BRPI0819977A2

BRPI0819977A2 - proteína elastase pancreática tipo i, seu método de produção, sua composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método de produzir a referida composição, e uso da referida composição

Info

Publication number: BRPI0819977A2
Application number: BRPI0819977-9A
Authority: BR
Inventors: F. Nicholas Franano; Kimberly Bland; Marco D. Wong; Bee C. Ding
Original assignee: Proteon Therapeutics, Inc.
Priority date: 2007-12-04
Filing date: 2008-12-04
Publication date: 2020-08-18
Also published as: CA2707051A1; TWI619726B; US20130336956A1; CY1114724T1; US8501449B2; AR069584A1; JP2015172056A; PT2229440E; TW201643188A; US20150329846A1; TWI577385B; CN104711243B; CN103952388A; CN109893647A; HK1148772A1; EP2229440B9; AU2008338743A1; HRP20131135T1; TW200938219A; US20180155703A1

Abstract

PROTEÍNA ELASTASE PANCREÁTICA TIPO l, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, SUA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUZIR A REFERIDA COMPOSIÇÃO, E USO DA REFERIDA COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a métodos para a produção, purificação, formulação e utilização de proteínas elastases recombinantes biologicamente ativas. Método recombinantes para produzir proteínas elastases terapeuticamente úteis, assim como composições farmacêuticas compreendendo as referidas proteínas elastases são descritos. As proteínas elastases recombinantes novase as preparações de proteína também são descritas. Os métodos são descritos para tratar e prevenir as doenças de tubos biológicos usando composições farmacêuticas contendo as proteínas elastases da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNA ELASTASE PANCREÁTICA TIPO |, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, SUA | COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUZIR A REFERIDA COMPOSIÇÃO, E USO DA REFERIDA COMPOSIÇÃO".

Este pedido de patente reivindica o benefício do pedido provisó- rio U.S. Nº 60/992 319, depositado em 4 de dezembro de 2007, os conteú- dos do qual são aqui incorporados em sua totalidade por referência.

1. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos recombinantes para a produção e formulação de proteínas elastases para uso no tratamento e pre- venção de doenças de tubos biológicos. A presente invenção refere-se ainda às proteínas elastases recombinantes novas e composições farmacêuticas contendo tais proteínas. A presente invenção refere-se posteriormente ao uso de composições farmacêuticas compreendendo proteínas elastases re- combinantes para o tratamento e prevenção de doenças de tubos biológicos.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A elastina é uma proteína capaz de espontaneamente retornar de- pois de ser estirada. A elastina reticulada é o principal componente estrutural das fibras elásticas, que confere elasticidade do tecido. Uma proteinase pode ser chamada de uma elastase se ela possuir a capacidade de solubilizar a elas- tina madura reticulada (Bieth, JG "Elastases: catalytic and biological properties", nas pp. 217-320 (Edição Mecham, Regulation of Matrix Accumulation, Nova York, Academic Press, 1986). Vários pedidos de patentes publicados (WO 2001/21574; WO 2004/073504; e WO 2006/036804) indicam que a elastase, isolada e em combinação com outros agentes, é benéfica no tratamento de do- | enças de tubos biológicos, incluindo as tubos biológicos que está experimen- tando, ou suscetível de experimentar, obstrução e vasoespasmo. Para a terapia de elastase de indivíduos humanos, o uso de uma elastase humana é desejá- — velparareduziro risco de reação imunológica a uma elastase não-humana. Até hoje, entretanto, não há meios conhecidos comercialmente viáveis de produzir elastase biologicamente ativa em forma suficientemente | pura e em quantidades suficientes para aplicações clínicas. Porque as elas-

tases são poderosas proteases que podem hidrolisar numerosas proteínas D exceto a elastina, a atividade proteolítica da elastase apresenta obstáculos em potencial para sua produção recombinante. Por exemplo, a atividade da ; elastase madura pode danificar a célula hospedeira, que está expressando- a, degradar-se, ou degradar os agentes usados para ajudar na produção ou na caracterização da elastase.

