PT2229440E

PT2229440E - Proteínas de elastase recombinante e métodos de fabrico e utilização das mesmas

Info

Publication number: PT2229440E
Application number: PT88614672T
Authority: PT
Inventors: Nicholas Franano; Kimberly Bland; Marco D Wong; Bee C Ding
Original assignee: Proteon Therapeutics Inc
Priority date: 2007-12-04
Filing date: 2008-12-04
Publication date: 2013-11-11
Also published as: KR101732190B1; HUE032739T2; PT2666854T; ES2627066T3; RU2611200C2; US20160319267A1; CN104711243B; LT2666854T; RU2010127232A; JP2017104114A; US20160243205A1; US20180155703A1; CY1118930T1; US20110081705A1; CA2707051A1; KR20180011860A; TW200938219A; CN101918547B; CN104711243A; PL2666854T3

Description

DESCRIÇÃO

PROTEÍNAS DE ELASTASE RECOMBINANTE E MÉTODOS DE FABRICO E

UTILIZAÇÃO DAS MESMAS

1. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos recombinantes de produção e formulação de proteínas de elastase para utilização no tratamento e prevenção de doenças das condutas biológicas. A presente invenção também diz respeito a novas proteínas de elastase recombinantes e composições farmacêuticas contendo tais proteínas. Ainda mais, a presente invenção diz respeito à utilização de composições farmacêuticas compreendendo proteínas de elastase recombinante para o tratamento e prevenção das doenças das condutas biológicas.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A elastina é uma proteína capaz de espontaneamente recuar depois de ser esticada. A elastina reticulada é o principal componente estrutural das fibras elásticas, a qual confere a elasticidade do tecido. A proteínase pode ser nomeada uma elastase se possuir a capacidade de solubilizar elastina reticulada, madura, (Bieth, JG

"Elastases: catalytic and biological properties", em pp. 217-320 (Mecham Edition, Regulation of Matrix Accumulation, New York, Academic Press, 1986). Vários pedidos de patente publicados (WO 2001/21574; WO 2004/073504; e WO 2006/036804) indicam que a elastase, isoladamente e em combinação com outros agentes, é benéfica no tratamento de doenças das condutas biológicas, incluindo as condutas biológicas que estão a experimentar ou susceptíveis de experimentar, obstrução e vasoespasmo. Para a terapia com 1 elastase de seres humanos, a utilização de uma elastase humana é desejável para reduzir o risco de uma reação imune a elastase não humana.

Até esta data, no entanto, não existe qualquer meio conhecido comercialmente viável de produção de elastase biologicamente ativa em forma suficientemente pura e em quantidades suficientes para aplicações clinicas. Porque as elastases são proteases potentes que podem hidrolisar numerosas outras proteínas que não a elastina, a atividade proteolitica da elastase levanta obstáculos potenciais para a sua produção recombinante. Por exemplo, a atividade da elastase madura pode danificar a célula hospedeira que está a expressar, degradar-se ou degradar os agentes utilizados para ajudar na produção ou a caracterização da elastase.

As elastases são frequentemente expressas em preproproteinas, contendo um péptido de sinal, um peptídeo de ativação, e uma porção ativa madura. A clivagem da sequência de sinal quando da secreção produz uma pró-proteína que pode ter pouca ou nenhuma atividade enzimática, e cuja sequência de aminoácidos compreende a sequência de aminoácidos de um péptido de ativação e de uma proteína madura. Geralmente, para a expressão recombinante, um precursor inativo pode ser expresso, em vez da enzima ativa madura para contornar os danos para a célula que expressa. Por exemplo, a Patente US 5212068 descreve a clonagem de ADNc da elastase pancreática humana (aí referido como elastase "IIA", "II-B", "IIIA" e "III-B"). As várias elastases foram expressas como cADNs de comprimento total, incluindo as sequências nativas de sinal, em células de mamífero COS-1. Além disso, as versões de manipulação de elastases, contendo uma sequência 2 de sinal B. subtilis e uma sequência de sinal β-galactosidase, foram também expressas em B. subtilis e E. coli, respectivamente. A Patente US 5212068 também sugere a expressão de elastases em S. cerevisiae. Geralmente, os exemplos de trabalho na expressão da elastase na Patente US 5212068 mostram baixa atividade da elastase recuperada ou exigem uma etapa de ativação que envolve o tratamento com tripsina, para gerar a elastase ativa. Além disso, as elastases estão amplamente presentes em corpos de inclusão, quando expressas em E. coli, e apenas pequenas porções da elastase expressa eram solúveis e ativas. Nenhuma das preparações de elastase descritas na Patente US 5212068 foi purificada com qualidade farmacêutica.

Dall'Acqua et al. De 1999, Protein Engineering 12, pp 981-986, descreve a expressão e secreção de elastase de neutrófilos humanos recombinantes tipo a partir de Pichia pastoris, e mencionam a ausência da sequência pro da elastase, que, por conseguinte, não necessita de um passo de ativação.

Assim, existe uma necessidade na técnica para métodos de fabrico recombinantes que permitam a geração de quantidades terapêuticas de elastases de grau farmacêutico biologicamente ativas, e de preferência, que evitem um passo de ativação de tripsina que é dispendioso para a preparação em larga escala e pode resultar na contaminação com tripsina do produto final. A administração de uma elastase contendo tripsina a um doente pode resultar na ativação dos receptores de protease ativados 1 e 2, o que pode reduzir alguns dos efeitos benéficos do tratamento com elastase. 3 A citação ou identificação de qualquer referência na Secção 2 ou em qualquer outra parte do presente pedido não deve ser interpretado como uma admissão de que essa referência está disponível como técnica anterior à invenção.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é definida nas reivindicações. Na medida em que a seguinte descrição pode definir os detalhes relativos a um assunto que não é coberto pelas reivindicações, tal assunto é fornecido apenas para informação. A presente invenção proporciona métodos novos e eficientes de produção de proteínas recombinantes de elastase e à utilização das proteínas recombinantes em composições, por exemplo, composições farmacêuticas, formulações de elastase ou dosagens unitárias, para o tratamento e prevenção das doenças das condutas biológicas. A presente invenção é dirigida a proteínas de proelastase auto-ativadas, ácidos nucleicos que codificam para proteínas de proelastase auto-ativadas, células hospedeiras compreendendo os referidos ácidos nucleicos, métodos de produção de proteínas de proelastase auto-ativadas e a utilização de proteínas de proelastase auto-ativadas no fabrico de proteínas de elastase maduras, biologicamente ativas, por exemplo, para utilização em formulações farmacêuticas. 0 termo "auto-ativado" (ou "autoativado é aqui utilizado indistintamente com os termos" auto-ativação", "auto-ativação" e "auto-ativado" e não se destina a sugerir que uma etapa de ativação tenha tido lugar. A termo "ativação" é aqui utilizado alternadamente 4 com o termo "conversão" e não se pretende implicar que uma proteína resultante da "ativação" possui necessariamente atividade enzimática.

Como usado aqui a seguir, e a menos que indicado em contrário, o termo "elastase" geralmente refere-se a proteínas de elastase maduras com atividade de elastase, bem como as proteínas, incluindo as proteínas de elastase imaturas, incluindo proteínas de proelastase imaturas (também aqui referido como proproteínas de elastase) e proteínas de preproelastase imaturas (também designado aqui como preproproteínas de elastase).

As elastases preferidas da invenção são elastases pancreáticas do tipo I, por exemplo, elastase pancreática humana do tipo I e elastase pancreática de porcino do tipo I. As elastases pancreáticas do tipo I são por vezes aqui referidas como "elastase-1", "elastase I," " elastase do tipo 1", ou "ELA-1". A elastase pancreática humana do tipo I é também referida aqui como hELA-1 ou ELA-1 humana e a elastase pancreática porcina do tipo I também é referida aqui como pELA-1 ou ELA-1 porcina.

Uma proteína de elastase madura da invenção tem tipicamente uma sequência de aminoácidos codificada por um gene da elastase que ocorre naturalmente ou uma variante dessa sequência. As variantes da sequência preferidas, incluindo variantes que contêm substituições de aminoácidos, estão aqui descritas. Uma proteína de proelastase é, em grande parte, um precursor inativo de uma proteína de elastase madura, e uma proteína de preproelastase contém ainda uma sequência de sinal para a secreção de proteínas. Pré e pró 5 sequências das proteínas de elastase da invenção são normalmente não nativas para os genes de elastase que codificam as proteínas de elastase maduras da invenção. Assim, num sentido, as proteínas de elastase imaturas da invenção são proteínas "quiméricas", com as suas porções maduras codificadas por um gene de elastase de ocorrência natural e as suas porções imaturas codificadas por sequências de genes não-elastase.

Para facilidade de referência, as proteínas de elastase da invenção e os seus componentes de núcleo de sequência são apresentados na Figura 2. Como mostrado na Figura 2, os resíduos de aminoácidos dentro da sequência de proelastase que são N-terminal para a ligação de clivagem (isto é, a ligação que é clivada para dar a proteína de elastase madura) são aqui designados como PX, . . . P5, P4, P3, P2 e Pl, onde PI é imediatamente N-terminal para a ligação de clivagem, enquanto os resíduos de aminoácidos localizados no C-terminal para a ligação de clivagem (e para o terminal N) da proteína de elastase madura são designados Pl' ., P2' , P3' , ... PX' , em que Pl' é imediatamente C-terminal para a ligação de clivagem e representa o resíduo de aminoácido N-terminal da proteína madura.

Figura 2 mostra também os seguintes componentes: (1) SEQUÊNCIA DE SINAL: uma sequência que aumenta a proporção de moléculas expressas que são segregadas a partir da célula. Uma sequência exemplar é dos aminoácidos 1-22 da SEQ ID N°s: 50 ou 51. (2) PRO-PÉPTIDO + ESPAÇADOR: uma sequência de pro-péptido opcional, preferencialmente não elastase, (tal como factor pro-propéptido de levedura a), que pode ainda, opcionalmente, incluir uma ou mais sequências espaçadoras 6 (uma sequência de factor pro-péptido de levedura a e sequências separadoras KEX2 e STE 13 estão representadas na Figura 1B) . Numa forma de realização especifica, a sequência de pro-péptido não inclui um espaçador. (3) PRO-PÉPTIDO DE ELASTASE: Péptido que, quando presente na extremidade N-terminal de uma elastase, torna a molécula inativa ou menos ativa, em comparação com a correspondente proteína de elastase madura. 0 pró-péptido de elastase pode ser contíquo com o peptídeo de ativação, ou pode conter aminoácidos adicionais relativos ao peptídeo de ativação. Exemplos de sequências de pro-péptido de elastase são os aminoácidos 1-10 da SEQ ID N°s: 64 e 69. (4) PÉPTIDO DE ATIVAÇÃO: aqui utilizados alternadamente com "sequência de ativação", um péptido de ativação é um componente de, e pode ser contíguo com o pró-péptido da elastase. Como mostrado na Figura 2, o peptídeo de ativação contém resíduos de aminoácidos PIO através de PI. Uma sequência exemplar de péptido de ativação de consenso é a SEQ ID N°: 80; outros exemplos de sequências de péptido de ativação são as SEQ ID N°s: 23, 72 e 73. (5) SEQUÊNCIA DE RECONHECIMENTO: Uma sequência de reconhecimento é um componente do pro-peptídeo de elastase. Como mostrado na Figura 2, a sequência de reconhecimento contém resíduos de aminoácidos P3 através de PI. Exemplos de sequências de reconhecimento de consenso são as sequências SEQ ID N°s :11-13 e 93, e uma sequência de reconhecimento exemplar é a SEQ ID N°: 20. (6) DOMÍNIO DE CLIVAGEM: Uma região na proteína de proelastase que abrange a ligação de clivagem. Como mostrado na Figura 2, o domínio de clivagem contém resíduos de aminoácidos P5 através de P3' . Sequências exemplares de 7 domínio de clivagem são as SEQ ID N°s: 42, 43, 48, 49, 53, 53, 54 e 55. (7) SÍTIO DE CLIVAGEM: Outra região Na proteína de proelastase que também abrange a ligação de clivagem. Como mostrado na Figura 2, o sítio de clivagem contém resíduos de aminoácidos P4 através de P4'. Uma sequência exemplar do sítio de clivagem é a SEQ ID N°: 27. (8) PROTEÍNA DE PREPROELASTASE: Uma proteína que pode compreender todos os componentes. Uma proteína de preproelastase exemplar pode incluir péptidos da SEQ ID N°: 50, 51, 96, ou 97, seguido por uma proteína ligada operativamente da SEQ ID N°: 64 ou SEQ ID N°: 69. (9) PROTEÍNA DE PROELASTASE: Uma proteína que compreende proteína de elastase madura, um pro-péptido de elastase e pro-péptidos opcionais e sequências espaçadoras. Sequências de proelastase exemplares são a SEQ ID: 64 e 69. (10) PROTEÍNA DE ELASTASE MADURA: Uma proteína que, quando processada adequadamente exibe atividade de elastase. Exemplos de sequências maduras são a SEQ ID N°: 1 (humana) e SEQ ID N°: 39 (porcina).

Os componentes proteicos da elastase podem ser considerados blocos modulares das proteínas da elastase, proteínas de proelastase e proteínas de preproelastase. Por exemplo, a presente invenção proporciona uma proteína de proelastase compreendendo a sequência de um pro-peptídeo de elastase e uma proteína de elastase madura. O pro-peptídeo de elastase pode conter um péptido de ativação. O pro-peptídeo de elastase também pode conter uma sequência de reconhecimento da elastase. A presente invenção também fornece uma 8 proteína de proelastase que compreende um domínio de clivagem ou sítio de clivagem na região que abrange a junção entre o pró-péptido de elastase e a proteína de elastase madura. As proteínas de proelastase podem ainda compreender uma sequência de sinal para secreção. Tais proteínas são consideradas proteínas de preproelastase. As proteínas de preproelastase podem ainda compreender um pro-peptídeo de factor alfa de levedura e opcionalmente uma sequência espaçadora entre a sequência de sinal e o pro-peptídeo da elastase. As proteínas de elastase da invenção também podem conter componentes, para além dos principais componentes modulares ilustrados na Figura 2. Por exemplo, uma proteína de elastase pode conter um epítopo marcador ou um marcador de histidina para a purificação. Deve também notar-se que as proteínas de elastase da invenção não necessitam de conter todos os componentes representados na Figura 2, mas, geralmente, contêm, pelo menos, um dos componentes (incluindo, a título de exemplo, mas não como limitação, uma elastase madura ou uma sequência de proelastase) ilustrados na Figura 2. Proteínas de elastase exemplificativas da invenção estão estabelecidas nas concretizações 1-12, 28-39 e 68-69 na Secção 8 abaixo, incluindo as proteínas de proelastase exemplares de tipo I previstas nas concretizações 13-27 na Secção 8 abaixo.

Os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de elastase da invenção, métodos para a produção e purificação de proteínas, células recombinantes e os sobrenadantes de cultura de células, composições compreendendo proteínas de elastase (por exemplo, composições farmacêuticas, dosagens unitárias, formulações) , a utilização das proteínas para fins terapêuticos e kits compreendendo as proteínas, formulações, composições farmacêuticas e doses unitárias 9 são aqui englobadas. Os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de elastase da invenção são exemplificados nas concretizações 40-67 na Secção 8 abaixo, incluindo os vectores (ver, por exemplo, formas de realização 70-72). Também exemplificados na Secção 8 estão células recombinantes (ver, por exemplo, formas de realização 73-84), os sobrenadantes celulares contendo proteínas de elastase (ver, por exemplo, forma de realização 88) . Os métodos para produzir proteínas de elastase são exemplificados nas formas de realização 89-224, 261-276 e 347-373 na Secção 8. Os métodos para produzir formulações da elastase são exemplificados nas formas de realização 225-260 na Secção 8. Métodos de produção de composições farmacêuticas são exemplificados nas concretizações 374-385 na Secção 8. As composições farmacêuticas compreendendo proteínas de elastase são exemplificadas nas formas de realização 386 e 277-313 na Secção 8, e as dosagens unitárias são exemplificadas nas formas de realização 415-420 na Secção 8. Formulações de proteínas de elastase são exemplificadas nas concretizações 324-346 na Secção 8. A utilização das proteínas de elastase para fins terapêuticos é exemplificada nas concretizações 387-414 na Secção 8. Kits compreendendo as proteínas estão exemplificados na Secção 8, por meio das formas de realização 421-424. Vários aspectos da presente invenção dizem respeito a composições farmacêuticas e/ou proteínas de proelastase com a SEQ ID N°s: 64 e 69 exemplificadas como formas de realização 425-472 na Secção 8 abaixo; no entanto, tais formas de realização são aplicáveis a outras sequências de proteínas da elastase e composições aqui reveladas. 10

Os métodos de produção aqui descritos, muitas vezes incluem um passo de ativação, em que o peptídeo de ativação é removido a partir da sequência de proelastase/separado a partir da sequência de elastase madura, gerando, assim, uma proteina de elastase madura. Os passos de ativação aqui descritos podem ser passos de ativação automática, ou seja, efectuados por uma atividade da elastase, ou um passo de ativação não-automático, isto é, não mediado por elastase, por exemplo, levado a cabo por tripsina.

Em certos aspectos, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótideos que codifica uma proteina de elastase (incluindo, mas não se limitando a uma proteina de qualquer uma das SEQ ID N°s: 6-9, 64-69, 88-91, ou 98-103), compreendendo (i) um pró-péptido de elastase compreendendo uma sequência de peptideo de ativação que compreende uma sequência de reconhecimento da elastase operacionalmente ligada a (ii) a sequência de aminoácidos de uma proteina tendo a atividade da elastase. A proteina compreende ainda opcionalmente uma sequência de sinal, tal como um péptido de sinal de factor de levedura α e exemplificado pela sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 34, operativamente ligada ao dito pro-péptido de elastase. O factor α é por vezes aqui referido como "factor alfa" ou "factor de acasalamento alfa". Em certas formas de realização especificas, a proteina compreende um pró-péptido de não-elastase tal como, o factor de pro-peptideo de levedura a. Em certas formas de realização especificas, a proteina pode compreender uma ou mais sequências espaçadoras. As sequências espaçadoras podem incluir, mas não estão limitados a, sitios de clivagem da protease Kex2 e STE13. Numa concretização especifica, pode ser usado um espaçador 11

Kex2. Numa outra forma de realização, um espaçador Kex2 pode ser operativamente ligado a espaçadores STE 13, conforme mostrado na Figura 1B. Uma sequência de péptido de sinal e uma sequência de pro-péptido não-elastase é exemplificado pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 51 ou 97. Um péptido contendo uma sequência de péptido de sinal, uma sequência de pro-péptido não-elastase e uma sequência espaçadora é exemplificado pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID N°s: 50 ou 96.

Em outras formas de realização especificas, a sequência de sinal é uma sequência de sinal de secreção de mamifero, tal como uma sequência de sinal de elastase de porcino ou humana do tipo I (utilizado de forma intercambiável com uma elastase pancreática do tipo I).

De preferência, a sequência de reconhecimento da elastase é uma sequência de reconhecimento de elastase pancreática do tipo I.

Em concretizações especificas, a proteina que possui atividade de elastase tipo I é uma elastase madura humana do tipo I, por exemplo, uma proteina da sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1, 4, 5, 84, ou 87. A presente invenção também proporciona uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteina que compreende (i) uma sequência de sinal operável em Pichia pastoris, operacionalmente ligada a (ii) uma sequência de ativação (incluindo, mas não limitado a uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°s: 23, 12 72, 73, ou 80) que compreende uma sequência de reconhecimento de protease (incluindo, mas não limitado a uma sequência de aminoácidos de qualquer das SEQ ID N°s:ll-23 e 93, o qual por sua vez está operacionalmente ligada à (iii) sequência de aminoácido de elastase madura humana do tipo I. Numa concretização preferida, a sequência de reconhecimento de proteases é uma sequência de reconhecimento da elastase humana do tipo I, ainda mais preferivelmente uma sequência de reconhecimento de elastase da SEQ ID N°: 20.

Proteínas de proelastase (compreendendo opcionalmente uma sequência de sinal, representando, assim, proteínas de preproelastase) e proteínas da elastase maduras codificadas pelos ácidos nucleicos da invenção são também fornecidas, tal como são as composições (por exemplo, composições farmacêuticas, formulações e dosagens unitárias) compreendendo as referidas proteínas de elastase maduras.

Numa concretização preferida, a proteína de proelastase ou a proteína de elastase madura não tem um resíduo de metionina N-terminal. Numa outra forma de realização, no entanto, a proteína de proelastase ou a proteína DE elastase madura tem um resíduo de metionina N-terminal. a Tabela 1 abaixo resume os identificadores de sequências utilizadas na presente descrição. As proteínas preferidas da invenção compreendem ou consistem em qualquer uma das SEQ ID N°s: 1-32, 34, 37-73, 77, 78, 82-92, 98-105 e listadas na Tabela 1 a seguir, ou estão codificadas em parte ou totalmente pelas sequências nucleotídicas da SEQ ID N°: 33 e SEQ ID N°: 81. 13

Tabela 1: Resumo das SEQ ID N°s de aminoácidos e nucleotídeos MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Elastase humana madura I, incluindo a primeira "valina" com a possibilidade de polimorfismo na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 1 Elastase humana madura If menos a primeira "valina" com a possibilidade de polimorfismo na posição 220 (V ου L) (numeração refere-se a posição no contexto de preproproteína) Aminoácido 2 Elastase humana madura I, menos as primeiras duas "valinas" com a possibilidade de polimorfismo na posição 22 0 (Y ou L) (numeração refere-se a posição no contexto de preproproteína) Aminoácido 3 Elastase humana madura I, com a primeira "valina" substituída por "alanina" com a possibilidade de polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se a posição no contexto de preproproteína) Aminoácido 4 Elastase humana madura I (isótipo 2) , incluindo a primeira "valina" Aminoácido 5 Proproteína de elastase manipulada n° 1 (variante pPROT42) , com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 6 Proproteína de elastase manipulada n° 2, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se a posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 7 Proproteína de elastase manipulada n° 3, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se a posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 8 14 MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Proproteína de elastase manipulada n° 4, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 9 Proproteína de elastase manipulada n° 5 (variante de tripsina ativada pPROT24), com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 10 Sequência de reconhecimento de elastase de consenso 1 (posições Xaai = P3, Xaa2 = P2, Xaa3 = Pl) Aminoácido 11 Sequência de reconhecimento de elastase de consenso 2 (posições P3-P2-P1) Aminoácido 12 Sequência de reconhecimento de elastase de consenso 3 (posições P3-P2-P1) Aminoácido 13 Sequência de reconhecimento de elastase 1 (posições P3-P2-P1) Aminoácido 14 Sequência de reconhecimento de elastase 2 (posições P3-P2-P1) Aminoácido 15 Sequência de reconhecimento de elastase 3 (posições P3-P2-P1) Aminoácido 16 Sequência de reconhecimento de tripsina de tipo selvagem (Pprot24) (Posições P3-P2-P1) Aminoácido 17 Sequência de reconhecimento de elastase 5 (posições P3-P2-P1) Aminoácido 18 Sequência de reconhecimento de elastase 6 (posições P3-P2-P1) Aminoácido 19 Sequência de reconhecimento de elastase 7 (posições P3-P2-P1 das variantes 48 e 55) Aminoácido 20 Sequência de reconhecimento de elastase 8 Aminoácido 21 Sequência de ativação de elastase humana 1 Aminoácido 22 Sequência de ativação de elastase humana 2 Aminoácido 23 Sítio de clivagem pro-PROT-201 Aminoácido 24 15 MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Sítio de clivagem pPROT40 Aminoácido 25 Sítio de clivagem pPR0T41 Aminoácido 26 Sítio de clivagem pPROT42 Aminoácido 27 Sítio de clivagem pPROT43 Aminoácido 28 Sítio de clivagem pPROT44 Aminoácido 29 Sítio de clivagem pPROT45 Aminoácido 30 Sítio de clivagem pPROT46 Aminoácido 31 Sítio de clivagem pPROT47 Aminoácido 32 Região de codificação de elastase humana 1 (isto é, elastase pancreática humana tipo 1 (n° de acessão NCBI NM001971) Aminoácido 33 Peptídeo de sinal de factor de levedura alfa Aminoácido 34 Iniciador 20F Nucleotídeo 35 Iniciador 24R Nucleotídeo 36 Sitio de clivagem P3 da elastase variante pPROT42, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 37 Sítio de clivagem P2 da elastase variante pPROT42, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 38 Elastase pancreática porcina madura I (a partir do GenBank P00772.1) Aminoácido 39 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 40 da elastase Aminoácido 40 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 41 da elastase Aminoácido 41 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 42 da elastase Aminoácido 42 16 MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 43 da elastase Aminoácido 43 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 44 da elastase Aminoácido 44 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 45 da elastase Aminoácido 45 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 46 da elastase Aminoácido 46 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 47 da elastase Aminoácido 47 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 48 da elastase Aminoácido 48 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 49 da elastase Aminoácido 49 Peptídeo de sinal do factor de acasalamento de levedura alfa, pro-péptido e sequência espaçadora 1 Aminoácido 50 Peptídeo de sinal do factor de acasalamento de levedura alfa e sequência de pro-péptido 2 Aminoácido 51 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 52 da elastase Aminoácido 52 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 53 da elastase Nucleotídeo 53 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 54 da elastase Nucleotídeo 54 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 55 da elastase Aminoácido 55 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 56 da elastase Aminoácido 56 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 57 da elastase Aminoácido 57 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 58 da elastase Aminoácido 58 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 59 da elastase Aminoácido 59 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 60 da elastase Aminoácido 60 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 61 da elastase Aminoácido 61 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 62 da elastase Aminoácido 62 Domínio de clivagem do pro-péptido da variante 63 da elastase Aminoácido 63 17 MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Proenzima da elastase com domínio de clivagem da variante 48, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 64 Proenzima da elastase com domínio de clivagem da variante 49, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 65 Proenzima da elastase com domínio de clivagem da variante 52, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 66 Proenzima da elastase com domínio de clivagem da variante 53, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 67 Proenzima da elastase com domínio de clivagem da variante 54, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 68 Proenzima da elastase com domínio de clivagem da variante 55, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 69 Elastase de tipo selvagem + variante de clivagem AlaArg, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 70 Elastase de tipo selvagem + variante de clivagem Arg, com possível polimorfismo na posição 220 (V ou L) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 71 Peptídeo de ativação da variante 48 da elastase humana Aminoácido 72 Peptídeo de ativação da variante 55 da elastase humana Aminoácido 73 18 MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Sequência de consenso do domínio de clivagem da elastase humana correspondente aos resíduos P5, P4, P3, P2, Pl, P'l, P'2 e P'3 do domínio de clivagem da elastase Aminoácido 74 Iniciador de mutagénese PCR para a construção de Pprot73 Ácido nucleico 75 Iniciador de mutagénese PCR para a construção de Pprot73 Ácido nucleico 76 Variante do terminal-C de ELA-1 madura de Talas et al., Invest Dermatol. 114(1):165-70 Aminoácido 77 Variantes de ELA-1 madura, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 78 Variantes de peptídeo de ativação (tipo selvagem, tripsina clivável), com possíveis polimorfismos na posição 10 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 79 Sequência de consendo de peptídeo de ativação Aminoácido 80 Região de codificação de ELA-1.2A Aminoácido 81 Produto de tradução de ELA-1.2A (sequência de tripsina ativada Pprot24) Aminoácido 82 Produto de tradução de ELA-1.2A (sequência de tripsina ativada Pprot24), com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V) ; 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 83 19 MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Elastase humana madura I, incluindo a primeira "valina", com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 84 Elastase humana madura I, menos a primeira "valina", com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 85 Elastase humana madura I, menos as duas primeiras "valinas", com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 86 Elastase humana madura I, incluindo a primeira "valina" substituída por "alanina", com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 87 Proproteína de elastase manipulada n° 1 (variante Pprot42), com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 88 Proproteína de elastase manipulada n° 2, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V) ; 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 89 20 MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Proproteina de elastase manipulada n° 3, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V) ; 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteina) Aminoácido 90 Proproteina de elastase manipulada n° 4, com possiveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V) ; 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteina) Aminoácido 91 Proproteina de elastase manipulada n° 5 (sequência de tripsina ativada Pprot24), com possiveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V) ; 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteina) Aminoácido 92 Sequência de reconhecimento de elastase de consenso 4 (Posições P3-P2-P1) Aminoácido 93 Sitio de clivagem P3 da variante de elastase Pprot42, com possiveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteina) Aminoácido 94 Sítio de clivagem P2 da variante de elastase Pprot42, com possiveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteina) Aminoácido 95 Peptideo de sinal do factor de acasalamento de levedura alfa, pro-péptido e sequência espaçadora 1 Aminoácido 96 Peptideo de sinal do factor de acasalamento de levedura alfa e sequência de pro-péptido 2 Aminoácido 97 21 MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Proenzima de elastase com o domínio de clivagem da variante 48 genérica para a SEQ ID N° 64, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 98 Proenzima de elastase com o domínio de clivagem da variante 49, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V) ; 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 99 Proenzima de elastase com o domínio de clivagem da variante 52, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 100 Proenzima de elastase com o domínio de clivagem da variante 53, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V) ; 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 101 Proenzima de elastase com o domínio de clivagem da variante 54, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V) ; 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 102 Proenzima de elastase com o domínio de clivagem da variante 55, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 103 22 MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Elastase de tipo selvagem + variante de clivagem AlaArg, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 5 9 (M ou V) ; 22 0 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 104 Elastase de tipo selvagem + variante de clivagem Arg, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 105 Variante de clivagem da elastase humana madura I com ausência dos quatro primeiros aminoácidos, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 106 Variante de clivagem da elastase humana madura I com ausência dos seis primeiros aminoácidos, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 107 Variante de clivagem da elastase humana madura I com ausência dos nove primeiros aminoácidos, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (numeração refere-se à posição no contexto da preproproteína) Aminoácido 108 Sequência de ácido nucleico da Figura IA Ácido nucleico 109 Sequência de aminoácido da Figura IA Aminoácido 110 Sequência de ácido nucleico da Figura 1B Ácido nucleico 111 23 MOLÉCULA NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO SEQ ID N° Sequência de aminoácido da Figura 1B Aminoácido 112 Sequência de ácido nucleico da Figura 13 Ácido nucleico 113 Sequência de aminoácido da Figura 14 Aminoácido 114 Domínio de clivagem da sequência de tripsina ativada Pprotl01-24-V Aminoácido 115 Domínio de clivagem da sequência auto-ativada pPROT101-42-V Aminoácido 116 Domínio de clivagem da sequência auto-ativada pPROT101-49-V Aminoácido 117 Domínio de clivagem da sequência auto-ativada pPROT101-55L-V Aminoácido 118

Existem pelo menos cinco polimorfismos confirmados proteina da elastase humana do tipo I, nas posições 10 (Q ou H) ; 44 (W ou R) ; 59 (M ou V); 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) . A proteina de comprimento total (preproelastase) é de 258 aminoácidos de comprimento. Os 8 primeiros aminoácidos correspondem à sequência de sinal ou "pré" péptido que é clivada para gerar uma pró-proteína inativa, e uma outra sequência de "pró" péptido (compreendendo ou consistindo em 10 aminoácidos correspondente a um péptido de ativação) é clivada gerar a proteína madura ativa. Assim, o polimorfismo na posição 10 está presente na pró-proteína, mas não na proteína madura.

Assim, na Tabela 2 abaixo são apresentadas todas as combinações possíveis dos cinco polimorfismos da elastase humana do tipo 1. A presente invenção proporciona proteínas de preproelastase e proelastase (incluindo, mas não limitado às variantes de proteínas de preproelastase e proelastase aqui descritas) , tais como as proteínas 24 exemplificadas nas formas de realização 1-39 e 68-69 ou as proteínas obtidas ou obteníveis pelo método de qualquer uma das formas de realização, 89-224, 261-276 e 347-373 na Secção 8, que compreende a qualquer uma das combinações de polimorfismos apresentadas na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Variantes da elasfcase imatura humana do tipo I (pre-pro) e as proteínas da elastase pro. A numeração de posição refere-se à posição no conteact© da preproproteina de elastase nativa humana de tipo I.

Posição 1 10 1 44 1 59 1 220 1 243 Concretização Q ou R | W ou R | M ou V | V ou L | Q ou R ! 22. H 1 w M i i i R j 23. H | W V i t I Q j 24. H j R V i V I Q | 25. H I w V 1 v | R i 2a H !R M j L I Q i 27, H 1R M I v ! R I 28. H I R V 11 I Q | 29. H 1R V !v I R j 30. H J R M | i 1 R í 31- H j W V | L 1 R 32. H 1 R V 1 í- | R Por outro lado, na Tabela 3 abaixo são apresentadas toda as combinações possíveis dos quatro polimorfismos da elastase humana de tipo I, que podem estar presente numa proteína de elastase madura. A presente invenção fornece proteínas de elastase maduras (incluindo mas não limitado às variantes de proteínas de elastase maduras aqui descritas), como as proteínas de elastase maduras obtidas ou que possam ser obtidas pelo método de qualquer uma das formas de realização, 89-224, 261-276 e 347-373 na Secção 8, que compreende a qualquer uma das combinações de polimorfismos apresentados na Tabela 3 abaixo. 26

Tabela 3: Variantes de proteínas de elastase maduras humanas do tipo I. A numeração da posição refere-se à posição no contexto da preproproteína de elastase humana nativa de tipo I.

As elastases maduras do tipo I da invenção podem ser purificadas, por exemplo para utilização em composições farmacêuticas. Em concretizações especificas, as elastases são, pelo menos, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% puras.

As elastases maduras do tipo I da invenção têm, preferivelmente, uma atividade específica maior do que 1, maior do que 5, maior do que 10, maior do que 20, maior do que 25, ou maior do que 30 U/mg de proteína, tal como determinado através da medição da taxa de hidrólise do substrato peptídico pequeno de N-succinil-Ala-Ala-Ala-pNitroanilida (SLAP), que é catalisada pela adição de elastase. Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de elastase que catalisa a hidrólise de 1 micromole de substrato por minuto a 30°C e a atividade 27 específica é definida como a atividade por mg de proteína de elastase (U/mg). De preferência, uma elastase madura humana de tipo I tem uma atividade específica dentro de um intervalo em que o limite inferior é de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 ou 20 U/mg de proteína e em que o limite superior é, independentemente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50 U/mg de proteína. Em concretizações exemplificativas, a atividade específica é na gama de 1 a 40 U/mg de proteína, de 1 a 5 U/mg de proteína, de 2 a 10 U/mg de proteína, de 4 a 15 U/mg de proteína, de 5 a 30 U/mg de proteína, de 10 a 20 U/mg de proteína, 20 a 40 U/mg de proteína, ou qualquer intervalo cujos limites inferiores e superiores são selecionados de entre qualquer um dos valores anteriores. Uma elastase porcina madura de tipo I tem de preferência uma atividade específica dentro de um intervalo em que o limite inferior é de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 ou 75 U/mg de proteína e em que o limite superior é, de forma independente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 90, 95 ou 100 U/mg de proteína. Em concretizações exemplificativas, a atividade específica da elastase porcina é na gama de 10 a 50 U/mg de proteína, de 20 a 60 U/mg de proteína, de 30 a 75 U/mg de proteína, de 30 a 40 U/mg de proteína, 20 a 35 U/mg de proteína, de 50 a 95 U/mg de proteína, de 25 a 100 U/mg de proteína, ou qualquer intervalo cujos limites inferiores e superiores são selecionados de entre qualquer um dos valores anteriores.

Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção referem-se a composições, tais como composições farmacêuticas, formulações e dosagens unitárias de elastase, tais como as exemplificadas nas concretizações 277-314, 346, 386, e 415-420, ou aquelas obtidas ou que 28 podem ser obtidas pelo método de qualquer uma das concretizações 261-276 e 374-385 na Secção 8 abaixo.

Em certas concretizações, as composições da invenção compreendem proteínas de elastase de tripsina ativada, por exemplo, as proteínas de tripsina ativada realizadas por qualquer um dos métodos aqui divulgados. Noutras concretizações, as composições compreendem proteínas de elastase auto-ativadas, por exemplo, as proteínas de elastase auto-ativadas realizadas por qualquer um dos métodos aqui divulgados. Em certos aspectos, uma composição da invenção é caracterizada por, pelo menos, um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, ou pelo menos sete das seguintes propriedades: (a) a composição é livre de tripsina; (b) , a composição é substancialmente livre de tripsina; (c) a composição é livre de qualquer proteína que consiste nas SEQ ID N°s: 70 e 71; (d) a composição é substancialmente livre de qualquer proteína que consiste nas SEQ ID N°s 2 e 3; (e) a composição é livre de proteínas bacterianas; (f) a composição é substancialmente livre de proteínas bacterianas; (g) a composição é isenta de proteínas de mamíferos diferentes da referida proteína de elastase madura;(h) a composição é substancialmente isenta de proteínas de mamíferos diferentes da referida proteína de elastase madura; (i) a composição é livre ou substancialmente livre de um, dois, três ou todas as quatro proteínas consistindo na SEQ ID N°: 85, 86, 94 e 95; (j) a composição é livre ou substancialmente livre de um, dois ou todos os três proteínas consistindo na SEQ ID N°: 106, 107 e 108; (k), a composição contém níveis farmaceuticamente aceitáveis de endotoxinas (por exemplo, 10 EU/mg de elastase ou menos, ou 5 EU/mg de elastase ou menos); (1) a 29 proteína de elastase madura na composição é caracterizada por uma atividade específica de 1 a 40 U/mg de proteína ou de qualquer outro intervalo de atividade específica aqui descrito; (m) a atividade da tripsina na referida composição corresponde a menos do que 4 ng por 1 mg de proteína de elastase madura ou qualquer outro intervalo de atividade da tripsina divulgado aqui; (n) a composição compreende polisorbato-80; (o), a composição compreende dextrano; (p) a composição compreende iões de sódio, iões de potássio, iões de fosfato, iões de cloreto e polissorbato-80; (q) a composição compreende iões sódio, iões potássio, iões fosfato, iões de cloreto e dextrano; (r) a composição compreende iões sódio, iões de potássio, iões de fosfato, iões de cloreto, polissorbato-80 e dextrano; (s) a proteína de elastase madura na referida composição exibe uma quantidade de estabilidade aqui descrita, por exemplo, mantém 60% a 100% da sua atividade específica após pelo menos uma semana de armazenamento a 4°C, depois de pelo menos um mês de armazenagem a 4°C, após pelo menos dois meses de armazenamento a 4°C, após pelo menos três meses de armazenamento a 4°C, durante, ou após, pelo menos, seis meses de meses de armazenamento a 4°C; e (t), a composição compreende uma dosagem unitária de 0,0033 mg a 200 mg da referida proteína de elastase madura, ou qualquer outra dosagem unitária da proteína de elastase madura aqui revelada.

Em certos aspectos, a composição é caracterizada por, pelo menos, três características, pelo menos, quatro ou cinco características selecionadas independentemente de entre os seguintes grupos de (i) a (v); (i) (a), (b) ou (m) 30 (ii) (e) ou (f) (iii) (g) ou (h) (iv) (k) (v) (1)

Em concretizações específicas, duas das ditas, pelo menos três, ou pelo menos quatro das referidas características são selecionadas a partir dos grupos (i) e (iv) ou (v). Em outras formas de realização, pelo menos três das referidas quatro características são selecionadas a partir dos grupos (i) , (iv) e (v) .

Em concretizações específicas, a presente invenção proporciona uma composição, incluindo, mas não limitada a uma composição farmacêutica, formulação da elastase ou dosagem unitária, que compreende: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase humana tipo I, que é livre de tripsina e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase humana tipo I, que é substancialmente livre de tripsina e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável. Em concretizações específicas, a elastase humana tipo I e/ou a composição compreende menos de 5 ng/ml de atividade de tripsina, inferior a 4 ng/ml de atividade de tripsina, menos de 3 ng/ml de atividade de tripsina, menos de 2 ng/ml de atividade da tripsina, ou inferior a 1,56 ng/ml de atividade de tripsina. Nos exemplos anteriores, a atividade da tripsina ng/ml pode ser testada numa composição de elastase humana tipo I líquida 31 ou preparação que contém 1 mg/ml de proteína de elastase humana tipo I. Assim, as atividades de tripsina podem também ser descritas em termos de miligramas de proteína de elastase, por exemplo, menos de 3 ng de atividade de tripsina/mg de proteína de elastase, menos de 1,56 ng de atividade de tripsina/mg de proteína de elastase, etc. A presente invenção proporciona ainda uma composição que compreende (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase humana tipo I e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável, em que a composição compreende menos que 5 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, menos do que 4 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, menos de 3 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, menos de 2 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, ou menos do que 1,56 ng de atividade de tripsina por mg de elastase. A presente invenção proporciona ainda métodos de melhoria da qualidade das proteínas de elastase maduras produzidas por métodos de ativação de tripsina (por exemplo, os métodos da forma de realização 145 na Secção 8, abaixo), que compreende a purificação da proteína de elastase madura numa coluna de resina Macro-Prep High S. Foi verificado pelos presentes inventores que as proteínas de elastase maduras purificadas numa coluna de resina Macro-Prep High S produzem composições de elastase com níveis de atividade de tripsina correspondentes a 20-25 ng de atividade de tripsina/mg de proteína da elastase, em comparação com a purificação numa coluna Poros (Poli (estireno-divinilbenzeno)) , que produz composições de elastase com níveis de atividade de tripsina correspondente a cerca de 1000 ng de atividade de tripsina/mg de proteína de elastase. A presente invenção proporciona ainda composições 32 de elastase compreendendo proteínas de elastase maduras produzidas por purificação de proteínas elastase de tripsina cativada numa coluna de resina Macro-Prep S High. A coluna de resina Macro-Prep S High está disponível em BioRad (Hercules, CA), de acordo com os quais uma coluna de suporte rígida de metacrilato com pouco encolhimento e inchamento. Outras colunas de permuta de catiões semelhantes da mesma classe e/ou com o mesmo tamanho de grânulos (cerca de 50 mm) podem ser utilizadas, tal como outras colunas de metacrilato, podem ser adequadamente utilizadas.

Outros aspectos da presente invenção referem-se a composições, incluindo, mas não se limitando a composições farmacêuticas, formulações de elastase ou dosagens unitárias, compreendendo elastase pancreática porcina tipo I. Em concretizações específicas, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase pancreática porcina tipo I, que é livre de tripsina e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase pancreática porcina tipo I que é substancialmente livre de tripsina e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável. Em concretizações específicas, a elastase pancreática porcina tipo I e/ou a composição compreende menos do que 100 ng/ml de atividade de tripsina, inferior a 75 ng/ml de atividade de tripsina, inferior a 50 ng/ml de atividade de tripsina, inferior a 25 ng/ml de atividade de tripsina, inferior a 15 ng/ml de atividade de tripsina, inferior a 10 ng/ml de atividade de tripsina, menos de 5 ng/ml de atividade de tripsina, inferior a 4 ng/ml de atividade de tripsina, 33 menos de 3 ng/ml de atividade de tripsina, menos de 2 ng/ml de atividade de tripsina, ou inferior a 1,56 ng/ml de atividade de tripsina. Nos exemplos anteriores, a actividade da tripsina ng/ml pode ser testada numa composição de elastase pancreática porcina tipo I liquida ou preparação que contém 1 mg/ml de elastase pancreática porcina tipo I. Assim, as atividades de tripsina podem também ser descritas em termos de miligramas de proteina de elastase, por exemplo, menos de 25 ng de atividade de tripsina/mg de proteina de elastase, menos de 5 ng de atividade de tripsina/mg de proteina de elastase, etc. A presente invenção proporciona ainda um composição que compreende (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase porcina tipo I e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável, em que a composição compreende de 100 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, inferior a 75 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, menos de 50 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, menos de 25 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, inferior a 15 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, menos de 10 ng actividade de tripsina por mg de elastase, menos de 5 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, inferior a 4 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, menos de 3 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, menos de 2 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, ou menos do que 1,56 ng de actividade de tripsina por mg de elastase.

