個複本、2個複本或3個複本嵌入宿主細胞基因體。
  19. 如請求項17之宿主細胞，其中該載體之2-5個複本、2個複本或3個複本嵌入宿主細胞基因體。
  20. 如請求項16之宿主細胞，其中該自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質之表現係在甲醇誘導性啟動子控制下，及/或其中該宿主細胞為甲醇酵母宿主細胞。
  21. 一種製備自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質之方法，包括在產生該彈性蛋白酶原蛋白質之條件下培養如請求項16至20中任一項之宿主細胞及回收該彈性蛋白酶原蛋白質。
  22. 如請求項21之方法，其中(a)該宿主細胞培養在複合培養基中；及/或(b)該彈性蛋白酶原蛋白質之表現係在甲醇誘導性啟動子控制下，且其中該培養條件包含一段甲醇誘導；及/或(c)該宿主細胞係在檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下培養；及/或(d)該宿主細胞為甲醇酵母宿主細胞，且其中該等培養條件包括一段生長或誘導時期：(i)在22℃至28℃之溫度下；或(ii)在2至6之pH下(e)該宿主細胞培養於複合培養基中，且該回收自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質之回收步驟包括自宿主細胞培養物回收上清液。
  23. 如請求項22之方法，其中該宿主細胞培養於複合培養基中，其中該複合培養基以甲醇複合培養基緩衝或以甘油複合培養基緩衝。
  24. 如請求項22之方法，其中該宿主細胞係在檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物存在下培養，且其中(i)該檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物分別為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉或乙酸鈉；及/或(ii)至少一種檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽化合物係以5-50mM、7.5-100mM、10-150mM、50-200mM、100-150mM、75-125mM或90-110mM之濃度存在於該培養物中。
  25. 如請求項22之方法，其中該宿主細胞培養於複合培養基中，且該回收自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質之步驟包括自宿主細胞培養物回收上清液，且進一步包括自該上清液回收自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質。
  26. 如請求項21之方法，其進一步包括使回收之彈性蛋白酶原蛋白質經受活化條件，使產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質。
  27. 如請求項26之方法，其中：(a)該活化條件包括調整含有自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質之溶液之pH至鹼性pH、7至9之pH或8之pH，直到產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質；及/或(b)該活化條件包括添加催化量之彈性蛋白酶至含有自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質之溶液；及/或(c)自體活化於濃度50-200mM、75-175mM、100-150mM、75-125mM濃度之Tris鹼下進行；及/或(d)該活化條件維持至N端變異體減少至0-2%之範圍。
  28. 如請求項27之方法，其中該活化條件包括調整含有自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質之溶液之pH至鹼性pH、7至9之pH或8之pH，直到產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質，且其中：(i)該pH維持歷時0.5至8小時、2-7小時或6小時之時期；及/或(ii)該暴露於鹼性pH係在22℃至28℃之溫度下或26℃之溫度下進行；及/或(iii)該溶液中回收自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質之濃度小於10mg/ml、小於5mg/ml、小於2mg/ml、小於1mg/ml、小於0.5mg/ml、小於0.25mg/ml及/或小於0.1mg/ml或至少0.2mg/ml。
  29. 如請求項26之方法，其中：(a)該自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質純化後，該自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質經受活化條件；或(b)該自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質於上清液中經受活化條件。