As elastases são frequentemente expressas em pré-pró- proteínas, contendo um peptídeo sinal, um peptídeo de ativação, e uma por- ção madura, ativa. A clivagem da sequência sinal sob secreção rende uma pró-proteina que pode ter pouca ou nenhuma atividade enzimática, e cuja sequência de aminoácido contém a sequência de aminoácido de um peptí- deo de ativação e de uma proteina madura. Geralmente, para a expressão recombinante, um precursor inativo pode ser expresso em vez da enzima : madura ativa para contornar os danos a célula que o expressa. Por exemplo, a Patente US. Nº 5212068 descreve a clonagem de cDNAs da elastase - pancreática humana (referidas aqui como elastase "IIA", "Il B", "INIA" e "IIIB"). As várias elastases foram expressas em sequência completa de cDNAs, in- cluindo as sequências sinais nativas, em células mamíferas COS-1. Além disso, as versões modificadas das elastases, contendo uma sequência sinal de B.subtilise uma sequência sinal de B-galactosidase, foram também ex- pressas em B.subtilis e E.coli, respectivamente. A Patente U.S. Nº 5212068 sugere também expressar elastases em S.cerevisiae. Geralmente, os exem- plos de trabalho de expressão da elastase na Patente U.S. Nº 5212068 mos- tram baixa atividade da elastase recuperada ou exigem uma etapa de ativa- ção envolvendo o tratamento com tripsina para gerar a elastase ativa. Além disso, as elastases estavam amplamente presentes em corpos de inclusão quando expressas em E. coli, e apenas pequenas porções da elastase ex- pressas eram solúveis e ativas. Nenhuma das preparações de elastase des- crita na Patente U.S. Nº 5212068 foi purificada ao grau farmacêutico.

Assim, há uma necessidade da técnica para métodos de produ- ção recombinantes que permitem a geração de quantidades terapêuticas de elastases de grau farmacêutico biologicamente ativo e de preferência evitar

' | 3 uma etapa de ativação de tripsina que é custosa para a preparação em - grande escala e pode resultar em contaminação da tripsina do produto final. A administração de uma elastase contendo tripsina a um paciente pode re- ' sultar em ativação de receptores 1 e 2 ativados por protease, que podem reduzir alguns dos efeitos benéficos do tratamento da elastase.

Citação ou identificação de qualquer referência na Seção 2 ou em qualquer outra seção do presente pedido não deve ser interpretada co- mo uma admissão de que tal referência está disponível como técnica anteri- or da presente invenção.

3.SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece novos métodos eficientes para pro- duzir proteínas elastases recombinantes e o uso das proteínas recombinan- tes em composições, por exemplo, composições farmacêuticas, formulações / de elastase ou dosagens unitárias, para o tratamento e a prevenção de do- enças de tubos biológicos.

: A presente invenção é direcionada às proteínas pró-elastases autoativada, ácidos nucleicos que codificam as proteínas pró-elastases au- toativadas, células hospedeiras compreendendo os referidos ácidos nuclei- cos, métodos de produção de proteínas pró-elastases autoativadas e uso de proteínas pró-elastases autoativadas na produção de proteínas elastases maduras ativas biologicamente, por exemplo, para uso em formulações far- macêuticas. O termo "autoativada" (ou "autoativada") é usado aqui de forma alternada com o termo "auto-ativação", "própria-ativação", e "própria-ativada" e não tem a intenção de sugerir que uma etapa de ativação foi realizada. O termo "ativação" é usado aqui de forma intercambiável com o termo "conver- são" e não tem a intenção de sugerir que uma proteína resultante da "ativa- ção" necessariamente possui atividade enzimática.

Como usado aqui abaixo, e salvo indicação em contrário, o ter- mo "elastase" geralmente se refere a proteínas elastases maduras com ati- vidade de elastase, bem como proteínas elastases não-maduras, incluindo proteínas pró-elastases não-maduras (também referidas aqui como pró- proteínas elastases) e proteínas pré-pró-elastases não-maduras (também

. 4 referidas aqui como pré-pró-proteínas elastases). * As elastases preferidas da invenção são elastases pancreáticas tipo |, por exemplo, elastase pancreática tipo | humana e elastase pancreáti- f ca tipo | porcina. Elastases pancreáticas tipo | são às vezes referidas aqui como "elastase-1", “elastase |", "elastase tipo 1", "tipo 1 elastase" ou "ELA- 1". Elastasepancreática tipo | humana também é referida aqui como hELa-1 ou hELA-1 humana, e a elastase pancreática tipo | porcina também é referi- da aqui como pELA-1 ou ELA-1 porcina.