Em outras formas de realização, a presente invenção proporciona composições de proteínas de elastase, tais como proteínas de elastase maduras, incluindo mas não se limitando a composições farmacêuticas, formulações de elastase ou dosagens unitárias, que são livres de variantes 34 N-terminais correspondentes a uma, duas, três ou todas quatro da SEQ ID N°s: 70, 71, 104, 105. Em certas formas de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase madura humana tipo I (ii) um veiculo farmaceuticamente aceitável, cuja composição farmacêutica está isenta de qualquer proteína com a SEQ ID N°s: 70, 71, 104, 105.

Em outras formas de realização, a presente invenção proporciona uma composição, incluindo, mas não limitado a uma composição farmacêutica, uma formulação de elastase ou dosagem unitária, que compreende (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase humana tipo I, que é livre ou substancialmente livre de proteínas variantes que contêm aminoácidos específicos adicionais na extremidade N-terminal da proteína de elastase madura (SEQ ID N°s: 37, 38, 70, 71, 94, 95, 104, 105) e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável. Em outras formas de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase humana tipo I, que é livre ou substancialmente livre de proteínas variantes a que faltam os aminoácidos N-terminais da proteína de elastase madura (SEQ ID N°s: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, 108) e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável. Em concretizações específicas, a elastase humana tipo I e/ou a composição compreende menos do que 25% de variantes N-terminais, menos de 20% de variantes N-terminais, menos de 15% de variantes N-terminais, menos de 10% de variantes N-terminais, menos de 5% de variantes N-terminais, menos de 4% de variantes N-terminais, menos de 3% de variantes N-terminais, menos de 2% de variantes N-terminais, menos de 35 1% de variantes N-terminais, menos de 0,5% de variantes N-terminais, 0% de variantes N-terminais, ou inclui variantes N-terminais numa quantidade variando entre qualquer duas das percentagens precedentes (por exemplo, 2%-25% de variantes N-terminais, 0,5%-10% de variantes N-terminais, 5%-15% de variantes N-terminais, 0%-2% de variantes N-terminais, etc.) Tal como aqui utilizado, o termo "menos do que X% de variantes N-terminal" refere-se à quantidade de variantes N-terminal como a percentagem de proteína de elastase total.

Em outras formas de realização, a presente invenção proporciona uma composição, incluindo, mas não limitado a uma composição farmacêutica, uma formulação de elastase ou uma dosagem unitária, que compreende (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase madura humana tipo I (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável, cuja composição farmacêutica está substancialmente isenta de proteínas bacterianas e/ou está substancialmente livre de outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I. Em concretizações específicas, a elastase humana tipo I e/ou a composição compreende menos do que 25% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, menos de 20% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, menos de 15% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, menos de 10% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, menos de 5% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, menos de 4% de 36 proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, menos de 3% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, menos de 2% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, menos de 1% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, menos de 0,5% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I e, 0% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, ou compreende de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I numa quantidade que varia entre qualquer duas das percentagens precedentes (por exemplo, 2% -25% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, 0,5%-10% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, 5% a 15% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, 0%-2% de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I, etc.). Tal como aqui utilizado, o termo "menos do que X%" de proteínas bacterianas e/ou outras proteínas de mamífero que não a referida elastase madura humana tipo I refere-se à quantidade de tais proteínas como uma percentagem do total de proteína numa preparação de elastase ou na referida composição. Em certas formas de realização, a elastase representa pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,8% do total de proteínas em tais composições ou preparações. 37

Os métodos para o tratamento e prevenção das doenças das condutas biológicas, compreendendo a administração das composições (por exemplo, composições farmacêuticas, formulações de elastase ou dosagens unitárias) compreendendo elastase madura humana tipo I purificada da invenção a um paciente com necessidade de tal, também são aqui revelados.

Além disso são fornecidos vectores que compreendem ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das proteínas de elastase da invenção ("ácidos nucleicos da invenção"), as células hospedeiras modificadas para expressar os ácidos nucleicos da invenção. Em concretizações especificas, os vectores compreendem ainda uma sequência de nucleótideos que regulam a expressão da proteina de elastase. Por exemplo, a sequência de nucleótideos que codifica a proteina da invenção pode ser ligada operacionalmente a um promotor indutivel por metanol. Outros promotores adequados são exemplificados na Secção 5.3 abaixo.

Numa concretização específica, a presente invenção proporciona um vector compreendendo uma sequência de nucleótideos que codifica um quadro de leitura aberta, que compreendendo um péptido de sinal de factor de levedura oí, ou um péptido de sinal de elastase tipo I (por exemplo, péptido de sinal de elastase porcina), operacionalmente ligado a uma sequência de pro-proteína de elastase humana tipo I. Opcionalmente, o vector compreende ainda um promotor induzivel por metanol operativamente ligado ao quadro de leitura aberta. 38

Também são fornecidas as células hospedeiras que compreendem os ácidos nucleicos e os vectores da invenção. Em certas formas de realização, o vector ou ácido nucleico está integrado no genoma da célula hospedeira; em outras formas de realização, o vector ou ácido nucleico é extracromossómico. Uma célula hospedeira preferida é uma célula de Pichia pastoris. Outras células hospedeiras adequadas são exemplificadas na Secção 5.3 abaixo.

Numa concretização especifica, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira de Pichia pastoris geneticamente modificada para codificar um quadro de leitura aberto, compreendendo um péptido de sinal de factor de levedura a-, ou um péptido de sinal de elastase porcina operacionalmente ligado a uma sequência de proenzima de elastase humana tipo I humano. Opcionalmente, o quadro de leitura aberta está sob o controlo de um promotor de metanol indutivel. A presente invenção proporciona ainda métodos para a produção de uma proteína de elastase imatura ou madura da invenção, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira manipulada para expressar um ácido nucleico da invenção, sob condições em que a proteína de proelastase é produzida. Em certas formas de realização, a proteína elastase madura é também produzida.

Condições de cultura preferidas para a produção das proteínas de proelastase e maduras da invenção, em particular para a célula hospedeira de Pichia pastoris, incluem um período de crescimento, a um pH baixo. Tipicamente, o pH baixo é de 2,0, 2,5, 3.0, 3,5, 4,0, 4.5, 39 5.0, 5.5, 6,0, ou qualquer intervalo entre quaisquer dois dos valores acima referidos. Em concretizações especificas, o pH baixo é um pH entre 2,0 a 6,0, 2,0 a 5,0, 3,0 a 6,0, 3,0 a 5,0, 4,0 a 6,0 ou 3,0 a 4,0. No final do período de cultura, o pH da cultura pode ser aumentado, de preferência a um pH de 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0 ou a um pH variando entre quaisquer dois dos valores precedentes com a finalidade de separar ou remover a sequência de ativação a partir da proteína de elastase madura. Em concretizações específicas, o pH da cultura é aumentado para um valor de pH variando de 7,5 al0,0 ou 8,0 a 9,0 e mais preferivelmente a um pH de 8,0.

Sempre que a expressão de uma proteína de proelastase da invenção está sob o controlo de um promotor de metanol induzível, as condições para a produção de uma proteína de elastase imatura ou madura da invenção podem também compreender um período de indução do metanol.

Os métodos de produção de elastase da invenção podem compreender ainda o passo de recuperação da proteína expressa pela célula hospedeira. Em certos casos, a proteína recuperada é uma proelastase que compreende a sequência de ativação. Em outros casos, a proteína recuperada é uma elastase madura sem a sequência de ativação. Sob certas condições, ambas as proteínas de proelastase e elastase madura são recuperadas.

De preferência, em particular onde é desejado contornar a auto-ativação de uma proelastase auto-ativada, as condições de cultura para a expressão de proelastase podem compreender um período de crescimento e a indução a um pH 40 baixo. Tipicamente, o pH baixo é de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, ou qualquer intervalo entre quaisquer dois dos valores acima referidos. Em concretizações específicas, o pH baixo é um pH variando de 2,0 a 3,0, 4,0 a 5,0, 5,0 a 6,0 ou 6,0 a 7,0. Em concretizações particulares, o pH varia entre 4,0 a 6,0 e é mais preferencialmente um pH de 5,5.

De preferência, em particular onde é desejado para contornar a auto-ativação de uma proelastase auto-ativada, as condições de cultura para a expressão de proelastase compreendem um período de crescimento e indução de citrato de sódio, succinato de sódio ou acetato de sódio. Em concretizações especificas, é usada uma concentração de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-15 mM, 50-200 mM, 75-175 mM a 100-150 mM, 75-125 mM, ou de qualquer gama cujos limites superiores e inferiores sejam selecionados de entre qualquer um dos valores anteriores (por exemplo, 50-75 mM, 75-100 mM, etc.). Numa concretização preferida, a concentração de citrato de sódio, succinato de sódio ou acetato de sódio é de 90-110 mM e ainda mais preferencialmente é de 100 mM.

Adicionalmente, particularmente quando é desejável para contornar a auto-ativação de uma proelastase auto-ativada ou a auto-degradação pela elastase madura, as condições de cultura para a expressão de uma proteína de elastase imatura podem compreender um período de crescimento e indução, na extremidade inferior da gama de temperaturas adequadas para a célula hospedeira em questão. Por exemplo, quando a célula hospedeira é uma célula hospedeira de Pichia pastoris, a gama preferida é de cerca de 22-28°C. Numa concretização específica, a célula hospedeira de Pichia pastoris é cultivada a 28°C. 41

Adicionalmente, particularmente quando é desejável contornar a degradação da proteina por proteases das células hospedeiras, as condições de cultura para a expressão de uma proteina de elastase imatura podem compreender um periodo de crescimento e indução, na extremidade inferior da gama de temperaturas adequadas para a célula hospedeira em questão. Por exemplo, quando a célula hospedeira é uma célula hospedeira de Pichia pastoris, a gama preferida é de cerca de 22-28°C. Numa concretização especifica, a célula hospedeira de Pichia pastoris é cultivada a 28°C. A ativação de uma proteina de proelastase auto-ativada da invenção pode ser iniciada pela adição de elastase extrínseca numa pequena quantidade (quantidade catalítica). Em determinadas concretizações, uma quantidade catalítica de elastase extrínseca representa menos de 10%, menos de 5%, menos de 2%, menos de 1%, menor de 0,5% ou menos de 0,1%, quer numa base molar ou de peso molecular, da elastase na amostra à qual se adiciona o catalisador de elastase.

Como alternativa ou concomitantemente, a proelastase auto-ativada pode ser sujeita a um pH 7-11 (mais preferivelmente pH 8), sobre o qual o péptido de ativação da proelastase auto-ativada é removido sem a necessidade de tripsina e resultando em elastase madura, ativa. Em concretizações específicas, é adicionada uma base Tris a uma concentração de 50-200 mM, 75-175 mM a 100-150 mM, 75-125 mM, ou qualquer intervalo cujos limites inferiores e superiores sejam selecionados de entre qualquer um dos valores anteriores (por exemplo, 50-75 mM, 75-100 mM, etc.), durante a etapa de ativação. Numa concretização preferida, 42 a base Tris é adicionada a uma concentração de 90-110 mM, mais de preferência 100 mM. O pH da base Tris é 7-11, de preferência, em formas de realização especificas, é base de Tris está a um pH de 7,0-11,0, 7-9, 7,5-9,5, 7,5-10, 8-10, 8-9, ou qualquer intervalo cujos limites inferiores e superiores sejam selecionados de entre qualquer um dos valores anteriores. Numa concretização preferida, a base Tris está a um pH de 7,5-8,5, com maior preferência 8,0. A expressão de uma sequência de elastase imatura pode, em alguns casos, produzir uma mistura de proteínas de proelastase e proteínas de elastase maduras, bem como proteínas de elastase variantes N-terminais. Assim, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo pelo menos duas de (1) uma proteína de proelastase, (2) uma proteína de elastase madura, e (3) , proteínas de elastase variantes de N-terminal.

Uma vez que uma elastase madura é produzida, pode ser liofilizada, por exemplo, para formulações farmacêuticas. Numa concretização exemplar, a presente invenção proporciona métodos de isolamento de elastase madura liofilizada tipo I compreendendo os passos: (a) cultura de uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeirade Pichia pastoris, manipulada para expressar uma molécula de ácido nucleico que codifica para um quadro de leitura aberta de preproelastase sob condições em que o quadro de leitura aberta é expresso, em que, numa forma de realização específica, dito quadro de leitura aberta compreende sequências de nucleótidos que codificam na direção 5' para a direção 3' (i) um péptido de sinal, por exemplo, um péptido de sinal operável em Pichia pastoris; 43 (ii) uma sequência de ativação compreendendo uma sequência de reconhecimento de elastase; e (iii) a sequência de uma proteína de elastase madura tipo I, produzindo assim uma proteína de proelastase; (b) sujeição da proteína de proelastase a condições de auto-ativação, produzindo, assim, uma elastase madura tipo I, em que as condições de auto-ativação incluem uma ou uma combinação das seguintes características: (i) alterar o pH de uma solução (que pode ser um sobrenadante da cultura de células) que contenha a proteína de proelastase, por exemplo, a um pH de 6,5-11, de preferência 8-9; (ii) purificação da proteína de proelastase, por exemplo, por cromatografia de troca iónica, e submeter a solução de conversão estendida para remover as variantes N-terminais, produzindo, assim, uma elastase madura humana tipo I; (iii) concentração da proteína de proelastase (por exemplo, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, oito vezes, 10 vezes, 12 vezes, ou uma gama em que os limites superior e inferior são selecionados independentemente a partir dos níveis de concentração expostos); (iv) submeter a proteína de proelastase ao aumento da temperatura (por exemplo, 29°C, 30°C, 32°C, 35°C, 40°C, 45°C ou 40°C, ou num intervalo no qual os limites inferiores e superiores sejam selecionados independentemente de entre as temperaturas precedentes); (v) purificação da proteína DE proelastase (por exemplo, usando resina Macro-Prep S High) a partir de um sobrenadante da cultura de células e a incubação de uma solução compreendendo a proteína de proelastase purificada 44 à temperatura ambiente (por exemplo, 22°C a 26°C) durante um período de pelo menos um dia (por exemplo, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias ou seis dias, um intervalo de dias em que os limites superior e inferior são selecionados independentemente a partir dos valores anteriores) (isto é influenciado pela presença de citrato/acetato, concentração, temperatura e pH da solução, e pode ser prontamente determinado por um perito na técnica). (c) opcionalmente, purificar a elastase madura humana tipo I, por exemplo, da etapa de cromatografia de troca iônica para a cromatografia de polimento; e (d) liofilizar a elastase madura humana tipo I, isolando uma elastase madura humana liofilizada tipo I. A elastase madura tipo I é preferencialmente uma elastase humana tipo I. Em certos aspectos, a elastase madura liofilizada tipo I é de preferência mais do que 95% pura; em formas de realização específicas, a elastase madura liofilizada tipo I é mais do que 98% ou mais de 99% pura.

As proteínas de elastase maduras da invenção podem ser formuladas em composições farmacêuticas. Assim, em formas de realização exemplares, a presente invenção proporciona um método de geração de uma composição farmacêutica que compreende uma elastase madura humana tipo I compreendendo (i) isolar uma elastase madura humana liofilizada tipo I de acordo com os métodos descritos acima; e (ii) reconstituir a elastase madura humana liofilizada tipo I num transportador farmaceuticamente aceitável. As elastases maduras humanas tipo I da invenção têm, preferivelmente, uma atividade específica maior do que 1, maior do que 5, maior do que 10, maior do que 20, maior do que 25, ou maior 45 do que 30 U/mg de proteína, tal como determinado através da medição da taxa de hidrólise do substrato peptídico pequeno de N-succinil-Ala-Ala-Ala-pNitroanilida (SLAP), que é catalisado pela adição de elastase. Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de elastase que catalisa a hidrólise de 1 micromole de substrato por minuto a 30°C e a atividade especifica é definida como a atividade por mg de proteína de elastase (U/mg) . De preferência, uma elastase humana madura tipo I da invenção tem uma atividade específica dentro de um intervalo em que o limite inferior é de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 ou 20 U/mg de proteína e ou limite superior é, de forma independente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50 U/mg de proteína. Em concretizações exemplificativas, a atividade específica é na gama de 1-40 U/mg de proteína, 1-5 U/mg de proteína, 2-10 U/mg de proteína, 4-15 U/mg de proteína, 5-30 U/mg de proteína, 10-20 U/mg de proteína, 20-40 U/mg de proteína, ou qualquer intervalo cujos limites superiores e inferiores sejam selecionados de entre qualquer um dos valores anteriores (por exemplo, 1-10 U/mg, 5-40 U/mg, etc.).

As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente estáveis. Em concretizações específicas, uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica preparada por liofilização e reconstituição, tal como descrito acima) mantém pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 60%, e mais preferencialmente pelo menos 70% da sua atividade específica após uma semana de armazenamento a 4°C. Em concretizações específicas, a composição farmacêutica mantém pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 95% da sua atividade específica após a reconstituição e uma semana de armazenagem a 4°C. 46

Esta invenção também fornece proteínas que compreendem uma sequência de aminoácidos de pro-proteína de elastase tipo I que contém uma sequência de domínio de clivagem da elastase. Outros domínios de clivagem que podem ser utilizados na presente invenção são qualquer uma das sequências descritas pela sequência de consenso do domínio de clivagem (SEQ ID N°: 74) Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Xaag

Xaa7 Xaas, onde Xaai = P5, Xa2 = P4, Xaa 3 = P3, Xaa4 = P2, Xaa5 = Pl, Xaa6 = P'l, Xaa7 = P'2 e Xaas = P'3, onde:

Xaai é glutamato, histidina, prolina, glicina, asparagina, lisina, ou alanina, ou, opcionalmente, um seu análogo;

Xaa2 é treonina, alanina, prolina ou histidina, ou, opcionalmente, um seu análogo; - Xaa3 é alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina ou valina, ou, opcionalmente, um seu análogo, é mas de preferência, não é glicina ou prolina; - Xaa4 é prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina ou treonina, ou, opcionalmente, um seu análogo;

Xaas é alanina, leucina, valina, isoleucina, mas não serina ou glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato, ou lisina, ou, opcionalmente, um seu análogo; - Xaa6 é alanina, leucina, valina, isoleucina ou de serina, ou, opcionalmente, um seu análogo; - Xaa7 é glicina, alanina ou valina, ou, opcionalmente, um seu análogo; e

Xaa8 é valina, treonina, fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou, opcionalmente, um seu análogo. 47

Esta invenção também proporciona um método de isolamento de uma elastase madura humana tipo I compreendendo: (a) cultura, sob condições de cultura, de uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de nucleótideos que codifica uma pró-proteina compreendendo (i) uma sequência de ativação que compreende uma sequência de reconhecimento de tripsina ligada operativamente a (ii) uma sequência de aminoácidos de uma proteína possuindo atividade de elastase sob as ditas condições de cultura, em que as referidas condições compreendem um período de crescimento ou indução a um pH de 2-6; (b) recuperar a pró-proteína expressa; (c) contactar a proteína recuperada com uma quantidade catalítica de tripsina em condições de pH nas quais a tripsina seja ativa; e (d) isolamento da elastase madura humana tipo I. Neste método, a elastase madura humana tipo I pode consistir essencialmente naa SEQ ID N°: 1, 4, 5, 84, ou 87. Em certas formas de realização, as condições podem compreender (a) um período de crescimento ou indução a um pH de 4-6; (b) um período de crescimento ou indução de 22°C a 28°C; ou (c) concentrações de citrato de sódio, succinato de sódio ou acetato de sódio de cerca de 50 mM a cerca de 200 mM, ou a concentração de citrato de sódio é de 90 mM a cerca de 110 mM no meio de cultura das referidas células hospedeiras.

Deve notar-se que os artigos indefinidos "um" e "uma" e o artigo definido "o" são usados no presente pedido, como é comum nos pedidos de patente, para significar um ou mais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Além disso, o termo "ou" é usado no presente pedido, como é comum nos pedidos de patente, significando a disjuntiva "ou" ou o conjuntivo "e". 48

Todas as publicações mencionadas nesta descrição são aqui incorporadas por referência. Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou algo semelhante que foi incluido nesta desctição é unicamente com a finalidade de proporcionar um contexto para a presente invenção. Não devem ser tomados como uma admissão de que qualquer ou todos estes temas fazem parte da base da técnica anterior ou eram do conhecimento geral comum no campo relevante à presente invenção, tal como existindo antes da data de prioridade do presente pedido.

As caracteristicas e vantagens da invenção irão tornar-se mais evidente a partir da seguinte descrição detalhada das suas concretizações 4. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figuras 1A-1B: A Figura IA mostra a sequência ELA-1.2A humana sintética (ou seja, recombinante). A sequência de elastase 1 humana recombinante (ou seja, a elastase pancreática humana tipo 1) contém uma região codificadora de 750 pares-base. Os sitios de enzimas de restrição selecionados estão sublinhados. As substituições de bases estão em duplo sublinhado, texto em negrito e os códãos que as contenham estão duplamente sublinhados. Os códãos de parada estão em caixas. A sequência de pró-péptido está em itálico. A região de codificação resulta numa proteína de 250 aminoácidos . Após a clivagem do pró-péptido de 10 aminoácidos, a natureza da enzima resultante é de 240 aminoácidos. A Figura 1B mostra a região de fusão de tradução pPROT324. A fusão de tradução entre o vector e uma região de codificação de ELA-1 está representado. A amplificação por PCR da sequência de ELA-1 prevista para a incorporação dos domínios de clivagem de sinal KEX2 e STE13 49 para produzir um produto segregado com um terminal-N esperado do primeiro aminoácido (em negrito) da sequência de ativação (em itálico).

Figura 2: Esquema do N-terminal para o C-terminal dos (sobreposição) principais componentes das proteínas de elastase da invenção, em que os componentes numerados representam: (1) sequência de sinal (linhas verticais); (2) pro-peptídeo opcional/sequência espaçadora (blocos); (3) pro-péptideo de elastase (linhas diagonais, combinação de o padrão não sombreado e padrão em diamante); (4) peptídeo de ativação (combinação de o padrão não sombreado e padrão em diamante); (5) sequência de reconhecimento (padrão de diamante); (6) domínio de clivagem (padrão não sombreado, padrão de diamante e a parte esquerda das riscas horizontais); (7) sítio de clivagem (padrão não sombreado, padrão de diamante e a parte esquerda das riscas horizontais); (8) proteína de preproelastase (esquema inteiro); (9) proteína de proelastase (riscas diagonais, sem sombra, padrão do diamante e riscais horizontais combinadas); e (10) proteína de elastase madura (riscas horizontais). A tabela mostra as designações de aminoácidos da região no esquema delimitado pela seta. Não desenhado à escala. A nomenclatura é apenas para fins de referência e não se destina a conotar uma função particular, atividade ou mecanismo.

Figura 3. Diagrama do vector pPROT24-V. "factor de Secreção a" refere -se a uma cassete que contém o péptido de sinal de factor de levedura α e de pro-péptido, seguido de uma repetição do sítio Kex2 e STE13.

Figura 4: análise de SDS-PAGE de fracções de cromatografia de captura de uma cultura de 201-24-266-VU contendo tripsina ativada pró-PRT-201. Os números da faixa correspondem aos números de fração. As frações 6-18 50 consistem principalmente em proenzima glicosilada (banda superior) e proenzima não glicosilada (banda inferior). As fracções 19-35 consistem principalmente em proenzima não gi icosilada. M = marcadores de peso molecular. FT = fluxo através da coluna.

Figuras 5A-5F: A Figura 5A é uma tabela de dados da pro-proteína auto-ativada. As sequências de pro-péptido estão listadas na primeira coluna. SDS-PAGE de sobrenadantes após 1, 2 e 3 dias de indução (faixas 1, 2 e 3, respectivamente) são apresentados na segunda coluna. A produção de pro-proteína relativa baseada em SDS-PAGE está listada na terceira coluna. A estabilidade relativa da pro-proteína ao longo de 3 dias de indução com base em SDS-PAGE está listada na quarta coluna. Pro-proteinas com 42 e 48 sequências de pro-péptido são classificadas como tendo baixa estabilidade devido à presença da proteína madura durante a indução (observada após 1, 2 e 3 dias, para a variante 42 e após 2 e 3 dias, para a variante 48) . Taxas de conversão relativas das pro-proteinas conforme determinado pelo tempo para atingir a velocidade máxima de reação SLAP estão indicadas na quinta coluna. Os percentuais estimados de proteína convertida que compreendiam as variantes N-terminal da proteína de elastase madura estão listados na sexta coluna. As Figuras 5B-5F mostram dados da taxa de conversão das sequências de pro-péptido 24, 42, 48, 49 e 55, respectivamente.

Figura 6. Esquema de clonagem pPROT55M3-V. pPROT55M3-V foi construído por ligação in vitro de duas cassetes de expressão adicionais para a estrutura de vector 4.3 kb pPROT55-V, dando um total de três cassetes de expressão em tandem. 0 fragmento da cassete de expressão kb 2,3 foi libertado de pPROT55-V com digestão de restrição BglII e 51

BamHT e purificado, seguido por ligação de duas cópias da cassete de expressão para pPROT55-V linearizado com BamHI.

Figura 7: Frasco de agitação de otimização do clone 201-55M3-006-VU. O meio de indução padrão, BKME, foi preparado e suplementado com citrato de sódio para se atingir as concentrações finais de 0, 12,5, 25 e 50 mM de citrato de sódio, pH 5,5. O meio foi utilizado para ressuspender pelotes de células em fase de crescimento usando uma proporção de 1 g de peso molhado de células para 10 ml de meio de indução. As suspensões de células de 25 mL cada, foram colocadas em frascos não-vortex de 250 ml e incubadas a 22°C ou 25°C durante 3 dias com agitação a 275 rpm. Foi adicionado metanol duas vezes por dia a uma concentração final de 0,5% em volume. Aliquotas de sobrenadante foram tiradas durante o período de 3 dias e analisadas quanto à expressão da proteína por SDS-PAGE e coloração com Coomassie. O painel A mostra as amostras induzidas a 22°C e o Painel B mostra as amostras induzidas a 25°C. Em ambos os painéis, as faixas 1-3 são sobrenadantes após 1, 2 e 3 dias após a indução, respectivamente, contendo 0% de citrato de sódio; as faixas 4-6 são semelhantes, excepto com 12,5% de citrato de sódio; as faixas 7-9 são semelhantes, excepto com 25% de citrato de sódio; e as faixas 10-12 são semelhantes, excepto com 50 mM de citrato de sódio.

Figura 8. Análise de SDS-PAGE de sobrenadantes de fermentação 201-55-001-VU e 201-55M3-003-VU. Faixas 1, 2: sobrenadante 201-55-001-VU; faixas 3, 4: obrenadante 201-55M3-003-VU; faixa 5: vazia; faixa 6: marcadores de peso molecular.

Figura 9. A análise de SDS-PAGE de fracções de cromatografia de captura da pro-proteína pPROT55M3-V. Um total de 30 microlitros de cada fracção de eluição foi misturado com 10 microlitros de amostra de tampão de 52 carregamento 4X ____________ _ ______________ mercaptoetanol. As proteínas foram sujeitas a electroforese num gel de gradiente linear de 8-16%, seguido por coloração com Coomassie. Foram observadas duas formas predominantes de PRT-201: a pro-proteína (frações 15-43) e PRT-201 maduro espontaneamente convertido (frações 15-44). Números da faixa correspondem aos números da fração. M, marcador de peso molecular. AC, antes da coluna (pré-carga) de amostra.

Laemmli suplementado com beta-

Figura 10: Análise de HIC-HPLC de conversão da pró-proteína purificada. pró-PRT-201-003-55M3-VU purificado foi submetido a conversão a 26°C. 0 gráfico mostra as quantidades relativas de PRT-201 maduro (de comprimento total) e variantes N-terminal produzidas durante a conversão.

Figura 11: Análise de HIC-HPLC da conversão da pró-proteína no sobrenadante de fermentação realizada por filtração de fluxo tangencial. 0 sobrenadante de fermentação 55M3-201-003-VU clarificado foi submetido a filtração de fluxo tangencial com 100 mM de Tris, pH 8,0, utilizando diafiltração a volume constante, à temperatura ambiente, com membranas de celulose regenerada. O gráfico mostra as quantidades relativas de pró-proteína, PRT-201 maduro (de comprimento total) e variantes de N-terminal presentes em vários pontos temporais durante a conversão.

Figura 12. Análise de SDS-PAGE de fracções de cromatografia de captura da conversão pPROT55M3-V. Um total de 30 microlitros de cada fracção de eluição foi misturado com 10 microlitros de amostra de tampão de carregamento 4X Laemmli suplementado com beta-mercaptoetanol. As proteínas foram sujeitas a electroforese num gel de gradiente linear de 8-16%, seguido por coloração com Coomassie. Foram observadas duas formas predominantes de PRT-201: a forma glicosilada madura (fracções 35-70), e a forma não glicosilada madura 53 (fracções 75-160). Os números de faixa correspondem aos números de fração. M, marcador de peso molecular. AC, antes da coluna (pré-carga) de amostra.

Figura 13: Dependência da concentração de pró conversão. pró-PRT-201 purificado a partir do clone 201-a-003-55M3 VU (pró-PRT-201-55M3-003-UV) foi submetido a conversão em concentrações de 0,2, 1,0, 1,6, e 1,8 mg/mL. As reações foram monitorizadas por conversão de HIC-HPLC em tempo real até a pro-proteina ser ^ 1% da proteína total. O gráfico mostra as quantidades relativas de PRT-201 maduro (de comprimento total) (barras sombreadas) e variantes de N-terminal (barras diagonais cheias), produzidos durante a conversão.

Figura 14. Sequência de ADN de elastase pancreática porcina sintética (isto é, recombinante) tipo 1. A sequência recombinante contém uma região de codificação de 750 pares-base. Sítios de restrição SacII e Xbal como sublinhados foram incorporados para facilitar a clonagem. Os códãos de parada estão em caixas. A sequência de pró-peptídeo é em negrito.

Figura 15. Sequência de aminoácidos de elastase pancreática porcina sintética (isto é, recombinante) tipo I. A região de pró-peptídeo é em negrito enquanto o sítio de clivagem da tripsina está em caixa. Após a clivagem do pro-péptido de 10 aminoácidos, a enzima madura resultante é de 240 aminoácidos.

Figura 16. Esquema de clonagem de elastase pancreática porcina tipo I em vector PV-1. Após a síntese da região codificadora da pro-proteina de elastase pancreática porcina tipo I, foi clonada no vector pUC Blue Heron. Além de amplificar a sequência de codificação da elastase pancreática porcina tipo I, a PCR foi usada para incorporar os sítios de restrição Xhol e SacII para clonagem no vector 54 PV-1. 0 produto de PCR foi digerido, purificado em gel e ligado com o vector PV-1 digerido com Xhol e SacII, resultando assim num vector de expressão pPROT101-24-V que codifica a tripsina ativada da pro-proteína de elastase pancreática porcina tipo I.

Figura 17. Análise da expressão dos clones pPROT101-42-V auto-ativado e de tripsina ativada pPROT101-24-V durante a indução de metanol por SDS-PAGE. Os sobrenadantes em frasco de agitação após 1 dia de indução foram analisados num gel de gradiente de 8-16%, seguido por coloração com coloração com Coomassie. As faixas 1-10 contêm os sobrenadantes de dez diferentes clones transformados com pPROT101-42-V. As faixas 11-12 contêm os sobrenadantes a partir de dois clones diferentes transformadas com pPROT101-24-V. M, marcadores de peso molecular.

Figura 18. Análise da expressão dos clones de pPROT101-49-V auto-ativado e pPROT101-55L-V durante a indução de metanol por SDS-PAGE. Os sobrenadantes em frasco de agitação após 1 e 2 dias de indução foram analisados num gel de gradiente de 8-16%, seguido por coloração com Coomassie. As faixas 1-2 contêm os sobrenadantes a partir do clone pPROT101-49-V após 1 e 2 dias após a indução, respectivamente. As faixas 3-4 contêm os sobrenadantes a partir do clone pPROT101-55L-V após 1 e 2 dias após a indução, respectivamente. M, marcadores de peso molecular.

Figura 19. Ativação temporal de proteínas pPROT101-49-V e pPROTl01-55L-V através do teste de conversão em pequena escala, conforme determinado pela atividade de elastase SLAP. As barras de erro representam ± SD da média (n = 4).

Figura 20. Análise de SDS-PAGE dos sobrenadantes pPROTlOl-49-V e pPROT101-55L-V antes e depois do ensaio de conversão de pequena escala. Antes da electroforese, as amostras foram misturadas com ácido cítrico, agente redutor TCEP e 55 tampão de amostra LDS (Invitrogen, CA) . As amostras foram aquecidas a 70°C durante 10 minutos. Faixas 1-2: sobrenadante pPROT101-49-V pré e pós ensaio de conversão, respectivamente; faixas 3-4: sobrenadante pPROT101-55L V prée pós ensaio de conversão, respectivamente. M, marcadores de peso molecular.

Figura 21. Curva padrão de TrypZean.

Figura 22. Vista lateral parcialmente seccionada de uma forma de realização do dispositivo médico descrito na Secção 5.9.

Figura 23. Vista semelhante à da Figura 22, que ilustra o movimento dos actuadores do dispositivo médico.

Figura 24. Vista em secção da extremidade do plano da linha 2- 2 na Figura 22.

Figura 25. Vista em secção da extremidade do plano da linha 3- 3 da Figura 22.

Figura 26. Diagrama do percurso do fluido do dispositivo médico da Figura 22, que se estende a partir dos centros de Luer através das condutas de fornecimento de fluido para o reservatório e, em seguida, para os penetradores de tecidos.

Figura 27. Vista lateral parcialmente seccionada de uma segunda forma de realização do dispositivo médico da presente invenção, que mostra os actuadores nas suas configurações restritas.

Figura 28. Vista semelhante à da Figura 27, mas mostrando os actuadores nas suas configurações sem restrições.

Figura 29. Cista em perspectiva de extremidade do conjunto ao longo da linha de 3'-3' da Figura 27. 56

Figura 30. Vista em perspectiva de extremidade do conjunto ao longo da linha de 4'-4' da Figura 29 que mostra os penetradores de tecidos.

Figura 31. Vista lateral que mostra o detalhe da extremidade proximal do dispositivo, apresentado para a direita nas Figuras 27 e 28.

Figura 32. Vista parcial do exterior do dispositivo médico da Figura. 22 na sua posição restringida.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a métodos para a expressão recombinante e a produção de proteínas de elastase maduras, biologicamente ativas. A presente invenção proporciona métodos novos e eficientes de produção de proteínas de elastase recombinantes por cultura de células hospedeiras, incluindo a célula hospedeira preferida, Pichia pastoris, que compreende os ácidos nucleicos que codificam para proteínas de proelastase e proteínas de preproelastase. Também é proporcionada a utilização de proteínas recombinantes para a fabricação de composições farmacêuticas para o tratamento e prevenção das doenças das condutas biológicas (incluindo as artérias ou veias).

Em certos aspectos, a presente invenção é dirigida a proteínas recombinantes de proelastase auto-ativadas e ácidos nucleicos relacionados, células hospedeiras e métodos de fabrico. Tais proteínas de proelastase auto-ativadas são concebidas para conter um sítio de reconhecimento de elastase imediatamente N-terminal ao primeiro resíduo da proteína de elastase madura. Sob determinadas condições de cultura, tais como as descritas na Secção 6 abaixo, é possível reduzir a auto-ativação até 57 se desejar. É também possível reduzir a auto-ativação até o a proelastase ser removida da cultura de células. A presente invençãoto proporciona a expressão eficiente e processos de purificação para a produção de proteínas de elastase de grau farmacêutico. A presente invenção também fornece métodos para o tratamento ou prevenção de doenças das condutas biológicos, utilizando as proteínas de elastase da invenção. A descrição na Secção 5 aqui é aplicável às formas de realização da Secção 8. Assim, por exemplo, uma referência a uma proteína de elastase da invenção inclui, mas não está limitada a, uma referência a uma proteína de elastase de acordo com qualquer uma das formas de realização 1-39 e 68-69, ou uma proteína de elastase obtida ou obtenível pelo método de qualquer uma das formas de realização 89-224, 261-276 e 347-373. Da mesma forma, uma referência a um ácido nucleico da presente invenção refere-se, inter alia, a um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das concretizações 40-67; a referência a um vector refere-se, inter alia, uma referência a um vector de acordo com qualquer uma das concretizações 70-72; a referência a uma célula refere-se, inter alia, a uma célula de acordo com qualquer uma das concretizações 73-87; a referência a um sobrenadante de cultura de células refere-se, inter alia, a um sobrenadante de cultura de células de acordo com a concretização 88; a referência a composições, tais como composições farmacêuticas, formulações de elastase e suas dosagens unitárias, inclui, por exemplo, aquelas exemplificadas nas formas de realização 277-314, 346, 386, e 415-420, ou aquelas obtidos ou podem ser obtidas pelo método de qualquer uma das formas de realização 261-276 e 58 374-385; e as referências a métodos terapêuticos também incluiem uma referência aos métodos terapêuticos de acordo com qualquer uma das concretizações 387-414, e as referências a um kit incluiem a referência, inter alia, uma referência a um kit das concretizações 421-425 da Secção 8.

5.1 PROTEÍNAS DE ELASTASE A presente invenção é dirigido a, inter alia, os métodos para a expressão recombinante e a produção de proteínas de elastase maduras, biologicamente ativas. As proteínas de elastase são geralmente expressas como preproproteínas, contendo, entre outras sequências, um péptido de sinal, um peptídeo de ativação, e uma parte madura com atividade biológica. Sequências de proteína de elastase madura adequadas são descritas na secção 5.1.1 abaixo. Sequências de peptídeos de ativação adequados estão descritos na Secção 5.1.2 abaixo. Sequências de sinal adequadas são descritas na Secção 5.1.3 abaixo.

Por conseguinte, em determinados aspectos, as proteínas de elastase da invenção são proteínas de preproelastase. A remoção da sequência de sinal da preproproteína após a secreção geralmente produz uma pró-proteína inativa contendo um peptídeo de ativação e uma proteína madura. As frases "sequência de ativação" e "peptídeo de ativação" são aqui utilizadas indiferentemente. Assim, noutros aspectos, as proteínas de elastase da invenção são proteínas de proelastase compreendendo um peptídeo de ativação que está operacionalmente ligado a uma proteína de elastase madura. Numa forma de realização exemplar, um peptídeo de ativação ou sequência de tipo selvagem de elastase pancreática humana tipo I compreende os primeiros 10 aminoácidos N-terminais da proproteína de elastase humana tipo I (SEQ ID 59 Ν°: 22) . Em certas formas de realização, o péptido de ativação é um péptido de SEQ ID N°: 80. Os peptídeos de ativação ou de sequências úteis para a prática desta invenção incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID N°: 23, 72 e 73. Ainda outras sequências de ativação úteis para a prática da presente invenção podem ser obtidas a partir dos resíduos N-terminal 1-10 da SEQ ID N°:64-69 e 98-103. A remoção do peptídeo de ativação a partir da sequência de proelastase gera uma proteína de elastase madura. O passo em que o peptídeo de ativação é removido a partir da sequência de proelastase/separado a partir da sequência de elastase madura para gerar uma proteína de elastase madura é referido aqui como um passo de ativação. Assim, em ainda outros aspectos, as proteínas de elastase da invenção são proteínas de elastase maduras.

Os resíduos de aminoácidos que constituem a extremidade C-terminal (ou seja, o terminal carboxi) do péptido de ativação e o terminal N (isto é, o terminal amino) da proteína madura que cercam a ligação de clivagem estão representados na Figura 2 e também aqui identificados como se segue. Em primeiro lugar, os resíduos localizados na extremidade C-terminal do peptídeo de ativação são designados PX, ... P5, P4, P3, P2 e Pl, onde PI é o resíduo C-terminal do peptídeo de ativação. Os resíduos localizados na região N-terminal da proteína madura são designados Pl ', P2', P3 ', ... PX', em que Pl é o resíduo de aminoácido N-terminal da proteína madura. A ligação cindível que é clivada por proteólise (referida como a "ligação de clivagem" na Figura 2) é a ligação peptídica entre o resíduo Pl do peptídeo de ativação e o resíduo Pl' da proteína madura. 60 A região que abrange os quatro aminoácidos da extremidade C-terminal do peptideo de ativação (resíduos de P4 para Pl) através dos primeiros 4 aminoácidos da extremidade N-terminal da proteína madura (resíduos de Pl a P4 ') é aqui referida como "sítio de clivagem". A região que abrange cerca de 5 aminoácidos do terminal-C do peptideo de ativação (isto é, os resíduos de Pl a P5) até aproximadamente os primeiros três aminoácidos do terminal N da proteína madura (isto é, os resíduos de Pl a P3') é aqui referida como o "domínio de clivagem". Exemplos de domínios de clivagem que podem ser utilizados no contexto da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID N°s: 42, 43, 48, 49, 52, 53, 54 ou 55. Outros domínios de clivagem que podem ser utilizados na presente invenção são qualquer uma das sequências descritas pela sequência do domínio de clivagem de consenso Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Xaa 6 Xaa 7 Xaa e, onde Xaa i = P5, Xaa 2 = P4 Xaa 3 = P3, Xaa4 = P2, Xaas = Pl/ Xaa6 = Pl', Xaa7 = P2' e Xaas = P3', em que:

Xaa4 é glutamato, histidina, prolina, glicina, asparagina, lisina, ou alanina, ou, opcionalmente, um seu análogo;

Xaa2 é treonina, alanina, prolina ou histidina, ou, opcionalmente, um seu análogo; - Xaa3 é alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina ou valina, ou, opcionalmente, um seu análogo, mas não é de preferência, glicina ou prolina; - Xaa4 é prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina ou treonina, ou, opcionalmente, um seu análogo; 61

Xaas é valina, treonina, fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou, opcionalmente, um seu análogo.