  30. 如請求項26至29中任一項之方法，其進一步包括分離成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之步驟。
  31. 如請求項30之方法，其中：(a)以管柱層析分離成熟I型彈性蛋白酶蛋白質；及/或(b)移除成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之糖化型式。
  32. 如請求項31之方法，其中該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質係以包含陽離子交換層析之管柱層析分離。
  33. 一種製備成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之調配物之方法，該方法包括：(a)使如請求項1至11中任一項之自體活化的彈性蛋白酶原蛋白質經受自體活化條件，使產生成熟I型彈性蛋白酶蛋白質；及(b)調配該成熱I型彈性蛋白酶蛋白質，藉此產生含有該成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之調配物。
  34. 如請求項33之方法，其進一步包含在調配該成熱I型彈性蛋白酶蛋白質前，純化該成熱I型彈性蛋白酶蛋白質。
  35. 如請求項34之方法，包括經由管柱層析純化純化該成熟I型彈性蛋白酶。
  36. 如請求項35之方法，其中該管柱層析包含陽離子交換層析。
  37. 如請求項33至36中任一項之方法，其中調配成熟I型彈性蛋白酶蛋白質包括凍乾該成熟I型彈性蛋白酶。
  38. 如請求項37之方法，其進一步包含在凍乾前或後混合熟I型彈性蛋白酶蛋白質及一或多種緩衝成份。
  39. 一種醫藥組合物，其包括使用比色N-琥珀醯基-Ala-Ala-Ala-對硝基苯胺(SLAP)之水解檢定所量化之具有20至50U/mg蛋白質活性之成熟I型彈性蛋白酶蛋白質，其中該醫藥組合物中胰蛋白酶之上限為每1mg成熟I型彈性蛋白酶蛋白質小於25ng胰蛋白酶。
  40. 如請求項39之醫藥組合物，其中：(i)該成熟I型彈性蛋白酶包括與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：84之胺基酸序列具有至少85%序列一致性、至少95%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性或100%序列一致性之胺基酸序列；或(ii)該成熟I型彈性蛋白酶包括相對於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：84之胺基酸序列具有不超過15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個保守胺基酸取代，及/或不超過5、4、3、2或1個非保守胺基酸取代之胺基酸序列。
  41. 一種醫藥組合物，其包含具有使用比色N-琥珀醯基-Ala-Ala-Ala-對硝基苯胺(SLAP)之水解檢定所量化之具有20至100U/mg蛋白質活性之成熟I型彈性蛋白酶蛋白質，其中該醫藥組合物中胰蛋白酶之上限為每1mg成熟I型彈性蛋白酶蛋白質小於25ng胰蛋白酶。
  42. 如請求項41之如請求項35之方法，其中：(i)該成熟I型彈性蛋白酶包括與SEQ ID NO：39之胺基酸序列具有至少85%序列一致性、至少95%序列一致性、至少98%序列一致性、至少99%序列一致性或100%序列一致性之胺基酸序列；或(ii)該成熟I型彈性蛋白酶包括相對於SEQ ID NO：39之胺基酸序列具有不超過15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個保守胺基酸取代，及/或不超過5、4、3、2或1個非保守胺基酸取代之胺基酸序列。
  43. 如請求項39之醫藥組合物，其中：(a)該組合物中胰蛋白酶活性之上限為每1mg成熟I型彈性蛋白酶蛋白質小於4、3、2或1.56ng；(b)該醫藥組合物無胰蛋白酶；及/或(c)該醫藥組合物之特徵為下列之一或多個：(i)該醫藥組合物不含細菌蛋白質；(ii)該醫藥組合物不含該成熟彈性蛋白酶蛋白質以外之哺乳動物蛋白質；(iii)該醫藥組合物中內毒素之量不超過醫藥上可接受之量、不超過每公克I型彈性蛋白酶10 EU或不超過每公克I型彈性蛋白酶5 EU；(iv)該醫藥組合物為劑量型式，包含0.0033mg-200mg之該成熟彈性蛋白酶蛋白質；(v)該醫藥組合物包含聚山梨醇酯-80；(vi)該醫藥組合物包含葡聚糖；(vii)該醫藥組合物包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子及聚山梨醇酯-80；(viii)該醫藥組合物包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子及葡聚糖；(ix)該醫藥組合物包含鈉離子、鉀離子、磷酸根離子、氯離子、聚山梨醇酯-80及葡聚糖；(x)該醫藥組合物包含海藻糖；(xi)該醫藥組合物包含甘露糖醇；(xii)在儲存於4℃至少1個月後、儲存於4℃至少3個月後或儲存於4℃至少6個月後，該醫藥組合物中之成熟彈性蛋白酶蛋白質維持其比活性之60%至100%。
  44. 如請求項43之醫藥組合物，其中該組合物中胰蛋白酶活性之上限為每1mg成熟I型彈性蛋白酶蛋白質小於4、3、2或1.56ng，且其中該組合物中胰蛋白酶活性之上限使用N-苯甲醯基-Phe-Val-Arg-對硝基苯胺(BENZ)比色水解胰蛋白酶活性檢定。