A proteína elastase madura da invenção tem tipicamente uma sequência de aminoácido codificada por um gene da elastase que ocorre naturalmente ou uma variante de tal sequência. As variantes da sequência preferidas, incluindo as variantes contendo substituições de aminoácido, são descritas aqui. Uma proteína pró-elastase é um precursor amplamente inati- É vo de uma proteína elastase madura e uma proteína pré-pró-elastase con- tém ainda uma sequência sinal de para a secreção de proteína. As sequên- f cias pré e pró das proteínas elastases da invenção não são geralmente nati- vas aos genes da elastase que codificam as proteínas elastases maduras da invenção. Assim, num certo sentido, as proteínas elastases não maduras da invenção são proteínas "quiméricas", com suas porções maduras codifica- das porum gene da elastase que ocorre naturalmente e suas porções não- maduras codificadas por sequências de genes de não-elastases.

Para facilitar a referência, as proteínas elastases da invenção e seus componentes de sequência principais são mostrados na figura 2. Con- forme mostrado na figura 2, os resíduos de aminoácido na sequência da pró- elastase que são N-terminal à ligação de clivagem (ou seja, a ligação que é clivada para produzir a proteína elastase madura) são designados aqui como PX, ...P5, P4, P3, P2 e P1, onde P1 é imediatamente N-terminal à ligação de clivagem, enquanto que os resíduos de aminoácidos localizados ao C- terminal para a ligação de clivagem (e ao N-terminal) da proteína elastase madura são designados P1', P2', P3', ... PX', onde P1' é imediatamente C- terminal à ligação de clivagem e representa o resíduo de aminoácido N- terminal da proteína madura. A figura 2 mostra também os seguintes com-

Á 5 ponentes: : (1) SEQUÊNCIA SINAL: uma sequência que aumenta a propor- ção de moléculas expressas que são secretadas da célula. Uma sequência i de exemplo é aminoácidos de 1 a 22 da SEQ ID NOS: 50 ou 51. (2) PRÓ-PEPTÍDEO + ESPAÇADOR: uma sequência opcional de pró-peptídeo, preferivelmente sem elastase, (como pró-peptídeo do fator a da levedura) que pode ainda, opcionalmente, incluir uma ou mais sequên- cias espaçadoras (uma sequência pró-peptídeo do fator a da levedura e se- quências espaçadoras Kex2 e STE13 estão representadas na figura 1B). Em uma modalidade específica, a sequência de pró-peptídeo não inclui um es- paçador.

(3) PRÓ-PEPTÍDEO ELASTASE: peptídeo que, quando presen- tes na extremidade N-terminal de uma elastase, torna a molécula inativa ou - menos ativa em comparação com a proteína elastase madura corresponden- te. O pró-peptídeo da elastase pode ser contíguo com o peptídeo de ativa- ii ção ou pode conter aminoácidos adicionais em relação ao peptídeo de ativa- ção. As sequências de pró-peptídeo da elastase exemplares são aminoáci- dos de 1-10 da SEQ ID NOS: 64 e 69. (4) PEPTÍDEO DE ATIVAÇÃO: usado de forma intercambiável aquicom "sequência de ativação", um peptídeo de ativação é um compo- nente, e pode ser contíguo com o pró-peptídeo da elastase. Conforme mos- trado na figura 2, o peptídeo de ativação contém resíduos de aminoácidos de P10 a P1. Uma sequência de peptídeo de ativação exemplar consenso é a SEQ ID NO: 80; outros exemplos de sequências de peptídeo de ativação são SEQIDNOS:23,72e73.

(5) SEQUÊNCIA DE RECONHECIMENTO: uma sequência de reconhecimento é um componente do pró-peptídeo da elastase. Conforme mostrado na figura 2, a sequência de reconhecimento contém resíduos de aminoácidos de P3 a P1. As sequências consenso da sequência de reco- —nhecimento exemplar são SEQ ID NOS: 11-13 e 93 e uma sequência de re- conhecimento exemplar é a SEQ ID NO: 20. (6) DOMÍNIO DE CLIVAGEM: a região na proteína pró-elastase

D f 6 que abrange a ligação de clivagem. Conforme mostrado na figura 2, o domí- - nio de clivagem contém resíduos de aminoácidos de P5 a P3'. As sequên- cias de domínio de clivagem exemplares são SEQ ID NOS: 42, 43, 48, 49, í 53, 53, 54 e 55. (7) SÍTIO DE CLIVAGEM: outra região na proteína pró-elastase que também abrange a ligação de clivagem. Conforme mostrado na figura 2, o sítio de clivagem contém resíduos de aminoácidos de P4 a P4'. Uma se- quência site exemplar clivagem é SEQ ID NO: 27. (8) PROTEÍNA PRÉ-PROELASTASE: uma proteína que pode compreender todas as partes dos componentes. Uma proteína pré-pró- elastase exemplar pode incluir peptídeos da SEQ ID NO: 50, 51, 96 ou 97 seguido de uma proteína operacionalmente ligada da SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 69. E (9) PROTEÍNA PROELASTASE: uma proteína que compreende a proteina elastase madura, um pró-peptídeo de elastase e sequências op- " cionais do pró-peptídeo e do espaçador. As sequências de pró-elastase e- xemplares são SEQ ID NOS: 64 e 69.