As três regiões de aminoácidos que abrange os resíduos P3, P2 e PI do peptídeo de ativação são referidas aqui como um "local de reconhecimento da elastase". Exemplos de locais de reconhecimento que podem ser utilizados no contexto da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID N°s: 14-16, e 18-21. Outros locais de reconhecimento contemplados por esta invenção incluem qualquer local de reconhecimento descrito pelos sítios de reconhecimento de consenso da SEQ ID N°: 11, 12, 13, ou 93. A sequência de reconhecimento de consenso de elastase 1 SEQ ID N°: 11 é representada pela sequência de péptido Xaai Xaa2 Xaa3, em que Xaai = P3, Xaa2 = P2, Xaa3 = Pl, em que: - Xaai é alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina ou valina, ou, opcionalmente, um seu análogo, mas não é de preferência, glicina ou prolina; - Xaa2 é prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina ou treonina, ou, opcionalmente, um seu análogo; - Xaa3 é alanina, leucina, valina, isoleucina ou de serina, ou, opcionalmente, um seu análogo, mas não é de 62 preferência, glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato, ou lisina. A sequência de reconhecimento de consenso de elastase 2 SEQ ID N°: 12 é representado pela sequência Xaai Pro Xaa2, em que: - Xaa i é alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina ou valina, ou, opcionalmente, um seu análogo, mas não é de preferência, glicina ou prolina; - Pro é prolina, ou, opcionalmente, um seu análogo; - Xaa2 é alanina, leucina, valina, isoleucina ou de serina, ou, opcionalmente, um seu análogo, mas não é de preferência, glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato ou lisina. A sequência de reconhecimento de consenso de elastase 3 SEQ ID N°: 13 é representada pela sequência de péptido Xaai

Xaa2 Xaa3, em que Xaa3 = P3, Xaa2 = P2, Xaa3 = Pl, em que Xaai é asparagina ou alanina, ou, opcionalmente, um seu análogo; em que Xaa2 é prolina ou alanina, ou, opcionalmente, um seu análogo: e em que Xaa3 é alanina, leucina ou valina, ou, opcionalmente, um seu análogo. A sequência de reconhecimento de consenso de elastase 4 SEQ ID N°: 93 é representada pela sequência Xaa3 Pro Xaa2, em que: - Xaa i é alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina ou valina, ou, opcionalmente, um seu análogo, mas não é de preferência, glicina ou prolina; - Pro é prolina, ou, opcionalmente, um seu análogo; 63 - Xaa2 é alanina, leucina, valina, isoleucina ou serina, ou, opcionalmente, um seu análogo, mas não é de preferência, glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato ou lisina. A referência a uma sequência como uma "sequência de clivagem, "dominio "clivagem", "sequência de ativação", "sequência de reconhecimento de elastase", etc., são apenas para facilidade de referência, e não se destina a sugerir qualquer função da sequência ou mecanismo pelo qual a sequência é reconhecida ou processada.

As proteínas da invenção são geralmente compostas por aminoácidos e podem, além disso incluir um ou mais (por exemplo, até 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ou 15), análogos de aminoácidos. Geralmente, tal como é aqui utilizado, um aminoácido refere-se a um estereoisómero L de ocorrência natural. Um análogo de aminoácido refere-se a um D-estereoisómero, um aminoácido quimicamente modificado, ou outro aminoácido não natural. Por exemplo, os aminoácidos não naturais incluem, mas não estão limitados a ácido azetidinecarboxilico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, β-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutirico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-aminoheptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisbutírico, ácido 2-aminopimélico, butilglicina terciária, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosine, alo-isoleucina, N-metilalanina, N- 64 metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico e tioprolina. Um aminoácido quimicamente modificado inclui um aminoácido que é quimicamente bloqueado, reversivelmente ou irreversivelmente, e/ou modificado num ou mais dos seus grupos laterais, átomos de carbono-α, grupo amino terminal, ou grupo de ácido carboxilico terminal. Uma modificação química inclui a adição de porções químicas, criação de ligações novas e remoção de unidades químicas. Exemplos de aminoácidos quimicamente modificados incluem, por exemplo, sulfóxido de metionina, metionina-sulfona, S-(carboximetil) cisteína, sulfóxido de S-(carboximetil) cisteína e S-(carboximetil) cisteína sulfona. Modificações de grupos laterais de aminoácidos incluem a acilação de grupos ε-amino da lisina, N-alquilação de arginina, histidina ou lisina, alquilação de grupos de ácido carboxilico glutâmico ou aspártico, e desamidação de glutamina ou asparagina. Modificações do terminal amino incluem o alquilo des-amino, N-inferior, N-di-alquilo-inferior, e as modificações N-acilo. Modificações do grupo carboxilo terminal incluem a amida, alquilo amida inferior, dialquilo amida e modificações de éster de alquilo inferior. Um alquilo inferior é um alquilo C1-C4. Além disso, um ou mais grupos laterais, ou grupos terminais, podem ser protegidos por grupos de proteção conhecidos de um químico de proteínas normalmente qualificado. 0 carbono-α de um aminoácido pode ser mono ou di-metilado.

As proteínas da invenção podem ser modificadas ou derivatizadas, tal como modificadas por fosforilação ou glicosilação, ou derivadas por conjugação, por exemplo, 65 para um lípido ou uma outra proteína (por exemplo, para visar ou estabilização), ou semelhantes. A presente invenção geralmente refere-se a uma proteína de elastase "isolada" ou "purificada". Uma proteína de elastase isolada é aquela que é removida do seu ambiente celular. Uma proteína de elastase purificada é substancialmente isenta de material celular ou outras proteínas contaminantes da fonte celular ou de tecido a partir do qual a proteína de elastase é derivada, ou substancialmente livre de percursores químicos ou outras substâncias químicas quando sintetizadas quimicamente. A linguagem "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de proteínas de elastase em que a proteína é separada dos componentes celulares das células a partir das quais é produzida de forma recombinante. Assim, a proteína de elastase que é substancialmente isenta de material celular inclui preparações de proteína de elastase tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) de proteína heteróloga (também referido aqui como uma "proteína contaminante "). Quando a proteína de elastase é produzida por um processo em que é segregada no meio de cultura, é também de preferência substancialmente livre do meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos do que cerca de 20%, 10%, ou 5% do volume da preparação de proteína de elastase.

Em certas concretizações, uma elastase isolada ou purificada é, adicionalmente, isenta ou substancialmente isenta de ADN celular. Em concretizações específicas, o ADN genómico da célula hospedeira está presente numa quantidade inferior a 10 picogramas, menos do que 5 picogramas, menos do que 3 picogramas, menos de 2 picogramas, ou inferior a 1 66 picograma de ADN por miligrama de proteína de elastase numa preparação de proteína de elastase isolada ou purificada, ou uma composição compreendendo proteína de elastase isolada ou purificada. Numa concretização, o ADN da célula hospedeira é ADN de Pichia pastoris.

Sequências de proteínas de elastase úteis são apresentadas na Tabela 1. Numa concretização específica, a invenção proporciona uma proteína de proelastase (incluindo, mas não se limitando a uma proteína de qualquer uma das SEQ ID N°s: 6-9, 64-69, 88-91 e 98-103), compreendendo (i) uma sequência de ativação compreendendo uma sequência de reconhecimento de elastase operacionalmente ligada a (ii) uma sequência de aminoácidos de uma proteína possuindo atividade de elastase tipo I. Vários polimorfismos da elastase humana do tipo I são conhecidos. Qualquer combinação de polimorfismos é contemplada nas sequências de proteínas de proelastase da presente invenção, incluindo mas não se limitando às combinações de polimorfismos estabelecidas na Tabela 2. A proteína compreende ainda opcionalmente uma sequência de sinal operativamente ligada à dita sequência de ativação. Em certas formas de realização específicas, a sequência de sinal é operável em Pichia pastoris, tal como um péptido de sinal de factor de levedura-α, exemplificado pela sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 34. Péptideos contendo sequências de sinal alternativos são exemplificados nas SEQ ID N°s: 50 e 96 (que contém um péptido de sinal, um pró-péptido de não-elastase e uma sequência espaçadora) e SEQ ID N°s: 51 e 97 (que contém o péptido de sinal e um pro-péptideo de não-elastase). Em outras formas de realização específicas, a sequência de sinal é uma sequência de sinal de secreção de mamífero, tal como uma sequência de sinal de elastase 67 porcina. De preferência, a sequência de reconhecimento da elastase é uma sequência de reconhecimento da elastase tipo I, mais preferencialmente uma sequência de reconhecimento de elastase humana tipo I. A presente invenção abrange ainda as variantes das proteínas de elastase da invenção. As variantes podem conter substituições de aminoácidos num ou mais residuos não essenciais de aminoácidos previstos. De preferência, uma variante inclui não mais do que 15, não mais do que 12, não mais do que 10, não há mais do que 9, não mais do que 8, não mais do que 7, não mais do que 6, não mais do que 5, não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2 ou não mais do que 1 substituição conservadora de aminoácidos em relação a uma elastase madura que ocorre naturalmente e/ou não mais do que 5, não mais do que 4, não mais do que 3, ou não mais do que 2 substituições não conservadoras de aminoácidos, ou não mais do 1 substituição não conservadora de aminoácidos, em relação a uma elastase madura que ocorre naturalmente.

Em concretizações especificas, a variante não tem mais do que 10 ou mais preferivelmente não mais do que cinco substituições conservadoras de aminoácidos relativamente a uma elastase madura, uma proelastase ou uma preproelastase da invenção, tais como em relação a uma elastase madura da SEQ ID N°: ou SEQ ID N°: 84 ou uma proteina de proelastase da SEQ ID N°: 6-9, 64-69, 88-91 e 98-103. As sequências de aminoácidos da SEQ ID N°s: 1 e 84 contêm uma ou mais posições correspondentes a possíveis polimorfismos na sequência de elastase madura, nas posições 44 (W ou R) , 59 (M ou V) , 220 (V ou L) ; e 243 (Q ou R) (as posições referem-se à preproproteína). A invenção engloba, assim, 68 proteínas de elastase maduras com qualquer combinação dos quatro polimorfismos identificados na SEQ ID N° : 84. Cada uma dessas combinações é descrita na Tabela 3 acima. A sequência das SEQ ID N°s: 88-91 e 98-103 contêm ainda um polimorfismo potencial na sequência de pro-péptido, na posição 10 (Q ou H). A invenção engloba, assim, as sequências de preproelastase e proelastase contendo qualquer combinação dos cinco polimorfismos identificados nas SEQ ID N°s:88-91 e 98-103. Cada uma dessas combinações é descrita na Tabela 2 acima.

Uma "substituição conservadora de aminoácidos" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas familias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares descarregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano).

As proteínas de elastase variantes da invenção podem incluir substituições de aminoácidos, com os análogos de aminoácidos, assim como aminoácidos, como aqui descrito. 69

Em concretizações específicas, a proteína da invenção compreende ou consiste essencialmente numa variante de uma elastase madura humana tipo I, por exemplo, uma variante que é pelo menos cerca de 75%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica às pro-proteínas de elastase ou proteínas de elastase maduras listadas na Tabela 1, tais como, mas não limitadas a, pro-proteínas de elastase das SEQ ID N°s: 6-9, 64-69, 88-91 e 98-103, e retêm a atividade da elastase, quando expressa para produzir uma proteína de elastase madura de SEQ ID N°: 1, 4, 5, 84 ou 87.

Para determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação óptima (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas na sequência de uma primeira sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico para um alinhamento óptimo com um segundo aminoácido ou sequência de ácido nucleico). Os resíduos de aminoácidos ou nucleótideos nas posições de aminoácidos correspondentes ou posições de nucleótideos são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou de nucleótideo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (% identidade = (# posições idênticas/# total de posições sobrepostas) x 100). Numa forma de realização, as duas sequências são do mesmo comprimento. Em outras formas de realização, as duas sequências diferem em comprimento por não mais do que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% do comprimento da mais longa das duas sequências. 70 A determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo está incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. Biol. 215:403-410. Pesquisas de nucleótidos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para se obter sequências de nucleótideos homólogas a moléculas de ácido nucleico da invenção. Pesquisas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para se obter sequências de aminoácidos homólogas para moléculas de proteínas da invenção. Para obter alinhamentos com folga, para fins de comparação, pode ser utilizado Gapped BLAST como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, o PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa reiterada que detecta relações distantes entre as moléculas (Id.). Ao utilizar os programas BLAST, BLAST Gapped e PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Outro exemplo preferido, não limitativo, de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). Tal algoritmo está incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que faz parte do pacote de software de alinhamento de sequências CGC. Quando se utiliza o programa ALIGN para a comparação 71 de sequências de aminoácidos, pode ser utilizada uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Os algoritmos para a análise de sequências são conhecidos na técnica e incluem ADVANCE e ADAM como descrito em Torellis e Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; e FASTA, descrito em Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. 85:2444-8. Dentro do FASTA, KTUP é uma opção de controlo, que define a sensibilidade e velocidade da pesquisa. Se ktup =2, as regiões semelhantes nas duas sequências a ser comparadas são encontradas, olhando para os pares de resíduos alinhados; se ktup =1, os aminoácidos individuais alinhados são examinados, ktup pode ser ajustado para 2 ou 1 para sequências de proteínas, ou de 1 a 6, para as sequências de ADN. O padrão ktup se não for especificado é 2 para proteínas e 6 para ADN. Para uma descrição mais detalhada dos parâmetros FASTA ver http : //bioweb.pasteur.fr/does/man/man/fasta.1.html#sect2, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência. A percentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada utilizando técnicas semelhantes às descritas acima, com ou sem permissão de lacunas. No cálculo da percentagem de identidade, comparações tipicamente exatas são contadas.

As proteínas de elastase da invenção podem apresentar modificações pós-translação, incluindo, mas não limitadas a glicosilações (por exemplo, glicosilação N-ligados ou 0-ligados), miristilações, palmitilações, acetilações e fosforilações (por exemplo, serina/treonina ou tirosina). Numa concretização, as proteínas de elastase da invenção 72 exibem níveis reduzidos de glicosilação O-ligada e/ou glicosilação N-ligada em relação às proteínas de elastase expressas endogenamente. Noutra concretização, as proteínas de elastase da invenção não exibem glicosilação O-ligada ou glicosilação N-ligada.

5.1.1. SEQUÊNCIA DE ELASTASE MADURA

As sequências de elastase maduras da presente invenção, são preferencialmente sequências de elastase de mamíferos, mais preferencialmente sequências de elastase humanas. Em outras formas de realização, as sequências de elastase maduras de mamíferos são de outros mamíferos, tais como ratinho, ratazana, porco, vaca ou cavalo.

Nos métodos e composições da invenção, a sequência de elastase madura utilizada é de preferência a elastase pancreática tipo I, que cliva preferencialmente sequências de proteínas hidrofóbicas, de preferência, no lado carboxi de pequenos resíduos hidrofóbicos, tais como a alanina. Exemplos de elastases pancreáticas tipo I incluem a enzima da elastase humana I (número de acesso NCBI NP 001962), que é expressa na pele e a enzima da elastase pancreática porcina I (número de acesso NCBI CAA27670) que é expressa no pâncreas. As SEQ ID N°: e SEQ ID N°: 84 são exemplos de sequências de elastase madura humana tipo I.

Alternativamente, uma elastase tipo II que pode clivar sequências de proteínas hidrofóbicas, de preferência, no lado carboxi de médios e grandes resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, pode ser utilizada. Exemplos de elastases tipo II incluem a enzima da elastase humana IIA (número de acesso NCBI NP254275) e a enzima da elastase porcina II 73 (número de acesso NCBI A26823) que são ambas expressas no pâncreas.

As variantes de uma proteína de elastase madura da invenção estão também englobadas. As variantes incluem proteínas que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas a partir da sequência de aminoácidos da proteína de elastase madura da invenção e exibem atividade biológica de elastase. Uma parte biologicamente ativa de uma proteína de elastase madura da invenção pode ser uma proteína que tem, por exemplo, pelo menos 150, 160, 175, 180, 185, 190, 200, 210, 220, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238 ou 239 aminoácidos de comprimento. Além disso, outras partes biologicamente ativas, nas quais outras regiões da proteína são eliminadas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas para uma ou mais das atividades funcionais da forma nativa de uma proteína de elastase madura da invenção.

Além disso, as proteínas de elastase maduras compreendendo qualquer combinação dos quatro polimorfismos de elastase humana tipo I são representadas pela SEQ ID N°: 84. Combinações possíveis são apresentadas na Tabela 3 acima.

5.1.2. SEQUÊNCIAS DE ATIVAÇÃO DE PROELASTASE A sequência de ativação de elastase é uma sequência cuja remoção de uma proteína de proelastase resulta numa proteína de elastase madura biologicamente ativa.

As sequências de ativação geralmente contêm sítios de reconhecimento de protease adjacentes ao local onde as pro-proteínas são clivadas para produzir proteínas maduras, 74 biologicamente ativas. Uma sequência de ativação pode ser manipulada para adicionar um sitio de reconhecimento da protease ou da elastase, ou podem ser manipuladas para substituir um sitio de reconhecimento de proteases existente com um outro local de reconhecimento de protease. Peptideos de ativação ou sequências úteis para a prática desta invenção incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID N°: 23, 72 e 73. Ainda outras sequências de ativação úteis para a prática da presente invenção podem ser obtidas a partir dos residuos N-terminal 1-10 da SEQ ID N°: 64-68. Em aspectos preferidos, a sequência de ativação da proelastase é manipulada para conter uma sequência de reconhecimento de elastase do tipo I ou tipo II. Mais preferencialmente, a sequência de reconhecimento da elastase é reconhecida pela elastase madura à qual está operacionalmente ligada. Assim, em formas de realização dirigidas a uma elastase tipo II, a sequência de reconhecimento é mais preferencialmente uma sequência de reconhecimento de elastase tipo II. Por outro lado, nas formas de realização dirigido a uma elastase tipo I, a sequência de reconhecimento é mais preferencialmente sequência de reconhecimento de elastase tipo I. Numa concretização preferida, a sequência de reconhecimento é uma sequência de reconhecimento de elastase humana tipo I. As sequências de reconhecimento tipo I exemplares incluem a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°s: 14-16 e 18-21. Outros sitios de reconhecimento contemplados por esta invenção incluem qualquer sitio de reconhecimento descrito pelos sitios de reconhecimento de consenso da SEQ ID N°: II, 12, ou 13.

5.1.3. SEQUÊNCIAS DE SINAL

As proteínas de proelastase da invenção podem ainda conter uma sequência de sinal que aumenta a secreção da proteína 75 de proelastase para o meio de cultura da célula hospedeira na qual é expressa. A sequência de sinal nativa da proteina de elastase pode ser utilizada, particularmente para a expressão numa célula hospedeira de mamifero. Em outras concretizações, a sequência de sinal nativa de uma proteina de elastase da invenção pode ser removida e substituída por uma sequência de sinal a partir de uma outra proteina, tal como a sequência de sinal da elastase porcina tipo I, a sequência de sinal da elastase humana tipo I, ou sequência de sinal de factores de levedura-α. Em certas concretizações especificas, o péptido de sinal de factor de levedura-a pode ainda compreender (1) um pro-peptídeo de factor de levedura-α ou (2) um pro-peptídeo factor de levedura-α e sequência espaçadora, cada um, respectivamente, exemplificado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID N°s: 50 e 96, ou SEQ ID N°s: 51 e 97. Alternativamente, a sequência de secreção gp67 da proteína de envelope de baculovírus pode ser utilizada como uma sequência de sinal heteróloga (Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons, 1992)).Outros exemplos de sequências de sinal heterólogas eucarióticas incluem as sequências secretoras de melitina e fosfatase alcalina de placenta humana (Stratagene, La Jolla, Califórnia). Em ainda outro exemplo, as sequências de sinal heterólogas procarióticas úteis incluem o sinal secretor phoA (Sambrook et al, supra) e o sinal de uma proteína secretória A (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey).

5.2 ELASTASE DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Um aspecto da invenção diz respeito a moléculas de ácidos nucleicos recombinantes que codificam uma proteína de 76 elastase recombinante da invenção. Tal como aqui utilizado, o termo "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por exemplo, cADN ou ADN genómico) e moléculas de ARN (por exemplo, mARN) e análogos do ADN ou ARN gerados utilizando análogos de nucleótideos. A molécula de ácido nucléico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas de preferência é ADN de cadeia dupla. A presente invenção é dirigida a ácidos nucleicos que codificam as proteinas de elastase da invenção. Assim, em certas formas de realização, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótideos que codifica uma proteina de proelastase (incluindo, mas não se limitando a uma proteina de qualquer uma das SEQ ID N°s: 6-9, 64-69, 88-91 ou 98-103) que compreende (i) uma sequência de ativação compreendendo uma sequência de reconhecimento da elastase operacionalmente ligada a (ii) uma sequência de aminoácidos de uma proteina possuindo atividade de elastase tipo I. Em outras formas de realização, a presente invenção também proporciona uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótideos que codifica uma proteina que compreende (i) uma sequência de sinal operável em Pichia pastoris, operacionalmente ligada a (ii) uma sequência de ativação (incluindo, mas não limitado a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°s: 23, 72 ou 73) que compreende uma sequência de reconhecimento de protease que por sua vez está operacionalmente ligada à (iii) sequência de aminoácidos de uma elastase madura humana tipo I.

Um ácido nucleico da invenção pode ser purificado. Uma molécula de de ácido nucleico "purificado", tal como uma molécula de cADN, pode ser substancialmente livre de outro 77 material celular, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de percursores quimicos ou outras substâncias quimicas quando sintetizadas quimicamente.

Nos casos em que a molécula de ácido nucleico é uma molécula de cADN ou ARN, por exemplo, mARN, tais moléculas podem incluir uma "cauda" poli A ou, alternativamente, pode faltar a tal cauda 3'.

Uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser amplificada utilizando cADN, mARN ou ADN genómico como modelo e os iniciadores oligonucleotidicos apropriados de acordo com as técnicas de amplificação de PCR padrão. 0 ácido nucleico assim amplificado pode ser clonado num vector adequado e caracterizado por análise da sequência de ADN. Além disso, os oligonucleótideos que correspondem toda ou a uma porção de uma molécula de ácido nucleico da invenção podem ser preparados por técnicas sintéticas padrão, por exemplo, utilizando um sintetizador de ADN automatizado.

5.3 VECTORES DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE E CÉLULAS HOSPEDEIRAS

Proporciona-se vectores que compreendem qualquer um dos ácidos nucleicos da invenção, ou as células hospedeiras manipuladas para expressar os ácidos nucleicos da invenção. Em concretizações especificas, os vectores compreendem uma sequência de nucleótideos que regula a expressão da proteina codificada pelo ácido nucleico da invenção. Por exemplo, a sequência de nucleótideos que codifica a 78 proteína da invenção pode ser ligada operacionalmente a um promotor indutível por metanol.

As células hospedeiras que compreendem os ácidos nucleicos e os vectores da invenção também são fornecidos. Em certas formas de realização, o vector ou ácido nucleico está integrado no genoma da célula hospedeira; em outras formas de realização, o vector ou ácido nucleico é extracromossómico. Uma célula hospedeira preferida é uma célula de Pichia pastoris.

Tal como aqui utilizado, o termo "vector" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vector é um "plasmídeo", que se refere a um laço de ADN de cadeia dupla circular no qual segmentos de ADN adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vector é um vector virai, em que segmentos de ADN adicionais podem ser ligados no genoma virai. Determinados vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vectores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vectores de mamíferos epissómicos). Outros vectores (por exemplo, vectores de mamíferos não epissómicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira, e são assim replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vectores, vectores de expressão, são capazes de dirigir a expressão de sequências de codificação às quais eles estão ligados operativamente. Em geral, os vectores de expressão de utilidade em técnicas de ADN recombinante estão muitas vezes na forma de plasmídeos (vectores). 79

Os vectores de expressão recombinantes da invenção compreendem uma sequência de nucleótideos que codifica para a elastase madura, uma proelastase ou uma preproelastase da invenção numa forma adequada para a expressão numa célula hospedeira. Isto significa que os vectores de expressão recombinantes incluem uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem utilizadas para a expressão, que está operativamente ligado à sequência de ácido nucleico a ser expressa. Com o termo um vector de expressão recombinante, "operativamente ligado" pretende-se significar que a sequência de nucleótideos de interesse está ligada à sequência reguladora de um modo que permite a expressão da sequência de nucleótideos (por exemplo, transcrição/sistema de tradução in vitro ou numa célula hospedeira quando o vector é introduzido na célula hospedeira). 0 termo "sequência reguladora" destina-se a incluir promotores, estimuladores e outros elementos de controlo da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Tais sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). As sequências reguladoras incluem as que constituem diretamente a expressão de uma sequência nucleotidica em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que expressam diretamente a sequência nucleotidica apenas em determinadas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras especificas de tecido). Será apreciado pelos peritos na técnica que a concepção do vector de expressão pode depender de factores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão da proteína de elastase desej ada, etc. Os vectores de expressão da presente invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras para assim se produzir 80 as proteínas de elastase codificadas por ácidos nucleicos tal como aqui descrito.

Os vectores de expressão recombinantes da invenção podem ser projetados para a expressão de uma proteína de elastase da invenção em células procarióticas (por exemplo, E. coli) ou eucarióticas (por exemplo, células de insecto (usando vectores de expressão de baculovírus) células de levedura ou células de mamífero. As células hospedeiras adequadas serão discutidas em Goeddel, supra. Alternativamente, o vector de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usando sequências reguladoras do promotor T7 e T7 polimerase. A expressão de proteínas em procarióticas é geralmente realizada em E. coli com vectores contendo promotores constitutivos ou induzíveis dirigindo a expressão quer de proteínas de fusão quer de não-fusão. Vectores de fusão adicionam um número de aminoácidos a uma proteína codificada, geralmente ao terminal amina da proteína recombinante. Tais vectores de fusão servem tipicamente três finalidades: 1) aumentar a expressão da proteína de elastase recombinante; 2) aumentar a solubilidade da proteína de elastase recombinante; e 3) ajudar na purificação da proteína de elastase recombinante, atuando como um ligando de purificação de afinidade. Muitas vezes, em vectores de expressão de fusão, um domínio de clivagem proteolítico é introduzido na junção do fragmento de fusão e da proteína recombinante, para permitir a separação da proteína recombinante a partir da porção de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão. Assim, a porção de domínio de fusão e de clivagem proteolítica em conjunto podem atuar como uma sequência de ativação, 81 incluindo um sitio de reconhecimento da protease, para a expressão recombinante de uma proteina de elastase. As enzimas capazes de ativar tais proteinas de fusão, e as suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem Factor Xa, trombina e enteroquinase. Vectores de expressão de fusão tipicos incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith e Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fundem glutationa S-transferase (GST), proteina de ligação à maltose E, ou proteina A, respectivamente, com a proteina recombinante alvo.

Exemplos de vectores de expressão induzida não-fusão de E. coli adequados incluem pTrc (Amann et al., 1988, Gene 69:301-315) e pET-lld (Studier et al, 1990, Gene Expression Technology:. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia, 185:60-89). A expressão do gene alvo a partir do vector pTrc baseia-se na transcrição de ARN polimerase a partir de um promotor trp-lac híbrido de fusão. A expressão do gene alvo a partir do vector pET-lld baseia-se na transcrição do promotor de fusão T7 lac-GNIO mediada por uma polimerase virai de ARN co-expressa (T7 GN 1). Esta polimerase virai é fornecida pelas estirpes hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) de um profago residente λ GN1 abrigando um gene T7 gnl sob o controlo transcricional do promotor lacUV 5.

Uma estratégia para maximizar a expressão da proteína recombinante da elastase em E. coli é expressar a proteína numa bactéria hospedeira com uma capacidade diminuída para clivar proteoliticamente a proteína recombinante (Gottesman, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia, 82 185:119-129). Uma outra estratégia é alterar a sequência de ácido nucleico do ácido nucleico a ser inserido num vector de expressão de modo a que os codões individuais para cada um dos aminoácidos sejam preferencialmente utilizados em E. coli (Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 2 0:2111-2118). Tal alteração das sequências de ácidos nucleicos da invenção pode ser realizada por técnicas convencionais de sintese de ADN.

Noutra concretização, o vector de expressão é um vector de expressão de levedura. Exemplos de vectores para expressão na levedura S. cerevisiae ou P. pastors incluem pYepSecl (Baldari et al. , 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz de 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), e pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA). Para expressão em levedura, é usado, de preferência, um promotor indutivel por metanol. A alteração da sequência de ácido nucleico do ácido nucleico a ser inserido num vector de expressão de modo a que os codões individuais para cada um dos aminoácidos sejam preferencialmente utilizados em P. pastoris é também aqui contemplada. Mais especificamente, os codões da SEQ ID N°: 33 ou SEQ ID N°: 81 podem ser substituídos por codões que são utilizados preferencialmente em P. pastoris.

Alternativamente, o vector de expressão é um vector de expressão de baculovirus. Vectores de baculovirus disponíveis para expressão de proteínas em células de insectos em cultura (por exemplo, células Sf 9) incluem a série pAc (Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e a série pVL (Lucklow e Summers, 1989, Virology 170:31-39). Uma outra estratégia é alterar a sequência de 83 ácido nucleico do ácido nucleico a ser inserido num vector de expressão de modo a que os codões individuais para cada um dos aminoácidos sejam preferencialmente aqueles utilizados em células de insectos.

Ainda numa outra forma de realização, uma proteína de elastase é expressa em células de mamífero usando um vector de expressão de mamífero. Exemplos de vectores de expressão de mamífero incluem pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329 (6142):840-2) e pMT2PC (Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187-195). Quando usado em células de mamífero, as funções de controlo do vector de expressão são muitas vezes fornecidas por elementos requladores virais. Por exemplo, os promotores vulqarmente utilizados são derivados de polioma, Adenovírus 2, citomegalovírus e Vírus Símio 40. Para outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas, ver capítulos 16 e 17 de Sambrook et al., supra.

Noutra concretização, o vector de expressão recombinante de mamífero é capaz de dirigir a expressão do ácido nucleico preferencialmente num tipo particular de célula (por exemplo, elementos reguladores específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de promotores específicos de tecido adequados incluem o promotor da albumina (específico do fígado; Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de linfóides (Calame e Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-275), em particular promotores de receptores de células T (Winoto e Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733) e imunoglobulinas (Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen e Baltimore, 1983, Cell 84 33:741-748), promotores específicos de neurónios (por exemplo, o promotor do neurofilamento; Byrne e Ruddle, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:5473-5477), promotores específicos do pâncreas (Edlund et al., 1985, Science 230:912-916), promotores específicos mamários e das glândulas (por exemplo, promotor do soro de leite; Patente US 4873316 e Pedido Europeu EP264166). Promotores de desenvolvimento regulados também são abrangidos, por exemplo, o promotor de rato Hox (Kessel e Gruss, 1990, Ciência 249:374-379) e o promotor da beta-fetoproteína (Campes e Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546).

Em certos aspectos da invenção, a expressão de uma proteína da invenção pode ser aumentada através do aumento da dosagem do gene correspondente, por exemplo, pela utilização de uma cópia elevada do vector de expressão ou a amplificação do gene. A amplificação do gene pode ser conseguida em em células CHO deficientes em dihidrofolato-redutase ("dhfr") por co-transfecção do gene de interesse com o gene dhfr e exposição ao meio seletivo com concentrações escalonadas crescentes de metotrexato. Veja-se, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology Unit 16.14, (John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1996) . Um método alternativo para aumentar o número de cópias do gene é multimerizar uma cassete de expressão (por exemplo, o promotor com a sequência de codificação), que codifica para a proteína de elastase de interesse num vector, antes da introdução do vector numa célula hospedeira. Métodos e vectores para conseguir a multimerização da cassete de expressão em leveduras e sistemas de células hospedeiras de mamífero são conhecidos (ver, por exemplo, Monaco, Methods in Biotechnology 8: Animal Cell Biotechnology, em pp. 39-348 (Humana Press, 85 1999); Vassileva et al. 2001, Protein Expression and Purification 21:71-80; Mansur et al., 2005, Biotechology Letter 27 (5):339-45. Além disso, kits para a expressão do gene multi-cópia estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, um kit de expressão multi-cópia de Pichia pode ser obtido a partir de Invitrogen (Carlsbad, Califórnia). A multimerização de uma cassete de expressão é exemplificada no Exemplo 6, infra.

Deste modo, outros aspectos da invenção referem-se a células hospedeiras em que um vector de expressão recombinante, da invenção foi introduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são aqui utilizados indiferentemente. Entende-se que tais termos se referem não só à célula em particular, mas à progénie ou progénie potencial de tal célula. Porque podem ocorrer certas modificações em gerações sucessivas, quer devido a mutação ou a influências ambientais, tal progénie não pode, de facto, ser idêntica à célula parental, mas estar ainda incluída no âmbito do termo como aqui utilizado.

Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica (por exemplo, E. coli) ou eucariótica (por exemplo, células de insecto, leveduras ou células de mamíferos). O vector de ADN pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através de técnicas de transformação ou transfecção convencionais. Tal como aqui utilizado, os termos "transformação" e "transfecção" são destinados a referir uma variedade de técnicas reconhecidas na técnica para a introdução de ácido nucleico estranho 86 numa célula hospedeira, incluindo a co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção ou electroporação. Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook et ai. (supra), e outros manuais de laboratório.

Para a transfecção estável de células de mamífero, sabe-se que, dependendo do vector de expressão e técnica de transfecção usada, apenas uma pequena fracção das células pode integrar o ADN estranho no seu genoma. De modo a identificar e selecionar estes integrantes, uma sequência que codifica para um marcador selecionável (por exemplo, quanto à resistência a antibióticos) é geralmente introduzida nas células hospedeiras, juntamente com o quadro de leitura aberta de interesse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência a fármacos, tais como G418, higromicina, zeocina e metotrexato. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por seleção do fármaco (por exemplo, células que incorporaram a sequência de codificação do marcador selecionável irão sobreviver, enquanto que as outras células morrerão).

Numa outra forma de realização, as características de expressão de uma sequência de codificação de elastase endógena dentro de uma célula, linha celular ou microorganismo podem ser modificadas por inserção de um elemento regulador de ADN heterólogo à sequência de codificação da elastase no genoma de uma célula, linha celular estável ou microrganismo clonado tal que o elemento 87 regulador inserido está operacionalmente ligado ao gene endógeno

Uma sequência heteróloga, que contém um elemento de regulação, pode ser inserida numa linha de células estáveis ou microrganismo clonado, de tal forma que esteja operacionalmente ligada e ative a expressão de um gene endógeno da elastase, utilizando técnicas, tais como recombinação homóloga alvo, as quais são bem conhecidas dos peritos na especialidade, e descritas, por exemplo, em Chappel, Patente US 5272071; WO 91/06667, publicada em 16 de Maio de 1991. A sequência heteróloga pode ainda incluir péptidos de sinal, sequências de clivagem e/ou sequências de ativação da presente invenção.

5.4 MÉTODOS DE FABRICAÇÃO DE PROTEÍNAS DE ELASTASE MADURAS

Uma célula hospedeira da invenção, tal como uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica em cultura, pode ser utilizada para produzir uma proteina de elastase da invenção. Por conseguinte, a invenção proporciona ainda métodos para a produção de uma proteina de elastase da invenção usando as células hospedeiras da invenção. Numa concretização, o método compreende a cultura da célula hospedeira da invenção (na qual um vector de expressão recombinante que codifica para uma proteina de elastase da invenção tenha sido introduzido) num meio adequado de tal modo que a proteina de elastase seja produzida. Numa outra forma de realização, o método compreende ainda o isolamento da proteina de elastase a partir do meio ou da célula hospedeira. A presente invenção proporciona ainda métodos para a produção de proteínas de elastase imaturas da invenção compreendendo a cultura de uma célula hospedeira manipulada 88 para expressar um ácido nucleico da invenção, sob condições em que seja produzida a proteína de proelastase. Em certas formas de realização, a proteína de preproelastase também é produzida. A presente invenção proporciona ainda métodos para a produção de proteínas de elastase maduras da invenção compreendendo a cultura de uma célula hospedeira manipulada para expressar um ácido nucleico da invenção, sob condições em que a proteína de proelastase seja produzida e submetendo a proteína de proelastase a condições de ativação tais que a proteína de elastase madura seja produzida.

Condições de cultura preferidas para a produção das proteínas imaturas e maduras da invenção, em particular para a célula hospedeira de Pichia pastoris, incluem um período de crescimento, a um pH baixo. Em concretizações específicas, o pH baixo é um pH de 2-6, um pH de 2-5, um pH de 3-6, um pH de 3-5, um pH de 4-6, um pH de 3-4 ou qualquer intervalo cujos limites inferiores e superiores sejam selecionados de entre qualquer um dos valores anteriores. No final do período de cultura, o pH da cultura pode ser aumentado, de preferência a um pH de 7-11, mais preferencialmente a um pH de 8.

Sempre que a expressão de uma proteína de proelastase da invenção está sob o controlo de um promotor induzível por metanol, as condições para a produção de uma proteína de elastase imatura ou madura da invenção podem também compreender um período de indução de metanol.

Os métodos de produção de elastase da invenção podem compreender ainda o passo de recuperação da proteína 89 expressa pela célula hospedeira. Em certos casos, a proteína recuperada é uma proelastase, contendo a sequência de ativação. Em outros casos, a proteína recuperada é uma elastase madura sem a sequência de ativação. Sob certas condições, ambas as proteínas de proelastase e elastase e madura são produzidas. Em outros casos, a preproelastase é produzido.

De preferência, em particular onde é desejado contornar a auto-ativação de uma proelastase auto-ativada, as condições de cultura para a expressão da proelastase compreendem um período de crescimento em citrato de sódio, succinato de sódio ou acetato de sódio. Em concretizações específicas, uma concentração de cerca de 5-50 mM, 7,5-100 mM, de 10-150 mM, 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ou qualquer gama cujo limites superiores e inferiores sejam selecionados de entre qualquer um dos valores anteriores é utilizado. Numa concretização preferida, a concentração de citrato de sódio, succinato de sódio ou acetato de sódio é de 90-110 mM, mais de preferência 100 mM.

Adicionalmente, particularmente quando é desejável contornar a degradação da proteína, as condições de cultura para a expressão de proelastase compreendem um período de crescimento e indução, na extremidade inferior do intervalo de temperatura adequado para a célula hospedeira em questão. Por exemplo, quando a célula hospedeira é uma célula hospedeira de Pichia pastoris, a gama preferida é de cerca de 22-28°C. Em concretizações específicas, a célula hospedeira de Pichia pastoris é cultivada a uma temperatura de cerca de 28°C. O crescimento e indução não necessitam de ser realizados à mesma temperatura; por exemplo, numa concretização em que a Pichia pastoris é utilizada como uma 90 célula hospedeira, o crescimento pode ser realizado a 28°, enquanto a indução pode ser realizada a 22°C. A ativação de uma proteína de proelastase auto-ativada da invenção pode ser iniciada pela adição de elastase extrínseca numa pequena quantidade (quantidade catalítica). Como alternativa ou concomitantemente, a ativação de uma proteína de proelastase auto-ativada da invenção pode ser iniciada por elevação do pH da solução contendo a proteína de proelastase auto-ativada. 0 pH é de de preferência 7-11; em formas de realização específicas, a solução está a um pH de 7-10, 7-9, 8-10, 8-9, ou qualquer intervalo cujos limites inferiores e superiores sejam selecionados a partir de qualquer um dos precedentes valores. Numa concretização preferida, o pH da solução é de 7-9, mais preferivelmente

Em concretizações específicas, a proelastase auto-ativada pode ser sujeita a base Tris, durante o passo de ativação. Em concretizações específicas, a base Tris é adicionada a uma concentração de 5-50 mM, 7,5-100 Mm, de 10-150 mM, 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ou qualquer cujo intervalo entre os limites inferiores e superiores seja selecionado de entre qualquer um dos valores anteriores. Numa concretização preferida, a base Tris é adicionada a uma concentração de 90-110 mM, mais de preferência 100 mM. O pH da base de Tris é 7-11, de preferência; em formas de realização específicas, a base de Tris tem um pH de 7-10, 7-9, 8-10, 8-9, ou qualquer intervalo cujos limites inferiores e superiores sejam selecionados a partir de qualquer um dos valores anteriores. Numa concretização preferida, a base Tris está a um pH de 7-9, mais preferivelmente 8. 91

Em certos aspectos da invenção, a temperatura durante a auto-ativação da elastase é a temperatura ambiente, por exemplo, uma temperatura variando de 22°C a 26°C. Em certas formas de realização, o passo de ativação da elastase é preferencialmente realizado com a proelastase a uma baixa concentração inicial, por exemplo, de 0,1-0,3 mg/ml, para a precisão óptima da reação de clivagem e a formação minima de variantes N-terminais.

Em certas formas de realização da invenção, não é necessária a adição de quantidades catalíticas de elastase para converter a proelastase auto-ativada em elastase madura, como a proelastase pode sofrer autoproteolisis. Em certas formas de realização, a taxa de autoproteolisis é independente da concentração. Sem pretender ser limitado pela teoria, acredita-se que a concentração de autoproteolisis independente de certas proteínas de proelastase auto-ativadas é mediada através de um processo intramolecular, onde a molécula de proelastase se cliva através de uma reação intramolecular. No entanto, em outras formas de realização, a ativação da proelastase auto-ativada é dependente da concentração. Sem pretender ser limitado pela teoria, acredita-se que a concentração dependente da autoproteolisis de certas proteínas de proelastase auto-ativadas é mediada através de uma reação intermolecular onde a proelastase é clivada por outra proelastase e/ou por uma elastase madura. Ainda em outras modalidades, algumas pro-proteinas de elastase auto-ativadas exibem uma combinação de concentração de ativação dependente e de concentração independente. Nos casos em que a auto-ativação é dependente da concentração, a pró-proteina pode ser mantida numa forma mais diluida para reduzir a ativação, se desejado. A ativação de pro- 92 proteínas de elastase compreendendo o domínio de clivagem do pro-péptido de elastase de SEQ ID N°: 55, que incluem, mas não estão limitados à pro-proteína da SEQ ID N°: 69 pode ser controlada através da manutenção de tais pro-proteínas numa forma diluída. É também reconhecido que certas variantes de sequências N-terminais da elastase madura indesejadas podem acumular-se no decurso da produção de proteínas de elastase maduras da presente invenção. Mais especificamente, as proteínas de proelastase contendo o domínio clivagem do pró-péptido de elastase da SEQ ID N°: 42 que incluem a pro-proteína da SEQ ID N°: 6 pode produzir variantes da sequência N-terminal, onde ocorreu a clivagem da ligação peptídica que é o C-terminal de qualquer dos resíduos nas posições P3 ou P2. No entanto, a ocorrência de tais variantes N-terminais indesejáveis pode ser reduzida através da colocação de certos aminoácidos em certas localizações na sequência de ativação. Por exemplo, quando uma prolina está presente na posição P2, a produção de variantes N-terminais com um ou dois aminoácidos N-terminais adicionais é reduzida ou eliminada. Além disso, a eliminação da necessidade de tripsina para a ativação reduz ou elimina a produção da variante que carece de nove resíduos N-terminais. Além disso, a ocorrência de variantes N-terminais indesejáveis pode ser reduzida ou eliminada através da realização da reação de ativação sob certas condições.

Mais especificamente, em certas formas de realização as condições de ativação incluem uma "conversão alargada" durante o passo em que as variantes N-terminais produzidas durante a parte inicial da reação de conversão são subsequentemente seletivamente degradadas. As quantidades 93 conversão relativas de espécies de proteínas, durante a alargada" podem ser monitorizadas em tempo real por HIC-HPLC. A degradação seletiva de variantes N-terminais indesejáveis aumenta a proporção do comprimento total de PRT-201 madura na reação de conversão e reduz a proporção de variantes N-terminais. Para proteínas de proelastase contendo o dominio de clivagem de pró-péptido de elastase da SEQ ID N°: 55, o passo de conversão alargada é realizado durante 4 a 8 horas, de preferência cerca de 6 horas. Para outras proteínas de proelastase, o passo de conversão alargada pode ser aumentado ou diminuído, dependendo da proporção de variantes N-terminais em relação à elastase madura (comprimento total) imediatamente depois de toda a proelastase ter sido convertida. Quando a conversão ocorre em meios complexos, tais como caldo de fermentação, o período de conversão alargada pode ser aumentado devido à competição no sítio ativo da elastase madura por outras proteínas e péptidos em solução. Alternativamente, uma mistura de elastase madura e variantes N-terminalde elastase pode ser recuperada a partir dos meios complexos, antes da etapa de conversão alargada, reduzindo assim a o sítio ativo de competição e o tempo necessário para remover as espécies de variantes N-terminais.