  45. 如請求項39之醫藥組合物，其：(a)含有小於0.5%重量比之由SEQ ID NO：2所組成之蛋白質，及/或小於0.5%重量比之由SEQ ID NO：3所組成之蛋白質；及/或(b)不含或實質上不含由SEQ ID NO：70及71所組成之蛋白質。
  46. 如請求項45之醫藥組合物，其不含或或實質上不含SEQ ID NO：2之蛋白質及SEQ ID NO：3所組成之蛋白質。
  47. 如請求項45之醫藥組合物，其不含或實質上不含由SEQ ID NO：37、38、85、86、94、95、104、105、106、107及108所組成之一或多種蛋白質。
  48. 如請求項47之醫藥組合物，其不含或實質上不含由SEQ ID NO：37、38、85、86、94、95、104、105、106、107或108任一者所組成之蛋白質。
  49. 如請求項39至48中任一項之醫藥組合物，其係凍乾之醫藥組合物。
  50. 如請求項39至48中任一項之醫藥組合物，其係液體醫藥組合物。
  51. 如請求項50之醫藥組合物，其：(a)包含氯化鈉；(b)包含磷酸鹽緩衝鹽水；(c)包含磷酸鹽緩衝液；(d)包含濃度為2-10%體積重量比或2.5-4%體積重量比之甘露糖；(e)包含濃度為0.001-5%體積重量比或0.01%體積重量比之聚山梨醇酯-80；(f)具有125-500mOsm/kg或275-325mOsm/kg之滲透壓度；或(g)具有成熟I型彈性蛋白酶之濃度為0.1mg/ml-50mg/ml。
  52. 如請求項50之醫藥組合物，其(a)包含137mM氯化鈉、2.7mM磷酸鉀、10mM磷酸鈉，具有7.4之pH；或(b)包含合計濃度為2-10% w/v、2.5-8%或4-6% w/v之一或多種右旋糖、乳糖、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、葡聚糖-70、甘油、精胺酸、甘胺酸、葡聚糖-44或葡聚糖-18。
  53. 如請求項52之醫藥組合物，其包含包含137mM氯化鈉、2.7mM磷酸鉀、10mM磷酸鈉，具有7.4之pH，且其中(i)該醫藥組合物包含0.01%之聚山梨醇酯-80；(ii)該醫藥組合物中成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之濃度為0.001mg/ml-50mg/ml，且該醫藥組合物包含5-10%或6-9%之選自右旋糖、乳糖、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、葡聚糖-70、甘油、精胺酸、甘胺酸、葡聚糖-44或葡聚糖-18之賦形劑；或(iii)該醫藥組合物中成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之濃度為0.001mg/ml-50mg/ml，且該醫藥組合物進一步包含8%之葡聚糖-18。
  54. 如請求項53之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含0.01%之聚山梨醇酯-80及該醫藥組合物中成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之濃度為0.001mg/ml-50mg/ml。
  55. 如請求項53之醫藥組合物，其中該醫藥組合物中成熟I型彈性蛋白酶蛋白質之濃度為0.001mg/ml-50mg/ml，且該組合物進一步包含8%之葡聚糖-18及0.1%之聚山梨醇酯-80。
  56. 如請求項39至48中任一項之醫藥組合物，其係用於：(a)投予需要之患者該醫藥組合物而治療或預防生物管道疾病；(b)向人類個體之動脈或靜脈之壁局部投予該醫藥組合物，以治療上增加需要之人類個體動脈或靜脈之直徑；(c)向人類個體之動脈或靜脈之壁局部投予該醫藥組合物，以預防需要之人類個體之動脈或靜脈血管痙攣；(d)向人類個體之動脈或靜脈之壁局部投予該醫藥組合物，以治療需要之人類個體中受阻塞動脈或靜脈，其中該投藥使得該動脈或靜脈之壁中之彈性蛋白發生蛋白水解，引起該動脈或靜脈之直徑擴大；(e)向人類個體之動脈或靜脈之壁局部投予該醫藥組合物，以治療需要之人類個體中連接至動靜脈血液透析移植物或動靜脈瘺之動脈或靜脈，其中該投藥使得該動脈或靜脈之壁中之彈性蛋白發生蛋白水解，引起該動脈或靜脈之直徑擴大；或(f)向人類個體之靜脈之壁局部投予該醫藥組合物，以治療人類個體中供血液透析用之靜脈，其中該投藥使得該靜脈之壁中之彈性蛋白發生蛋白水解，引起該靜脈之直徑擴大。
  57. 如請求項56之醫藥組合物，其係用於藉由投予需要之患者該醫藥組合物而治療或預防生物管道疾病，其中：(i)該醫藥組合物係非經腸投予；(ii)該醫藥組合物係直接投予至血管壁；(iii)該醫藥組合物係直接投予外科手術暴露之血管的外部外膜表面；或(iv)該醫藥組合物係使用藥物傳遞導管投予血管壁。
  58. 一種如請求項1至11中任一項之自體活化的I型彈性蛋白酶原蛋白質之用途，其係用於製備用於下列之藥物：治療或預防生物管道疾病；治療上增加動脈或靜脈之直徑；預防動脈或靜脈血管痙攣；治療受阻塞動脈或靜脈；治療連接至動靜脈血液透析移植物或動靜脈瘺之動脈或靜脈；或治療供血液透析用之靜脈。
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