(10) PROTEÍNA ELASTASE MADURA: uma proteína que quan- do processadas corretamente apresenta atividade de elastase. As sequên- cias maduras exemplares são SEQ ID NO: 1 (humana) e SEQ ID NO: 39 (porcina).

Os componentes da proteína elastase podem ser considerados blocos de construção modular das proteínas elastases, proteinas pró- elastases e proteínas pré-pró-elastases. Por exemplo, a presente invenção fornece uma proteína pró-elastase compreendendo a sequência de um pró- peptídeo de elastase e uma proteina madura elastase. O pró-peptídeo de elastase pode conter um peptídeo de ativação. O pró-peptídeo de elastase também pode conter uma sequência de reconhecimento da elastase. A pre- sente invenção também fornece uma proteína pró-elastase compreendendo um domínio de clivagem ou sítio de clivagem na região que abrange a jun- ção entre o pró-peptídeo de elastase e a proteína elastase madura. As prote- Ínas pró-elastases podem ainda compreender uma sequência sinal para se-

“ L 7 creção. Tais proteínas são consideradas proteínas pré-pró-elastase. As pro- p teínas pré-pró-elastase podem ainda compreender um pró-peptídeo de fator a da levedura e, opcionalmente, uma sequência espaçadora entre a se- Ã quência sinal e o pró-peptídeo de elastase. As proteínas elastases da inven- ção também podem conter componentes além dos componentes modulares principais ilustrados na figura 2. Por exemplo, uma proteína elastase pode conter um marcador de epítopo ou um marcador de histidina para purífica- ção. Deve-se também observar que as proteínas elastases da invenção não precisam conter todos os componentes descritos na figura 2, mas geralmen- te contêm pelo menos um dos componentes (incluindo, a título de exemplo, mas não se limitando a, uma sequência de elastase madura ou de pró- elastase) mostrados na figura 2. As proteínas elastases exemplares da in- venção são estabelecidas nas modalidades 1-12, 28-39 e 68-69 na Seção 8 - abaixo, incluindo proteínas pró-elastases tipo | exemplares estabelecidas nasmodalidades 13-27 na Seção 8 abaixo.

a Os ácidos nucleicos que codificam as proteínas elastases da in- venção, os métodos para produzir e purificar as proteínas, as células recom- binantes e sobrenadantes de cultura de células, as composições compreen- dendo proteínas elastases (por exemplo, composições farmacêuticas, dosa- gens unitárias e formulações), o uso das proteínas para fins terapêuticos e kits compreendendo as proteinas, as formulações, as composições farma- cêuticas e as doses unitárias estão englobadas aqui. Os ácidos nucleicos que codificam as proteínas elastases da invenção são exemplificados nas modalidades 40-67 na Secção 8 abaixo, incluindo vetores (ver, por exemplo, modalidades 70-72). Também exemplificadas na Seção 8 estão as células recombinantes (ver, por exemplo, modalidades 73-84), sobrenadantes de células contendo proteínas elastases (ver, por exemplo, modalidade 88). Métodos para produzir proteínas elastase são exemplificados nas modalida- des 89-224, 261-276 e 347-373 na Seção 8. Métodos para produzir formula- ções da elastasesão exemplificados nas modalidades 225-260 na Seção 8. Métodos para produzir composições farmacêuticas são exemplificados nas modalidades 374-385 na Seção 8. Composições farmacêuticas compreen-

« í 8 dendo proteínas elastases são exemplificadas nas modalidades 277-313 e " 386 na seção 8, e dosagens unitárias são exemplificadas nas modalidades 415420 na Seção 8. Formulações de proteínas elastases são exemplifica- ' das nas modalidades 324-346 na Seção 8. O uso das proteínas elastases parafinsterapêuticos é exemplificado nas modalidades 387-414 na Seção 8. Os kits compreendendo as proteínas são exemplificados na Seção 8 por meio das modalidades 421-424. Vários aspectos da invenção que refere-se a proteínas pró- elastases com SEQ ID NOS: 64 e 69 são exemplificados como Modalidades específicas na Secção 8 abaixo; entretanto, tais modalidades são aplicáveis a outras sequências de proteína elastase divulgadas aqui.