Como mencionado acima, durante uma reação de conversão de pró-PRT-201-003-55M3-VU, existe uma reação secundária que conduz à produção de variantes N-terminais. No caso especifico de pró-PRT-201-003-55M3-VU, a estas variantes N-terminais faltam as primeiras duas valinas e têm pouca ou nenhuma atividade de elastase. Para outras pró-proteínas mutantes existem variantes N-terminal adicionais produzidas, algumas com adições e outras com diferentes exclusões. Um passo de remoção N-terminal foi desenvolvido 94 o que reduz as variantes N-terminais de um intervalo de 0-2%. O desenvolvimento deste passo de remoção envolve uma variedade de ensaios e observações. Como mencionado anteriormente, durante a optimização das condições de conversão, em experiências com pró-PRT-201-42, observou-se que as reações de conversão mais longas levam frequentemente a uma percentagem muito baixa de variantes N-terminais. Foi subsequentemente determinado que as reações de conversão mais longas permitiram que a PRT-201 madura degrada-se seletivamente as variantes N-terminais. A descoberta da capacidade da PRT-201 para degradar seletivamente as variantes N-terminais sob certas condições teve um enorme beneficio ao ajudar a produzir uma forma mais purificada do produto PRT-201 com menos variantes N-terminais. Este passo de remoção da variante N-terminal foi aplicado num processo de produção em larga escala através do estabelecimento de condições que permitem que a pró-PRT-201 se converta em PRT-201 madura e, em seguida, permitir que a PRT-201 degrade as variantes N-terminais.

Um exemplo representativo de um tal passo é mostrado na Figura 10, uma vez que foi monitorizado em tempo real por HIC-HPLC. Em cerca de 50 minutos, 100% de pró-PRT-201-SSM3 tinha sido completamente convertido em aproximadamente 86% de PRT-201 madura e 14% de variantes N-terminais. A reação de conversão foi alargado o que permitiu à PRT-201 madura degradar seletivamente as variantes N-terminais, resultando numa diminuição de variantes de 14% para 2%. Com incubações mais longas, as variantes N-terminais podem ser seletivamente degradadas para um nivel indetectável. Quando o nivel das variantes N-terminais é suficientemente baixo, a atividade da PRT-201 é suprimido com citrato de sódio e ajustamento do pH da reação para 5,0. 95

Uma vez que a elastase purificada madura foi obtida, a enzima ativa pode ser trazido para uma solução em que a proteína de elastase é relativamente inativa e colocada num tampão para a cromatografia de coluna adicional, por exemplo, cromatografia de permuta catiónica, passos de purificação. Em geral, a proteína de elastase pode ser colocada em citrato de sódio a uma concentração de cerca de 5 a 25 mM e um pH de cerca de 2 a 5. Numa concretização específica, a elastase é colocada em 20 mM de citrato de sódio, pH 5. As fracções eluídas são analisadas em seguida, opcionalmente, por um, mais do que um, ou todos os seguintes métodos: (1) espectrofotometria a A280 para determinar a concentração, (2) SDS-PAGE para avaliar a pureza, (3) ensaio da atividade, por exemplo, ensaio SLAP, para avaliar a atividade específica da elastase, e (4) HIC-HPLC para detectar a elastase madura e variantes N-terminais, e as fracções com características apropriadas (por exemplo, atividade específica aceitável, aceitavelmente baixos níveis (de preferência, ausência) de gi icoformas detectáveis, e aceitavelmente níveis baixos (de preferência, ausência) detectáveis de variantes N-terminais) são reunidas.

Uma vez que a elastase madura purificada foi obtida, a enzima ativa pode ser trazida para uma solução adequada para a liofilização. Em geral, a proteína de elastase pode ser colocada num tampão de 1 x tampão fosfato salino ("PBS") (137 mM de cloreto de sódio, 10 mM de fosfato de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, pH 7,4) antes da liofilização. Em certas formas de realização, a proteína de elastase pode ser colocada num tampão de 0,1 X PBS (13,7 96 mM de cloreto de sódio, 1,0 mM de fosfato de sódio, 0,27 mM de fosfato de potássio, pH 7,4) antes da liofilização. A expressão de uma sequência de proelastase pode, em alguns casos, produzir uma mistura de proelastase e proteínas de elastase maduras. Assim, a presente invenção proporciona uma composição que compreende tanto uma proteína de proelastase como uma proteína de elastase madura.

5.5 COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

As proteínas de elastase maduras da invenção podem ser incorporadas em composições farmacêuticas adequadas para administração. Tais composições tipicamente compreendem a proteína da elastase e ingredientes farmaceuticamente inertes, por exemplo, um transportador farmaceuticamente aceitável. Tal como aqui utilizada a linguagem "transportador farmaceuticamente aceitável" pretende incluir todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, e similares, compatíveis com a administração farmacêutica. Também contemplados como ingredientes farmaceuticamente inertes são excipientes convencionais, veículos, enchimentos, ligantes, desintegrantes, solventes, agentes solubilizantes e agentes corantes. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com uma proteína de elastase madura, a sua utilização nas composições é contemplada. Os compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.

Por conseguinte, certos aspectos da presente invenção referem-se a composições farmacêuticas. Em concretizações 97 específicas, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma elastase madura humana tipo I e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável. A elastase madura humana tipo I que pode ser utilizada na composição inclui, mas não se limita às proteínas da SEQ ID N°: 1, 4, 5, 84, 87. A elastase madura humana tipo I pode conter qualquer uma das combinações de polimorfismos apresentados na Tabela 3 acima.

Em outras formas de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase madura humana tipo I (ii) um veiculo farmaceuticamente aceitável, cuja composição farmacêutica está isenta de tripsina, ou de fragmentos de tripsina. Em outras formas de realização, a composição farmacêutica é substancialmente livre de tripsina ou de fragmentos de tripsina. Tal como aqui utilizada, a frase "sem tripsina" refere-se a uma composição na qual a tripsina não é utilizada em qualquer parte do processo de produção. Tal como aqui utilizada, a frase "substancialmente livre de tripsina" refere-se a uma composição em que a tripsina está presente numa percentagem final (isto é, peso de tripsina/peso total da composição) de não mais do que cerca de 0,0025% ou, mais preferencialmente, inferior a cerca de 0,001% numa base de peso/peso. Tal como aqui utilizada, a frase "isento de" tripsina refere-se a uma composição em que a variante é não detectável, por exemplo, por meio de um ensaio enzimático ou ELISA.

Em certos aspectos, uma composição da invenção tem menos atividade de tripsina do que o equivalente a 3 ng/ml de 98 tripsina como medido por um ensaio de BENZ, de preferência menos atividade de tripsina do que o equivalente a 2,5 ng/ml de tripsina como medido por um ensaio de BENZ, e ainda mais preferivelmente menos atividade de tripsina do que o equivalente a 2 ng/ml de tripsina como medido por um ensaio de BENZ. Numa concretização especifica, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteina de elastase em que a atividade de tripsina é equivalente a menos do que 1,6 ng/ml de tripsina como medido por um ensaio de BENZ. Exemplos de composições de elastase com menos actividade de tripsina que o equivalente a 1,6 ng/ml de tripsina como medido por um ensaio de BENZ são fornecidos no Exemplo 8 abaixo. Em certas formas de realização, a atividade de tripsina ng/ml pode ser testada ensaiada numa composição de elastase humana tipo I liquida ou preparação que contém 1 mg/ml de proteina de elastase humana tipo I. Assim, as atividades de tripsina podem também ser descritas em termos de miligramas de proteina de elastase, por exemplo, menos de 3 ng de atividade de tripsina/mg de proteina de a elastase, menos de 1,56 ng de atividade de tripsina/mg de proteina de elastase, etc. A presente invenção proporciona ainda composições farmacêuticas que são livres ou substancialmente livres de variantes N-terminais indesejáveis de elastase madura. Variantes N-terminais indesejáveis incluem, mas não estão limitadas a, variantes produzidas por clivagem da ligação peptidica que é o C-terminal de qualquer dos resíduos nas posições P5, P4, P3, P2, P'l, P'2, P'3, P'4, P'6 e/ou P'9. Certas variantes N-terminais indesejáveis são produzidas pela ativação da tripsina; outros são produzidos por auto- 99 ativação das sequências de proelastase que não continham sequências de ativação optimizadas.

Em certas formas de realização, a composição farmacêutica é livre ou substancialmente livre de uma, mais do que uma ou todas as variantes N-terminais de elastase maduras, que incluem mas não estão limitadas a SEQ ID N°s: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, 108. Em certas formas de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase madura humana tipo I (ii) um veiculo farmaceuticamente aceitável, cuja composição farmacêutica está isenta ou substancialmente isenta de qualquer proteína com a SEQ ID N°s: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107 ou 108. Em outras formas de realização, a composição farmacêutica é substancialmente livres de variantes de N-terminal de elastase maduras, que incluem mas não estão limitados a SEQ ID N°s: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107 ou 108. Tal como aqui utilizada, a frase "livre" de uma variante particular, refere-se a uma composição em que a variante é não detectável, por exemplo, por meio de ensaio de HPLC de permuta catiónica, um ensaio de HPLC de interação hidrofóbica, ou espectrometria de massa combinada com a cromatoqraf ia líquida. Tal como aqui utilizada, a frase "substancialmente livre" refere-se a uma composição em que a variante N-terminal está presente numa percentaqem final (isto é, peso da variante N-terminal/peso total da composição) de, pelo menos, menos do que cerca de 0,5%. Em certas concretizações preferidas, a composição que é substancialmente isenta da variante N-terminal é uma composição em que a concentração da variante N-terminal é inferior a cerca de 0,1% ou menos do que cerca de 0,01%, ou, mais preferivelmente, ainda menos do que cerca de 0,001% numa base peso/peso. Em certos aspectos, a presença 100 de variantes N-terminais é detectada por meio de ensaio de HPLC de permuta catiónica, ensaio de HPLC de interação hidrofóbica, ou espectrometria de massa combinada com a cromatografia liquida.

Em certas formas de realização especificas, uma composição farmacêutica, que é livre de variantes N-terminais da SEQ ID N°: 70, 71, 104 e 105 é produzida por ativação de uma proelastase que não contém uma arginina na posição PI e/ou uma alanina na posição P2.

Em outras formas de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase madura humana tipo I (ii) um veiculo farmaceuticamente aceitável, cuja composição farmacêutica está essencialmente isenta de proteínas bacterianas e/ou está substancialmente livre de proteínas de mamífero diferentes da referida elastase madura humana tipo I. Tal como aqui utilizada, a frase "substancialmente livre de proteínas de mamífero" ou "substancialmente livre de proteínas bacterianas" refere-se a uma composição em que tais proteínas estão presentes numa percentagem final (isto é, peso de proteínas de mamíferos (excepto a elastase e, facultativamente, uma proteína transportadora, tal como a albumina) ou proteínas bacterianas/peso total da composição) de, pelo menos, menos do que cerca de 0,5%. Em certas concretizações preferidas, a composição que é substancialmente isenta de tais proteínas é uma composição onde a concentração da proteína indesejável é inferior a cerca de 0,1% ou menos do que cerca de 0,01%, ou, mais preferivelmente, ainda menos do que cerca de 0,001% numa base peso/peso. 101

Em certos aspectos, uma composição farmacêutica que está "livre de proteinas de mamíferos" (excepto a elastase) contém a elastase, que é produzida a partir de uma linha celular recombinante que não é uma célula de mamifero e em que nenhuma proteína com uma sequência de mamífero ou uma sequência substancialmente de mamífero está presente em qualquer parte do processo de produção. Em certos aspectos, uma composição farmacêutica que está "livre de proteínas bacterianas" contém elastase, que é produzida a partir de uma linha celular recombinante que não é uma célula bacteriana e em que nenhuma proteína com uma sequência bacteriana ou uma sequência substancialmente bacteriana está presente em qualquer porção do processo de produção.

As elastases maduras humanas tipo I (incluindo variantes) da presente invenção são de preferência purificadas para utilização em composições farmacêuticas. Em concretizações específicas, as elastases são, pelo menos, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% puras. Em outras formas de realização específicas, as elastases são até 98%, 98,5%, 99%, 99,2%, 99,5% ou 99,8% puras.

Para a formulação de composições farmacêuticas, as elastesas maduras humanas tipo I humano da invenção têm de preferência uma atividade específica superior a 1, superior a 5, superior a 10, superior a 20, superior a 25, ou superior a 30 U/mg de proteína, tal como determinado através da medição da taxa de hidrólise do substrato peptídico pequeno de N-succinil-Ala-Ala-Ala-pNitroanilida (SLAP), que é catalisada pela adição de elastase. Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de 102 elastase que catalisa a hidrólise de 1 micromole de substrato por minuto a 30°C e a actividade especifica é definida como a atividade por mg de proteína de elastase (U/mg). De preferência, uma composição farmacêutica compreende uma elastase madura humana tipo I que tem uma atividade especifica dentro de um intervalo em que o limite inferior é de 1 , 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 ou 20 U/mg de proteína e em que o limite superior é, de forma independente, 5, O \—1 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50 U/mg de proteína. Em concretizações exemplificativas, a atividade específica é na gama de 1-40 U/mg de proteína, 1-5 U/mg de proteína, 2-10 U/mg de proteína, 4-15 U/mg de proteína, 5-30 U/mg de proteína, 10-20 U/mg de proteína, 20-40 U/mg de proteína, ou qualquer intervalo cujos limites superiores e inferiores sejam selecionados de entre qualquer um dos valores anteriores.

As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente estáveis. Em concretizações específicas, uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica preparada por liofilização, supra) mantém pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 60%, e mais preferencialmente pelo menos 70% da sua atividade específica depois de uma semana, mais preferencialmente depois de 1 mês, ainda mais preferencialmente, depois de 3 meses e, mais preferivelmente, após 6 meses de armazenamento a 4°C. Em concretizações específicas, a composição farmacêutica mantém pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da sua atividade específica depois de uma semana, mais preferencialmente depois de 1 mês, mais preferivelmente ainda, após 3 meses, e mais preferencialmente, após 6 meses de armazenamento a 4°C. 103

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Os métodos para administrar as elastases para tratar ou prevenir doenças das condutas biológicas são descritos na 2001/21574; WO 2004/073504; e WO 2006/036804. A via mais preferida de administração é a parentérica, por exemplo, a administração direta na parede do vaso, incluindo a administração local para a superfície externa adventícia de vasos expostos cirurgicamente e a administração local para a parede do vaso usando um cateter de entrega de fármacos. As soluções ou suspensões utilizadas para a administração parentérica pode incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, açúcares, tais como sacarose ou dextranos, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol, polissorbato 80 (também conhecido como Tween 80), ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como metil-parabeno, antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetracético; tampões, tais como fosfatos e agentes para o ajustamento da tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose única ou múltipla feitos de vidro ou plástico. A preparação parentérica pode ser fechada num cateter de entrega de fármacos. Em todos os casos, a composição deve ser estéril.

Em concretizações especificas, uma composição farmacêutica da invenção é uma formulação liquida que compreende um ou 104 mais dos seguintes excipientes: dextrose (por exemplo, 2-10% p/v), lactose (por exemplo, 2-10% p/v); manitol (por exemplo, 2-10% p/v), sacarose (por exemplo, 2-10% p/v); trealose (por exemplo, 2-10% p/v), ácido ascórbico (por exemplo, 2-10 mM) ; cloreto de cálcio (por exemplo, 4-20 mM) ; dextrano-70 (por exemplo, 2-10% p/v), poloxâmero 188 (por exemplo, 0,2-1% p/v), polissorbato-80 (por exemplo, 0,001-5% p/v, mais preferencialmente 0,1-5%), glicerina (por exemplo, 0,2-5% p/v), arginina (por exemplo, 2-10% p/ v), glicina (por exemplo, 2-10% p/v); dextrano-44 (por exemplo, 2-10% p/v), e dextrano-18 (por exemplo, 2-10% p/ v) . Em certas formas de realização, a concentração, isoladamente ou em conjunto, de dextrose, lactose, manitol, sacarose, trealose, dextrano-70, glicerina, arginina, glicina, dextrano ou dextrano-44-18 está dentro de um intervalo no qual o limite inferior é de 2,5, 4, 5, ou 7% p/v e em que o limite superior é, de forma independente, 4, 5, 6, 8, ou 10% p/v.

Uma formulação líquida pode ser feita pela adição de água a uma formulação seca contendo uma proteína madura de elastase, um ou mais reagentes de tampão e/ou um ou mais excipientes. A formulação seca pode ser feita por liofilização de uma solução compreendendo a proteína de elastase madura, um ou mais reagentes de tampão, e/ou um ou mais excipientes.

Uma formulação líquida pode ser feita, por exemplo, através da reconstituição de proteínas de elastase liofilizadas da invenção com água esterilizada ou com uma solução tampão. Exemplos de uma solução tampão, incluem soluções estéreis de soro fisiológico ou tampão de fosfato salino. Numa concretização específica, após a reconstituição de uma 105 formulação seca compreendendo proteína de elastase madura para a concentração de proteína desejada, a solução contém cerca de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, 10 mM de fosfato de sódio (uma concentração de solução salina tamponada com fosfato, que é considerada 1 x) e o pH da solução é de aproximadamente 7,4. Em certos aspectos, a formulação seca compreendendo a proteína de elastase madura também contém sódio, cloreto e iões fosfato em quantidades tais que somente é necessário água para a reconstituição.

Uma formulação líquida pode também ser feita, por exemplo, através da reconstituição de proteínas de elastase liofilizadas com uma solução tampão contendo um ou mais excipientes. Exemplos de excipientes incluem polissorbato 80 e dextrano. Numa concretização específica, após a reconstituição de uma formulação seca compreendendo de elastase proteína madura para a concentração de proteína desejada da solução resultante contém cerca de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, 10 mM de fosfato de sódio, 0,01% de polissorbato-80, e o pH da solução é de aproximadamente 7,4. Um ou mais excipientes podem ser misturados com a proteína de elastase madura antes da liofilização ou depois da liofilização, mas antes da reconstituição. Assim, em certos aspectos, a formulação seca compreendendo proteína de elastase madura também contém excipientes tais como polissorbato 80 ou dextrano.

Em certos aspectos, a presente invenção fornece uma formulação líquida que compreende: 0,001-50 mg/ml de proteína de elastase madura numa solução de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, 10 mM de fosfato de sódio e compreendendo 5-10%, mais 106 preferencialmente 6-9%, de um excipiente selecionado de dextrose, lactose, manitol, sacarose, trealose, dextrano-70, glicerina, arginina, glicina, dextrano-44 ou dextrano-18 .

Numa concretização especifica, a presente invenção proporciona uma formulação liquida que compreende: 0,001-50 mg/ml de proteina de elastase madura numa solução de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, 10 mM de fosfato de sódio, com um pH de 7,4.

Numa outra forma de realização especifica, a presente invenção proporciona uma formulação liquida que compreende: 0,001-50 mg/ml de proteina de elastase madura numa solução de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, 10 mM de fosfato de sódio, e compreendendo 0,01% de polissorbato-80, com um pH de 7,4.

Numa outra forma de realização especifica, a presente invenção proporciona uma formulação liquida que compreende: 0,001-50 mg/ml de proteina de elastase madura numa solução de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, 10 mM de fosfato de sódio, e compreendendo 0,01% de polissorbato-80 e 8% de dextrano-18, com um pH de 7,4.

Numa outra forma de realização especifica, a presente invenção proporciona uma formulação liquida que compreende: 0,001-50 mg/ml de proteina de elastase madura numa solução de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, 10 mM de fosfato de sódio e compreendendo 8% de dextrano-18, com um pH de 7,4. 107

As formulações líquidas da invenção contêm de preferência uma concentração final de proteínas de elastase maduras dentro de um intervalo em que o limite inferior é de 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15 ou 20 mg/ml, e em que o limite superior é, independentemente, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, ou 1500 mg/ml.

Em certos aspectos, a presente invenção fornece uma formulação líquida que compreende: 0,0001-500 mg/ml (mais preferencialmente 1-100 mg/ml, e ainda mais preferencialmente de 0,5-20 mg/ml) de proteína de elastase madura numa solução de 0,5><PBS-1,5xPBS (mais preferencialmente lx PBS), a solução compreendendo 5-10% (mais preferivelmente de 6-9%) de um excipiente selecionado de dextrose, lactose, manitol, sacarose, trealose, dextrano-70, glicerina, arginina, glicina, dextrano-44 ou dextrano-18, e possuindo um pH de 6,5-8,5. Numa concretização específica, a formulação líquida compreende 0,5 mg/ml de proteína de elastase madura e 8% de dextrano-18 em 1 x PBS, pH 7,4. Numa concretização específica, a formulação líquida compreende 5 mg/ml de proteína de elastase madura e 8% de dextrano-18 em 1 x PBS, pH 7,4. A formulação líquida da presente invenção tem preferencialmente uma osmolalidade dentro de um intervalo em que o limite inferior é de 100, 125, 150, 175, 200, 250 ou 275 mOsm/kg e em que o limite superior seja, independentemente, 500, 450, 400 , 350, 325, 300, 275 ou 250 mOsm/kg. Em concretizações específicas, a osmolaridade da formulação líquida da invenção tem de preferência uma osmolaridade de cerca de 125-500 mOsm/kg, mais preferivelmente de cerca de 275-325 mOsm/kg, por exemplo, 108 como medido pelo método de abaixamento do ponto de congelação. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas, tais como composições que podem ser feitas nas formulações líquidas da invenção, em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. Forma de dosagem unitária tal como aqui utilizado refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o sujeito a ser tratado, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de proteína de elastase madura, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido.

Tal como aqui definido, uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína de elastase madura (isto é, uma dosagem eficaz) varia entre cerca de 0,0033 mg-200 mg. Para vasos de menor diâmetro e paredes mais finas, tais como uma fístula artério-venosa rádio-cefálicas, as doses mais pequenas (tais como de 0,0033 mg, 2,0 mg) são preferíveis. Para os vasos com um diâmetro maior e paredes mais espessas, como as artérias femorais, doses maiores (como 2,05-100 mg) são preferíveis.

Em certas concretizações, as composições farmacêuticas podem ser incluídos num recipiente, pacote, dispensador, ou cateter. Em ainda outras concretizações, as composições farmacêuticas podem ser incluídos num recipiente, pacote, dispensador, ou cateter, juntamente com instruções para administração. As instruções para a administração podem ser incluídos na forma impressa, quer dentro ou em cima de 109 um recipiente, pacote, dispensador, ou cateter. Alternativamente, as instruções para a administração podem ser incluídas dentro ou em cima de um recipiente, pacote, dispensador, ou um cateter, na forma de uma referência a um outro documento impresso ou acessível na Internet que fornece as instruções. A invenção inclui métodos para a preparação de composições farmacêuticas. Uma vez que uma elastase madura é produzida de acordo com a invenção, pode ser liofilizada e armazenada até ser reconstituída numa formulação farmacêutica adequada para administração. Numa concretização exemplar, a presente invenção proporciona um método de isolamento de uma madura humana tipo I liofilizada que compreende: (a) cultura de uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira de Pichia pastoris, manipulada para expressar uma molécula de ácido nucleico que codifica para um quadro de leitura aberta de preproelastase sob condições nas quais o quadro de leitura aberta é expresso, em que o referido quadro de leitura aberta compreende sequências de codificação de nucleótideos, na direcção 5' para 3' (i) um péptido de sinal operável em Pichia pastoris; (ii) uma sequência de ativação compreendendo uma sequência de reconhecimento da elastase; e (iii) a sequência de uma proteína de elastase madura tipo I, produzindo assim uma proteína de proelastase; (b) sujeição da proteína de proelastase a condições de auto-ativação, produzindo, assim, uma elastase madura humana tipo I, em que as condições de auto-ativação incluem, por exemplo: (i) alterar o pH de uma solução contendo a proteína de proelastase, por exemplo, a um pH de 6,5-11, preferencialmente 8-9; ou (ii) purificação da proteína de proelastase, por exemplo, por cromatografia de troca iónica, e submetendo a solução a conversão alargada 110 para remover as variantes N-terminais, produzindo assim uma elastase madura humana tipo I; (c) opcionalmente, purificar a elastase madura humana tipo I, por exemplo, do passo de cromatografia de troca iónica para a cromatografia de polimento; e (d) liofilização da elastase madura humana tipo I, isolando uma elastase madura humana tipo I liofilizada. A elastase madura tipo I é preferencialmente uma elastase humana tipo I. Em certos aspectos, a elastase madura tipo I liofilizada é de preferência mais do que 95% pura, em formas de realização especificas, a elastase madura tipo I liofilizada é mais do que 98% ou mais de 99% pura.

As proteínas de elastase maduras da invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas. Assim, em concretizações exemplificativas, a presente invenção proporciona um método de geração de uma composição farmacêutica que compreende uma elastase madura humana tipo I, compreendendo o referido método (i) isolar uma elastase madura humana tipo I liofilizada de acordo com os métodos descritos acima (por exemplo, na Secção 5.4) e (ii) a reconstituição da elastase madura humana tipo I liofilizada num transportador farmaceuticamente aceitável

5.6 DOSE EFETIVA A presente invenção geralmente proporciona o beneficio de administração parentérica, de preferência, local, das proteínas de elastase recombinantes, isoladamente ou em combinação com outros agentes, para o tratamento ou prevenção de doenças nas condutas biológicas. 111

Em certas formas de realização, como uma alternativa à administração parentérica, podem ser utilizadas a administração oral de agentes para o tratamento ou prevenção de doenças nas condutas biológicas. A toxicidade e eficácia terapêutica das proteinas de elastase utilizadas na prática dos métodos da invenção pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinação da DL50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação de doses entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o indice terapêutico e pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos.

5.7 MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO A invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo novas proteinas de elastase e métodos de utilização destas para a prevenção ou tratamento de doenças nas condutas biológicas. Tais composições farmacêuticas podem ser formuladas de uma maneira convencional tal como descrito na secção 5.5 acima.

As composições de elastase da presente invenção podem ser administradas para o segmento desejado da conduto biológica a ser tratada por um dispositivo conhecido dos especialistas na técnica aceitável para a entrega soluções numa parede de uma artéria ou veia, por exemplo, uma seringa, um cateter de entrega de fármacosa, uma agulha de administração de fármacos, um polímero implantado de 112 entrega de fármacos, tal como uma preparação de folha ou de microesferas, um cateter implantável, ou um stent vascular revestido com polímero, preferencialmente um stent autoexpansível.

Em certas formas de realização, a administração no segmento desejado pode ser orientada por visualização direta, ultrassom, CT, orientação fluoroscópica, MRI ou orientação endoscópica.

Em certos aspectos da presente invenção, a administração de uma elastase para uma conduta biológica compreende a aplicação de uma formulação líquida de elastase diretamente para a superfície externa adventícia de uma artéria ou veia exposta cirurgicamente. Em aspectos específicos da presente invenção, a administração é feita com uma seringa.

Em certos aspectos da presente invenção, a administração de uma elastase para uma conduta biológica compreende a localização de um equipamento de difusão, em estreita proximidade com o segmento da conduta biológica a ser tratada. Em algumas formas de realização, durante a administração da proteína de elastase por um equipamento de difusão, uma porção do aparelho de fornecimento pode ser inserido dentro da parede da conduta biológica. Em algumas concretizações, o lúmen da conduta biológica pode ser pressurizado, enquanto a proteína de elastase é entregue ao segmento pressurizado da conduta biológica. Em algumas concretizações, o lúmen da conduta biológica é pressurizado por ação mecânica. Em algumas concretizações, o lúmen da conduta biológica é pressurizado com um cateter de balão. Em algumas formas de realização, a pressão é aplicada à 113 parede interior da conduta biológica por um membro autoexpansivel, que é parte de um cateter ou dispositivo. Em algumas formas de realização, a proteina de elastase é administrada e a pressurização é realizada pelo mesmo dispositivo. Em algumas formas de realização, a conduta biológico é exposta cirurgicamente e a proteina de elastase é entregue no lúmen ou é aplicada na superfície externa da conduta biológica in vivo. Em concretizações que envolvem a entrega do lúmen, o fluxo de sangue através do vaso pode ser interrompido com uma braçadeira ou para permitir que a elastase contacte a parede do vaso, por periodos mais longos de tempo e para evitar a inibição da elastase por soro. Em algumas formas de realização, a conduta biológica é removida cirurgicamente e a elastase é entregue à superfície luminal e/ou na superfície externa da conduta, in vitro. A conduta tratada pode, em seguida, em certas concretizações, ser devolvida ao corpo.

Em outros aspectos da presente invenção, a administração de uma elastase a uma conduta biológicA envolve o uso de uma formulação de polimero, que é colocada como um stent dentro do vaso a ser tratado, aplicado um grampo ou tira sobre a superfície externa da conduta biológica ou um envoltório no ou em torno do vaso a ser tratado, ou outro dispositivo, em torno ou próximo do vaso a ser tratado.

Ainda em outros aspecto da presente invenção, uma elastase é injetada por via percutânea numa região de tecido para fins de dilatação das artérias e/ou veias dentro desta região, incluindo as artérias colaterais. Em outros aspectos, a elastase é injetada por via percutânea diretamente na parede de uma artéria ou veia ou nos tecidos circundantes para o efeito de dilatar um segmento 114 específico do vaso. Em formas de realização destinadas a tratamento de vasos do coração, uma proteína de elastase pode ser entregue por via percutânea no espaço pericárdico ou diretamente aplicada aos vasos coronários expostos cirurgicamente.

Os dispositivos médicos que podem ser usadas para administrar as proteínas de elastase da invenção aos vasos sanguíneos são descritos na Secção 5.9 abaixo.

5.8 KITS A presente invenção fornece kits para praticar os métodos da presente invenção. Um kit "terapêutico" da invenção compreende, um ou mais recipientes de um ou mais dos agentes aqui descritos como úteis para o tratamento ou prevenção de doenças nas condutas biológicas, opcionalmente em conjunto com quaisquer agentes que facilitem a sua entrega. Um kit alternativo da invenção, o kit de "fabrico", compreende um ou mais recipientes de um ou mais dos agentes aqui descritos como úteis para a produção de proteínas de elastase recombinantes. 0 kit terapêutico da invenção pode compreender opcionalmente componentes adicionais, úteis para a realização dos métodos da invenção. A título de exemplo, o kit terapêutico pode compreender transportadores farmacêuticos úteis para a formulação dos agentes da invenção. 0 kit terapêutico pode também compreender um dispositivo ou um componente de um dispositivo para a realização dos métodos terapêuticos da invenção, por exemplo uma seringa ou uma agulha. A inclusão de dispositivos, tais como um cateter de injeção intramural 115 perivascular ou cateteres de injeção endoluminais nos kits terapêuticos está também contemplada. Em certas formas de realização, os agentes da invenção podem ser fornecidos na forma de dose unitária. Além disso, ou em alternativa, os kits da invenção podem proporcionar um material de instruções que descreve o desempenho de um ou mais dos métodos da invenção, ou um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula o fabrico, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou produtos biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência de fabricação do uso ou venda para administração humana. Os materiais de instrução podem ser incluídos na forma impressa no interior ou sobre um ou mais recipientes do kit. Alternativamente, os materiais de instrução podem ser incluídos dentro ou em cima de um ou mais recipientes do kit na forma de uma referência a um outro documento impressa ou acessível pela Internet que fornece os materiais didáticos.

Em concretizações específicas, um kit da presente invenção compreende um dispositivo médico, tal como descrito na Secção 5.9 abaixo. 0 kit de fabrico da invenção pode compreender, opcionalmente, componentes adicionais, úteis para a realização dos métodos da invenção.

5.9 DISPOSITIVOS MÉDICOS PARA ADMINISTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE ELASTASE

Aqui proporcionados são dispositivos médicos que podem ser utilizados para administrar das proteínas de elastase da presente invenção a uma conduta biológica, tal como uma artéria ou veia. Tais dispositivos são descritos abaixo e 116 no pedido provisório 61/025,084, apresentado em 31 de Janeiro de 2008, no pedido provisório 61/025,463, apresentado em 1 de Fevereiro de 2008 e o pedido provisório 61/075,710, apresentado em 25 de Junho de 2008, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade. As proteínas de elastase da presente invenção também podem ser administradas as condutas biolóqicas através de cateteres convencionais.

Numa forma de realização, um dispositivo médico útil para a administração das proteínas de elastase tem um eixo longitudinal central, e compreende um ou mais actuadores, em que um ou mais actuadores podem existir numa configuração constrangida em que um comprimento do referido um ou mais actuadores é orientado substancialmente paralelo ao eixo longitudinal do referido dispositivo e uma configuração sem restrições no qual pelo menos uma porção do comprimento do referido um ou mais actuadores é orientado substancialmente não paralelo ao eixo longitudinal central do dispositivo. Após o dispositivo ser posicionado num local alvo adjacente à parede de uma conduta biológica, um ou mais actuadores (e, se desejar, todos os actuadores) podem ser libertados a partir de uma configuração limitada e podem adoptar uma configuração não constrangida, fazendo, assim, o contacto com a parede da conduta biológica. Um ou mais actuadores podem ser de qualquer forma e, em concretizações preferidas, o movimento de um ou mais actuadores da configuração limitada à configuração irrestrita ocorre após a libertação de uma força de constrangimento por parte do operador, mas sem o impulso do operador de qualquer das forças deformantes para o dispositivo ou o tecido alvo. 117

Numa primeira concretização especifica, ilustrada na Figura 22, o dispositivo é um cateter de fornecimento de fluido 10 que compreende um ou mais actuadores que são formados como um par de ranhuras alongadas 12, 14, sendo as regiões de intermediários móveis entre uma configuração restrita orientada substancialmente paralela ao eixo longitudinal central 15 do conjunto de cateter e uma configuração sem restrições no qual pelo menos uma parte do par de ranhuras é orientado substancialmente não paralelo ao referido eixo longitudinal central (ver as porções L esquerda e R direita do comprimentos da ranhura da Figura 23) . Uma ou mais ranhuras 12, 14 podem ser construídas em forma de bandas ou fios alongados cada um tendo extremidades opostas proximais e distais. Numa forma de realização preferida, as ranhuras têm superfícies interiores opostas planas, 24, 26, e uma frente plana voltada para as superfícies exteriores 28, 30. Nesta forma de realização, as ranhuras 12, 14 podem trasladar-se entre as posições constrangidas e as posições não restringidas, como mostrado, respectivamente, nas Figuras 22 e 23. Numa forma de realização, o par de ranhuras é posicionado costas com costas nas suas configurações restritas, como mostrado na Figura 22. O cateter 10 compreende ainda um ou mais penetradores de tecido 16, 18 fixados a uma ou mais das superfícies de uma ou mais ranhuras 12, 14, um componente de cateter central 20 com um comprimento alongado e um componente de cateter exterior 22 que pode proteger penetrador ou penetradores de tecido durante o movimento do cateter no interior da conduta biológica.

Os penetradores de tecido 16, 18 podem ser construídos de qualquer material adequado. Os exemplos preferidos de tais 118 materiais incluem, mas não estão limitados a, níquel, alumínio, aço e as suas ligas. Numa concretização específica, os penetradores de tecido são construídas de nitinol. 0 componente de cateter central 2 0 e o componente de cateter exterior 22 podem ser construídos com materiais tipicamente utilizados na construção de cateteres. Exemplos de tais materiais incluem, mas não se limitam a, silicone, poliuretano, nylon, dacron, e PEBAX™.

Os actuadores são, de preferência construídos de um material flexível e resiliente. Numa forma de realização preferida, o material flexível e resiliente é capaz de ser constrangido por aplicação de uma força de constrangimento, por exemplo, quando os actuadores estão na configuração constrangida, e adoptam a sua forma original não constrangida quando a força restritiva é removida, por exemplo, quando os actuadores estão na configuração não constrangida. Qualquer tipo de material flexível e resiliente pode ser utilizado, incluindo, mas não limitado a aço cirúrgico, alumínio, polipropileno, materiais olefínicos, poliuretano e outros materiais de borracha sintética ou de plástico. Um ou mais actuadores são de preferência construídos de um material com memória de forma. Exemplos de tais materiais com memória de forma incluem, mas não estão limitadas a, ligas de cobre-zinco-alumínio-níquel, ligas de alumínio-cobre-níquel, ligas de níquel-titânio (NITI). Numa forma de realização preferida, o material com memória de forma é nitinol. Numa forma de realização preferida, quando o par de ranhuras assume a configuração não constrangida, as propriedades de memória de forma do material a partir do qual cada ranhura é 119 formada causa as estrias, sem a aplicação de qualquer força externa deformadora, e curvam-se radialmente para longe uma da outra num plano único como mostrado na Figura 23.

Uma ou mais das ranhuras (e de preferência cada uma das estrias) tem uma conduta flexivel de fornecimento de fluido 32, 34, que se prolonga ao longo do comprimento da ranhura, ou no interior da ranhura, conforme mostrado na Figura 24. Como as ranhuras 12, 14 se movem do seu trilho, em configurações restritas às suas configurações arqueadas, sem restrições, as condutas de distribuição de fluido 32, 34 também se movem a partir de configurações diretas para configurações arqueadas. Numa forma de realização, as condutas de fornecimento de fluido 32, 34 são canais tubulares separados que são fixados ao longo dos comprimentos do par de ranhuras 12, 14. Numa outra forma de realização, as condutas de distribuição de fluidos são condutas formadas em ou no interior do material das ranhuras.

Uma ou mais das ranhuras (e de preferência cada uma das ranhuras 12,14) é também formada com um trilho denteado 36, 38 que se estende ao longo do comprimento da ranhura (Figura 24) . Os trilhos denteados 36, 38 são formados, quer do mesmo material que as ranhuras 12, 14, ou num material que flecte com as ranhuras 12, 14.

Um ou mais dos penetradores de tecido 16, 18 é fixado às superfícies exteriores 28, 30 do par de ranhuras 12, 14 (Figura 24). Os penetradores de tecido 16, 18 estão ligados a e comunicar com as condutas de fornecimento de fluido 32, 34 que se estendem ao longo dos comprimentos das 120 ranhuras 12, 14. Os penetradores de tecido 16, 18 estão posicionados para se projetarem substancialmente perpendicular a partir das superfícies exteriores 28, 30 das ranhuras 12, 14. Os penetradores de tecido 16, 18 têm furos interiores ocos que se comunicam com as condutas de distribuição de fluido 32, 34 das ranhuras. As extremidades distais dos penetradores de tecido têm aberturas de distribuição de fluido que comunicam com o interior dos furos dos penetradores de tecido. O dispositivo permite a distribuição de fluidos para dentro ou através de uma ou mais camadas distintas de uma parede de uma conduta biolóqica, por exemplo, uma parede vascular. A parede vascular compreende numerosas estruturas e camadas, incluindo a camada endotelial e a camada de membrana basal (colectivamente a camada íntima), a lâmina elástica interna, a camada média e a camada adventícia. Estas camadas são dispostas de tal modo que o endotélio está exposto ao lúmen do vaso, e a membrana basal, a lâmina elástica interna, os meios, e a adventícia estão, cada um sucessivamente em camadas sobre o endotélio, tal como descrito no Pedido de Patente US 2006/0189941A1. Com os dispositivos médicos da presente invenção, a profundidade a que os penetradores de tecido 16, 18 podem penetrar é determinado pelo comprimento de cada um dos penetradores de tecido 16, 18. Por exemplo, se o alvo é a camada adventícia, são utilizados penetradores de tecido 16, 18 tendo um comprimento suficiente para a penetração à profundidade da camada adventícia mediante a implantação do dispositivo. Da mesma forma, se a camada de destino é a camada média, são utilizados penetradores de tecido 16, 18, tendo um comprimento definido suficiente para a penetração 121 até à profundidade da camada medial após a implantação do dispositivo.

Em concretizações específicas, o comprimento dos penetradores de tecido 16, 18 podem variar de cerca de 0,3 mm a cerca de 5 mm para aplicações vasculares, ou até cerca de 20 mm ou mesmo 30 mm, para aplicações que envolvem outros espaços biológicos ou condutas, por exemplo, em aplicações no cólon. Os penetradores de tecido 16, 18 têm preferencialmente um diâmetro de cerca de 0,2 mm (calibre 33) para cerca de 3,4 mm (calibre 10), mais de preferência entre 0,2 mm a 1,3 mm (cerca de calibre 33 a 21) . As pontas distais dos penetradores de tecido podem ter um chanfro padrão, um chanfro curto, ou um verdadeiro chanfro curto. Numa concretização alternativa, os penetradores de tecido associadas a qualquer uma ranhura não são de comprimentos idênticos, mas pode ser configurados de tal modo que as suas extremidades distais alinhem de modo a serem equidistantes da parede da conduta biológica quando o dispositivo médico está na posição não constrangido, por exemplo, durante a utilização. O componente de cateter central 20 tem um comprimento alongado com extremidades proximal e distai opostas, mostrado à esquerda e à direita, respectivamente na Figura 22. Numa concretização, o componente de cateter central 20 tem uma superfície exterior cilíndrica, que se estende ao longo do seu comprimento. As extremidades proximais das ranhuras 12, 14 estão ligadas, por exemplo, soldadas ou coladas, com a extremidade distai do componente de cateter central 20, enquanto as extremidades distais das ranhuras 12, 14 estão ligadas, por exemplo, soldadas ou coladas, a uma ponta de orientação do cateter 40. A ponta 40 tem uma 122 superfície exterior lisa que é concebida para se mover facilmente no tubo biológico. Um furo do fio de guia 48 prolonga-se através do comprimento do cateter central 20 e da ponta 40. O furo do fio de guia é dimensionado para receber um fio de guia num engate deslizante através do furo.