Os métodos de produção descritos aqui, muitas vezes incluem uma etapa de ativação, através do qual o peptídeo de ativação é removido E da sequência da pró-elastase/ separado da sequência da elastase madura, gerando com isso uma proteína elastase madura.

As etapas de ativação e descritas aqui podem ser etapas de autoativação, ou seja, realizadas por uma atividade da elastase, ou etapa de não autoativação, ou seja, não me- diada pela elastase, por exemplo, realizado pela tripsina.

Em certos aspectos, a presente invenção fornece uma molécula deácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifi- ca uma proteína elastase (incluindo, mas não se limitado a, uma proteína de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6-9, 64-69, 88-91, ou 98-103) compreen- dendo (i) um pró-peptídeo de elastase compreendendo uma sequência de peptídeo de ativação compreendendo uma sequência de reconhecimento da elastase operacionalmente ligada a (ii) sequência de aminoácido de uma proteína tendo atividade de elastase.

A proteina opcionalmente compreende ainda uma sequência sinal, tal como um peptídeo sinal do fator a da levedu- ra e exemplificado pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 34, opera- cionalmente ligada ao referido pró-peptídeo de elastase.

O fator a é às ve- zes referido aqui como "fator-alfa" ou "fator alfa de cruzamento" ou "fator-a de cruzamento." Em certas modalidades específicas, a proteína compreende um pró-peptídeo sem elastase como o pró-peptídeo sinal do fator a da leve-

i 9 dura. Em certas modalidades específicas, a proteína pode compreender uma - ou mais sequências espaçadoras. As sequências espaçadoras podem inclu- ir, mas não estão limitadas a, sítios de clivagem de protease Kex2 e STE13. ' Em uma modalidade específica, um espaçador Kex2 pode ser usado. Em outramodalidade, um espaçador Kex2 pode ser operacionalmente ligado a espaçadores STE13 como mostrado na figura 1B. Uma sequência do peptí- deo sinal e uma sequência de pró-peptídeo sem elastase são exemplificadas pela sequência de aminoácido da SEQ IDS NO: 51 ou 97. Um peptídeo con- tendo uma sequência de peptídeo sinal, uma sequência de pró-peptídeo sem elastase, e uma sequência espaçadora são exemplificadas pela se- quência de aminoácido da SEQ IDS NO: 50 ou 96.

Em outras modalidades específicas, a sequência sinal é uma sequência sinal de secreção de mamíferos, tais como uma sequência sinal r da elastase tipo | humana ou porcina (usadas de forma intercambiável com a elastase pancreática tipo |). . Preferencialmente, a sequência de reconhecimento da elastase é uma sequência de reconhecimento da elastase pancreática tipo |.

Em modalidades específicas, a proteína tendo atividade de elas- tase tipo | é uma elastase maduro tipo | humana, por exemplo, uma proteína dasequênciade aminoácido da SEQ ID NO: 1,4, 5, 84 ou 87.

A presente invenção também fornece uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína compreendendo (i) uma sequência sinal operável em Pichia pasto- ris operacionalmente ligada a (ii) uma sequência de ativação (incluindo, mas nãoselimitado a, uma sequência de aminoácido da SEQ ID NOS: 23, 72,73 ou 80) compreendendo uma sequência de reconhecimento da protease (in- cluindo, mas não se limitado a, uma sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOS :11-23 e 93, que por sua vez é operacionalmente |li- gada a (iii) sequência de aminoácido de uma elastase madura tipo | humana.

Em uma modalidade preferida, a sequência de reconhecimento da protease é uma sequência de reconhecimento da elastase tipo | humana, mais prefe- rivelmente uma sequência de reconhecimento da elastase da SEQ ID NO:

Í 10

20. E As proteínas pró-elastases (opcionalmente compreendendo uma sequência sinal e, portanto, representando as proteínas pré-pró-elastases) e : proteínas elastases maduras codificadas pelos ácidos nucleicos da invenção também são fornecidas, assim como as composições (por exemplo, compo- sições farmacêuticas, formulações e dosagens unitárias) compreendendo as referidas proteínas elastases maduras. Em uma modalidade preferida, a proteína pró-elastase ou a pro- teína elastase madura não tem um resíduo de metionina N-terminal. Em ou- tramodalidade, entretanto, a proteína pró-elastase ou proteína elastase ma- dura tem um resíduo de metionina N-terminal. A Tabela 1 abaixo resume os identificadores de sequência usa- dos no presente relatório. As proteínas preferidas da invenção compreen- 7 dem ou consistem de qualquer uma das SEQ ID NOS:1-32, 34, 37-73, 77, 78,82-92e98-105 listadas na Tabela 1 abaixo, ou são codificadas em parte » ou totalmente pelas sequências de nucleotídeos SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 81. Nucleotídeo ou aminoácido Elastase humana madura |, incluindo a primei- | Aminoácido 1 ra "valina", com possíveis polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Elastase humana madura |, excluindo a primei- Aminoácido ra "valina", com possíveis polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Elastase humana madura |, excluindo as pri- Aminoácido 3 meiras duas "valinas", com possíveis polimor- fismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró- proteína) Elastase humana madura |, com a primeira| Aminoácido 4 "valina" substituída pela "alanina", com possí- veis polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a

: 1 Nucleotídeo ou aminoácido numeração refere-se à posição no contexto da E" pré-pró-proteína)

Elastase humana madura | (isotipo 2), incluin- | Aminoácido 5 do a primeira "valina” Pró-proteína elastase nº1 modificada (p-| Aminoácido PROT42 variante), com possível polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere- se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Pró-proteina elastase nº2 modificada (p- Aminoácido 7 PROT42 variante), com possível polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere- se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Pró-proteina elastase nº3 modificada (p-| Aminoácido

: PROTA4?2 variante), com possível polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-

' se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Pró-proteína elastase nº4 modificada (p- Aminoácido PROT42 variante), com possível polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere- se à posição no contexto da pré-pró-proteína) A pró-proteíina elastase nº5 modificada (p-| Aminoácido 10 PROT42 variante), com possível polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere- se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Sequência de reconhecimento da elastase 1 Aminoácido 1" consenso (Posições Xaal = P3, Xaa2= P2, Xaa3=P1) Sequência de reconhecimento da elastase 2 Aminoácido 12 consenso (Posições P3-P2-P1) Sequência de reconhecimento da elastase 3 Aminoácido 13 consenso (Posições P3-P2-P1) Sequência de reconhecimento da elastase 1 Aminoácido 14 (Posições P3-P2-P1) Sequência de reconhecimento da elastase 2) Aminoácido 15 (Posições P3-P2-P1)

ai 12 Nucileotídeo ou aminoácido Sequência de reconhecimento da elastase 3 Aminoácido . (Posições P3-P2-P1) Sequência de reconhecimento da tripsina do| Aminoácido 17 tipo selvagem (pPROT24) (Posições P3-P2- P1) Sequência de reconhecimento da elastase 5] Aminoácido (Posições P3-P2-P1) Sequência de reconhecimento da elastase 6 Aminoácido (Posições P3-P2-P1) Sequência de reconhecimento da elastase 7 Aminoácido 20 (Posições P3-P2-P1 de variantes 48 e 55) Sequência de reconhecimento da elastase 8 - Sequência de ativação da elastase humana 1 Sequência de ativação da elastase humana 2 - Sítio de clivagem pró-PROT-201 Sítio de clivagem pPROTA40 | Aminoácido | 25 | Sítio de clivagem pPROT41 Sítio de clivagem pPROT42 Sítio de clivagem pPROT43 Sítio de clivagem pPROT44 Sítio de clivagem pPROTA5 Sítio de clivagem pPROT46 Sítio de clivagem pPROTA7 Região de codificação de uma elastase-1 hu- Nucleotídeo 33 mana (ou seja, elastase pancreática tipo | hu- mana) (NCBI No.

De acesso NM 001971) Peptídeo sinal do fator alfa da levedura Primer 20F Nucleotídeo Primer 24R Nucleotídeo Elastase variante do sítio de clivagem p- Aminoácido 37 PROT42 P3, com possível polimorfismos na

Ê 13 Nucleotídeo ou aminoácido Á posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à ' posição no contexto da pré-pró-proteína) Elastase variante do sítio de clivagem p-| Aminoácido 38 PROT42 P2, com possível polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Elastase pancreática poucina madura | (do| Aminoácido 39 GenBank Acesso P00772.1) Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido ante de elastase 40 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- Aminoácido 41 ante de elastase 41 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido 42 - ante de elastase 42 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido 43 e ante de elastase 43 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- Aminoácido 44 ante de elastase 44 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido 45 ante de elastase 45 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido ante de elastase 46 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- Aminoácido 47 ante de elastase 47 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- Aminoácido ante de elastase 48 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido ante de elastase 49 Sequência do peptídeo, pró-peptídeo e espa-| Aminoácido çador sinal do fator a de cruzamento da leve- dura 1 Sequência do peptídeo e pró-peptídeo sinal do Aminoácido fator a de cruzamento da levedura 2