Um par de lúmens de fornecimento de fluido 44, 46 prolongam-se através do interior do componente de cateter central 20 para todo o comprimento do componente de cateter (Figura 25). Na extremidade distai do componente de cateter central 20 o par de lúmens de fornecimento de fluido 44, 46 comunica com o par de condutas de fornecimento de fluido 32, 34 que se prolongam ao longo dos comprimentos das ranhuras 12, 14 para os penetradores de tecido 16, 18. Um fio de guia 48 também se estende através do interior do componente de cateter central 20 a partir da extremidade proximal até à extremidade distai do componente de cateter central (Figura 25) . A extremidade proximal do componente de cateter central 20 está provida com um par de eixos Luer 50, 52 (Figura 22). Numa concretização, cada eixo Luer 50, 52 comunica com os lúmens de fornecimento de 44, 46 que se estendem por todo o comprimento do cateter central. Cada eixo Luer 50, 52 está concebido para ser ligado a uma fonte de fornecimento de fluido para comunicação de um fluido através de cada eixo Luer 50, 52, então através de cada lúmen de fornecimento de fluido 44, 4 6 que se estende através do componente de cateter central 20, e depois através de cada conduta de fornecimento de fluido 32, 34 que se estende ao longo dos comprimentos do par de ranhuras 12, 14, e depois através dos penetradores de tecido 16, 18 fixados a cada um dos pares de ranhuras. Numa outra forma de realização, cada eixo Luer 50, 52 comunica, 123 independentemente, com ambos os lúmens de fornecimento de fluido 44, 4 6 que se estendem por todo o comprimento do componente de cateter central. Nesta configuração, um primeiro fluido pode ser fornecido através de um primeiro eixo Luer para ambos os penetradores de tecido 16, 18 e um segundo fluido pode ser fornecido através de um segundo eixo Luer para ambos os penetradores de tecido 16, 18. A entrega de fluido a partir de ambos os penetradores de tecidos de cada eixo Luer pode ser conseguida por uma conduta independente que se estende a partir de cada eixo Luer para um reservatório comum distai 61, como mostrado na Figura 32. Este reservatório comunica com ambos os penetradores de tecido 16, 18. Alternativamente, noutra forma de realização, o dispositivo médico da presente invenção compreende apenas um único eixo Luer ligado a um único lúmen de fornecimento de fluido que se estende através do cateter central, que, em seguida, é ligado a um reservatório comum distai, permitindo a entrega de um único fluido em ambos os penetradores de tecido 16, 18. 0 componente de cateter exterior 22 tem uma configuração tubular que rodeia o par de ranhuras 12, 14 e uma maioria do cateter central 20 (Figura 22). 0 componente de cateter 22 tem um comprimento alongado que se estende entre as extremidades opostas proximal e distai do componente de cateter mostrados à esquerda e à direita, respectivamente na Figura 22. A extremidade distai do componente de cateter está dimensionado para engatar num engate seguro com a ponta de guia 40, em que a superfície exterior da ponta 40 se funde com a superfície exterior do componente de cateter 22, quando a extremidade distai do componente de cateter é acoplada com a ponta. A configuração tubular do componente de cateter 22 é dimensionada de modo que uma 124 superfície interior do componente de cateter 22 seja afastada para fora da pluralidade de penetradores de tecido 16, 18 no par de ranhuras 12, 14 nas posições de constrangimento no par de ranhuras. A extremidade proximal do cateter central 20 prolonga-se para além da extremidade proximal do componente de cateter 22, quando a extremidade distai do componente de cateter interage com a ponta de guia do cateter 40. A ligação mecânica 54 é proporcionada entre a extremidade proximal do componente de cateter exterior 22 e a extremidade proximal do componente de cateter central 20 que permite que o componente exterior do cateter seja movido para trás ao longo dos comprimentos do par de ranhuras 12, 14 e o componente do cateter central 20 leve a que a extremidade distai componente exterior do cateter 22, se separe da ponta de guia 40 e passe por cima do par de ranhuras 12, 14, e para a frente ao longo do comprimento do componente de cateter central 20 e ao longo dos comprimentos do par de ranhuras 12, 14 para engatar a extremidade distai do componente exterior do cateter 22 com a ponta 40 (Figura 22). A ligação mecânica 54 poderia ser fornecida por uma alavanca ou botão que desliza manualmente o componente exterior do cateter 22 ao longo do componente central do cateter 20. A ligação 54 pode também ser fornecida por um mecanismo seletor rotativo ou gatilho. Além disso, a ligação 54 pode ser fornecida com um indicador sonoro ou táctil (por exemplo, clicando) do movimento incremental do componente exterior do cateter 22, relativamente ao componente central do cateter 20.

Numa concretização, o componente exterior do cateter 22 é fornecido com uma única faixa de fecho 56, que se prolonga 125 ao longo de todo o comprimento de um lado do componente exterior do cateter 22 na superfície interior do componente exterior do cateter (Figura 24) . A faixa de fecho 56 no interior do componente exterior do cateter 22 engata num encaixe deslizante com o trilho denteado 36, 38 de um lado de cada uma das ranhuras 12, 14. Avançando o componente exterior do cateter 22 para a frente ao longo do comprimento do componente central do cateter 20 e o par de ranhuras 12, 14 na direção da ponta de guia 40 faz com que o conjunto de cateter leve a que a faixa de fecho 56 do componente exterior do cateter deslize ao longo dos trilhos 36, 38 do par de ranhuras 12, 14. Isso move a par de ranhuras 12, 14 a partir de sua configuração curvada, sem restrições mostrado na Figura 23 em direção à sua configuração restrita costas com costas, mostrada na Figura 22. 0 envolvimento dos trilhos denteados 36, 38 na faixa de fecho 56 do componente exterior do cateter 22 mantém o par de ranhuras 12, 14 na sua posição relativa costas com costas mostrada na Figura 22. Com o componente exterior do cateter 22 empurrado para a frente por cima do componente central do cateter 20 e o par de ranhuras 12, 14 a que a extremidade distai do cateter exterior do componente 22 engata com a ponta de guia 40,os penetradores de tecido 16, 18 são cobertos e a conjunto de cateter da presente invenção pode ser movido para a frente ou para trás, de forma segura numa conduta biológica. O componente exterior do cateter 22 cobre os penetradores de tecido 16, 18 proj etando a partir do par de ranhuras 12, 14 e 0 engaj amento do componente exterior do cateter 22 com a ponta distai de guia 40 fornece ao conjunto de cateter uma superficie exterior lisa que facilita a inserção do conjunto do cateter para dentro e através de uma conduta biológica, tal como num vaso sanguíneo. Numa outra forma de realização, o componente exterior do cateter 22 está 126 provido de dois trilhos denteados a 180 graus um do outro que se prolongam ao longo de todo o comprimento do componente exterior do cateter 22 sobre a superfície interior e as ranhuras têm trilhos de ambos os lados.

Um fio de guia 58 é usado com o conjunto de cateter (Figura 22). O fio de guia 58 prolonga-se através do furo do fio de guia 48 do componente central do cateter, ao longo das ranhuras 12, 14 e, através da saida da ponta de guia 42. Em certas formas de realização, o fio de guia 58 tem um núcleo sólido, por exemplo, em aço inoxidável ou nitinol superelástico. 0 fio de guia pode ser construído de material rádio-opaco, quer na sua totalidade, ou nas suas porções distais (por exemplo, a mais distai de 1 mm a 25 mm ou a mais distai de 3 mm a 10 mm) . O fio de guia 58 pode ser opcionalmente revestido com um revestimento medicamente inerte, tais como Teflon®.

Na utilização deste dispositivo, o fio de guia 58 é posicionado na conduta biológica por métodos bem conhecidos na técnica. 0 fio de guia 58 prolonga-se a partir da conduta biológica, através da saida do fio de guia 42 na ponta 40 do conjunto, por intermédio da blindagem exterior do cateter 22 passando os penetradores de tecido 16, 18, e através do furo do fio de guia 48 do cateter central 20. Em outras formas de realização, o conjunto de cateter é um conjunto de cateter de permuta rápida, em que o lúmen do fio de guia está presente na extremidade distai da ponta de guia 40 do cateter, mas não se estende ao longo de todo o comprimento do dispositivo médico. 127

Após o posicionamento do fio de guia, o dispositivo é avançado para dentro da conduta biológica ao longo do fio de guia 58 previamente posicionado. Um ou mais marcadores rádio-opacos podem opcionalmente ser fornecidos no dispositivo para controlar a posição do dispositivo na conduta biológica. Qualquer material que impede a passagem de radiação electromagnética é considerado rádio-opaco e pode ser utilizado. Materiais rádio-opacos preferidos incluem, mas não estão limitados a, platina, ouro ou prata. 0 material rádio-opaco pode ser revestido sobre a toda a superficie ou uma parte da ponta 40, na totalidade ou em parte das ranhuras 12, 14 ou outros actuadores, sobre o fio de guia 58, ou em alguma combinação das estruturas precedentes. Alternativamente, um anel de material rádio-opaco pode ser unido à ponta 40. O dispositivo pode, opcionalmente, ser fornecido com imagem, como o ultrassom intravascular ou tomografia de coerência óptica. A ponta do dispositivo pode, opcionalmente, ser fornecida com ópticas que são usadas para determinar a posição do dispositivo, ou as caracteristicas da conduta biológica circundante.

Quando o dispositivo está na sua posição desejada na conduta biológica, o operador utiliza a ligação mecânica 54 para retrair o componente exterior do cateter 22 afastado para trás a partir da ponta 40. Numa concretização preferida, como o componente exterior do cateter 22 é retirado de cima dos penetradores de tecido 16, 18, a faixa de fecho 56 do componente exterior do cateter 22 é retirada ao longo dos trilhos 36, 38 do par de ranhuras 12, 14. Esse movimento liberta o par de ranhuras 12, 14 a partir das suas configuração constrangida costas com costas mostrada na Figura 22, e permite que o material de memória de forma das ranhuras 12, 14 adopte as suas configurações não 128 constrangidas arqueadas mostradas na Figura 23. Como as ranhuras 12, 14 se movem para as suas configurações não restringidas, arqueadas, as ranhuras entram em contacto com a superfície interior da parede da conduta biológica e os penetradores de tecido 16, 18 sobre as superfícies exteriores 28, 30 das ranhuras 12, 14 são pressionados para dentro da superfície interior da conduta biológica na posição do dispositivo.

Depois dos penetradores de tecido 16, 18 terem entrado na camada desejada da parede de uma conduta biológica, um líquido pode ser emitido através dos lúmens de fornecimento de fluido 44, 46 no componente central do cateter 20, através das condutas de fornecimento de fluido 32, 34 sobre o par de ranhuras 12, 14, e através dos penetradores de tecido 16, 18. Quando a distribuição do fluido está completa, o operador utiliza a ligação mecânica 54 para mover o componente exterior do cateter 22 (que também pode ser referido como um componente de blindagem) para a frente sobre o componente central do cateter 20 e ao longo do par de ranhuras 12, 14 em direção à ponta de guia 40. Como o componente exterior do cateter 22 se move para a frente sobre o par de ranhuras 12, 14, a faixa de fecho 5 6 no interior do componente exterior do cateter 22 passa por cima dos trilhos 36, 38 no par de ranhuras 12, 14, fazendo com que as ranhuras 12, 14 para se desloquem da sua configuração sem restrições, arqueada de volta para sua configuração restrita. Quando o componente exterior do cateter 22 tiver avançado totalmente ao longo dos pares de ranhuras 12, 14 e de novo engate com ponta de guia 40, a faixa de fecho 56 no componente exterior do cateter 22 segura as ranhuras 12, 14 na sua configuração constrangida. O dispositivo, em seguida, pode ser reposicionado para a 129 libertação numa outra localização na conduta biológica ou em outra conduta biológica, ou retirado do corpo. A forma e comprimento das ranhuras 12, 14 são selecionados de modo que as várias formas de realização do aparelho possam ser usadas em espaços biológicos ou condutas de vários tamanhos, ou diâmetros. Em certas formas de realização, as ranhuras podem ser planas ou arredondadas. As ranhuras planas têm, de preferência, uma largura que varia de cerca de 0,2 mm a cerca de 20 mm, uma altura que varia entre cerca de 0,2 mm a cerca de 5 mm, e um comprimento que varia entre cerca de 10 mm a cerca de 200 mm, dependendo da aplicação particular. As ranhuras arredondadas têm de preferência um diâmetro que varia entre cerca de 0,2 mm a cerca de 20 mm e um comprimento que varia entre cerca de 10 mm a cerca de 200 mm, dependendo da aplicação particular. Em concretizações especificas, as ranhuras planas são 3,5 mm a 5 mm, 5 mm a 10 mm, de 10 mm a 15 mm, de 15 mm a 20 mm de largura, no seu interior ou em qualquer gama entre estas (por exemplo, 3,5 mm a 10 mm) ; entre 3,5 mm a 5 mm, 5 mm a 10 mm, 10 mm a 15 mm, com 15 mm a 20 mm em altura, no seu interior ou em qualquer gama entre estas (por exemplo, 3,5 mm a 10 mm), e de 10 a 20 mm, 20 mm a 40 mm, 40 mm a 80 mm, 80 mm a 120 mm, 120 mm a 150 mm, 150 a 200 mm de comprimento, no seu interior ou em qualquer gama entre estas (por exemplo, de 10 mm a 40 mm) , ou qualquer permutação do exposto (por exemplo, uma largura de 5 a 10 mm, uma altura de 3,5 a 5 mm, e um comprimento de 20 a 40 mm) . Em outras formas de realização, as ranhuras arredondadas são de 3,5 mm a 5 mm, 5 mm a 10 mm, 10 mm a 15 mm, 15 mm a 20 mm de diâmetro, no seu interior ou em qualquer gama entre estas (por exemplo, entre 3,5 mm a 10 mm) e 10 mm a 20 mm, 20 mm a 40 mm, 40 mm a 80 mm, 80 mm a 130 120 mm, 120 mm a 150 mm, 150 a 200 mm de comprimento, no seu interior ou em qualquer gama entre estas (por exemplo, de 10 mm a 40 mm) , ou qualquer permutação do exposto (por exemplo, um diâmetro de 5 mm a 10 mm e um comprimento de 20 a 40 mm).

Numa segunda forma de realização especifica, mostrado na Figura 27, o dispositivo da presente invenção é um cateter de administração de fluido 110 que inclui um componente central do cateter 112 com um comprimento alongado com um eixo longitudinal 113, um ou mais (e de preferência dois) actuadores flexíveis, resilientes que, nesta concretização específica, são formadas como tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 que se estendem desde a parte distai do componente central do cateter 112. Pelo menos uma parte dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 são móveis entre uma configuração constrangida que está orientada substancialmente paralela ao eixo central longitudinal 113 do conjunto de cateter e uma configuração não constrangida que é orientada substancialmente não paralela ao eixo longitudinal central 113 do cateter. O cateter compreende ainda um ou mais (e de preferência dois) penetradores de tecido flexíveis, alongados 118, 120 que se estendem através dos dois tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116, e um tubo de distribuição exterior 122 que se estende ao longo de porções do comprimento do componente central do cateter 112, dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 e 132 e do trilho do meio. 131 0 componente central do cateter 112 e o tubo de distribuição exterior 122 podem ser construídos de quaisquer materiais adequados para a construção de cateteres. Exemplos de tais materiais incluem, mas não se limitam a, silicone, poliuretano, nylon, dacron, e PEBAX™.

Os penetradores de tecido 118, 120 ligam-se aos respectivos eixos 166, 168 (Figura 31). Um ou mais dos pares de penetradores de tecido 118, 120 tem de preferência um diâmetro de cerca de 0,2 mm (calibre 33) para cerca de 3,4 mm (calibre 10), mais preferivelmente 0,8 milímetros a 1,3 mm (cerca de calibre 18 a 21) . Um ou mais dos pares de penetradores de tecido pode ter um chanfro padrão, um chanfro curto ou um verdadeiro chanfro curto. O par de penetradores de tecido 118 e 120 é de preferência construído de materiais que permitam aos penetradores de tecido, flectir ao longo dos seus comprimentos. Exemplos de tais materiais incluem, mas não estão limitados a, níquel, alumínio, aço e as suas ligas. Numa concretização específica, os penetradores de tecido são construídas de nitinol. O comprimento total dos penetradores de tecido 118, 120 pode ser construído de um só material, ou as extremidades distais (por exemplo, da distai de 1 mm para a distai de 20 mm), incluindo os eixos 156, 158, dos penetradores de tecido 118, 120 podem ser construídos de um material e conectados aos respectivos eixos 166, 168 através de um tubo feito de um material diferente, por exemplo, plástico.

Um ou mais dos pares de tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 são de preferência construídos de um material flexível e resiliente. Tal material flexível e resiliente pode ser deformado, por 132 exemplo, quando os tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 estão na configuração rectilinea, restrita da Figura 27, mas retornam à sua forma original quando a força de deformação é removida, por exemplo, quando os tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 estão na configuração curva, sem restrição mostrada na Figura 28. Qualquer tipo de material flexivel e resiliente pode ser utilizado, incluindo, mas não limitado a aço cirúrgico, aluminio, polipropileno, materiais óleofinicos, poliuretano e outros materiais de borracha sintética ou de plástico. 0 par de tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 é mais de preferência, construído de um material com memória de forma. Exemplos de tais materiais com memória de forma incluem, mas não estão limitadas a, ligas de cobre-zinco-alumínio-níquel, ligas de aluminio-cobre-niquel, ligas de niquel-titânio (NiTi). Numa forma de realização preferida, o material com memória de forma é nitinol. 0 componente central do cateter 112 tem um comprimento alongado flexível com extremidades proximais 124 e distais 12 6 (Figura 27) . A extremidade distai 12 6 do componente central do cateter é formada como uma ponta de guia que tem uma configuração de forma exterior que vai orientar a extremidade distai 126 através de uma conduta biológica. Um furo de fio de guia de 128 dentro do trilho do meio 132 prolonga-se através do centro do cateter central 112 a partir da extremidade proximal 124 até à extremidade distai 126. 0 furo do fio de guia 128 recebe um fio de guia flexível alongado 130 para um movimento deslizante do furo 128 ao longo do fio (Figura 29) . O fio de guia 130 é utilizado para orientar o conjunto de cateter através de uma conduta biológica. Em certas formas de realização, o 133 fio de guia 130 tem um núcleo sólido, por exemplo, de aço inoxidável ou nitinol superelástico. O fio de guia pode, opcionalmente, ser feito de um material rádio-opaco, quer na sua totalidade, ou nas suas porções distais (por exemplo, o mais distai de 1 mm a 25 mm ou mais distai de 1 mm a 3 mm) . O fio de guia 130 pode, opcionalmente, ser revestido com um revestimento medicamente inerte, tal como Teflon®. Em outras formas de realização, o conjunto de cateter é um conjunto de cateter de permuta rápida, em que um fio de guia é posicionado na extremidade distai da ponta de guia 126 e prolonga-se a partir da mesma.

Um trilho estreito no meio 132 em torno do furo de fio de guia 128 estende-se desde a ponta da guia da extremidade distai do cateter 126 para a extremidade proximal do cateter 124. O trilho do meio 132 liga ponta de guia 126 a uma porção de base 138 do componente central do cateter. A porção base do componente central do cateter 138 tem uma superfície exterior cilíndrica, que se estende ao longo de todo o comprimento da porção de base. A porção de base 138 prolonga-se ao longo de uma parte do comprimento total do componente central do cateter 112. Como mostrado na Figura 29, o furo do fio de guia 128 prolonga-se através do centro da porção de base do componente central do cateter 138. Além disso, um par lúmens dos penetradores de tecido 140, 142 também se estendem por todo o comprimento da porção de base do componente central do cateter 138 ao longo do furo do fio de guia 128. Na extremidade proximal 124 do componente central do cateter, um par de portas 144, 146 comunicam o par de lúmens 140, 142 com o exterior do componente central do cateter 112 (Figura 27). 134

Numa concretização alternativa, o dispositivo médico da Figura 27, também pode compreender um único actuador flexível, resiliente, que é formado como um tubo de apresentação do penetrador de tecido, um penetrador de tecido, único, flexível, alongado que se prolonga através do tubo de apresentação do penetrador de tecido e conecta-se a um eixo, e um tubo de distribuição exterior, que se estende ao longo de porções do comprimento do componente central do cateter, o tubo de apresentação do penetrador de tecido, e o trilho do meio. 0 par do primeiro e segundo tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 projeta-se da porção de base do componente central do cateter 138 em direção à extremidade distai do cateter 12 6. Cada um dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido é formado como um estreito tubo alongado tendo uma extremidade proximal que é fixada à porção de base do componente central do cateter 138, e uma extremidade distai oposta 148, 150. Cada um dos primeiros e segundos de tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 tem um furo interior 152, 154, que comunica com o respectivo primeiro lúmen do penetrador tecido 140 e o segundo lúmen do penetrador de tecido 142 na porção de base do componente central do cateter 138.

Como mostrado nas Figuras 29 e 30, as configurações exteriores dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 emparelham com o trilho do meio 132 de modo que os comprimentos dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 podem ser posicionados lado a lado em lados opostos do trilho do meio 132. As extremidades distais do tubo do penetrador de tecido 148, 135 150 podem ser formadas como superfícies de ponta de guia que também facilitam a passagem do cateter através do sistema vascular. As extremidades distais do tubo do penetrador de tecido 148, 150 são de preferência maiores em diâmetro do que os tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116. Numa concretização específica, as extremidades distais do tubo dos penetradores de tecido 148, 150 são arredondadas e as pontas protuberantes. Tais pontas são atraumáticas e os tubos não irão inadvertidamente perfurar a parede de uma conduta biológica. As pontas 148, 150 estão expostas e não se estendem para fora para além do diâmetro da ponta de guia 126.

Cada um dos tubos dos penetradores de tecido 114, 116 é de preferência construído de um material com memória de forma, como o nitinol. Os tubos 114, 116 são formados com configurações curvas, não restritas mostradas na Figura 28. Os tubos 114, 116 movem-se das configurações não restringidas, curvas, mostrados na Figura 28, quando nenhuma força restritiva é aplicada contra os tubos. A fim de que os tubos de apresentação 114, 116 permanecem em configurações restritas, direitas, ao longo do trilho do meio 132, uma força restritiva deve ser aplicada aos tubos para mantê-los nas suas posições direitas, constrangidas mostradas na Figura 27. Como cada um dos tubos 114, 116 se move a partir da sua configuração linear, restrita mostrada na Figura 28 para a sua configuração curva, sem restrições apresentada na Figura 28, os furos dos penetradores de tecido 152, 154 que se prolongam através dos tubos também se movem a partir das configurações rectas para as configurações curvas. 136 0 par de penetradores de tecido 118, 120, a partir das suas extremidades distais aos eixos 166, 168, tem comprimentos que são ligeiramente mais longos do que os comprimentos combinados dos lúmens dos penetradores de tecido 140, 142 que se prolongam através da porção de base central do cateter 138 e os furos dos penetradores de tecido 152, 154 que se prolongam através dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116. As pontas 156, 158 dos penetradores de tecido 118, 120 estão posicionadas adjacentes às extremidades distais 148, 150 dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 e estão posicionadas no interior dos furos 152, 154 dos tubos na configuração constrangida da Figura 27. Pelo contrário, as extremidades proximais dos penetradores de tecido 118, 120 projetam-se através das portas laterais 144, 146 do cateter central 112. O par de penetradores de tecido 118 e 120 são dimensionados para deslizar facilmente através dos lúmens dos penetradores de tecido 140, 142 do componente central do cateter 112, e dos furos dos penetradores de tecido 152, 154 e dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116. As portas laterais 144, 146 do componente central do cateter 112 estão, de preferência em ângulos de 20° e de 90° para a extremidade proximal do cateter central 124, o mais preferivelmente em ângulos de 30° a 60° para a extremidade proximal do cateter central 124.

Um par de movimento manual do operador para os controladores de movimento linear 162, 164 pode ser ligado às extremidades proximais dos penetradores de tecido 118, 120 e podem ser fixados às portas dos cateteres centrais 144, 146 (Figura 31). Os controladores 162, 164 podem ser construídos de modo a converter o movimento do operador em movimento linear controlado dos penetradores de tecido 118, 137 120, através dos lúmens dos penetradores de tecido do cateter central 140, 142 e através dos furos dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 152, 154. Numa forma de realização, existem controladores de rotação 162, 164 que podem ser movidos manualmente num sentido, de tal modo que as pontas de injeção dos penetradores de tecido 156, 158 nas extremidades distais dos penetradores de tecido possam ser posicionados de forma ajustável para estender um comprimento desejado a partir dos furos dos tubos dos penetradores de tecido 152, 154 nas extremidades distais dos tubos dos penetradores de tecido 148, 150. Rodando os controladores no sentido oposto, os penetradores de tecido 118, 120 podem ser recolhidos de volta para os furos dos tubos dos penetradores de tecido 152, 154. Cada um dos movimentos do operador para os controladores de movimento linear 162, 164 pode ser fornecido com um eixo 166, 168, que comunica com o interior do furo que se prolonga através dos penetradores de tecido 118, 120 e pode ser utilizado para ligar uma seringa ou um tubo contendo uma solução de um agente de diagnóstico ou terapêutico. O tubo de distribuição exterior 122 tem uma extensão tubular que rodeia o cateter central 112, os tubos de de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 e 132 e o trilho do meio. O tubo de distribuição 122 pode ser montado no componente central do cateter 112 e o par de tubos de apresentação dos penetradores tecido 114, 116, para o movimento de deslizamento para uma posição para a frente do tubo de distribuição 122, onde uma extremidade distai aberta 172 do tubo de distribuição está colocada adjacente à extremidades distais 148, 150 dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 conforme mostrado na Figura 27, e uma posição de retaguarda do tubo de 138 implantação 122, onde a extremidade distai do tubo 172 está posicionada adjacente à ligação dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 com o componente central do cateter 112 como mostrado na Figura 28. A extremidade proximal oposta 174 do tubo de distribuição 122 pode ser fornecida com uma ligação mecânica de 176 a 112 ao cateter central. A ligação mecânica 176 permite que o tubo de implantação 122 seja movido entre as suas posições para a frente e para a retaguarda em relação ao cateter central. 112 e aos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 (Figuras 27 e 28) . Tal ligação pode ser proporcionada por um botão giratório, uma ligação deslizante, um botão de disparo ou de pressão ou alguma conexão, que seja operável manualmente para fazer com que o tubo de distribuição 122 se mova em relação ao cateter central 112 e aos tubos de apresentação 114, 116. Quando o tubo de distribuição 122 é movido para a sua posição avançada mostrada na Figura 27, a extremidade distai do tubo 172 passa ao longo dos comprimentos dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 e move os tubos de apresentação para as suas posições restritas que se prolongam ao longo dos lados opostos do trilho do meio do cateter central 132. Quando o tubo de distribuição 122 é movido para a sua posição recuada apresentada na Figura 28, a extremidade distai 172 do tubo de distribuição é retraida ao longo do comprimento dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 e, gradualmente, permite que os tubos de apresentação 114, 116 libertem a sua energia limitada e movimentem as suas configurações curvas, sem restrições mostradas na Figura 28.

Em utilização do cateter 110, o tubo de distribuição 122 está na posição para a frente mostrada na Figura 27. O fio 139 de guia 130 encontra-se posicionado numa conduta biológica (tal como uma artéria ou veia) de uma maneira conhecida. O cateter é então avançado para dentro da conduta biológica sobre o fio de guia. O fio de guia 130 estende-se a partir da conduta biológica, e entra na extremidade distai do componente central do cateter 126 através do lúmen do fio de guia 128. 0 fio 130 passa através do comprimento do cateter central 112 e emerge na extremidade proximal do componente central do cateter adj acente às portas do cateter 144, 146, onde o fio de guia 130 pode ser manipulado manualmente. O cateter 110 pode ser avançado através da conduta biológica e pode ser guiado pelo fio de guia 130. Os marcadores rádio-opacos podem opcionalmente ser fornecidos no conjunto para monitorizar a posição do conjunto na conduta biológica. Qualquer material que impede a passagem de radiação electromagnética é considerado rádio-opaco e pode ser utilizado. Materiais rádio-opacos úteis incluem, mas não estão limitados a, ouro, platina ou prata. O material rádio-opaco pode ser revestido sobre a superfície de toda ou uma parte da ponta 126, na totalidade ou em parte dos tubos de apresentação 114, 116, sobre a totalidade ou parte dos penetradores de tecido 118, 120, sobre o fio de guia 130, ou em qualquer combinação das estruturas precedentes. Alternativamente, um anel de material rádio-opaco pode ser unido à ponta 126. A montagem pode, opcionalmente, ser fornecida com imagens, como ultrassom intravascular ou tomografia de coerência óptica. A ponta do conjunto pode, opcionalmente, ser provida de óptica que é útil para a determinação da posição do conjunto ou as caracteristicas da conduta biológica circundante. Quando o conjunto se encontra numa posição 140 desejada, o tubo de distribuição exterior 122 pode ser movido a partir da sua posição avançada mostrada na Figura 27 para a sua posição recuada apresentada na Figura 28, por manipulação manual da ligação mecânica 176.

Como o tubo de implantação 122 é retirado por cima do par de tubos de apresentação dos penetradores do tecido 114, 116, a energia restrita dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 é libertada e os tubos de movem-se para as suas configurações, não restritas curvas mostradas na Figura 28. Este movimento coloca os furos dos penetradores de tecido 152, 154 nas extremidades distais dos tubos dos penetradores de tecido 148, 150 contra as superfícies interiores da conduta biológica na qual o conjunto 110 foi inserido. 0 movimento do operador para os controladores de movimento linear 162, 164, em seguida, pode ser operado manualmente para alargar as extremidades distais dos penetradores de tecido 156, 158 a partir dos furos dos penetradores de tecido 152, 154 para as extremidades distais dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 148, 150. Um medidor pode ser proporcionado em cada um dos movimentos do operador nos controladores de movimento linear 162, 164 que proporcionam uma indicação visual da extensão da projeção das pontas dos penetradores de tecido 156, 158 a partir das extremidades dos tubos dos penetradores de tecido 148, 150, conforme os controladores 162, 164 são rodados. Os controladores também poderiam fornecer um som audível ou táctil tal como um clicar para indicar à distância os passos incrementais dos penetradores de tecido. Isso implanta as pontas dos penetradores de tecido 156, 158 a 141 uma distância desejada dentro das paredes da conduta biológica.

Numa terceira forma de realização especifica, um dispositivo médico da presente invenção é um cateter de distribuição de fluido que compreende um ou mais penetradores de tecido construídos de um material flexível e resiliente. Em certos aspectos, o dispositivo médico da presente invenção tem um eixo longitudinal central, e compreende uma ou mais penetradores de tecidos, em que um ou mais penetradores de tecido podem existir numa configuração constrangida em que um comprimento do referido um ou mais penetradores de tecido é orientado substancialmente paralelamente ao eixo longitudinal do referido dispositivo e uma configuração sem restrições no qual pelo menos uma porção do comprimento do referido um ou mais penetradores de tecido é orientado substancialmente não paralelo ao eixo longitudinal central do dispositivo. Após o dispositivo estar posicionado num local alvo adjacente à parede de uma conduta biológica, um ou mais penetradores de tecido (e, se desejar, todos os penetradores de tecido) podem ser libertados a partir de uma configuração limitada e podem adoptar uma configuração não restrita, fazendo, assim, contacto com a parede da conduta biológica. Um ou mais penetradores de tecido poden ser de qualquer forma e, em concretizações preferidas, o movimento de um ou mais penetradores de tecido a partir da configuração limitada à configuração irrestrita ocorre após a libertação de uma força de constrangimento por parte do operador, mas sem o impulso do operador de quaisquer forças deformantes para o dispositivo ou o tecido alvo. 142

Numa concretização preferida, os penetradores de tecido são construidos de um material flexivel, resiliente, que é capaz de ser constrangido por aplicação de uma força de constrangimento, por exemplo, quando os penetradores de tecido estão na configuração limitada, e adoptam a sua forma original não coagida quando a força restritiva é removido, por exemplo, quando os penetradores de tecido estão na configuração sem restrições. Qualquer tipo de material flexivel e resiliente pode ser utilizado, incluindo, mas não limitado a aço cirúrgico, alumínio, polipropileno, materiais olefinicos, poliuretano e outros materiais de borracha sintética ou de plástico. Um ou mais penetradores de tecidos são de preferência construidos de um material com memória de forma. Exemplos de tais materiais com memória de forma incluem, mas não estão limitadas a, ligas de cobre-zinco-alumínio-níquel, ligas de aluminio-cobre-niquel e ligas níquel-titânio (NiTi). Numa forma de realização preferida, o material com memória de forma é nitinol. Numa concretização preferida, quando os penetradores de tecido assumem a configuração sem restrições, as propriedades de memória de forma do material a partir do qual cada um penetrador de tecido é formado leva a que os penetradores de tecido, sem a aplicação de qualquer força de deformação externa, passem de uma posição substancialmente paralela ao eixo longitudinal do dispositivo médico, para uma posição substancialmente perpendicular ao eixo longitudinal do dispositivo médico.

Numa concretização preferida, os penetradores de tecido são mantidos na configuração limitada por um componente exterior do cateter tendo uma configuração tubular que rodeia os penetradores de tecidos. A ligação mecânica é proporcionada entre o componente exterior do cateter e o 143 componente central do cateter aos quais os penetradores de tecido estão associados. A ligação mecânica permite que o componente exterior do cateter seja movido para trás ao longo do comprimento do componente central do cateter, descobrindo assim as restrições de um ou mais penetradores de tecido e permitindo que um ou mais penetradores de tecido assumam uma configuração não coagida em que entram em contacto com o alvo local de entrega. Um perito na técnica apreciará que esta forma de realização especifica pode ser facilmente adaptada para incorporar marcadores rádio-opacos para facilitar o posicionamento das caracteristicas do dispositivo de troca rápida ou para facilitar a utilização do dispositivo. 0 dispositivo médico da presente invenção, nas suas diferentes formas de realização, permite a distribuição de fluidos em camadas distintas de uma parede vascular. A parede vascular consiste em numerosas estruturas e camadas, incluindo a camada endotelial e a camada de membrana basal (colectivamente a camada intima), a lâmina elástica interna, a camada média e a camada adventícia. Estas camadas são dispostas de tal modo que o endotélio está exposto ao lúmen do vaso, e a membrana basal, a intima, a lâmina elástica interna, os meios, e a adventícia estão, cada um sucessivamente em camadas sobre o endotélio, tal como descrito no Pedido de Patente US 2006/0189941A1. Com os dispositivos médicos da presente invenção, a profundidade a que as pontas dos penetradores de tecido 156, 158 podem penetrar o tecido alvo pode ser controlada pela rotação dos controladores 162, 164. Por exemplo, se o alvo é a camada adventícia, a energia limitada dos tubos 114, 116 é libertada, os tubos adoptam as suas configurações não restringidas, curvas, mostradas na Figura 144 28, e as pontas dos penetradores de tecido 156, 158 avançam com os controladores para um comprimento suficiente para a penetração até à profundidade da camada adventícia. Da mesma forma, se a camada de destino é a camada média, a energia limitada dos tubos 114, 116 é libertada, os tubos adoptam as suas configurações não restringidas, curvas, mostradas na Figura 28, e as pontas dos penetradores de tecido 156, 158 avançam com os controladores para um comprimento suficiente para a penetração até à profundidade da camada média.

Com os penetradores de tecido embebidos na camada desejada da parede da conduta biológica, um fluido pode então ser entregue através dos penetradores de tecido 118, 120.

Quando a distribuição do fluido está completa, os controladores 162, 164 podem ser operados para retirar as pontas dos penetradores de tecido 156, 158 de volta para o interior dos furos 152, 154 dos tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116. O tubo de distribuição 122 pode então ser deslocado para a sua posição para a frente, onde a extremidade distai do tubo de implantação 172 move os tubos de apresentação dos penetradores de tecido 114, 116 de volta para as suas posições restritas mostradas na Figura 27. Quando o tubo de implantação 122 foi deslocado para a sua posição de avanço completo mostrado na Figura 27, a montagem pode, então, ser reposicionada ou retirada do corpo. O dispositivo médico da presente invenção também permite a distribuição de fluidos para depósitos de placas no interior da parede da conduta biológica ou dentro da parede da conduta biológica. 145 0 dispositivo médico da presente invenção também permite a distribuição de fluidos para os espaços extracelulares ou tecidos localizados no exterior da parede exterior da conduta biológica (por exemplo, para a superfície exterior de um vaso sanguineo ou músculo posicionado contra a superfície exterior do vazo, tal como o miocárdio).

Uma característica vantajosa dos dispositivos da presente invenção é que os actuadores, em virtude do seu desenho, fazem contacto com menos do que a circunferência completa da parede interna de uma conduta biológica após a sua implantação na mesma. Em concretizações preferidas, os actuadores entram em contacto com menos de 100% da circunferência da parede interna de uma conduta biológica em que estejam implantados. Mais de preferência, os actuadores entram em contacto com menos de 75%, 50% ou 25% da circunferência da parede interna de uma conduta biológica em que estejam implantados. Mais de preferência, os actuadores entram em contacto com menos de 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% ou 0,1% da circunferência da parede interna de uma conduta biológica em que estejam implantados.

Os dispositivos podem ser utilizados para entregar fluidos que compreendem uma variedade de agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico a uma parede de uma conduta biológica. Os agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, proteínas, químicos, pequenas moléculas, células e ácidos nucleicos. Um agente terapêutico entregue pelo dispositivo pode incluir quer uma micropartícuia ou uma nanopartícuia, ser complexado com uma micropartícuia ou uma nanopartícuia, ou ser ligado a uma micropartícuia ou uma nanopartícuia. Agentes de proteínas incluem elastases, agentes anti-proliferativos, e agentes que inibem o vasoespasmo. O uso 146 dos dispositivos para a entrega de uma elastase é especificamente contemplado. Vários pedidos de patente publicados (WO 2001/21574; WO 2004/073504; e WO 2006/036804) ensinam que a elastase, isoladamente e em combinação com outros agentes, é benéfica para o tratamento de doenças das condutas biológicas, incluindo a obstrução das condutas biológicas e O vasoespasmo. Agentes de diagnóstico incluem, mas não estão limitados a, contraste, micropartículas, nanopartículas ou outros agentes de imagem.

Uma variedade de métodos de distribuição de fluidos distintos pode ser praticada com o dispositivo. Em certas aplicações, os fluidos distintos podem ser entregues através de cada penetrador de tecido do dispositivo, quer simultaneamente ou sequencialmente. Em outras aplicações, o mesmo fluido pode ser fornecido através de ambos os penetradores de tecidos, simultaneamente ou sequencialmente. As concretizações e/ou métodos, onde um primeiro fluido é fornecido através de ambos os penetradores de tecido seguido de entrega de um segundo fluido através de ambos os penetradores de tecido também são contemplados.

Os métodos de utilização dos dispositivos para fornecer fluidos para dentro ou através de uma parede de uma conduta biológica são também especificamente contemplados. Estes métodos compreendem os passos de introduzir o dispositivo para a conduta biológico, fazendo avançar o dispositivo para um local alvo no interior da conduta, libertando os actuadores das suas posições de restrição, avançando facultativamente os penetradores de tecido através de lúmens nos actuadores para penetrar até uma profundidade 147 desejada dentro a parede de uma conduta biológica, proporcionando, pelo menos, um fluido para dentro ou através da parede, opcionalmente, retornando os penetradores de tecido de volta para os lúmens dos actuadores, retrair os actuadores para a sua posição restringida, reposicionar o dispositivo na mesma, ou numa conduta diferente para o fornecimento de fluido adicional, se assim o desejar, e remover o dispositivo a partir da conduta.

6. EXEMPLOS

Esta seção descreve os métodos de produção de proteínas de elastase recombinantes do tipo I para uso clínico, por exemplo, como um agente para aumentar o diâmetro dos vasos sanguíneos e, assim, o lúmen dos vasos sanguíneos. A elastase pancreática humana tipo I exibe 89% de identidade de aminoácidos em todo o comprimento da elastase pancreática porcina do tipo I, com conservação total da "tríade catalítica" e especificidade para o substrato de determinação de resíduos. A elastase porcina tipo I é inicialmente sintetizada como uma proenzima enzimaticamente inativa que é ativada por tripsina para se obter a enzima madura, que contém quatro pontes dissulfureto internas e sem glicosilação (veja Shotton, 1970, Methods Enzymol 19:113-140, Elastase; e Hartley e Shotton, 1971, Biochem. J. 124 (2): 289-299, Pancreatic elastase. The Enzymes 3:323-373 e suas referências).

Os exemplos abaixo demonstram o desenvolvimento eficiente e escalável da expressão da elastase recombinante porcina e humana tipo I e esquemas de purificação adequados para a fabricação cGMP destas enzimas para estudos não clínicos e clínicos, e uso farmacêutico comercial. À elastase madura 148 porcina foi dado o nome de PRT-102. À elastase madura humana tipo I foi dado o nome de PRT-201.

6.1 TERMINOLOGIAS E ABREVIAÇÕES

Tal como aqui utilizados, os termos PRT-101, PRT-102, PRT- 201 e pro-PRT-201, significam o seguinte: PRT-101: elastase pancreática porcina. Salvo indicação em contrário, a elastase pancreática porcina empregue nos exemplos é a elastase pancreática porcina altamente purificada comprada em Elastin Products Company, Inc, Owensville, MO, # catálogo EC134. PRT-102: elastase pancreática porcina madura recombinante tipo I. Deve notar-se que os vectores com a designação "pPROTIOl-XXX" codificam PRT-102. PRT-201: elastase pancreática madura humana recombinante tipo I. pró-PRT-201: Forma de proenzima da elastase pancreática humana recombinante tipo I contendo uma sequência de pro-péptido.

As seguintes abreviaturas são utilizadas na secção 6 do pedido: BKGY: complexo de glicerol tamponado BKME: complexo de metanol tamponado CHO: Ovário de hamster chinês E. coli: Escherichia coli ELA-1: elastase pancreática tipo I HEK: rim embrionário humano HeLa-1: ELA-1 humana HIC: cromatografia de interação hidrofóbica MBP: proteína de ligação de maltose 149 pELA-1: ELA-1 porcina P. pastoris: Pichia pastoris PCR: reação em cadeia da polimerase PMSF: fluoreto de fenilmetilsulfonil RP: fase inversa S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae SDS-PAGE: electroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio SEC: cromatografia de exclusão de tamanho USP: United States Pharmacopeia YPDS: extrato de levedura de dextrose de peptona em meio de sorbitol

6.2 EXEMPLO 1: SÍNTESE DE ADN DA ELASTASE A sequência de codificação da elastase humana 1 foi obtida a partir da Patente US 5162205 (Takiguichi et al. 1992). Foram feitas várias alterações na sequência para facilitar a clonagem em vectores de expressão (Figura IA). As alterações de base caem dentro da degenerescência do código genético de modo a que não foram alterados residuos de aminoácidos. Um segundo codão de terminação foi introduzido imediatamente após o codão de terminação nativo para minimizar o potencial de leitura do ribossoma. A sequência de codificação modificada foi sintetizada por Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA) , utilizando uma técnica de "oligo longo" não-PCR sob licença da Amgen (Thousand Oaks, CA) . O ADN recombinante, denominado ELA-1.2A (SEQ ID N°: 81), foi clonado no vector Blue Heron pUC, um derivado de pUC119, e o plasmídeo resultante foi denominado pPROTl. O pPROTl foi sequenciado em ambas as cadeias para confirmar a sequência correta. Dados de sequenciação de alta qualidade com sobreposição extensa de 150 ambas as cadeias permitiram atribuições inequívocas ao longo da sequência inteira, que foi coberta por um minimo de quatro reações de sequenciação com pelo menos uma reação para cada cadeia.

6.3 Exemplo 2: EXPRESSÃO DE PRT-201 EM E. COLI

Uma variedade de estratégias de expressão foi tentada num esforço para obter elastase humana solúvel e enzimaticamente ativa em E. coli.