' 14 Molécula Nucleotídeo ou aminoácido Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- Aminoácido 52 , ante de elastase 52 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido 53 ante de elastase 53 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido ante de elastase 54 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido 55 ante de elastase 55 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido ante de elastase 56 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- Aminoácido 57 ante de elastase 57 : Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido 58 ante de elastase 58 " Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido ante de elastase 59 Domínio de clivagem do pró-peptideo da vari- Aminoácido ante de elastase 60 Domínio de clivagem do pró-peptídeo variante | Aminoácido 61 de elastase 61 Domínio de clivagem do pró-peptideo da vari- | Aminoácido 62 ante de elastase 62 Domínio de clivagem do pró-peptídeo da vari- | Aminoácido 63 ante de elastase 63 Pró-enzima elastase com domínio de clivagem| — Aminoácido variante 48, com possíveis polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteina) Pró-enzima elastase com domínio de clivagem| — Aminoácido variante 49, com possíveis polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Pró-enzima elastase com domínio de clivagem Aminoácido variante 52, com possíveis polimorfismos na

' 15 Nucleotídeo ou aminoácido Ô posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à ' posição no contexto da pré-pró-proteína) Pró-enzima elastase com domínio de clivagem Aminoácido 67 variante 53, com possíveis polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Pró-enzima elastase com domínio de clivagem Aminoácido variante 54, com possíveis polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Pró-enzima elastase com domínio de clivagem | — Aminoácido variante 55, com possíveis polimorfismos na posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à B posição no contexto da pré-pró-proteína) : Elastase do tipo selvagem + variante de cliva-| Aminoácido 70 Ú gem AlaArg, com possíveis polimorfismos na É posição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Elastase do tipo selvagem + variante de cliva- Aminoácido 71 gem Arg , com possíveis polimorfismos na po- sição 220 (V ou L) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Variante 48 do peptídeo de ativação da elasta- Aminoácido 72 se humana Variante 55 do peptídeo de ativação da elasta-| Aminoácido 73 se humana Sequência consenso do domínio de clivagem| — Aminoácido 74 da elastase humana; corresponde aos resí- duos P5, P4, P3, P2, P1, P'1, P?2, e P'3 de um domínio de clivagem da elastase Primer da mutagênese da PCR para a cons- | Ácido Nucleico 75 trução da pPPROT3 Primer da mutagênese da PCR ou construção | Ácido Nucleico 76 da pPROT3 Variante C-terminal da ELA1 madura de Talas

Ê 16 Nucleotídeo ou aminoácido À et al., 2000, Invest Dermatol. 114(1):165-70. FA : Variantes da ELA-1 madura, com possíveis) Aminoácido 78 polimorfismos nas posições 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a nu- meração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Variantes do peptídeo de ativação (tripsina do| Aminoácido 79 tipo selvagem, clivável), com possíveis poli- morfismos na posição 10 (Q ou H) (a numera- ção refere-se à posição no contexto da pré- pró-proteína) Sequência "consenso" do peptídeo de ativação | Aminoácido | so | Região de codificação da ELA-1.2A = Produto de translação da ELA-1.2A Aminoácido 82 (Sequência de pPPROT24 ativada pela tripsina) * Produto de translação da ELA-1.2A Aminoácido 83 (Sequência de pPROT24 ativada pela tripsina), com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Elastase humana madura |, incluindo a primei- Aminoácido ra "valina", com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteina) Elastase humana madura |, excluindo a primei- Aminoácido 85 ra "valina", com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteina) Elastase humana madura |, excluindo as pri- Aminoácido meiras duas "valinas", com possíveis polimor- fismos nas posições 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração

É 17 Molécula Nucleotídeo ou aminoácido É refere-se à posição no contexto da pré-pró- Elastase humana madura |, com a primeira| Aminoácido 87 "valina" substituída pela "alanina", com possí- veis polimorfismos nas posições 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Pró-proteina elastase nº1 modificada (p-| Aminoácido 88 PROT42 variante), com possíveis polimorfis- mos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) é Pró-proteína elastase nº2 modificada, com Aminoácido possíveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (VouL); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posi- ção no contexto da pré-pró-proteína) Pró-proteína elastase nº3 modificada, com Aminoácido possíveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (VouL); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posi- ção no contexto da pré-pró-proteína) Pró-proteína elastase nº4 modificada, com Aminoácido 91 possíveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (Voul); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posi- ção no contexto da pré-pró-proteína) Pró-proteína elastase nº5 modificada (sequên- | Aminoácido 92 cia ativada pela tripsina pPPROT24), com pos- síveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína)