Um conjunto de vectores de expressão E. coli compreendidas no quadro fusões da elastase pancreática humana tipo I (ELA-1) para o terminal carboxi de uma proteína de ligação à maltose (MBP) , foi por sua vez fundida a um péptido de secreção N-terminal. Ambas as sequências de codificação da ELA-1 madura humana e de proenzima foram clonadas em enquadramento fusões de C-terminal da sequência de codificação de MBP do plasmídeo pMAL-P2G (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) para se obter quer pPR0T3 (ELA madura-1) quer pPR0T5 (proenzima ELA-1). A construção de pPR0T3 foi efectuada obtendo primeiro por mutagénese por PCR de um fragmento de codificação de 6.6 kb de ELA-1 madura humana com um sítio SnaBI no códão N-terminal de valina ELA-1 madura humana e um sítio HindIII localizado em 3'para os códãos de terminação ELA-1 madura. Esta mutagénese de PCR, utilizou um modelo de pPROTl compreendendo a sequência de codificação de ELA-1.2A (SEQ ID N°: 81) e dois iniciadores oligonucleotídicos (5'ATC GTA GTC GGA TAC ACT GGG GAG GCC; SEQ ID N° : 75; e 5' GTC GAC aag ctt ate agt tgg agg cga t, SEQ ID N°: 76). 0 fragmento de PCR de 6,6 kb resultante foi isolado, digerido com SnaBI e HindIII e subsequentemente clonado no vector pMAL-digerido P2G Xmal/Hind III para produzir pPR0T3. A 151 construção de pPR0T3 foi efectuada através da clonagem do fragmento Scal/HindIII de PPR0T1 e ligação ao vector P2G pMAL que tinha sido digerido com SnaBI e HindIII. A fusão resultante operacionalmente liga o N-terminal da proenzima de ELA-1 humana que codifica a região do C-terminal da MBP de pMAL-P2G em pPR0T5. 0 dominio de clivagem da tripsina da pro-proteína ELA-lhumana é preservado em pPR0T5. A estirpe TB 1 de E. coli foi transformada com pPR0T3 e pPR0T5 e, subsequentemente, induzida com IPTG para determinar se a proteina de fusão ou a ELA-1 humana enzimaticamente ativa pode ser produzida. No caso de pPR0T3, toda a proteina de fusão MBP-ELA-1 produzida era insolúvel. Nenhuma das proteínas de fusão MBP-ELA-1 solúveis ou enzimaticamente ativas foi detectada no material periplasmático obtido por choque osmótico de pPR0T3 induzido contendo E. coli. No caso de pPR0T5, baixos niveis de proteina MBP-proELA-1 solúvel recombinante podiam ser detectados no material periplasmático obtido por choque osmótico de pPR0T5induzido contendo E. coli através do uso de SDS-PAGE e coloração com Coomassie, ou por utilização de anticorpos anti-MBP num Western blot (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). A proteina MBP-proELA-1 solúvel recombinante pode ser digerida com tripsina para produzir tanto MBP como ELA-1 madura humana. ELA-1 madura humana obtida por induções de pPR0T5 foi posteriormente analisada para a atividade da elastase com substrato peptideo SLAP. A atividade da elastase foi observada em extractos periplásmicos de pPR0T5. Esta atividade enzimática da elastase estava dependente da ativação da tripsina (ou seja, nenhuma atividade foi observada na ausência de tripsina e a quantidade de atividade é aumentada pelo aumento do período de tempo de ativação da tripsina). Além 152 disso, a actividade da elastase foi dependente de pPR0T5 na medida em que nenhuma atividade foi observada nos extractos de vector de controlo pMAL-P2G tratados em paralelo com tripsina. Finalmente, a atividade da elastase pPR0T5 foi inibida por PMSF (um inibidor de serina-protease conhecido). A proteína de fusão recombinante MBP-proELA-1 foi em seguida purificada e clivada com tripsina para se obter uma ELA-1 madura humana derivada de pPR0T5 enzimaticamente ativa. A proteína de fusão foi primeiro purificada por cromatografia de afinidade com amilose, seguido por eluição com maltose. A MBP-proELA-1 purificada foi em seguida tratada com tripsina imobilizada. Após o passo de ativação da tripsina, a MBP-proELA-1 clivada foi purificada por cromatografia em Sefarose SP catiónica. No entanto, as experiências subsequentes com pPR0T5 purificado por afinidade com ELA-1 madura humana derivada indicaram que apenas quantidades muito limitadas de elastase solúvel e enzimaticamente ativa pode ser obtida a partir de E. coli contendo pPR0T5. Além disso, a atividade específica do pPR0T5 derivado de ELA-1 madura humana por afinidade purificada, foi muito baixa, variando de 0,27-0,38 U/mg (U = micromole de substrato SLAP hidrolisado por minuto).

Uma estratégia alternativa de obtenção de ELA-1 solúvel e enzimaticamente ativa em E. coli também foi prosseguida. Em resumo, foi construído um vector pPROT8 que codifica uma proteína de fusão compreendendo os primeiros oito resíduos de aminoácidos de E. coli, subunidade alfa de lacZ, mais cinco aminoácidos codificados de poli resíduos ligantes seguido pela proenzima ELA-1 N-terminal humana. Este vector foi construído por ligação de um fragmento BamHI/Ncol contendo a ELA-1 humana a partir de sequência de codificação de pPROTl (isto é, um vector contendo a 153 sequência de ELA-1.2A, SEQ ID N° : 81) em pBlueHeron pUC (Blue Heron Biotechnology, Bothell, Washington, EUA), que foi digerido com BamHI/NcoI. A estirpe E. coli EC100 (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) foi transformada com pPR0T8 e, subsequentemente, induzida com IPTG para determinar se a quer a proteína de fusão ou a ELA-1 humana enzimaticamente ativa pode ser produzida. No caso de células transformadas EC100, todos os derivados pPR0T8 da proteína de fusão LacZ-proELA-1 produzida eram insolúveis (isto é, encontrados em corpos de inclusão) . Uma estirpe de E. coli que contêm mutações nos genes trxB e gor (estirpe Origami®, Mirus Takara Bio Inc., Madison, WI) foi subsequentemente transformada com pPR0T8 como as estirpes de E. coli com mutações nessas equências de codificação que são conhecidas promover a recuperação de proteínas recombinantes solúveis e enzimaticamente ativas. Embora alguns pPR0T8 solúveis derivados da proteína de fusão LacZ-proELA-1 na estirpe trxB / gor E. coli tenham sido recuperados após indução com IPTG, não poderiam ser convertidos em ELA-1 humana enzimaticamente ativa com tripsina.

6.4 EXEMPLO 3: EXPRESSÃO DA PRT-201 EM LINHAS CELULARES DE MAMÍFEROS Várias estratégias foram tentadas expressão num esforço para obter elastase pancreática (ELA-1) humana solúvel do tipo I e enzimaticamente ativa em linhas de células de mamíferos. 0 vector de expressão elevada de mamifero pcDNA3.1 (Invitrogen) contendo o promotor CMV foi utilizado como uma estrutura dorsal para dois vectores de expressão elastase ELA-1 humana, pPROT30 e pPR0T31. Para construir o pPROT30, a sequência de uma proenzima de ELA-1 humana foi amplificada por PCR e fundido com uma sequência de sinal de 154 elastase pancreática porcina incorporado no iniciador de PCR. Usando os sitios de restrição incorporados nos iniciadores de PCR, o produto de PCR foi digerido e ligado utilizando os locais de restrição correspondentes do vector pcDNA3.1. 0 pPR0T31 foi construído de uma forma semelhante, excepto em que foi usada a sequência de codificação de ELA- 1 madura humana em vez da sequência de codificação da proenzima numa tentativa de dirigir a expressão da enzima madura. 0 E. coli foi transformado com as reações de ligação e os clones foram selecionados para a seleção miniprep. Um clone para cada vector de expressão foi selecionado com base em padrões de digestão de restrição esperados para o inserto correto. 0 ADN de plasmídeo foi preparado para cada clone e as sequências de codificação do vector de expressão foram confirmadas por sequenciação de ADN.

As linhas de células de mamífero CHO, COS, HEK293 e HEK293T foram transitoriamente transfectadas separadamente com pPROT30 e pPR0T31. Depois de vários dias, os sobrenadantes de cultura de células foram colhidos e analisados para a pro-proteína ELA-1 humana (pPROT30) ou para a expressão da proteína madura (pPR0T31) através de Western blot. Um anticorpo policlonal de elastase pancreática anti-porcina reagiu de forma cruzada com uma banda do peso molecular esperado para a pro-proteína de ELA-1 humana em sobrenadantes de pPROT30 e para a proteína ELA-1 madura humana em sobrenadantes de pPR0T31.

Os sobrenadantes de pPROT30 e pPR0T31 foram analisados para a atividade de elastase por ensaio SLAP. Para o pPROT30, os sobrenadantes foram primeiro tratados com tripsina para converter a proenzima em PRT-201 madura. Nenhuma atividade de elastase foi detectada em nenhum dos sobrenadantes para qualquer vector utilizando o ensaio SLAP.

6.5 Exemplo 4: EXPRESSÃO DE TRIPSINA-ACTIVATED PRT-201 EM

P. PASTORIS 0 vector para a expressão segregada de P. pastoris, PV-1, foi sintetizado por Blue Heron e usado para, primeiro, clonar a sequência de codificação de ELA-1 humana do tipo selvagem. 0 vector PV-1 foi projetado para a clonagem simples, seleção e expressão de alto nivel da proteina recombinante. 0 vector contém o gene de resistência Zeocin® para a seleção direta de integrantes multi-cópia. A fusão do N-terminal do pró-péptido de elastase a uma sequência do tipo de acasalamento de levedura-α que compreende a secreção de sinal de levedura, pro-péptido e sequências espaçadoras como mostrado na Figura 1B permite a secreção da proteina expressa no meio de cultura. A pro-proteina de elastase secretada pode ser facilmente separada do sedimento de células, um primeiro passo importante para a purificação. Além disso, a forma da proenzima de ELA-1 humana contendo o sitio de clivagem da tripsina foi selecionada para expressão para evitar expressar diretamente a enzima madura, ativada, o que pode levar ao enrolamento proteico incorreto ou toxicidade para as células que expressam a enzima recombinante. A clonagem da construção de expressão pPROT24-V para dirigir a expressão da proenzima de ELA-1 foi realizada como se segue. A região de codificação de ELA-1 humana (SEQ ID N°: 81) foi amplificada a partir de Blue Heron pUC ELA-1 por PCR (Expand High Fidelity PCR System, Roche, Indianapolis, Ind.). 0 iniciador direto 20F incorporado um sitio Xhol (5'— ggctcgagaaaagagaggctgaagctactcaggaccttccggaaaccaatgcccgg-3, SEQ ID N°: 35) . 0 iniciador 24R incorporou um sitio SacII (5'-gggccgcggcttatcagttggaggcgatgacat-3', SEQ ID N°: 36). 0 produto de PCR resultante foi purificado em gel e clonado 156 em pCR2.1-T0P0 (Invitrogen). A sequência codificadora de ELA-1 foi isolada utilizando Xhol e SacII, purificada em gel, e clonada no vector PV-1 nesses sitios para render PPROT24-V (Figura 3). 0 produto ligado pPROT24-V foi amplificado em estirpe de E. coli TOPIO. A mistura de células foi plaqueada em placas de LB suplementadas com pouco sal 25 microgramas/ml de zeocina. 0 plasmideo de ADN foi preparado (Qiagen, Valência, CA) e o inserto de ELA-1 humana foi identificado por digestão de restrição. A sequência de codificação pPROT24 foi verificada por sequenciação de ambas as cadeias de ADN maxiprep purificada com várias reações sobrepostas. Dados de sequenciamento de alta qualidade permitiram atribuições de base inequivocas e confirmaram a sequência de codificação correta. Doses de glicerol pPROT24-V/TOP10 foram feitas e armazenadas a -80°C. A estirpe de P. pastoris NRRL Y-11430 do tipo selvagem obtida no Departamento de Agricultura dos EUA (USDA, Peoria, Illinois, EUA) foi utilizada para a transformação. 0 plasmideo de ADN a partir de pPROT24-V foi linearizado com Saci e a digestão completa foi confirmado pela execução de uma pequena alíquota da reação num gel de agarose. A electroporação foi usada para transformar P. pastoris com o plasmideo de ADN pPROT24-V. Misturas de células foram semeadas em placas de YPDS contendo 100 microgramas/ml de zeocina. Após três dias, as colónias começaram a formar-se e foram selecionadas ao longo de vários dias mais para a re-estriação em placas frescas.

Em geral, os transformantes resistentes a fármacos foram rastreados para a expressão num frasco em balão de 1 L. Uma única colónia foi utilizada para inocular 200 mL de meio de BKGY. A composição da solução de BKGY foi a seguinte: 10 157 g/L de glicerol, 13,4 g/1 de base azotada de levedura com sulfato de amónio e sem aminoácidos (Invitrogen) , 20 g/L de peptona de soja, 10 g/L de extracto de levedura, 0,4 mg/L de biotina em tampão de 0,1 M de fosfato de potássio (pH 5,0). A cultura foi cultivada durante dois dias, a 28°C, com agitação a 275 rpm. As culturas foram sedimentadas por centrifugação a 650 x g durante 10 min à temperatura ambiente. As pelotas de células foram ressuspensas com meio de indução BKME, pH 5,0, por ressuspensão das pelotas a uma razão de 1 g de células húmidas para 5 mL de meio de indução. Uma suspensão de células de 50 ml foi colocada num frasco de não-vortex de 500 mL para obter uma proporção de 1:10 de suspensão de células por volume do frasco. As células foram incubadas a 22 °C com agitação a 275 rpm durante 1-3 dias. O metanol no meio de indução foi reabastecido a uma concentração final de 0,5%, duas vezes por dia ao longo de indução.

Para o rastreio para a expressão, foram tomadas aliquotas de 1 ml, transferidas para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugadas durante 5 minutos a 20000 x g numa microcentrífuga. Os sobrenadantes foram transferidos para tubos frescos e armazenados a -80°C. Para a análise de SDS-PAGE, foram descongeladas aliquotas do sobrenadante e misturadas com tampão Laemmli 4 X suplementado com 5% em volume, com o agente de redução de beta-mercaptoetanol. As amostras foram fervidas durante 5 min, centrifugadas suavemente, e carregadas num gradiente de Tris-HCl de gel pré-fundido de 8-16% num sistema de electroforese Criterion (Bio-Rad) . Após a electrof orese, o gel foi corado com Coomassie e analisado quanto à expressão de proenzima de ELA-1 humana. O clone 201-24-266-VU foi selecionado como um clone de alto rendimento para uma avaliação mais aprofundada. Um banco de células de desenvolvimento 158 consistindo em doses de glicerol 201-24-266-VU foi preparado e armazenado a -80°C.

Para a produção em massa de proenzima ELA-1 humana usando o clone 201-24-266-VU, vários ciclos de produção foram realizadas, que geralmente seguiram os métodos descritos a seguir. Onde são aplicáveis, foram anotadas variações nos métodos.

Para a cultura de células, uma série de frascos de agitação de 2 L (tipicamente variando de 20 a 40 frascos) contendo 500 mL de meio de crescimento BKGY foram inoculados com 250 microlitros de stock de glicerol 201-24-266-UV descongelado. As culturas foram cultivadas a 28°C durante 2 dias numa incubadora com agitação a 250-300 rpm. Após 2 dias, as células foram sedimentadas por centrifugação e o sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspensas em meio de indução BKME, pH 5,0, numa proporção de 1 g de peso de células para 5 mL de meio. Um volume de 200-400 mL de suspensão de células foi colocado em frascos não-refletores de 2 L e cultivado durante 3 dias numa incubadora com agitação (250-300 rpm), a 22°C. O metanol nos meios foi reabastecido com o volume de 0,5%, duas vezes ao dia durante o curso da indução. No final da indução, as culturas em frascos de agitação foram centrifugadas para sedimentar as células. O sobrenadante foi removido e imediatamente filtrado a temperatura ambiente através de uma membrana de polietersulfona de 0,22 um utilizando unidades de filtração de vácuo de 1 L para remover quaisquer resíduos celulares restantes. O filtrado foi armazenado a 2-8°C durante até 1,5 meses. Com base na análise de HIC-HPLC, o rendimento da proenzima de ELA-1 humana a partir do clone pró-PRT-201-24-266-VU no sobrenadante clarificado foi tipicamente de 200 a 250 mg/L. 159 A captura de pró-PRT-201-24-266-VU a partir do sobrenadante foi realizada da seguinte forma. Em primeiro lugar, o sobrenadante de múltiplos ciclos de culturas em balão de agitação (tipicamente 4-10 voltas) foi combinado (tipicamente 8 a 25 L no total) , diluido oito vezes com água e ajustado para pH 5,0 com 1 M de HC1. O sobrenadante diluido foi então carregado um volume de leito equilibrado de 2 L em coluna de captura de permuta iónica Macro-Prep S High a 2-8°C a uma taxa de 100 mL/min (velocidade linear de fluxo 76 cm/h). O programa de cromatografia compreende os seguintes passos: 1. Lavar a coluna com 10 L (5 volumes de coluna [CV] ) de tampão A (20 mM de citrato de sódio, pH 5,0.) a 100 mL/min (76 cm/h); 2. Lavar a coluna com 4 L (2 CV) de uma mistura de 90% tampão A e 10% de tampão B (500 mM de cloreto de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0) para uma composição final de tampão de 50 mM de cloreto de sódio; 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0 a 100 ml/min (76 cm/h); 3. Lavar a coluna com 6 L (3 CV) de uma mistura de 8 0% tampão A e 2 0% tampão B para uma composição de tampão final de 100 mM de cloreto de sódio; 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0 a 100 ml/min (76 cm/h); 4. Lavar a coluna com 6 L (3 CV) de um gradiente linear, a partir de 75% de tampão A e 25% de tampão B para 68% de tampão A e 32% de tampão B, em 100 mL/min (153 cm/h); 5. Eluir com um gradiente linear de 30 litros (15 CV) , a partir de 68% de tampão A e 32% de tampão B a 0% de tampão A e 100% de tampão B, em 100 ml/min (76 cm/h) . O eluido foi recolhido em fracções de 500-1000 mL cada.

Normalmente, as duas espécies proteicas predominantes foram observadas por SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie: a proenzima glicosilada ELA-1 humana e a proenzima não-glicosilada de ELA-1 humana, conforme determinado por análise LC/MS subsequente, tipicamente 160 eluindo cerca de 320 mM de cloreto de sódio, mostrado na Figura 4. Em algumas execuções de produção foi observada uma proteina ligeiramente mais pequena do que a proenzima ELA-1 humana como uma espécie menor. A análise LC/MS subsequente destas fracções revelou que a maioria da proteina não era uma proenzima de comprimento completo, mas em vez disso tinha falta de vários aminoácidos no N-terminal. Estas variantes N-terminais foram purificadas e submetidas a análise de atividade de elastase, que revelou que tinham atividade de elastase inferior à PRT-201 de comprimento completo. As variantes N-terminal poderiam surgir a partir da proenzima ELA-1 humana exibindo um baixo nivel de atividade de elastase durante a cultura celular e as operações de cromatografia de captura e quer clivando-se através de uma reação intramolecular ou clivagem de outra molécula de proenzima ELA-1 humana através de uma reação intermolecular. Condições de clivagem sub-óptima durante estas operações podem conduzir a um elevado nivel de clivagem imprecisa da proenzima (por vezes referido como conversão espontânea ou não controlada), resultando em mais variantes N-terminais, em vez PRT-201 intacta, de comprimento completo.

Após a inspeção dos resultados de SDS-PAGE, um subconjunto das frações foi agrupada para obter pró-PRT-201 purificada, não glicosilada para processamento posterior. As fracções que continham proenzima glicosilada ou PRT-201 completa e/ou variantes N-terminais (que co-migram em SDS-PAGE) foram normalmente excluídas da conjugação. O agrupamento de pró-PRT-201 foi tipicamente armazenado num copo de plástico de 5 L a 2-8°C durante várias horas a durante a noite antes da conversão da proenzima para uma enzima madura. A conversão de pró-PRT-201 para PRT-201 madura por tripsina imobilizada foi efetuada da seguinte forma. As fracções 161 combinadas de pró-PRT-201 foram dialisadas em 20 mM de fosfato de sódio, pH 5,0, durante a noite a 2-8°C. Esta etapa prevê a remoção do citrato, que inibe a tripsina. Após a diálise, o pró-PRT-201 foi passado através de uma coluna de tripsina recombinante (TrypZean) imobilizado em esferas de agarose pré-equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, pH 5,0. Tipicamente, o tempo de contacto entre o pró-PRT-201 e a TrypZean imobilizada foi de entre 3,5 a 5 minutos. O material pós-conversão resultante foi analisado por SDS-PAGE para confirmar a conversão e subsequentemente carregado numa coluna de polimento Macro-Prep S High. A coluna foi lavada sequencialmente com 5 CV de 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0, 2 CV de 20 mM de citrato de sódio, 50 mM de cloreto de sódio, pH 5,0; e 3 CV de 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, pH 5,0. A coluna foi ainda lavada com um gradiente linear de 125 mM de cloreto de sódio para 160 mM de cloreto de sódio em 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0. O PRT-201 foi eluido com um gradiente linear a partir de 165 mM a 500 mM de cloreto de sódio em 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0 e recolhido em fracções. As fracções foram analisadas para a proteína por SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie e ensaio de atividade de elastase por SLAP. Normalmente, as fracções que têm uma atividade específica de 90% ou maior do que a da fracção com a atividade específica mais elevada foram reunidas. Na análise por LC/MS subsequente, as fracções de eluição tardia que têm atividade específica inferior foram encontradas para ser enriquecidas em variantes N-terminais de PRT-201.

Fracções agrupadas com elevada atividade específica foram diafiltradas em tampão de formulação composto de 0,1 x de PBS (13,7 mM de cloreto de sódio, 1 mM de fosfato de sódio, 0,27 mM de fosfato de potássio) a pH 5,0. Após a 162 concentração da PRT-201 a 1 mg/mL, o pH foi ajustado para 7,4. A solução foi, em seguida, separada em alíquotas para frascos de soro de vidro com uma rolha de elastómero, e liofilizadas. A liofilização foi realizada normalmente com um ciclo de secagem primária a -30 a -50°C e um ciclo de secagem secundária a -15°C. Após a liofilização, os frascos foram rolhados sob vácuo e cravados com um selo de aluminio. Os frascos foram, em seguida, tipicamente armazenados a 2-8°C ou 80°C.

Para avaliar a estabilidade do PRT-201 liofilizado em frascos, dois lotes que foram fabricados em medicamento estéril GMP foram colocadas num programa de estabilidade. 0 programa de estabilidade consiste em armazenamento do medicamento a -15°C e remoção periódica de um subconjunto de frascos para análise pela estabilidade indicando os métodos analíticos seguintes (as especificações estão entre parêntesis): aparecimento de material liofilizado (pó branco a esbranquiçado) , aspecto após a reconstituição (solução límpida, incolor, livre de partículas), atividade específica por ensaio SLAP (25-45 U/mg), pureza por RP-HPLC (pureza total: não inferior a 93%; impureza individual: não mais do que 2%) , pureza pela redução de SDS-PAGE (não inferior a 93%), pureza por SDS-PAGE não-reduzida (não inferior a 93%), injeções de partículas em conformidade (USP), agregados por SEC-HPLC (não mais do que 3%), conteúdo em cada frasco (4,5-5,5 mg), pH (6,5-8,5), humidade (não exceder 5%) e esterilidade (de acordo com USP). Até ao momento, ambos os lotes têm cumprido as especificações indicadas em todos os tempos testados (lote C0807117 por 12 meses e lote C1007132 por 9 meses) . Estes resultados indicam que a PRT-201 é estável durante pelo menos 12 meses quando armazenada em frascos liofilizados a -15°C. 163 0 uso de citrato de sódio, pH 5,0, durante tanta a cromatografia de captura de pró-PRT-201 e a cromatografia de polimento de PRT-201 convertido foi baseado nos dados que mostram que o citrato de sódio inibiu a atividade de elastase PRT-201 purificado e, portanto, pode também inibir a atividade da elastase de pró-PRT-201 e PRT-201 durante as operações de processamento. Tal inibição pode minimizar a conversão espontânea de pró-PRT-201 e variantes N-terminais e minimizar a auto-degradação do PRT-201. Numa experiência onde o tampão de ensaio SLAP continha 115 mM de citrato de sódio, pH 5,0, a atividade especifica de PRT-201 foi inibida em 91%.

Eventualmente, o material eluído a partir da coluna de captura de pró-PRT-201 não foi submetido a conversão pela tripsina, tal como descrito acima, mas em vez disso utilizado para obter preparações enriquecidas em várias espécies de proteina. Por exemplo, grupos de fracções contendo principalmente pró-PRT-201glicosilada, pró-PRT-201 não-glicosilada ou proteínas resultantes da conversão espontânea foram feitos a partir do fluido da coluna de captura. Tipicamente, estes conjuntos de fracções foram diafiltrados em 10 mM de fosfato de sódio, pH 5,0, liofilizados, e armazenados a -80°C.

Foi realizado um estudo para determinar o efeito do pH e da temperatura sobre a estabilidade do pro-PRT-201 purificado ao longo do tempo. pró-PRT-201 liofilizado foi reconstituído em 10 mM de fosfato de sódio a pH variando entre 3,0 e 8,4, seguido de incubação a 4°C ou 25°C, durante 7 dias. Após 7 dias, as amostras de pró--PRT 201 sob condições de pH 4,0-8,0 e 25°C mostraram um enriquecimento em PRT-201 madura, que aumentou com o aumento do pH, como mostrado por SDS-PAGE e coloração com Coomassie. Sob as condições de pH 8,4 e 25°C, a conversão 164 completa do pró-PRT-201 para PRT-201 madura foi observada. As amostras a 4°C, a partir de pH 4,0 a 8,4 mostraram pouca ou nenhuma conversão. A pH 3,0, não foi observada conversão tanto a 4°C como a 25°C. Tem sido relatado na literatura (Hartley e Shotton, 1971, Pancreatic elastase. Enzymes 3:323-373) que a elastase pancreática porcina é irreversivelmente inativada após armazenagem prolongada a pH inferior a 3,0. Assim, com base nestes resultados deste estudo, e para evitar a inativação irreversível de PRT-201, as condições úteis para minimizar a conversão de pró-PRT-201 purificado são armazenagem a 4°C entre pH 3,0-4,0.

6.6 EXEMPLO 5: EXPRESSÃO DE PRT-201 AUTO - AT IVADA EM P. PASTORIS

Para obter uma proenzima variante capaz de auto-ativação, eliminando assim a necessidade de ativação por tripsina, foram construídos e analisados uma variedade de vectores de clivagem de variantes de domínios de elastase em experiências de cultura e transformação em pequena escala. Os vectores variantes foram criados por PCR de mutagénese sítio dirigida do vector pPROT24-V e vectores derivados posteriores. A mutagénese sítio dirigida foi realizada utilizando polimerase de ADN Pfu Turbo (Stratagene). A estirpe de E. coli XLIO-Gold foi transformada com os plasmídeos resultantes. As misturas de células transformadas foram semeadas em placas de LB suplementadas com pouco sal 25 microgramas/ml de zeocina. Os clones resistentes a fármacos foram repicados e foi preparado o ADN do plasmideo (Qiagen, Valência, CA) . Os clones foram confirmados para as mudanças de códão esperadas pelo sequenciamento de ambas as estirpes de plasmideo de ADN na região de pro-péptido com múltiplas reações sobrepostas. P. 165 pastoris foi transformada com os vectores de variantes e os clones foram selecionados como descrito no Exemplo anterior.

Um sumário das variantes do dominio de clivagem de elastase que foram criadas são apresentados na Tabela 4 a seguir:

Tabela 4: Variantes de dominio de clivagem de elastase

Cleaved bond Pro- peptide sequence name P5 P4 P3 P2 PI P’l P’2 P’3 24 Glu Thr Asn Ala Arg Vai Vai Gly 40 Glu Thr Ala Ala Alá. Vai Vai Gly 41 Glu Thr Asn Ala Ala Aht Vai Gly 42 Glu Thr Asn Ala ' Ala Vai Vai Gly 43 Glu Thr Asn Ala Pn> Vai Vai Gly 44 Glu Thr ®r Ala m" Vai Gly 45 Glu Thr Vál HM m Vai Vai Gly 46 Glu Thr Ala \ ϊΐίβιι ow Vai Vai Gly 47 Glu Thr Asn Ctfy Vai Vai Gly 48 Glu Thr Asn Ala 'i Vai Vai Gly 49 Glu Thr Asn Hts Ala i Vai Vai Gly 52 Glu Thr Lys : S Ala Vai Vai Gly 53 Glu Thr m. IÉ· Vai Vai Gly 54 Glu ...íSI Asn I1ÉI1 mmm Vai Vai Gly 55 Bk ‘ Thr Asn .....Pm ,Ala, ] Vai Vai Gly 56 Thr Híè Ala : Vai Vai Gly 57 liipti Thr Asn 1*m Ala Vai Vai Gly 58 • tíis "·' Thr m'" Vai Vai Gly 59 GJit Thr ItÉÉIS ... Pn? Ai» ! Vai Vai Gly 60 His Thr ft» : Vai Vai Gly 61 llÉsili Thr mÈM Ala ! Vai Vai Gly 62 ....Hn Thr Lmtl·. Pm Aía i Vai Vai Gly 63 ilIMI Thr i· Àla i Vai Vai Gly

Para a Tabela 4, acima, a primeira coluna listando o "Nome da Sequência de Pro-Peptideo" corresponde a SEQ ID N° para o dominio de clivagem de elastase indicado. Assim, o 24 corresponde ao dominio de clivagem de tripsina de tipo selvagem da SEQ ID N°: 24. Os números 40-49, 52-63 166 correspondem, respectivamente, a variante de domínios de clivagem da elastase das ID SEQ N°s: 40-49, e 52-63.

Para a cultura dos clones variantes, as condições de cultura do frasco agitador desenvolvidos para o clone 201-24-266-VU de tripsina ativada descrito no Exemplo anterior foram geralmente seguidas. Foram testados vários métodos de converter as pro-proteínas variantes segregadas no sobrenadante do balão agitador para PRT-201 madura. A primeira estratégia de conversão constituída por cromatografia para purificar, primeiro, a proenzima variante, seguido por clivagem controlada num tampão de conversão específica. Uma vez que as mudanças de aminoácidos nas variantes de pro-proteínas resultaram em apenas pequenas alterações nos pontos isoeléctricos teóricos em comparação com a proenzima do tipo selvagem, a cromatografia de permuta catiónica foi realizada geralmente como descrito no Exemplo anterior. Os sobrenadantes das culturas de variantes do clone foram preparados por cromatografia, quer por diluição com água, em geral tal como descrito no Exemplo anterior, ou por concentração, seguido por diafiltração do sobrenadante usando filtração de fluxo tangencial para o tampão de carregamento de coluna. Após purificação cromatográfica, as fracções eluídas foram analisadas por SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie. A análise do gel demonstrou uma maior quantidade de conversão de proteína madura para pro-proteína nas fracções em comparação com o sobrenadante de partida, indicando que uma quantidade considerável de conversão espontânea da pró-proteína tinha ocorrido. Após subsequente purificação, a proteína convertida espontaneamente foi determinada por LC/MS para consistir principalmente em variantes N-terminais, que foram 167 mostradas ter pouca ou nenhuma atividade da elastase no ensaio SLAP. A segunda estratégia de conversão consistiu em converter o pró-proteina variante antes da purificação a partir do sobrenadante da cultura, seguido de purificação cromatográfica da enzima madura. Esta estratégia de conversão foi primeiramente testada num ensaio em pequena escala e, subsequentemente, expandida para acomodar volumes de conversão maiores. Para a conversão em pequena escala, o sobrenadante clarificado a partir de culturas de clone variantes foi tipicamente concentrado cinco vezes por centrifugação a 2-8°C num dispositivo de filtro ultracentrifugal. Depois da concentração, o retido foi diluido 5 vezes com tampão de Tris a uma concentração final de 100 mM de Tris-HCl tipicamente numa gama de pH de 8,0 a 9,0. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente numa plataforma de agitação. A atividade da elastase foi monitorizada pelo ensaio SLAP, tipicamente até que a velocidade de atividade de reação atingiu um patamar. Em alguns casos, a velocidade de reação aumentou tão lentamente que a monitorização SLAP foi interrompida antes que um patamar tinha sido alcançado. As amostras convertidas foram analisadas para espécies de proteínas (por exemplo, pró-proteína e PRT-201/variantes N-terminal) por SDS-PAGE. Para ampliar esta estratégia de conversão, o sobrenadante contendo a pro-proteína variante foi concentrado 10 vezes utilizando filtração de fluxo tangencial seguida de diafiltração com 100 mM de Tris-HCl, pH variando em 6,0-9,0. O progresso da reação de conversão foi monitorizado ao longo do tempo por meio de análise de HIC-HPLC no qual a pró-proteína, PRT-201, e as espécies de variantes N-terminais foram quantificadas. Quando o pH do 168 tampão de diafiltração foi de entre 8,0 e 9,0 foram verificadas geralmente maiores taxas de conversão.

As pro-proteinas de elastase listadas na Tabela 5 foram expressas em P. pastoris, tal como descrito e testadas quanto à sua capacidade de se submeter a auto-conversão em ensaios de conversão em pequena escala, como descrito na segunda estratégia de conversão acima. Os resultados desses estudos estão resumidos na Tabela 5 abaixo:

Tabela 5: Resultados de expressão de pro-proteinas de elastase em P. pastoris

Nome da sequência de pro-péptido Rendimento do frasco de agitação Estabilidade do frasco de agitação Taxa de conversão 5 de variantes N-terminais Tripsina usada no processamento 24 Alta Alta Rápida 20% Sim 40 Nenhuma NA NA NA Não 41 Intermédia Alta Lenta Não testado Não 42 Baixa Baixa Intermédia 25% Não 43 Intermédia Alta Lenta Não testado Não 44 Intermédia- alta Alta Não detectada NA Não 45 Intermédia Alta Não detectada NA Não 169

Nome da sequência de pro-péptido Rendimento do frasco de agitação Estabilidade do frasco de agitação Taxa de conversão 5 de variantes N-terminais Tripsina usada no processamento 46 Intermédia Alta Não detectada NA Não 47 Intermédia Alta Não detectada NA Não 48 Intermédia Baixa Rápida 15% Não 49 Alta Alta Lenta 35% Não 52 Intermédia Baixa Rápida Não testado Não 53 Intermédia Intermédia Rápida 25% Não 54 Intermédia Baixa Rápida Não testado Não 55 Intermédia- alta Intermédia Rápida 15% Não 56 Baixa Baixa Não testado Não testado Não 57 Baixa Baixa Não testado Não testado Não 58 Intermédia- alta Intermédia Lenta Não testado Não 170

Nome da sequência de pro-péptido Rendimento do frasco de agitação Estabilidade do frasco de agitação Taxa de conversão 5 de variantes N-terminais Tripsina usada no processamento 59 Intermédia- alta Intermédia Lenta Não testado Não 60 Intermédia- alta Alta Lenta Não testado Não 61 Nenhuma NA NA NA Não 62 Alta Alta Não detectado NA Não 63 Nenhuma NA NA NA Não

Na Tabela 5 acima, a primeira coluna listando o "Nome da Sequência de Pro-Peptídeo" coluna corresponde à SEQ ID N° para o dominio de clivagem de elastase indicado. Assim, o 24 corresponde ao dominio de clivagem de elastase ativada por tripsina de tipo selvagem da SEQ ID N°: 24. Os números 40-49, e 52-63, respectivamente, correspondem aos dominios de clivagem das variantes de elastase das ID SEQ N°s: 40-49, e 52-63. A coluna designada "Rendimento do frasco de agitração" corresponde ao valor do correspondente pró-proteína no sobrenadante de cultura ao longo de 3 dias de indução tal como determinado por análise de SDS-PAGE. A coluna designada "Estabilidade do frasco agitador" corresponde à estabilidade da pro-proteína correspondente no sobrenadante do meio de cultura do frasco agitador 171 durante 3 dias de indução tal como determinado pela quantidade de PRT-201/variantes N-terminais visto na análise de SDS-PAGE. A coluna designada "Taxa de conversão" corresponde à taxa relativa de conversão da pró-proteina para PRT-201, conforme indicado pelo tempo para atingir a velocidade máxima de reação SLAP (Rápida: menos de 60 minutos; Intermédia: 60 a 120 minutos, e lenta: superior a 120 minutos). Os cursos de tempo de conversão das variantes de pro-proteinas foram determinados utilizando o ensaio de conversão de pequena escala, descrito acima, e em comparação com o curso do tempo de conversão da pro-proteina 24 determinado por ativação utilizando tripsina imobilizada. A coluna designada "% Variantes N-terminais" refere-se à percentagem de proteínas convertidas que compuseram variantes N-terminais da proteina de elastase madura (isto é, as variantes que compreendem a clivagem da ligação C-terminal de qualquer outro local diferente de Pl). Para ilustrar os sistemas de classificação relativos utilizadas na Tabela 5, os exemplos de SDS-PAGE, taxa de conversão e de análises de variantes N-terminais de um subconjunto de variantes auto-ativadas são mostrados na Figura 5.

A análise das diferentes variantes revelou que as pro-proteinas de elastase compreendendo quer a variante de dominio de clivagem de elastase da SEQ ID N°: 48 ou da SEQ ID N°: 55 forneciam elastases auto-ativadas com qualidades superiores, incluindo rendimentos do frasco agitador de intermédios a altos e baixas percentagens de variantes após a conversão. Uma análise mais aprofundada das pro-proteinas de elastase compreendendo quer a variante do dominio de clivagem de elastase da SEQ ID N°: 48 e da SEQ ID N°: 55 revelou que a auto-ativação das pro-proteinas correspondentes (isto é, as proenzimas de elastase da SEQ 172 ID N°: 64 e SEQ ID N°: 69, respectivamente) produziu apenas uma classe de variante N-terminal com uma clivagem na ligação peptidica C-terminal para o resíduo P'2. Uma análise mais aprofundada das pro-proteínas de elastase revelou que a pró-proteína compreendendo a variante do domínio de clivagem da elastase da SEQ ID N°: 55 foi mais estável que a pro-proteína que compreende a variante do domínio de clivagem da elastase da SEQ ID N°: 48.

As experiências iniciais para optimizar as condições para a clivagem controlada de pró-PRT-201 purificado foram realizadas utilizando a pró-proteína com a sequência de pró-péptido 42 (SEQ ID N°: 6). Esta pro-proteína purificada foi submetida a conversão numa matriz de condições, incluindo o pH (7,7-8,9), a composição de tampão (0,4-10 mM de citrato de sódio), a concentração da proteína (0,14-0,23 mg/mL) , e o tempo de reação (5 a 24 horas) . No final do período de conversão, as reações foram extintas através da adição de ácido fórmico de modo a reduzir o pH para 3,0. As quantidades relativas de espécies de proteínas em cada reação foram determinadas por espectrometria de massa. Com base nestes resultados, as condições de conversão que resultaram em menor percentagem de variantes N-terminais incluíam um pH de 8,3, uma composição de tampão de 100 mM de Tris e citrato de sódio inferior a 1 mM, uma concentração de proteína de 0,2 mg/mL, e um tempo de reação de 5 a 24 horas. Neste estudo, apenas os pontos finais da reação foram analisados. Assim, os dados em tempo real sobre a qualidade da conversão não foram obtidos, e o resultado final pode ter reflectido tanto a produção inicial de variantes N-terminais e uma quantidade substancial de tempo para essas variantes se terem degradado. Subsequentemente, um ensaio de HIC-HPLC foi desenvolvido para permitir a monitorização em tempo real da 173 reação de conversão. Outros estudos de optimização de conversão, incluindo aqueles que utilizam o controlo de HIC-HPLC em tempo real, são descritos no Exemplo 6.

6.7 EXEMPLO 6: EXPRESSÃO DE PRT-201 AUTO-ATIVADO EM P. PASTORIS USANDO UMA. VARIANTE DE VECTOR MULTICÓPIA A integração multicópia de genes recombinantes em P. pastoris tem sido utilizada para aumentar a expressão da proteína desejada (ver, por exemplo, Sreekrishna et al, 1989, Biochemistry 28:4117-4125; Clare et al, 1991, Bio/ Technology 9:455-460; Romanos et al, 1991, Vaccine 9:901-906) . No entanto, em certos casos, os níveis de expressão obtidos a partir de integrantes de vectores de cópia única foram eficientes e não foram melhorados pelos vectores integrantes de multicópia (Cregg et al., 1987, Bio/ Technology 5:479-485). Eventos de integração do plasmídeo multicópia espontâneos ocorrem in vivo, a uma baixa frequência em P. pastoris. Para obter a integração genómica de múltiplas cópias de um gene e possivelmente aumentar a expressão de proteínas, um método de ligação in vitro pode ser utilizado para produzir insertos em tandem do gene num vector de expressão, seguido pela transformação de P. pastoris.

Para obter um integrante multicópia da variante pPROT55-V, foi usado um método de ligação in vitro para construir um vector contendo múltiplas cópias de pPROT55-V que foi subsequentemente utilizado para a transformação de P. pastoris. Para fazer o vector multicópia, o vector pPROT55-V foi digerido com BglII e BamHI para libertar a cassete de expressão de 2,3 kb que codifica o gene pró-PRT-201, o promotor A0X1, e a sequência de terminação da transcrição de AOX1. A cassete de expressão foi então ligada com uma preparação do vector pPROT55-V que tinha sido linearizado 174 com BamHI e tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitelo (New England Biolabs, Massachussets, EUA), para evitar a auto-ligação. A mistura de ligação foi incubada durante a noite a 16°C. A estirpe de E. coli TOP 10 (Invitrogen, Califórnia, EUA) foi transformada com a reação de ligação. A mistura de transformação foi plaqueada em LB com grandes quantidades de sal, na presença de 25 microgramas/mL de zeocina. Os transformantes resistentes a fármacos foram repicados e o ADN do plasmídeo foi preparado.

Para determinar o número de cassetes de expressão nos clones resultantes, o ADN do plasmideo foi digerido com BglII e BamHI e analisado por electrof orese em gel de agarose com um marcador padrão de tamanho de ADN. Um clone contendo uma inserção de banda única com o tamanho definido de acordo com três cassetes de expressão de 2,3 kb foi identificado e designado por pPROT55M3-V. O mapeamento com enzimas de restrição foi usado para confirmar a orientação de formação de multímeros lineares cabeça-a-cauda para o vector pPROT55M3-V. A Figura 6 ilustra o esquema de clonagem de pPROT55M3-V. A estirpe de P. Pastoril de tipo selvagem NRRL Y-11430 foi utilizada para a transformação, a qual foi realizada conforme descrito no Exemplo 4 com a exceção de que o vector pPROT55M3-V foi linearizado com BglII em vez de Saci antes da transformação. Os transformantes resistentes a fármacos foram cultivadas e testadas para a expressão da pro-proteina pPROT55M3 como descrito no Exemplo 4. A otimização das condições de cultura do frasco agitador foi realizada para minimizar a clivagem espontânea durante a indução. A otimização do frasco agitador focou-se em duas variáveis, temperatura e composição do meio de indução. Em 175 primeiro lugar, verificou-se que a realização de indução a 22°C em comparação com 25°C resultava numa proporção maior de proenzima para a enzima madura no sobrenadante da cultura para todas as composições de meio testadas. Em segundo lugar, a adição de citrato de sódio, para aumentar a força de tampão dos meios de indução resultou na ausência de enzima madura convertida espontaneamente no sobrenadante da cultura em todas as concentrações de citrato de sódio testadas (12,5 a 50 mm). Os efeitos destas variáveis na produção de pró-proteina de expressão e estabilidade do sobrenadante em frasco agitador ao longo do tempo estão ilustradas na Figura 7. A alta-expressão das três cópias do clone 201-55M3-003-VU foi selecionada para análise de fermentação em larga escala utilizando os procedimentos de fermentação estabelecidos para o clone 201-55-001-VU descritos como se segue. A fermentação do clone 201-55-001-VU foi efectuada por descongelação de um frasco de banco de células e usando-o para inocular um frasco agitador contendo 500 ml de meio de crescimento BKGY a pH 5,7. A cultura de semente foi cultivada durante 24 horas com agitação a 28°C até que o peso de células húmidas foi de aproximadamente 4 0 g/L. O fermentador contendo o meio de crescimento BKGY a pH 5,7 foi esterilizado em autoclave. Depois o meio foi arrefecido a 28°C, incluindo suplementos de levedura com base de azoto e adicionou-se biotina. O fermentador foi inoculado a uma razão de 1:33 de cultura de semente para meio de crescimento BKGY. O procedimento de fermentação começou com um semi-lote de glicerol e a alimentação de glicerol a pH 5,7 a 28°C. O pH foi controlado por 10% de ácido fosfórico e soluções de 30% de sulfato de amónio. A cultura foi agitada de 300-1000 rpm com arejamento para controlar o oxigénio dissolvido a 40%. 176

Depois do primeiro lote de glicerol ter esgotado e o oxigénio dissolvido cravado, indicando o esgotamento do glicerol a partir do sistema, mais 50% de glicerol foi alimentado a 131 g/h até ao peso de células húmidas ter alcançado preferencialmente entre 200 g/L a 300 g/L. Após o peso celular molhado ter atingido 200 g/L-300 g/L, a indução foi imediatamente iniciada com um bolo de metanol de 0,025 mL por grama de biomassa húmida. Após o esvaziamento do bolo de metanol e com o aumento de oxigénio dissolvido, a indução foi continuada através da adição de quantidades de metanol limitante, com uma taxa de 0,0034 g de metano/ g de peso molhado de células/h de alimentação constante. No inicio da alimentação de metanol constante, o pH do caldo de fermentação passou de 5,7 para 5,5 e a temperatura foi mudada de 28°C para 22°C. A fermentação foi colhida após 70 horas de indução.

Para determinar os rendimentos relativos dos clones individuais e das 3 cópias, o clone 201-55-001-VU, contendo um integrante do genoma do vector pPROT55-V, foi fermentado em paralelo com o clone 201-55M3-003-VU, contendo um integrante genómico de 3 cópias do vector pPROT55M3-V. As fermentações foram realizadas como descrito acima, excepto que o pH da cultura foi mantido a 5,7 durante a indução. Os sobrenadantes colhidos das fermentações de 201-55-001-201-VU e 55M3-003-VU foram analisados por gradiente de SDS-PAGE seguido por coloração com azul coloidal (Figura 8), o qual mostrou que a expressão de pró-proteína superior foi obtida a partir do clone de multicópia 201-55M3-003-VU em comparação com clone 201-55-001-VU único. Os resultados de SDS-PAGE foram confirmados por análise de HIC-HPLC da concentração de pró-proteína nos sobrenadantes de fermentação, demonstrando que o clone 201-55M3-003-VU produziu aproximadamente 600 mg/L de pró-proteína 177 segregada, enquanto o clone 201-55-001-VU produziu aproximadamente 400 mg/L. Assim, o clone de multicópia 201-55M3-003-VU contendo três cassetes de expressão produziu aproximadamente mais 50% de pro-proteina em comparação com o clone 201-55-001-VU de cópia única contendo uma única cassete de expressão.

Duas estratégias de conversão foram testadas usando o sobrenadante 201-55M3-003-VU produzido a partir da fermentação. Estas estratégias geralmente seguem as estratégias descritas para outras variantes de pro-proteínas no Exemplo 5, excepto que foram realizados numa escala maior. Na primeira estratégia, a pró-proteína foi capturada a partir do sobrenadante por cromatografia de permuta catiónica, seguido por conversão para a proteína madura e a cromatografia de polimento. Na segunda estratégia, a pró-proteína foi convertida na proteína madura antes da purificação, seguido por captura utilizando cromatografia de permuta catiónica, a conversão extensa para remover as variantes N-terminais, e ainda mais cromatografia de polimento. Ambas as estratégias também incluíam um passo de incubação prolongada num tampão a pH 8,0, após a conversão para efetuar a degradação seletiva de variantes N-terminais.

Utilizando a primeira estratégia, a captura da pro-proteina seguido por conversão e purificação de polimento de PRT-201 foram efectuadas como se segue. O 201-003-55M3-VU foi recolhido a partir da cultura de fermentação e congelado a -80°C. Cerca de 7 litros de sobrenadante clarificado congelado (3,5 L a partir da fermentação de 55M3-201-003-VU descrito acima e 3,5 L de culturas de 55M3-201-003-VU em frascos agitadores geralmente preparados como descrito nos Exemplos 4 e 5) foi descongelado e diluído 8 vezes com água desionizada e 1 M de citrato de sódio, pH 4,3, a 2-8°C para 178 se obter uma concentração final de 25 mM de citrato de sódio. 0 pH da solução foi ajustado para 4,7. A solução foi carregada em leito de 2,3 L de coluna de troca catiónica Macroprep High S a 76 cm/h a 2-8°C. A coluna foi lavada com 5 CV de 25 mM de citrato de sódio, pH 4,7, seguido de 5 CV de 160 mM de cloreto de sódio, 25 mM de citrato de sódio, pH 4,7. A pró-proteina foi eluida com 15 CV de um gradiente linear começando a partir de 160 mM cloreto de sódio para 500 mM de cloreto de sódio em 25 mM de citrato de sódio, pH 4,7, a 87 ml/min (67 cm/h). O eluido foi recolhido em fracções. As fracções foram analisadas por SDS-PAGE para o teor de proteina (Figura 9) . Uma pequena quantidade de proteina convertida espontaneamente foi observada por SDS-PAGE. As fracções contendo a pró-proteina foram reunidas para posterior processamento. O material reunido foi submetido a análise de HIC-HPLC, que revelou que consistia em 92% de pró-proteina e 8% de PRT-201 madura.

Para iniciar a conversão, o material reunido foi trocado utilizando tampão de filtração de fluxo tangencial dentro de 100 mM de cloreto de sódio, 20 mM de Tris, pH 4,0, utilizando diafiltração a volume constante entre 10-12°C. A filtração de fluxo tangencial foi realizada com membranas de celulose regenerada, uma pressão transmembranar de 15 psi, uma taxa de fluxo cruzado de 20 L/min e um fluxo de 800 mL/min. Três diavolumes do tampão a 2-8°C foi adicionado à mesma taxa que a do fluxo. Subsequentemente, adicionaram-se três volumes adicionais de tampão à temperatura ambiente à mesma velocidade que o fluxo para aumentar a temperatura da solução de conversão para o alvo de 26°C. A filtração de fluxo tangencial foi utilizada para concentrar a solução de conversão para o alvo de 1,5 mg/mL utilizando as condições de 15 psi de pressão 179 transmembranar, 1,2 L/min de taxa de fluxo cruzado, e 7 6 ml/min de fluxo. Contudo, após cerca de 2 minutos após o início do processo de concentração, foi observada uma precipitação inesperado e o processo de concentração foi interrompido. A concentração de proteína da solução de conversão foi determinada como sendo de 1,1 mg/ml por absorvância de UV a 280 nm, num volume de 570 mL. Para minimizar ainda mais a precipitação, a solução de conversão foi diluída para 1 mg/ml, com 100 mM de cloreto de sódio, 20 mM de Tris, pH 4,0, e filtrada através de uma membrana de 0,22 mícron. Dezasseis mL de 3 M de Tris, pH 9,0 foram adicionados à solução de conversão. A solução de conversão foi colocada num banho de água a 26°C. A reação de conversão foi monitorizada por análise de HIC-HPLC. Depois de 30 minutos, o HIC-HPLC mostrou que a maioria da pro-proteína tinha sido convertida para PRT-201 e algumas variantes N-terminais (Figura 10). Após 1 hora, a reação de conversão consistia em 0% de pro-proteína, 86% de PRT-201 de comprimento total e 14% de variantes N-terminais. O material de conversão foi incubado ainda por mais 4 horas, altura em que o tempo de análise de HIC-HPLC mostrou que o material de conversão consistia em 98% de PRT-201 de comprimento total e 2% de variantes N-terminais. O material de conversão foi diluído quatro vezes com água desionizada e 1 M de citrato de sódio, pH 4,3, para uma concentração final de 25 mM de citrato de sódio. O pH da solução foi ajustado para 5,0, em preparação para o carregamento da coluna de polimento. A solução foi carregada num leito de 600 ml de uma coluna de permuta catiónica Macroprep High S a 27 ml/min (83 cm/h) . A coluna foi lavada com 5 CV de 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0 seguido de 5 CV de 160 mM de cloreto de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0. O PRT-201 foi fluido com 15 CV de 180 um gradiente linear começando a partir de 160 mM para 500 mM de cloreto de sódio em 25 mM de citrato de sódio, pH 5,0, a 87 ml/min (67 cm/h) . 0 eluido foi recolhido em fracções. As fracções foram analisadas por SDS-PAGE para o teor de proteina e com o ensaio SLAP para a atividade especifica. As fracções contendo PRT-201 com uma atividade especifica de> = 30 U/mg foram reunidas. As fracções PRT-201 reunidas foram diafiltradas através de filtração de fluxo tangencial para tampão de formulação (0,1 x PBS, pH 5,0) . O pH do PRT-201 diafiltrado foi ajustado para pH 7,4 e a concentração de proteina foi ajustada para 1 mg mL por filtração de fluxo tangencial. Os frascos foram cheios e liofilizados como descrito para PRT-201 produzida a partir do clone 201-24-266-VU no Exemplo 4.

Utilizando a segunda estratégia, a conversão de pró-proteína, seguida por purificação de PRT-201 foi efectuada como se segue. Aproximadamente 7 L do sobrenadante clarificado congelado a partir da fermentação de 55M3-201-003-VU acima descrita foi descongelado e a reação foi iniciada pela conversão de filtração de fluxo tangencial com um tampão de conversão contendo 100 mM de Tris, pH 8,0, utilizando diafiltração a volume constante à temperatura ambiente com membranas de celulose regenerada. Dois diavolumes de 100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, foram suficientes para alterar o pH do retido de pH 5,0 a 8,0 e afetar a conversão. Uma experiência foi também realizada ajustando diretamente o pH do sobrenadante clarificado para 8,0 por adição de uma base de Tris a uma concentração final de 100 mM e ajustar o pH para 8,0 com 1 N de hidróxido de sódio. Isto resultou na formação de precipitados e um sobrenadante turvo, possivelmente devido à precipitação dos componentes do caldo, que era indesejável. O método preferido de 181 conversão usando filtração de fluxo tangencial não resultou em precipitação. A reação de conversão foi monitorizada por análise de HIC-HPLC em tempo real. Após o inicio da conversão, pró-PRT-201 convertida para PRT-201 madura lentamente durante as primeiras duas horas, seguida por uma aceleração da conversão (Figura 11) . Em 4,5 horas, a reação de conversão era constituída por cerca de 4% de pró-PRT-201, 75% de PRT-201madura e 21% de variantes N-terminais. Em 6,5 horas, a reação de conversão era constituída por cerca de 1% de pró-PRT-201, 83% de PRT-201 madura e 16% de variantes N-terminais. A redução nas variantes N-terminais de 21% para 16% de 4,5 horas a 6,5 horas pode ser devido à degradação das variantes N-terminais por PRT-201 ativa de comprimento completo, mas este não se encontrava completo e não tão rápido como a redução das variantes N-terminais vista durante a conversão de pró-PRT 201 purificado. Nesta segunda estratégia, estendendo-se a reação de conversão poderá não remover completamente as variantes N-terminais, devido às proteínas concorrentes no sobrenadante que competem pelo sitio ativo da elastase. Para melhorar a conversão da reação, o material pós-conversão foi capturado e subsequentemente diafiltrado num tampão apropriado para iniciar a conversão alargada a pH 8,0 para a degradação seletiva de variantes N-terminais, tal como descrito abaixo. A captura de PRT-201 a partir do material de conversão foi efectuada como se segue. O material de conversão foi trocado de tampão para 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0 e carregado numa coluna de cromatografia de permuta catiónica Macro-Prep High S. A coluna foi lavada com 5 CV de 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0 seguido de 5 CV de 20 mM de citrato de sódio, 160 mM de cloreto de sódio, pH 5,0. PRT- 182 201 foi fluido com um gradiente linear a partir de 160 mM de cloreto de sódio a 500 mM em 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0. As fracções foram analisadas por SDS-PAGE para o teor de proteina, e por HIC-HPLC para as variantes N-terminais, absorção de UV a 280 nm para a concentração de proteina, e ensaio SLAP para a atividade da elastase. Duas bandas de proteínas predominantes foram detectadas por SDS-PAGE, o que corresponde a PRT-201 e glicoformas de PRT-201, como mostrado na Figura 12. As fracções que continham glicoformas de PRT-201, conforme determinado por SDS-PAGE ou variantes N-terminais determinadas por HIC-HPLC foram excluídas da conjugação. As frações que apresentaram atividade especifica relativamente baixa (menos de 30 U/mg), conforme determinado pelo ensaio SLAP também foram excluidos da partilha. As restantes fracções contendo PRT-201 foram reunidas para posterior processamento. A análise HIC-HPLC das fracções reunidas revelou que este material consistia em aproximadamente 98% de PRT-201 do comprimento total 1-2% e variantes N-terminais. O material reunido foi armazenado a 2-8°C durante 12-16 horas.

Dada a observação prévia de que as variantes N-terminais parecem diminuir ao longo de um prolongado período de conversão, como descrito acima, o material de PRT-201 reunido foi sujeito a um passo de incubação prolongada a pH 8,0. A incubação prolongada foi realizada por diafiltração e filtração de fluxo tangencial com 100 mM de Tris, 300 mM de cloreto de sódio, pH 8,0 durante 2,5 horas à temperatura ambiente. Após 2,5 horas, a conversão de material consistia em 100% de PRT-201 madura, como mostrado por análise de HIC-HPLC. O material foi submetido a conversão de diafiltração e filtração de fluxo tangencial em 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0 para suprimir a atividade da elastase e preparar-se para a cromatografia em coluna. O 183 material PRT-201 diafiltrado foi armazenado durante aproximadamente 64 horas a 2-8°C. A purificação cromatográfica de polimento de PRT-201 foi efectuada como se segue. 0 material PRT-201 diafiltrado foi carregado numa coluna de permuta catiónica Macro-Prep High S e lavado com 5 CV de tampão C (20 mM de citrato de sódio, pH 5,0) seguido de 5 CV de 160 mM de cloreto de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0. A eluição de PRT-201 foi efectuada com um gradiente linear de 15 CV a partir de 68% de tampão C e 32% de tampão D (160 mM de cloreto de sódio, 25 mM de citrato de sódio, pH 5,0), a 0% de Tampão C e 100% de tampão D (500 mM de cloreto de sódio, 25 mM de citrato de sódio, pH 5,0), a 50 mL/min (153 cm/h) . O eluido foi recolhido em fracções. PRT-201 eluiu como um pico simétrico a 37 mS/cm (330 mM de cloreto de sódio) . As fracções foram analisadas por SDS-PAGE para a análise do conteúdo de proteina, absorção de UV a 280 nm para a concentração de proteina e ensaio SLAP para a atividade especifica. As fracções contendo PRT-201 que tinham uma atividade especifica de 30,1-38,8 U/mg foram reunidas. As fracções de PRT-201 reunidas foram diafiltradas através de filtração de fluxo tangencial para tampão de formulação (0,1 x PBS, pH 5,0). O pH do PRT-201 diafiltrado foi ajustado para pH 7,4 e a concentração de proteina foi ajustada para 1 mg/mL por filtração de fluxo tangencial. Os frascos foram cheios e liofilizados como descrito para PRT-201 produzida a partir do clone 201-24-266-VU no Exemplo 4.

As condições para os procedimentos de conversão acima descritas foram escolhidas com base em estudos de optimização de conversão que examinaram a concentração de proteina, temperatura, composição do tampão, diavolume e variáveis de pH. No primeiro estudo, foi analisado o efeito da concentração de pró-proteina para a produção de 184 variantes N-terminais durante a conversão. Pró-PRT-201 purificado a partir do clone 201-55M3-003-VU (pró-PRT-201-55M3-003-UV), a uma concentração inicial de 0,2 mg/mL em 20 mM de fosfato de sódio, pH 5,0 foi aliquotado e concentrado a 1,0, 1,6, e 1,8 mg/mL, utilizando dispositivos de concentração de centrífugos conforme determinado por absorvância UV a 280 nm. A conversão da pró-proteína foi efectuada por adição de Tris e de cloreto de sódio a cada 100 mM das quatro amostras de concentração, ajustamento do pH 5,0 a 8,0, e a incubação das amostras à temperatura ambiente. A reação de conversão foi monitorizada por HIC-HPLC em tempo real até a pro-proteína ser <= 1% do total de proteína (Figura 13). Neste ponto final, uma amostra de 0,2 mg/mL consistiu em cerca de 8% de variantes N-terminais, ao passo que amostras de 1,0 mg/mL, 1,6 e 2,0 mg/mL consistiram em aproximadamente 14%, 19% e 29% de variantes N-terminais, respectivamente. O restante da proteína em cada amostra consistiu em PRT-201de comprimento completo. Estes resultados demonstram que o aumento de concentrações de pró-PRT-201-55-003-VU durante a conversão conduz à formação de mais variantes N-terminais e menos PRT-201 de comprimento completo. Outros estudos sugeriram que a conversão de pró-PRT-201-003-55M3-VU ocorre por meio de reações tanto intramoleculares como intermoleculares. Assim, para esta variante de pro-proteína, é provável que as reações intermoleculares, que são favorecidas em soluções mais diluídas de pro-proteína, deem origem a uma conversão mais precisa ao passo que as reações intermoleculares, favorecida em soluções mais concentradas de pro-proteína, resultem numa conversão menos precisa, ou seja, a formação de uma percentagem mais e levada das variantes N-terminais em relação ao PRT-201 de comprimento total. 185

No segundo estudo, foi analisado o efeito da temperatura sobre a produção de variantes N-terminais durante a conversão. Pró-PRT-201 purificado a partir do clone 201-55M3-VU (denominado pró-PRT-201-55M3-003-UV) produzido numa concentração de 1,6 mg mL, foi submetido a conversão como descrito acima a 15°C ou 26°C. As reações de conversão foram monitorizadas em tempo real por HIC-HPLC e deixadas progredir até que a pro-proteína compreendesse <1% da proteína total. O tempo requerido para atingir esta redução da pro-proteína foi aproximadamente de 30 minutos a 26°C e cerca de 90 minutos a 15°C. Nessas ocasiões, uma percentagem semelhante de variantes N-terminal (cerca de 20% da proteína total), para ambas as temperaturas foi observada. Assim, a maior temperatura de 26°C resultou numa reação de conversão mais rápida em comparação com a diminuição da temperatura para 15°C, enquanto produzindo um perfil de produto de reação essencialmente idêntico. O terceiro estudo examinou o efeito da composição do tampão sobre a solubilidade da pró-proteína durante a reação de conversão. Pró-PRT-201 purificado(pro-PRT-201-003-55M3-VU) a uma concentração de 1,0 mg/mL, foi submetido a conversão sob as condições listadas na Tabela 6. As reações de conversão foram realizadas à temperatura ambiente, excepto para uma composição do tampão de 20 mM de Tris-HCl, 100 mM de cloreto de sódio, pH 4,0), que foi realizada de 2 a 8°C. As reações de conversão foram inspecionadas visualmente para precipitação. Como observado na Tabela 6, as composições de tampão, que não resultem em precipitação incluíam 100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de cloreto de sódio, pH 5,0, e 100 mM de Tris-HCl, 300 mM de cloreto de sódio, pH 8,0. As composições tampão com concentrações mais baixas de Tris ou sem cloreto de 186 sódio a um pH mais baixo (isto é, pH 5,0) exibiram precipitação.

Tabela 6: Efeito da composição de tampão na precipitação durante a conversão

Composição de tampão Temperatura Precipitação observada Solúvel (não foi observada precipitação) 1 mM Tris-HCL, pH 5, 0 Ambiente + 25 mM Tris-HCL, pH 5,0 Ambiente + 100 mM Tris-HCL, pH 5,0 Ambiente + 20 mM Tris-HCL, 100 mM cloreto de sódio, pH 4,0 O 0 00 1 CN + 100 mM Tris-HCL, 100 mM cloreto de sódio, pH 5,0 Ambiente + 100 mM Tris-HCL, 300 mM cloreto de sódio, pH 8,0 Ambiente +

No quarto estudo, o efeito no número de diavolume da filtração de fluxo tangencial na precipitação durante a conversão da pró-proteína contendo sobrenadante (pró-PRT-201-55M3-003-UV) foi analisado. A solução utilizada para a troca de tampão era de 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de 187 cloreto de sódio, pH 8,0. Além disso, foi testado um ajuste do pH direto do sobrenadante a partir de pH 5,0 a 8,0, sem filtração de fluxo tangencial. Como observado na Tabela 7, o ajustamento do pH direto do sobrenadante resultou numa grande quantidade de precipitação. Com 1 diavolume de troca, foi observada alguma precipitação. Nenhuma precipitação foi observada quando foram utilizados 2 a 5 diavolumes.

Tabela 7: efeito do numero de diavolumes na precipitação durante a troca de tampão

Diavolumes Precipitação observada 0 Maior precipitação 1 Menor precipitação 2 Não precipitação 3 Não precipitação 5 Não precipitação

No quinto estudo, foi analisado o efeito do pH sobre a atividade da elastase na PRT-201 madura. Este estudo foi desenhado para identificar uma faixa de pH útil para a conversão que não resultaria numa perda irreversível da atividade da elastase do produto de conversão da PRT-201 188 madura. Foram preparadas soluções de 1 mg/mL de PRT-201 em 20 mM de Tris-HCl, 20 mM de fosfato de potássio de pH de 1 a 14. As soluções foram mantidas à temperatura ambiente durante 0,5, 2, 24 e 48 horas. Nos pontos de tempo indicados, as soluções foram testadas para a atividade da elastase no ensaio SLAP. A atividade da elastase foi bastante estável a partir de pH de 3 a 8 em todos os pontos temporais. Em valores de pH inferior a 3 e superior 8, a atividade da elastase foi reduzida em todos os pontos do tempo, com uma correlação entre os pontos de tempo mais longos e menor atividade da elastase. Estes resultados indicaram que uma reação de conversão realizada fora de um intervalo de pH de 3 a 8 poderia afectar negativamente a atividade da elastase do produto de conversão da PRT-201.

6.8 EXEMPLO 7: PRODUÇÃO DE ELASTASE PANCREÁTICA PORCINA RECOMBINANTE AUTO-ATIVADA TIPO I

Um vector condificando a proenzima ELA-1 porcina auto-ativada foi expresso P. pastoris. A ELA-1 porcina auto-ativada resultante foi comparada com uma proteína ELA-1 porcina expressa como uma pró-proteína do tipo selvagem ativada por tripsina.

Para construir o vector de ELA-1 porcina ativada por tripsina, a região de codificação de ELA-1 porcina foi sintetizada por Blue Heron Biotechnology (Bothell, Washington), usando uma técnica não-PCR de "oligo longo" sob licença da Amgen (Mil Oaks, CA) . O gene recombinante foi clonado no vector pUC Blue Heron, um derivado de pUC119. O gene ELA-1 porcinofoi sequenciado em ambas as estirpes para confirmar a sequência correta. Os sítios de restrição Saci e Xbal foram incorporados como potenciais 189 locais de clonagem que flanqueiam o qene de ELA-1 porcino como mostrado na Figura 14. Um segundo códão de paragem foi também adicionado imediatamente após o códão de paragem nativo para minimizar o potencial de leitura do ribossoma. A Figura 15 mostra a sequência de aminoácidos idêntica natureza da proenzima ELA-1 porcina, a qual contém o sitio de tripsina ativada. A região de codificação de ELA-1 porcina foi amplificada por PCR usando um par de oligonucleótidos contendo sitios de restrição Xhol e Saci para facilitar a clonagem. 0 produto de PCR foi digerido com Xhol e Saci e purificado por electroforese em gel de agarose. 0 fragmento de ELA-1 porcina foi clonado no vector PV-1 em sitios de restrição Xhol e Saci. A estirpe de E. coli TOP 10 foi transformada com a mistura de ligação. A mistura de células foi plaqueada em placas de LB com baixo teor de sal suplementadas com 25 mg/mL de zeocina. Os clones resistentes a fármacos foram repicados e o ADN do plasmideo foi preparado (Qiagen, CA) . Com base em análise de restrição um clone contendo a inserção do gene ELA-1 porcino foi identificado e o vector foi chamado pPROTlOl-24-V. A sequência de codificação deste vector foi confirmada por sequenciação de ADN. 0 esquema de clonagem para pPROT101-24-V está representado na Figura 16.

Utilizando o vector pPROT101-24-V ativado por tripsina, três clones auto-ativados diferentes foram produzidos alterando o sitio de clivagem de tripsina na região do pro-péptido de ELA-1 porcina para os sitios de clivagem da elastase. Mutagénese dirigida ao sitio foi realizada geralmente como descrito no Exemplo 4 utilizando os iniciadores de síntese de oligonucleótidos contendo as mutações desejadas, tal como descrito na Tabela 8. Todas as 190 mutações na região do pró-péptido foram confirmadas por sequenciação de cadeia dupla de ADN.

Tabela 8. sequências de domínios de clivagem dos vectores de tripsina ativada ela-1 porcina auto-ativada. Os códãos mutagenizados estão sombreados, a ligação é clivada entre PI e P'l

Construct narrte Pro-pe ptide sequanee Mature sequenca SEQ ID NO. P7 | P6 PS P4 P3 P2 | P1 ΡΊ P*2 P’3 Tíypsln-activaíed pPROT101-24-V Phe PfD Glu Thr Asn Ala Arç Va! Vai Gly 115 Auto-activated pPROT101-42-V Phe Pro Gíut Thr Asn I Ala Ala Vel Vai G!y 116 Auto-activatod I Glv 117 J Mature sequence Construct nBme Pro-peptfde sequence SEQ ID NO. S P7 \ P6 j P5 P4 P3 P2 I P1 j ΡΊ P‘2 P’3 PPROT101-4S-V Phe Pro Glu Thr Asn fAla 1 Vai Vai Auto-activated p8|l PPROT101-5SL-V Pro «e Thr Asn Vai Gly 118 A estirpe NRRL Y-11430 do tipo selvagem de P. pastoris foi transformada e os transformantes resistentes a fármacos foram cultivados e testados para a expressão das pro-proteínas de ELA-1 porcina como descrito no Exemplo 3. Com base na análise por SDS-PAGE e coloração com Coomassie (ver Figuras 17 e 18) os clones pPROT101-24-V ativados por tripsina de tipo selvagem apresentaram os maiores níveis de expressão em comparação com os clones auto-ativados. Dos clones auto-ativados, os clones pPROTl01-49-V tinham o nível mais alto de expressão, seguido pelos clones pPROT101-55L-V e em seguida, os clones pPROT101-49-V. As pro-proteínas auto-ativadas pPROT101-42-V e pPROT101-55L-V exibiram conversão espontânea substancial durante a indução, enquanto a pro-proteína pPROT101-24-V ativada por 191 tripsina e a pro-proteína pPROT101-49-V auto-ativada mostrou maior estabilidade nos meios de indução.

Os estudos sobre a atividade da elastase da PRT-102 produzida por ativação da tripsina da proteína de proelastase expressa a partir de pPROT101-24-V apresentou uma atividade específica superior a PRT-201, como mostrado na Tabela 9 abaixo:

Tabela 9: Atividade de elastase de três amostras diferentes do elastase pancreática madura porcina tipo I (ativada por tripsina) como comparada com a elastase pancreática madura

humana tipo I

Nome da amostra PRT-201 PRT-202 PRT-102 PRT-102 Atividade medida por SLAP (U/mg de proteína) (replicações) 34, 6 91,8 99, 4 100,7 32,9 88,3 91,3 88, 6 Média das replicações 33, 6 88,5 93, 5 92, 9 Desvio padrão 0, 9 3,2 5,2 6,7 192

Uma experiência de conversão em pequena escala foi usada para determinar se as pro-proteinas pPROT101-55L-V e pPROT101-49-V poderiam ser convertidas em enzimas maduras que exibissem a atividade da elastase. Os sobrenadantes de pPROT101-55L-V e pPROTl01-49-V em frascos agitadores foram concentrados 10 vezes com uma unidade de filtro de centrifugação e diluidos cinco vezes com 100 mM de Tris-HC1, pH 9,0. A conversão foi deixada a prosseguir à temperatura ambiente e a atividade da elastase foi monitorizada ao longo do tempo por ensaio SLAP. A alteração média na absorvância por minuto, foi determinada a partir de cada ponto de tempo e avaliada como a velocidade da reação não normalizada (Figura 19). A conversão de ambos os sobrenadantes de pPROT101-49-V e pPROT101-55L-V resultaram num aumento da atividade de elastase. As amostras finais de ponto de tempo a partir de cada um dos clones foram analisadas por SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie e comparadas a amostras de pré-conversão (Figura 20) . Os resultados de SDS-PAGE confirmaram que a quase totalidade da pro-proteina pPROT101-49-V foi convertida em proteina madura até ao final do ensaio de conversão. Os resultados de SDS-PAGE, também mostraram que quase toda a pPROTlOl-55L-V tinha sido convertida espontaneamente em proteina madura antes do ensaio de conversão.

Preparações purificadas de pro-proteinas pPROT101-24-V e pPROTl01-49-V e enzimas maduras foram submetidas a Danforth Plant Science Center, MO para análise intacta do peso molecular. As pro-proteinas foram purificadas por cromatografia de troca catiónica (Macroprep High S, Bio-Rad) . Para a análise de enzima madura, as pro-proteinas de ambos os clones foram tratadas primeiro para produzir as enzimas maduras e em seguida purificadas por cromatografia 193 de troca catiónica. A pro-proteína ativada por tripsina foi tratada com tripsina, enquanto a pro-proteina auto-ativada foi convertido na presença de 100 mM de Tris-HCl, pH 9,0, seguido por cromatografia de troca catiónica. Os picos principais obtidos a partir da análise de espectrometria de massa são apresentados na Tabela 10.

Tabela 10: Pesos moleculares esperados e observados para proteínas ELA-1 porcinas

Proteína PM esperado PM observado Pro-proteína Pprotl01-24 ativada por tripsina 27068 27064 Enzima madura Pprotl01-24 ativada por tripsina 25908 25898 Pro-proteína Pprotl01-49V ativada por tripsina 27094 27047 Enzima madura Pprotl01-49V ativada por tripsina 25908 25910

Os resultados de SDS-PAGE da atividade da elastase e espectrometria de massa demonstraram que as formas auto-activados de elastase pancreática porcina tipo I, podem ser produzidas por manipulação da sequência de pró-péptido para substituir o sítio de clivagem da tripsina por um sítio de clivagem da elastase. Os níveis de expressão destas formas de elastase pancreática porcina auto-ativadas de tipo I são menores do que a forma ativada por tripsina de tipo selvagem. Dos clones auto-ativados testados, aqueles com a sequência de pró-péptido pPROT101-49-V demonstraram o maior 194 nível de expressão e a conversão menos espontânea. A conversão dos clones pPROT101-49-V e pPROT101-55L-V resultou na produção de proteínas maduras, com substancial atividade de elastase. A análise por espectrometria de massa revelou que o peso molecular da pro-proteína pPROT101-49-V e porcina madura tipo I correspondeu às massas esperadas.

6.9 EXEMPLO 8: ANÁLISE DA ATIVIDADE DE TRIPSINA NA ELASTASE-1 MADURA HUMANA RECOMBINANTE POR ENSAIO COLORIMÉTRICO DE SUBSTRATO DE PÉPTIDO BENZ

Um ensaio calorimétrico de hidrólise utilizando o substrato de péptido pequeno N-benzoil-Phe-Val-Arg-pNitroanilide (BENZ) foi realizado para determinar se a proteína de elastase madura purificada produzido pelo clone 55M3-201-003-VU auto-ativado possui atividade de tripsina. Três frascos de PRT-201 liofilizado purificado a partir do clone 201-55M3-003-VU foram recuperados a partir de armazenamento a -80°C e reconstituídos com água para se obter 1 mg/ml de PRT-201 em 0,1 x PBS, pH 7,4. As concentrações de proteína foram confirmadas através da medição da absorvância de UV a 280 nm. Uma solução de stock de TrypZean (10 mg/mL) foi utilizada para gerar uma curva padrão para a atividade da tripsina. A anteriormente testada amostra de PRT-201 ativada por tripsina foi incluída como um controlo positivo. Além disso, algumas amostras experimentais e de controlo foram adicionadas com TrypZean para determinar a recuperação da atividade da tripsina na presença de PRT-201. Um subconjunto das amostras enriquecidas e não enriquecidas foi tratado com inibidor de tripsina de soja (SBTI), para determinar a capacidade de SBTI para inibir qualquer atividade intrínseca ou cravada da tripsina. Os padrões de TrypZean foram também tratados com SBTI para 195 confirmar a eficácia do inibidor. Veja na Tabela 11 abaixo um resumo das amostras incluidas neste estudo.

Tabela 11: Foram preparadas Diluições de TrypZean para a curva padrão, utilizando o tampão de ensaio (0,1 M de Tris, pH 8,3). A curva padrão para soluções de TrypZean é mostrada na Figura 21

Descrição Não adição Mais TrypZean cravada (para 100 ng/mL) Mais SBTI (para 10 ug/mL) Mais TrypZean cravado e SBTI PRT-201 do clone 55M3 Frasco # 1 V V V V PRT-201 do clone 55M3 Frasco # 2 V V V V PRT-201 do clone 55M3 Frasco # 3 V V V V PRT-201 do clone ativado por tripsina V V V V 196

Descrição Não adição Mais TrypZean cravada (para 100 ng/mL) Mais SBTI (para 10 ug/mL) Mais TrypZean cravado e SBTI Apenas tampão (0,1 M Tris, pH 8,3) V V V V TrypZean padrão, 1,56 ng/mL V Não dado V Não dado TrypZean padrão, 3,13 ng/mL V Não dado V Não dado TrypZean padrão, 6,25 ng/mL V Não dado V Não dado TrypZean padrão, 12,5 ng/mL V Não dado V Não dado TrypZean padrão, 25 ng/mL V Não dado V Não dado 197

Descrição Não adição Mais TrypZean cravada (para 100 ng/mL) Mais SBTI (para 10 ug/mL) Mais TrypZean cravado e SBTI TrypZean padrão, 50 ng/mL V Não dado V Não dado TrypZean padrão, 100 ng/mL V Não dado V Não dado A solução de substrato foi preparada (0,4 mg/mL de N-benzoil-Phe-Val-Arg-pNitroanilide Lote 7733 em 0,1 M de Tris, pH 8.3) e pré-aquecida a 30°C num banho de água. Em triplicado, a 100 microlitros de cada amostra foram pipetados para uma microplaca de 96 poços. Usando um pipetador multicanal, 200 microlitros de solução de substrato foram pipetados para cada poço e a microplaca foi imediatamente colocada num leitor de microplacas pré-aquecido a 30°C. O leitor de microplacas registou a absorvância a 4 05 nm para cada poço uma vez por minuto, durante 60 minutos.

As amostras de PRT-201 também foram testadas para a atividade da elastase no ensaio SLAP. A solução SLAP de substrato foi preparada (4,5 mg/mL SLAP em 0,1 M de Tris, pH 8,3) e pré-aquecida a 30°C num banho de água. As amostras PRT-201 de 1 mg/ml foram diluídas 20 x com água a 0,05 mg/mL. Em triplicado, 10 microlitros de cada diluição 198 da amostra foi pipetada para uma microplaca de 96 poços. Usando um pipetador multicanal, 300 microlitros de solução de substrato SLAP foram pipetados para cada poço, e a microplaca foi imediatamente colocada num leitor de microplacas pré-aquecido a 30°C. O leitor de microplacas registou a absorvância a 405 nm para cada poço uma vez por minuto durante 5 minutos.

Os resultados dos ensaios de atividade SLAP e BENZ são apresentados respectivamente nas Tabelas 11 e 12 abaixo. TABELA 12: Média da atividade da tripsina, avaliada como concentração de TrypZean equivalente (ng/mL). Coeficiente de regressão < 0,8

Descrição Não adição Mais TrypZean cravada (para 100 ng/mL) Mais SBTI (para 10 ug/mL) Mais TrypZean cravado e SBTI PRT-201 do clone 55M3 Frasco # 1 <1,56[a] 118,7 <1,56 [a] <1,56 [a] PRT-201 do clone 55M3 Frasco # 2 <1,56[a] 122,4 <1,56 [a] <1,56 [a] PRT-201 do clone 55M3 Frasco # 3 <1,56[a] 122,8 <1,56 [a] <1,56 [a] 199

Descrição Não adição Mais TrypZean cravada (para 100 ng/mL) Mais SBTI (para 10 ug/mL) Mais TrypZean cravado e SBTI PRT-201 do clone ativado por tripsina 8,7 130,0 <1,56 [a] <1,56 [a] Apenas tampão (0,1 M Tris, pH 8,3) 1,3 Não dado <1,56 [a] Não dado TrypZean padrão, 1,56 ng/mL 2,7 Não dado <1,56 [a] Não dado TrypZean padrão, 3,13 ng/mL 3,7 Não dado <1,56 [a] Não dado TrypZean padrão, 6,25 ng/mL 6, 5 Não dado <1,56 [a] Não dado TrypZean padrão, 12,5 ng/mL 11,2 Não dado <1,56 [a] Não dado 200

Descrição Não adição Mais TrypZean cravada (para 100 ng/mL) Mais SBTI (para 10 ug/mL) Mais TrypZean cravado e SBTI TrypZean padrão, 25 ng/mL 23,5 Não dado <1,56 [a] Não dado TrypZean padrão, 50 ng/mL 49, 4 Não dado <1,56 [a] Não dado TrypZean padrão, 100 ng/mL 102,4 Não dado <1,56 [a] Não dado 201

Tabela 13: Média da atividade SLAP, reportada como U/mg

Descrição Não adição PRT-201 do clone 55M3 Frasco # 1 34, 9 PRT-201 do clone 55M3 Frasco # 2 36, 6 PRT-201 do clone 55M3 Frasco # 3 35, 7 PRT-201 do clone ativado por tripsina 32,1 0 nível de atividade de tripsina de PRT-201 a partir do clone 201-55M3-003-VU estava abaixo da gama da curva padrão no ensaio de atividade de tripsina (<1,56 ng/mL). Além disso, os coeficientes de regressão para as reações de hidrólise em triplicado eram pobres (<0,8), apoiando ainda mais a falta de atividade da tripsina nesta proteína de elastase madura auto-ativada. Em contraste, o nível de atividade de tripsina da amostra ativada por tripsina de controlo foi determinado ser de 8,7 ng/mL.

7. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

SEQ !D NO. Descrlptlon j Type of { sequencê Sequertca 1 Matura human elastase I, Incíudlng first "valine" j Amino acid, single letter formai, wfierein: X = V at L WGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGGTL IRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDGT EQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV TLNSYVQIGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTN GQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM VCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV TSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYISWINNVIASN 202

SEQ tD NO. Descrlptíon Type of sequence Seguence 2 Mature human elastase 1, minus first "valine” Amíno acid. single letter format, wherein: X = V or L VGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGGTLI RQNWVMTAAHCV0YQKTFRWAGDHNLSQNDGT EQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV TLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTN GQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM VCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV TSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYI3WINNVIASN 3 Mature human elastase 1, minus first two "valines" Amino acid, single letter format, wherein: X = V or L GGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGGTUR qnwvmtaahcvdyqktfrwagdhnlsqnogte GYVSVGKIWH PYWN SDN VAAG YDIALLRLAGSVT LNSYVQLGVLPQEGAILMINSPCYtTGWGKTKTNG QLAQTLGQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTMV caggdgvrsgcqgdsggplhclvngkysxhgvt SFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYISWINNVIASN 4 Mature human elastase I, with first "valine" substituted by “alansne" Amino acid. single letter format, wherein: X = V or L AVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGGTL IRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAGOHNLSQNDGT EQYVSVQKIWHPYWNSDNVMGYDtALLRLAGSV TLNSYVGLGVLPGEGAILANNSPCYiTGWGKTKTN GQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM VCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV TSFVSSRGCNVSRKPTVFTGVSAYISWÍNNVSASN 3 Mature human elastase i fisotype 2), including first "valine” Amino acid, single letter format WGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGGTL IRQNWVMTAAHCVDYQKTFRVVAGDHNISQNDGT EQYVSVQKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV TLNSYVQLGVLPGEGAILANNSPCYfTGWGKTKTN GQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM VCAGGDGSSLWMPG 6 Engíneered elastase proproteín no. 1 (pPROT42 variant) Amíno acid, single letter format, wherein X = V or L TQDLPETN AAWGGTE AGRNSWPSQiSLQYRSGG SRYHTCGGTURQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHNLSQN DGTEQYVS VQKIWHPY WN SONVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVOYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKP7VFTQVSAYIS WÍNNVIASN 7 Engineered elastase proproteín no. 2 Amino acid, single letter format, wherein: X = V or L TQDLPETNAAAVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SRYHTCGGTLíRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG OHNLSGNDGTEQYVSVGKiVVHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAiLANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLGQAYLPSVDYAICSSSSY WGSWKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS WÍNNVIASN 8 Engineered elastase proproteín no. 3 Amino acid, single letter format, wherein: X = V or L TQDLPETAAAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SRYHTCGGTLiRGNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHNLSQNDGTEGYVSVQKíWHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAGSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCY! TGWGKTKTNGQL AQTLQQAYLPS VDYAICSSSS Y WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCGGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYtS WÍNNVIASN 203 SEG !D NO. Description Type of sequence Sequence 9 Engineered eiastase proprotein no. 4 Amino acid, single ietter forniat, whsrein: X = V or L T QDLPETN NAPVGGTEAGRNSWPSQ ÍSLQYRSGG S RYHTCGGTLIRQNVWMTAAHCVDY QKTFRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVGKIWHPYWNSONVAAGY DIAILRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAÍCSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFT QV SAY IS WINNViASN 10 Wlíd-type eiastase proproíein no. 5 {produced from PPROT24 trypsir* activated sequence) Amino acid, single ietter format, wherein: X = V or L TQDLPETNARWGGTEAGRNSWPSGISLQYRSGG SRYHTCGGTLIRQN WVMTAAHCVDYQKTF RWAG OH N LSQN DGTEQYVSVQKiWHPYWN SDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYl TGWGKTKTNGQlAQTlQGAYLPSVDYAiCSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVS S RGCNVSRKPTVFTQVSAYiS WINNVIASN 11 Consensus eiastase recognition sequence 1 (Positions Xaa-,=P3, Xaa2=P2, Xaa3=Pi) Amino acid, three Ietter format Xaa.j Xas2 Xaa3 Xaa-:= alanlne, leucine, ísoieucirte, methionine, lysíne, asparagíne or valine Xaa2 = proilne, alanine, leucine, isoleucine, glycine. valine, or threonine Xaa3 = alanine. leucine, valine, iscteudne, orserine 12 Consensus eiastase recognition sequence 2 (Positions P3-P2-P1) Amino acid, thrse Ietter format Xaa.! Pro Xas2 Xaa1 - alanine, leucine, isoieuclne, methionine, iysine, or vaiine Xaa3 ~ alanine, leucine, valine, isoieucine, or serine 13 Consensus eiastase recognition sequence 3 (Positions P3-P2-P1) Amino acid, three Ietter format Xaa·] Xaa2Xaa3 Xaa^ asparagíne or alanine Xaa.2 = proilne or alanine Xaa3 = alanine or leucine or valine 14 Eiastase recognition sequence 1 (Posítions P3-P2-P1> Amino acid, three Ietter format Ala Ala Aia 15 Eiastase recognition sequence 2 {Positions P3-P2-P1> Amino acid, three Ietter format Asn Ala Aia 16 Eiastase recognition sequence 3 (Positions P3-P2-P1) Amino acid, three Ietter format Asrt Alá Pro 204 1 SEQIDNO, Descri ption Type of sequence | Sequence I 17 Wild-typ© trypsin recognition sequence (pPROT24) (Positions P3-P2- P1) Amino acid, three letter format | Asn Aia Arg | 18 Eiastase recognition sequence 5 (Positions P3-P2-P1) Amino acid, three letter format | Ala Pro Ala I 19 Eiastase recognitiori sequence 6 (Positions P3-P2-P1) Amino acid, three letter format | Ala Ata Pro | 20 Eiastase recognition sequence 7 (Positions P3-P2-P1 ofVaríants48 and 55) Amino acid, three letter format | Asn Pro Ala I 21 Eiastase recognition sequence 8 Amino acid, three letter format | Leu Pro Ala I 22 Human eiastase activation sequence 1 (Wiid-type) Amino acid, three letter format | Thr Gin Asp Leu Pro Glu Tfir Asn Ata Arg I 23 Human eiastase activation sequence 2 Amino acid, three letter format | Thr Gin Asp Leu Pro Glu Thr Asn Ata Ala | 24 pro-PROT-201 cieavage site Amino acid, three letter format | Thr Asn Ala Arg Vat Vai Gty Gfy | 25 pPROT40 cieavage site Amino acid, three letter format | Thr Ala Ala Ata Va! Vai Gly Gly I 26 PPRGT41 cieavage site Amino acid, three letter format | Thr Asn Ala Ala Ala Vai Gly Giy j 27 PPROT42 cieavage site Amino acid, thrse letter format | Thr Asn Ala Ala Vai Vai Gly Giy | 28 pPROT43 cieavage site Amino acid, three letter format | Thr Asn Ala Pro Vat Vat Giy Gty 205

SEQ (D NO, Oescriptíon Typeof sequence Sequence 29 PPROT44 cleavage site Amino acid. three letter formal ThrGiy AisGly lieVaiGlyGfy 30 pPROT45 cleavage sile Amino acid, Ihree leíter format Thr Va! Pro Gly Vai Vai Gly Gly 31 PPROT46 deavage site Amino acici, ihree letter format Thr Ala Pro Gly Vai Vai Gly Gíy 32 PPROT47 deavage sita Amino acid, Ihree Isííer formal Thr Asn Pro Gíy Vai Va! Gly Gly 33 Coding region of a hutnan elastase-1 (NCESÍ Accession No. N_001971) Núcleo tide ACCCAGG ACCTT CCGGAAACCAATGCCCGCGTA GTCGGAGGGACTGAGGCCGGGAGGAATTCCTG GCCCTCTCAGATTTCCCTCCAGTACCGGTCTGG AGGTTCCCGGTATCACACCTGTGGAGGGACCCT TATCAGACAGAACTGGGTGATGACAGCTGCTCA CTGCGT GGATTACCAGAAGACTTTCCGCGT GGT GGCTGGAGACCATAACCTGAGCCAGAATGATGG CACTGAGCAGT ACGTGAGTGTGCAGAAGAT CGT GGTGCATCCATACTGGAACAGCGATAACGTGGC TGCCGGCTATGACATCGCCCTGCTGCGCCTGGC GCAGAGCGTTACCCT CAATAGCT ATGT CCAGCTG G6TGTTCTGCCCCAGGAGGGAGCCATCCTGGCT AACAACAGTCCCTGCTACATCACAGGCTGGGGC AAGACCAAGACCAATGGGCAGCTGGCCCAGACC CTGCAGCAGGCTTACCTGCCCT CTGT GGACTAC GCCATCTGCTCCAGCTCCTCCTACTGGGGCTCC ACTGTGAAGAACACCATGGTGTGTGCTGGTGGA GATGGAGTTCGCTCTGGATGCCAGGGTGACTCT GGGGGCCCCCTCCATTGCTT6GTGAATGGCAAG TATTCTGTCCATGGAGTGACCAGCTTTGTGTCCA GCCGGGGCTGTAATGTCTCCAGGAAGCCTACAG TCTTCACCCAGGTCTCTGCTTACATCTCCTGGAT AAATAATGTCATCGGCT CCAACTGA 34 Yeasl alpha factor signal peptide Amino acid, Ihree leííer format Met-Arg-Phe-Pro-Ser-lte-Phe-Thr-Ata-VaM-eu-Phe- Ala-Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-Afa-Ala-Pro*Val-Asn-Thr- 35 20F primer Núcleo tide ggctcgagaaaagagaggctgaagctactcaggaccttccggaaac caatgcccgg 36 24R primer Núcleo tide gggccgcggcttatcagttggaggcgatgacat 37 PPROT42 P3 cleavage site variant eiasíase Amino acid, single íetter format, wherein: X-VorL AAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCG GTLIRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAGOHNLSQN DGTEQYVSVQKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLA GSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKT KTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVK NTMVCAGGDGVRSGCQGDS6GPLHCLVNGKYSX HGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYISWINNVIA SN 206 SEG !D NO. Description Type of sequence Sequence 38 PPROT42 P2 cleavage sita variant elastase Amirto acíd, single letter format, whenain: X = V or L AWGGTÊAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGGT URQNWVMTAAHCVDYQKTFRVVAGDHNLSQNDG TEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQS VTLNS YVQLGVLPQEGAILANN SPCYITGWG KTKT NGQLAGTLGQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNT MVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXH G VTSFVSSRGCNVSRKPTWTQVSAYISWiNNVIASN 39 Mature porcine pancreatic elastase i {from GenBank Accesston P00772.1) Amino acid, single letter format WGGTEAQRNSWPSQISLQYRSGSSWAHTCGGTL IRQNVWMTAAHCVORELTFRWVGEHNLNQNDGT EQYVGVQKiWHPYWNTDDVAAGYDIALLRtAQSV TLNSYVQLGVLPRAGTILANNSPCYITGWGLTRTN GQLAQTLQQAYLP7VDYAICSSSSYWGSTVKNSM VCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGQYAVHGV TSFVSRLGCNVTRKPTVFTRVSAYISWINNVtASN 40 Elastase variant propeptide cleavage dorna in 40 Amino acíd, three letter format Glu Thr Ala A!a Ala Vai Vai Gly 41 Elastase variant propeptide cleavage dorrtain 41 Amino acid, three letter format Glu Thr Asn Aía Ala Ala Vai Gly 42 Elastase variant propeptide cleavage dorrtain 42 Amino acid, three letter format Glu Thr Asn Aia Ala Vai Vai Gly 43 Elastase variant propeptide cleavage dorrtain 43 Amino acid, three letter format Glu Thr Asn Aia Pro Vai Vai Gly 44 Elastase variant propeptide cleavage domain 44 Amino acid, three letter format Glu Thr Gly Ala Gly lie Vai Gly 45 Elastase varia nt propeptide cleavage domain 45 Amino acid, three letter format Glu Thr Vai Pro Gly Vai Vai Gly 46 Elastase variant propeptide cleavage domain 46 Amino acid, three letter format Glu Thr Ala Pro Gly Va! Vai Gly 47 Elastase variant propeptide cleavage domain 47 Amino acid, three letter format Glu Thr Asn Pro Gly Va! Vai Gly 48 Elastase variant propeptide cleavage domain 48 Amino acid, three ietter format Giu Thr Asn Pro Ata Vai Vai Gly 207 j SEQ1DNO, Description Type of sequence Sequence I 49 Eiastase variant propepíide deavage domain 49 Amino acid, three ietter formai Glu Thr Asn His Aia Vai Vai Giy j 50 Yeastalphamaíing f3ctor signa! peptide, propepíide, and spaeer sequence 1 Amino acid, three Ietter format Met-Arg-Phe-Pro-Ser-He-Phe-Thr-Ala-Val-Leu-Phe- Ala-AJa-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala-AJa-Pra-Val-Asn-Thr* Thr-Thr-Glu-Asp-Glu-Thr-Ala-Ejfn-ffe-Pro-Ala-Glu* Aia-VsMIe-Giy-Tyr-Leu-Asp-Leu-Glu-Gly-Asp-Phe- Asp-Val-Ala-Val-Leu-ProPhe-Ser-Asn-Ser-Thr-Asn- Asn-Asn-G!y-Leu-Leii-Phe-lle-Asrt-Thr-Thr-l!e-Ala- Ser-lle-Ala-Aia-Lys-Glu-GltPGiy-Val-Ser-Leu-Asp- Lys-Arg'Glu-Al3'GiU'Ata | 51 Yeast alphamating facior signal peptide and propepíide sequence 2 Amino acid, three Ietter format Met-Arg-Phe-ProSer-lle-Phe-Thr-Ala-Vaí-Leu-Phe- Ala^Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-AIa-Ala-Pro-Vai-Asrv-Thr- Thr-Thr-Glu-Asp-Giu-Thr-Ala-GIn-lle-Pro-Ala-Giu- Ala-VaMie-Gíy-Tyr-Leu-Asp-Leu-Gíti-Giy-As:p-Phe- Asp-Val-Aia-Val-Leu-Pro-Phe-Ser-Asri-Ser-Thr-Asn- Asn-Asn~Gly-Leu-Leu-Phe-lle-Asn-Thr*Thr-lle-Ala- Ser-iie-Aia-Aia-Lys-Glu-Giu-GSy-Vaí-Ser-Leu-Asp- I 52 Eíastase variant propepíide cíeavage domain 52 Amino acid, three Ietter format GSu Thr Lys Pro Ala Vai Vai Giy | 53 Eiastase variant propepíide cíeavage domain 53 Amino acid, three Ietter format Glu Thr His Pro Ala Vai Vai Giy j 54 Eiastase variant propepíide cíeavage domain 54 Amino acid, three Ietter format Giu His Asn Pro Aia Vai Vai Giy I 55 Eiastase variant propepíide cíeavage domain 55 Amino acid, three ietter format His Thr Asn Pro Aia Vai Vai Giy 56 Eiastase variant propepíide deavage domain 56 Amino add, three Ietter format Pro Thr His Pro Ala Vai Vai Giy !57 Eiastase variant propepíide deavage domain 57 Amino acid, three Ietter format Pro Thr Asn Pro Ala Vai Vai Giy I 58 Eíastase variant propepíide deavage domain 58 Amino acid, three Ietter format His Thr His Pro Aia Vai Vai Giy 208

1 SEQIDNO. Description Type of sequence Sequence ί 59 Eiastase varianí propeptide cieavage domain 59 Amino acid, three letter formai Glu Thr Phe Pro Ala Vai Vai Gíy I 60 Eiastase variant propeptide cieavage domain 60 Amino acid, three letter format His Thr Phe Pro A!a Vai Vai Gly I 61 Eiastase variant propeptide cieavage domain 61 Amino acid, three letter format Gly Thr Phe Pro Aía Vai Vai Gly i 62 Eiastase variant propeptide cieavage domain 62 Amino acid, three letter format His Thr Gly Pro Ala Vai Va! Giy | 63 Eiastase variant propeptide cieavage domain 63 Amino acid, three letter format His Thr Lys Pro Ala Va! Vai Gly I 64 Eiastase proenzyme with variant cieavage domain 48 Amino acid, single ietter format, wherein: X = V or L TQDLPETNPAWGGTEAGRNSWPSGISLQYRSGG SRYHTCGGTURQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHNISQNDGTEQYVSVQKIWHPYWN SDNVAAGY D1ALLRLAGSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCY1 T GWGKTKTNGQl AQTLQQAYLPS VD Y AiCSSSS Y WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGOSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKP7VFTQVSAYIS WINNVÍASN j 65 Eiastase proenzyme with variant cieavage domain 49 Amino acid, single ietter format, wherein: X - V or L TQOLPETNHAWGGTE AGRN S WPSQISLOYRSGG SRYHT CGGTLf RQN WVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGY DÍALLRLAGSVTLNSYVQLGVI.PQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQGAYLPSVOYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTGVSAYiS WINNVÍASN 66 Eiastase proenzyme with variant cieavage domain 52 Amino acid, single ietter format, wherein: X = V or L TQDLPETKPAWGGTEAGRNSWPSQiSLQYRSGG SRYHTCGGTLIRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAGTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAY1S WINNVÍASN 67 Eiastase proenzyme with variant cieavage domain 53 Amino acid, single ietter format, wherein: X = V cr L TGDLPETHPAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SRYHTCGGTURQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHN LSGNDGTEQ YVSVQKIWHPYWNSDNVAAGY DI/MJ.RLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAiGSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYiS WINNVÍASN 209 SEQID NO. Descri ptien Type of sequence Sequence es Elastase proenzyme with variant deavage domam 54 Amino acid, síngie ietter format, wherein; X = V or L TQDLPEHNPAWGGTEAGRNSWPSQiSLQYRSGG SRYHTCGGTLIRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKfVVHPYWNSONVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAIIANNSPCY! TGWGKTKTNGQLAQTLQGAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCWVSRKPTVFTQVSAYtS WiNNVIASN 63 Elastase proenzyme with variant deavage domain 55 Amino acid, single ietter format, wherein: X = V or L tqdlphtnpawggteagrnswfsqislqyrsgg SRYHTCGGTLIRQNWVMTAAHCVDYGKTFRWAG DHNISQNDGTEQYVSVQKSVVHPYWNSDNVAAGY DiALLRLAQSVTLNSYVGLGVLPOEGAILANNSPCY! TGW6KTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYtS WiNNVIASN 70 Wild-type elastase +AlaArg deavage variant Amino acid, single Setter format, wherein: X-VorL AR WGGTEAGRNS WPSQISLQ YRSGGSRYH TCG GTLi RQN WVMTAAHCVOYQKTFRWAGOHN LSQN DGTEQYVSVQKiWHPYWNSDNVAAGYDÍALLRLA QSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYiTGWGKT KTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVK NTMVCAGGOGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSX HGVTSFVSSRGC N VS RKPTVFTQVSAYISWÍNN VIA SN 71 Wild-type elastase +Arg deavage variant Amino acid, single ietter format, wherein: X - V or L RWGGTEAGRNSWPSQíSLQYRSGGSRYHTCGG TLIRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAGOHNLSQND GTEQYVSVQKiWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQ SVTLNSYVQLGVLPQEGAiLANNS PC YITGWG KTK TNGQLAQTLQQAYLPSVDYA1CSSSSYWGSTVKNT MVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHG VTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYlSWINNVSASN 72 73 Variant 48 human eiastase actívation peptide Variant 55 human eiastase actívation peptide Amino acid, three ietter format Amino acid, three Ietter format Thr Gin Asp Leu Pro Gíu Thr Asn Pro Ala Thr Gin Asp Leu Pro Ris Thr Asn Pro Aia 74 Human eiastase deavage domain consensus sequence; corresponde to residires P5, P4, P3.P2, P1, ΡΊ, P’2, and P’3 of an eiastase deavage domain Amino acid, three Ietter format Xaa, Xaa2 Xaa2 Xa,S4 Xaag Xan,, Xaa? Xaa4 Xaa1 = gíutamate, histidine, proiine, giycine, asparaglne, lysine, or alanine Xaa2 = threonine, aianine, proiine or histidine Xaa3 = aianine, leucine, isoleucine, methionine, lysine, asparagine or vaíine Xaa4 = proiine, aianine, leucine, isoleucine, giycine, vaíine, or threonine Xaa5 = aianine, leucine, vaíine, isoleucine, orserine Xaa6 = alanine, leucine, vaíine, isoleucine orserine Xaa7 = giycine, aianine, or vaíine Xaa8 = vaíine, threonine, phenyialanine, tynosíne, or tryptophan 210 SEQID NO. Description Typô of sequence Sequence 75 FCR mutagenesís prímer Nucieic Acid ATC TAC GTA GTC GGA GGG ACT GAG GCC 76 FCR mutagenesís prímer Nucieic Acid gtc gac aag ctt ate agt tgg agg cga t 77 Maíure ELA1 C-terminai variant of Talas ef a/. Protein, single letter format WGGTEAGRWSWPSQÍSLQYRSGGSRYHTCGGTL IRQNVWMTAAHCVDYQKTFRVVAGDHNLSQNDGT EQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDiALLRLAGSV tlnsyvqlgvlpqegailannspcyítgwgktktn GQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM VCAGGDGVRSGCQGDSGGPPPLLGEWQVFSPW SOQLCVQPGL 78 Mature ELA1 variante Prateio, single letter format, wherein: B = W or R J = M or V X = V or L Z = Q cr R WGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCGGTL IRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDGT EQYVSVQKiWHPYWNSDNVAAGYDSALLRLAQSV TLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTN GQLAQTLQQAYLPSVOYAICSSSSYWGSTVKNTM VCAGGOGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV TSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN 79 Aclivation peptide varianls (wild-type, trypsin cteavable) Protein, single letter format, wherein U = Q or H TUDLPETNAR 80 Aclivation peptide variant consensos Protein, three letter format Thr Xaat Asp Leu Pro Xaa2 Xaa;, Xaa,. Xaa5 XaaB Xaa( - glutamine or histidine Xaa2 = glutamate, histidine, proline, glycine, asparagme, lysine. or alanine Xaaa = threonine, alanine, proílne or histidine Xaa4 = alanine, leuctne, isoleucine, methionlne, lysine, asparagine or valinB Xaa6= proiine, aíanine, leucine, tsoieuciria, glycine, valine, or threonine Xaa6 = alanine, leucine, valine, isoleucine, or serine 211 SEQ ÍD NO. 81

Description

Coding region of ELA-1.2A

Typeof | sequence Nucieoííde

Sequence

ACTCAGGACCTTCCGGAAACCAATGCCCGGGTA GTCGGAGGGACTGAGGCCGGGAGGAACTCCTG GCCCTCTCAGATTTCCCTCCAGTACCGGTCTGG AGGTTCCTGGTATCACACCTGTGGAGGGACCCT TATCAGACAGAACTGGGTGATGACAGCTGCACA CTGCGTGGATTACCAGAAGACTTTCCGCGTGGT GGCTGGAGACCATAACCTGAGCCAGAATGATGG CACTGAGCAGTACGTGAGTGTGCAGAAGATCGT GGTGCATCCATACTGGAACAGCGATAACGTGGC TGCAGGCTATGACATCGCCCTGCTGCGCCTGGC CCAGAGCGTTACCCTCAATAGCTATGTCCAGCTG GGTGTTCTGCCCCAG6A6GGAGCCATCCTGGCT AACAACAGTCCCTGCT ACATCACAGGCTGGGGC AAGACCAAGACCAATGGGCAGCTGGCCCAGACC TTGCAGCAGGCTTACCTGCCCTCTGTGGACTAT GCCATCTGCTCCAGCTCCTCCTACTGGGGCTCC ACTGTGAAGAACACTATGGTGTGTGCTGGTGGA GATGGAGTTCGCTCTGGATGTCAGGGTGACTCT GGGGGCCCCCTCCATTGCTTGGTGAATGGCAAG TATTCTCTTCATGGAGTGACCAGCTTTGTGTCCA GCCGGGGCTGTAATGTCTCTAGAAAGCCTACAG TCTTCACACGGGTCTCTGCTTACATCTCCTGGAT AAATAATGTCATCGCCTCCAACTGATAA 82 83 84

Translationpraduct Proteín, sing of ELA-1.2A leiter format (trypsin aetivaied pPROT24 sequence) Variante of Proíein, sing transíaíion product letter format of ELA-1.2A wherein; U = Q or H B = W or R (trypsin aetivaied J = M or V PPROT24 X = V or L sequence) Z = Q or R Mature tuiman Amino acid, efastase ), single letier inciuding first format "valine" wherein: B = W or R J = M or V X = V or L Z = Q or R

TGDLPEfTNARWGGTEAGRNSWPSQSSLQYRSGG SWYHTCGGTURQNWVMTAAHCVDYQKTFRVVAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKiWHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGGLAQTLQQAYLPSVOYAICSSSSY WGS7VKNTMVCAGGDGVRSGCQG0SGGPLHCLV N GKYSLHG VTSFVSSRGCN VSRKPTVFTRVSAYIS WiNNVIASN TUDLPETNARWGGTEAGRNSWPSQISLGYRSGG S 8 YHTCGGTLf RQN WVJTAAHC VDYQKTFR WAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKiWHPYWNSDNVAAGY OIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGGLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNViASM

WGGTEAGRNS WPSQISLGYRSGGSB YHTCGGTU IRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNOGT EQYVSVQKI WHPYWNSDNVAAGYDtALIRLAGSV TLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTN GQLAGTLGGAYLPSVOYAICSSSSYWGSTVKNTM VCAGGOGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV TSFVSSRGCN VS RKPTVFTZVSAYISWINNVLASN 212

SEQ !D NO. Description j Type of | Séquènce 1 sequence j 85 Mature human j Amino acid, | VGGTEAGRNSWPSQiSLQYRSGGSBYHTCGGTU eiastase 1, minus single ietter | RQNVWJTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDGTE first "valirte" format, ! QYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAOSVT wherein- 1 LNSYVQIGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTNG R - W nr R ^ QLAQTLQC5AYLPSVDYA1CSSSSYWGSTVKNTMV 1 CAG6DGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGVT J = M or V | SFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWÍNNVIASN X = V or L | J Z = Q Of R | 86 Mature human j Amino acid, | GGTEAGRNSWPSQISLGYRSGGS8YHTCGGTL1R eiastase 1. minus single Ietter j QNVWJTAAHCVDYQKTFRVVAGDHNLSQNDGTE first two "valines" format, ! QYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSVT Wherein- 1 LNSYVQLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGK.TKTNG B-WorR 1 QLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTMV " 1 CAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGVT J = M or V | SFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN X = V or L | J Z = Q: or R j 87 Matura human j Amino acid, j AVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCGGTL elastasel.with first single ietter | IRQNVWJTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDGT "valine" subsíituied format. 1 EQYVSVGKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV bv “alaníne" wherein- 1 TLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYfTGWGKTKTN y R-wnrR ; GQLAQTLQGAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM VO^GGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV J = M or V TSFVSS RGCN VSRKPTVFTZVSAYISWtNN Vt ASN X = V or L j Z = Qor R 1 88 Engineered eiastase proprotein no. 1 (pPROT42 varia nt) Amino acid, single ietter format, wherein: U = G or H B = W or R J = M or V X = V or L Z = Q or R TUOLPETNAAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTtIRQNVWJTAAHCVOYQKTFRWAG DHNLSGNDGTEQYVSVQKfWHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAiCSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNVtASN 89 Engineered eiastase proprotein no. 2 Amino acid. single Ietter formal, wherein: U = Qor H B = W or R J = M or V X = V or L Z = QorR TUDLPETNAAAVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTLIRGNWVJTAAHCVOYQKTFRVVAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNSDIWAAGY DÍALLRIAQSVTLNSYVQLGVIPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAtCSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCGGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WtNNVtASN 213

SEQID NO. Descríption Type of sequence Sequence I 90 Engineered elastase proprotein no, 3 Amino 3cid: single ietter format, wherein: U = Q or H B = W or R J = M or V X = V or L Z = Q or R TUDLPETAAAVVGGTEAGRNSWPSGISLGYRSGG | SBYHTCGGTLIRQNVWJTAAHCVDYQKTPRWAG | DHNLSQNDGTEQYVSVQKiVVHPYWNSDNVAAGY ! Dl ALLRLAQSVTLN SYVCH.GVL.PQEGAÍLANN SPCYI 1 TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY I WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGQSGGPLHCLV | NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYtS | WINNVIASN | 91 Engineered elastase proprotein no. 4 Amino acid, single Ietter format, wherein; U = Q or H B = W or R j = M or V X = V or L Z = Q or R TUDLPETNNAPVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTLiRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAG | DHNLSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGY DtAU_RLAGSVTl.N SYVQLGVLPQEGAILAN NSPCY t TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYSS | WiNNViASN | 92 Engineered elastase proprotein no. 5 (pPROT24 trypsin activated sequence) Amino acid, single ietter format, wherein; U = O or H B = W or R J = M or V X = V or L Z = Q or R TUDLPETNARWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG 1 SBYHTCGGTURQNWVJTAAHCVDYQKTFRVVAG | OHN LSQNDGTEQYVSVQK! WHPY WNS DNVAAGY | DIALLRLAaSVTLNSYVQLGVLPGEGAILANNSPCYt 1 TGWGKTKTNGQLAQTLGQAYLPSVDYAICSSSSY ! WGSTVKNTM VCAGGDGVRSGCQGDSGGPL HCLV | NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYíS j WiNNViASN | 93 Consensus elastase recogniSon sequence 2 (Positions P3-P2-P1) Amino acid, three Ietter format Xaa! Pro Xaa2 Xaa1 = alanine, leticine, isoieucine, methionine, lysine, asparaglne or vaiine Xaa2 = alanine, leucine, vaiine, isoieucine, or serine 94 PPROT42 P3 cteavage site variant elastase Amino acid. single Ietter format, wherein: B = W or R J = M or V X = V or L Z = Q or R AAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCG | GTLiRGNWVJTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQN DGTEQYVSVGKiWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLA QSVTLNS YVQLGVLPQEGAILAN NSPC Yl TGWG KT | KTNGGLAQTLQQAYLPSVDYAiCSSSSYWGSTVK NTMVCAGGOGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSX ! HGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNViA ! SN I 214

$εα iD mo. Descríptíon Type of sequence Sequence 95 PPROT42 P2 cleavage sito variant eíastase Amino acid, single íetter format, wherein; B = W or R j = M or V X = V or L Z = Q or R AWGGTEAGRNSWPSGtSLQYRSGGSBYHTCGGT LIRQNWVJTAAHCVDYGKTFRWAGDHNLSQNDG TEOYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQS VTLNS YVQLGVLPQEGAILANN SPC YITG WGKTKT NGQLAGTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNT MVCAG GDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGK YSXH G VTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN 96 Yeasíaíphamating factor signa! peptide, propeptide, and spacer sequence Amino actd, three letter format Met-Arg-Phe-Pro-Ser-ife-Phe-Thr-Aía-Val-Leu-Phe- Ala-Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala-Afa-Pro-Vat-Asn-Thr- Thr-Thr-Glu-Asp-Glu-Thr*Ala-Gln-lfe-Pro-Ala-Glu- Ala-Val-Ha-Gly-T yr-Ser-Asp-leu*Gtu*Gly-Asp-Phe- Asp-Val-Ala-Vai-Leu-Pro-Phe-Ser-Asn-Ser-Thr-Asr»- Asrt-Gly-Leu-Leu-Phe-lle-Asn-ThpThr-lle-Ala-Serdle- Ala-Ala-lys-Glu-Giu-Gty-Vat-Ser-teu-Gtu-Lys-Arg- Glu-Ata-Giu-Ala 97 Yeast aiphamating factor signa! peptide and propeptide sequence Amino acid, three letter format Met-Arg-Phe-Pro-Ser-lie-Phe-Tnr-Ata-Val-Leu-Phe- Ala-Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala-Ata-Pro-Val-Asn-Thr- Thr-Thr-Glu-Asp-Gíu-Thr-Ala-Gfn-lle-Pro-Aia-Glu- Alà-Vâl-liê-Gty-T yr-Sef-Asp-Leu-GIu-Gly-Asp-Phe- Ast>-Va!-Aia*Val-Leu-Pro-Phe-Ser-Asn-Ser-Thr-Asn- Asn-Gfy-Leu-Leu-Phe-lie-Asn-Thr-Thr-lie-Ala-Ser-lle- Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-Gty-Vat-Ser-Leu-Glu- ] 98 Eíastase proenzyme with variant cleavage domain 46 Amino acid, single ietter format, wherein: U = Q or H B W or R J = M or V X = V or L 2 = Qor R TUDLPETNPAWGGTEAGRNSWPSQISt-QYRSGG SBYHTCGGTLfRQNVWJTAABCVQYQKTFRVVAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKiVVHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVOLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVOYAtCSSSSY WGSTVKNTMVCAGGOGVRSGCQGOSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSR6CNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNVfASN 99 Eíastase proenzyme with variant cleavage domain 49 Amino acid, single tetter formal, wherein: U = Q or H B = W or R J = M or V X = V or L Z = QorR TUDLPETNHAWGGTEAGRNSWPSGISLQYRSGG I SBYHTCGGTLIRGNVWJTAAHCVOYQKTFRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIVVHPYWNSDNVAAGY DIALUÍLAQSVTLNSYVQLGVtPQEGAiLANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVOYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WJNISiVtASN 100 Eíastase j Amino acid, proenzyme with single tetter variant cleavage format, domain 52 wherein: U = Q or H B = W or R J = M or V X = V or L j Z = QorR TUDLPETKPAVVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTLIRQNWVJTAAHCVDYQKTFRVVAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILAMMSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCA6G0GVRSGCGGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WtNIWIASN 215

SEG (D NO. Description Type of sequence Sequence 101 Elastase proenzyme with varianí cieavage domain 53 Amino acid, single letter format, wherein: U = Q or H B = W or R J = M or V X = V or L 2 = Q or R TUDLPETHPAWGGTEAGRNSWPSQíSLQYRSGG SBYHTCGGTURQNWVJTAAHCVDYGKTFRWÂG DHNLSGNDGTEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGY oiallrlaqsvtlnsyvqlgvlpqegailannspcyi TGWGKTKTNGQLAQTLQGAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCIV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WÍNNVIASN 102 Elastase proenzyme with varian! cieavage ctomain 54 Amino acid, single letter format, wherein: U = Q or H B = W or R J = M or V X = V or L Z = Q or R TU DL PEHNPA WGGTE AGRNSWPSGISLQYRSGG SBYHTCGGTLfRQNWVJTAAHCVDYOKTPRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANMSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYIPSVDYAIC3SSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXH GVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WÍNNVIASN 103 Elastase proenzyme with varianí cieavage domain 55 Amino acid. single letter format, wherein; U = Q or H 8 = W or R J = M or V X = V or L Z * Q or R TUDIPHTNPAVVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTLIRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNSONVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGGLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGOGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WÍNNVIASN 104 Wiid-type eiastase +AiaArg cieavage varianí Amino acid, single letter format, wherein; 8 = W or R J = M or V X = V or L Z = Q or R ARWGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGGSBYHTCG GTLIRQN WVJTAAHC VDY QKTFRWAGDHNLSQN DGTEQYVSVQKIVVH PYWNSDNV AAGYDIALLRLA QSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYiTGWGKT KTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVK NTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSX HGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVtA SN vA O UI Wiíd-iype etastase +Arg cieavage variant Amino acid, single letter format, wherein: 8 = W or R J = M or V X = Vor L Z = Q or R RWGGTEAGRNSWPSQÍSLGYRSGGSBYHTCGGT LIRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDG TEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQS VTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKT NGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNT IWVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHG VTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYiSWINNVIASN 216

$EQ 1DN0. Descríption i Type of | sequence Sequence 106 Mature human j Amino acid, elastase!, minus N single letter terminal "VVGG'' formal, sequence wherein: B = Wor R J = M or V X - V of L I Z = Q or R TEAGRNSWPSGISLQYRSGGSBYHTCGGTLIRQN WVJTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDGTEQYV SVQKIWHPYWNSDNVAAGYDiALLRLAQSVTLNS YVQLGVLPQEGAILANNSPCYtTGWGKTKTNGQLA QTLQQAYLPSVOYAICSSSSYWGSTVKNTMVCAG GDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGVTSFV SSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVtASN 107 Mature human elastase!, minus N terminal WGGTE" sequence Amino acid, single letter format, wherein: 8 = Wor R J = MorV X = Vor L Z = Q or R AGRNSWPSQtSLQY RSGGSBYHTCGGTLIRQNWV JTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDGTEQYVSV QKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAOSVTLNSYV QLGVLPQEGAÍLANNSPCYITGWGKTKTNGQLAQT tGQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTMVCAGGD GVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGVTSFVSS RGCNVSRKPTVFTZVSAYfSWINNVIASN 108 Mature human elastase I, minus N terminal “WGGTEA GR·' sequence Amino acid, single letter format, wherein: B = Wor R J = M or V X = V or L Z = Q or R NSWPSGtSLQYRSGGSBYHTCGGTLIRQNWVJTA AHCVDYtXTFRWAGDHNLSGNDGTEQYVSVGKI VVHPYWNSONVAAGYDlALLRtAQSVTLNSYVQLG VLPQEGAilANNSPCYITGWGKTKTNGQLAQTLQQ AYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTMVCAGGDGVR SGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGVTSFVSSRGC NVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN 109 Fígure 1A sequence Nueleic Acid GAATTCAGTACTCAG GACCTTCCGG AAACCAATG CCCGGGTAGT CGGAGGG ACTGAGGCCGGGAGG AACTCCTGGCCCTCTCAGATTTCCCTCCAGTACC GGTCTGGAGGTTCCTGGTATCACACCTGTGGAG GGACCC7TATCAGACAGAACTGGGTGAT6ACAG CTGCACACTGCGTGGATTACCAGAAGACTTTCC GCGTGGTGGCTGGAGACCATAACCTGAGCCAGA ATGATGGCACTGAGCAGTACGTGAGTGTGCAGA AGATCGTGGTGCATCCATACTGGAACAGCGATA ACGTGGCTGCAGGCTATGACATCGCCCTGCTGC GCCTGGCCCAGAGCGTTACCCTCAATAGCTATG TCCAGCTGGGTGTTCTGCCCCAGGAGGGAGCCA T CCTGGCTAACAAC AGTCCCTGCTACATCACAGG CTGGGGCAAGACCAAGACCAATGGGCAGCTGG CCCAGACCTTGCAGCAGGCTTACCTGCCCTCTG TGGACTATGCCATCTGCTCCAGCTCCTCCTACTG GGGCTCCACTGTGAAGAACACTATGGTGTGTGC TGGTGGAGATGGAGTTCGCTCTGGATGTCAGGG TGACTCTGGGGGCCCCCTCCATTGCTTGGTGAA TGGCAAGTATTCTCTTCATGGAGTGACCAGCrrT GTGTCCAGCCGGGGCTGTAATGTCTCTAGAAAG CCTACAGTCTTCACACGGGTCTCTGCTTACATCT CCTGGATAAATAATGTCATCGCCTCCAACTGATA AGCTTGGATCCGTCGAC 217 SÊQtO NO. Descripiion Type of Sequence sequence 110 Figure 1A sequence Amino Acid, MKRILAIHQAMEGAPRVTLTSRANSISTSTHHSVLH single lettsr SGAPVGGAGADGIVHRGQVSLLQGLGQLPIGLGLA formai PACDVAGTWSGDGSLLGQNTGLDIAJEGNALGQA QQGDVIACSHVIAVPVWMHHOLLHTHVLtSAlILAQ VMVSSHHAESLLVIHAVCSCHHPVLSDKGPSTGVÍ PGTSRPVLEGNLRGPGVPPGLSPSDYPGIGFRKVL s 111 Figure 1B sequence Nucleic Acid ACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGG GTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTACT CAGGACCTTCCGGAAACCAATGCCCGGGTAGTC | GGGGGG 112 Figure 1B sequence Amino Acid, THR ILE ALA SER ÍLE ALA ALA LYS GLU GLU GLY ihree lelter VAL SER LEU GLU LYS ARG GLU ALA GLU ALA formai THR GLN ASP LEU PRO GLU THR ASN ALA ARG VAL VAL GLY GLY 113 Figure 13 sequence Nucleic Acid CCGCGGACCCAGGACTTTCCAGAAACCAACGCC CGGGTAGTTGGAGGGACCGAGGCTCAGAGGAA TrCTTGGCCATCTCAGATTTCCCTCCAGTACCGG TCTGGAAGTTCGT GG GCTCACACGTGT GGAGGG ACCCT CATCAGGCAGAACTGGGT GATG ACAGCC GCTCACTGCGT GGACA6AGAGTTGACCTTCCGT GTGGTGGTTGGAGAGCACAACCTGAACCAGAAC GATGGCACCGAGCAGTACGTGGGGGTGCAGAA GATCGTGGTGCATCCCTACTGGAACACCGACGA CGTGGCTGCAGGCTATGACATCGCCCTGCTGCG CCTGGCCCAGAGTGTAACCCTCAACAGCTACGT CCAGCTGGGTGTTCTGCCAAGGGCTGGGACCAT CCTGGCTAACAACAGTCCCT GCTACATCACAGG GTGGGGCCTGACCAGGACCAATGGGCAGCTGG CCCAGACCCTGCAGCAGGCTTACCTGCCCACCG TGGACTACGCCATCTGCTCCAGCTCCTCGTACT GGGGCTCCACCGTGAAGAACAGCATGGTGTGCG CCGGAGGGGACGGAGTTCGCTCTGGATGTCAG GGTGATTCTGGGGGCCCCCTTCATTGC7TGGTG AATGGTCAGTATGCTGTCCACGGTGTAACCAGCT TCGTGTCCCGCCTGGGCTGTAATGTCACCAGGA AGCCCACAGTCTTCACCAGGGTCTCTGCTTACAT CTCTTGGATAAATAACGTCATTGCCAGCAACTGA TAATCTAGA 114 Figure 14 sequence Amino Acid. TGDFPETNARWGGTEAQRNSWPSQISLGYRSGS single ietter SWAHTCGGTURQNWVMTAAHCVDRELTFRVWG formai EHNLNQNDGTEQYVGVQKtWHPYWNTDDVAAGY OlALLRLAGSVTLNSYVQLGVLPRAGTILANNSPCYf TGWGLTRTNGGLAQTtGQAYLPTVDYAICSSSSY WGSTVKNSMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGQYAVHGVTSFVSRLGCNVTRKPTVFTRVSAYIS W1NNVIASN 115 Cleavage domain sequence of trypsinaetivaíed pPROT101-24-V Amino Acid, Phe Pro Glu Thr Asn Ala Arg Vai Vai G!y three Ietter format 116 Cleavage domain sequence of auto- aciivated PPROT101-42-V Amino Acid Phe Pro Glu Thr Asn Ala Ala Vai Vai Gly 218 SEQ SD NO, Descrlption Type of sequence Sequence 117 Cleavage doma In sequence of auto' acíívated PPROT101-49-V Amino Acid Leu Pro His Thr Asn Pro Ala Vai Vai Gly 118 Cleavage domain sequence of auto-activated pPROT101-55L-V Amlno Acid P:he Pro Giu Thr Asn His AJa Vai Vai Gly 219

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de elastase pancreática auto-ativada tipo I compreendendo (i) uma sequência de ativação de elastase compreendendo uma sequência de reconhecimento de elastase operacionalmente ligada a (ii) a sequência de aminoácidos de uma elastase pancreática madura tipo I.
2. Proteína da reivindicação 1, em que o segundo resíduo de aminoácido N-terminal para a ligação que é clivado para dar a proteína de elastase pancreática madura tipo I é prolina, ou em que a referida sequência de reconhecimento de elastase compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID N°s: 11, 13, 15, 20 e 93, ou em que a referida sequência de ativação compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID N°s: 80, 72 e 73, ou em que a referida proteína compreende um domínio de clivagem compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID N°s: 42, 48, 49, 53 e 55, caracterizado por, opcionalmente, a referida sequência de elastase madura compreender uma sequência possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido a partir da posição 6 para a extremidade da SEQ ID N°: 84 ou SEQ ID N°: 1, ou em que a referida proteína compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID N°s: 64, 65, 67 e 69 e/ou; 1 em que a referida proteína compreende uma sequência de sinal.
3. Molécula de ácido nucleico que codifica para uma proteína de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 .
4. Vector compreendendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 3.
5. Célula hospedeira geneticamente manipulada para expressar a molécula de ácido nucleico da reivindicação 3 ou uma célula hospedeira compreendendo o vector da reivindicação 4, em que opcionalmente pelo menos uma cópia do referido vector é integrado no genoma da célula hospedeira.
6. Método de produção de uma proteína de elastase pancreática tipo I, compreendendo a cultura da célula hospedeira da reivindicação 5, sob condições em que é produzida uma proteína de proelastase, ainda opcionalmente compreendendo submeter a proteína a condições de ativação de tal modo que uma proteína de elastase pancreática madura tipo I maduro seja produzida.
7. Método da reivindicação 6 em que a tripsina não é usada em qualquer porção do processo de produção.
8. Método das reivindicações 6 ou 7, em que a célula hospedeira é cultivada na presença de um composto de citrato, sucinato ou acetato para circunscrever a auto-ativação de uma proelastase auto-ativada, ou em que o composto de citrato, sucinato ou acetato esta presente, 2 na dita cultura, numa concentração de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50-200 mM, 100-150 mM, 75-125 mM ou 90-110 nM; em que o referido composto de citrato, sucinato ou acetato é opcionalmente citrato de sódio, sucinato de sódio ou acetato de sódio, respectivamente, e/ou em que as referidas condições da reivindicação 6 incluem um período de crescimento ou indução a um pH de 2 a 6 e o referido método compreende, ainda, aumentar o pH da solução contendo a proteína para um pH de 6 a 12.
9. Método de produção de uma proteína de elastase pancreática madura tipo I, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira manipulada para expressar um ácido nucleico como definido na reivindicação 3 sob condições em que seja produzida uma proteína de proelastase; e (b) sujeitar a dita proteína de proelastase a condições de ativação tais que seja produzida uma proteína de elastase madura, em que a dita ativação no passo (b) é levada a cabo por uma elastase.
10. Método da reivindicação 9, em que a dita proteína de elastase pancreática madura tipo I é isolada.
11. Método de produção de uma composição farmacêutica compreende uma proteína de elastase pancreática madura tipo I, compreendendo: (a) sujeitar uma proteína de elastase pancreática tipo I auto-ativada a condições de auto-ativação para produzir uma proteína de elastase pancreática madura 3 tipo I; em que a dita auto-ativação é levada a cabo por uma elastase, e (b) formular a proteina de elastase pancreática madura tipo I.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, que compreende, ainda, os passos de (i) produzir uma elastase pancreática madura tipo I liofilizada; e (ii) reconstituir a elastase pancreática madura tipo I liofilizada em água ou num transportador farmaceuticamente aceitável, para produzir uma composição farmacêutica compreendendo uma elastase pancreática madura humana tipo I.
13. Método de acordo com qualquer das reivindicações 6-12, em que a ativação da dita proteina de proelastase é iniciada por adição de quantidade catalítica de elastase.
14. Composição farmacêutica que é: (a) obtida pelo método de qualquer das reivindicações 11, 12 ou reivindicação 13 quando dependente das reivindicações 11 ou 12, e/ou (b) compreender (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de elastase pancreática madura humana tipo I e (ii) um transportador farmaceuticamente aceitável, em que cada composição de (a) e/ou (b) 4 (c) a elastase pancreática madura humana tipo I é caracterizada por uma atividade especifica de 1 a 40 U/mg de proteina e/ou (d) a atividade de tripsina na dita composição é menos de 4 ng por 1 mg de proteina de elastase madura.
15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, em que a composição é livre de qualquer proteina consistindo na SEQ ID N°s 70 e 71, e/ou é livre de tripsina.
16. Composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 14 ou 15, a qual é uma solução para administração parentérica e compreende fosfato, um tampão de fosfato ou uma solução salina tamponada de fosfato. 5