É 18 Nucleotídeo ou aminoácido

' consenso (Posições P3-P2-P1) O nO

- PPROT42 P3 Elastase Variante do sítio de cli- | Aminoácido vagem, com possíveis polimorfismos nas posi- ções 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (VouL); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posi- ção no contexto da pré-pró-proteína) PPROT42 P2 Elastase Variante do sítio de cli- Aminoácido vagem, com possíveis polimorfismos nas posi- ções 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (VouL); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posi- ção no contexto da pré-pró-proteína) Sequência do peptídeo, pró-peptídeo e espa- Aminoácido çador sinal do fator a de cruzamento da leve- dura 1 i Sequência do peptídeo, e pró-peptídeo sinal Aminoácido 97 ' do fator a de cruzamento da levedura 2

Pró-enzima elastase com domínio de clivagem Aminoácido variante 48 Genérica a SEQ ID NO:64, com possíveis po- limorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no con- texto da pré-pró-proteína) Pró-enzima elastase com domínio de clivagem | — Aminoácido variante 49, com possíveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró- proteína) Pró-enzima elastase com domínio de clivagem Aminoácido 100 variante 52, com possíveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró- proteína) Pró-enzima elastase com domínio de clivagem | Aminoácido | 101 | õ 19 Nucleotídeo ou aminoácido E variante 53, com possíveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró- proteína) Pró-enzima elastase com domínio de clivagem| — Aminoácido variante 54, com possíveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró- proteína) Pró-enzima elastase com domínio de clivagem Aminoácido 103 variante 55, com possíveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou f V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró- - proteína) Elastase do tipo selvagem + variante de cliva- | Aminoácido gem AlaArg, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Elastase do tipo selvagem + variante de cliva- Aminoácido 105 gem Arg, com possíveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró- proteína) Variante de clivagem da elastase humana ma- Aminoácido 106 dura | sem os primeiros quatro aminoácidos, com possíveis polimorfismos nas posições 10 (Q ou H); 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Variante de clivagem da elastase humana ma- | Aminoácido 107 dura | sem os primeiros seis aminoácidos, com

: 20 Molécula Nucleotídeo ou aminoácido ' possíveis polimorfismos nas posições 44 (W By ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no con- texto da pré-pró-proteína) Variante de clivagem da elastase humana ma- | Aminoácido 108 dura | sem os primeiros nove aminoácidos, com possíveis polimorfismos nas posições 44 (W ou R); 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (a numeração refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína) Sequência de ácido nucleico da figura 1A Ácido Nucleico Sequência de aminoácido da figura 1A Sequência de ácido nucleico da figura 1B Ácido Nucleico Sequência de aminoácido da figura 1B Sequência de ácido nucleico da figura 13 Ácido Nucleico ' Sequência de aminoácido da figura 14 Sequência do domínio de clivagem da p- Aminoácido 115 PROT101-24-V ativada pela tripsina Sequência do domínio de clivagem da p-| Aminoácido 116 PROT101-42-V autoativada Sequência do domínio de clivagem da p- Aminoácido 107 PROT101-49-V autoativada Sequência do domínio de clivagem da p-| Aminoácido 118 PROT101-55L-V autoativada Tabela 1: Resumo das SEQ ID NOS dos aminoácidos e nucleo- tídeos Há pelo menos cinco polimorfismos confirmados na proteína e- lastase tipo | humana, nas posições 10 (Q ou H), 44 (W ou R), 59 (MouV), 220(Voul)&e243(Q ouR) A proteina (pré-pró-elastase) de sequência completa tem 258 aminoácidos em comprimento.

Os primeiros 8 aminoáci- dos correspondem a sequência sinal ou do "pré" peptídeo que é clivada para gerar uma pró-proteína inativa, e mais uma sequência de "pró" peptídeos

' i 21 (compreendendo ou consistindo de 10 aminoácidos que correspondem a um . peptídeo de ativação) são clivados para gerar a proteína madura ativa. As- sim, o polimorfismo na posição 10 está presente na pró-proteina, mas não : na proteína madura.

Portanto, na Tabela 2 abaixo são apresentadas todas as combi- nações possíveis dos 5 polimorfismos da elastase tipo | humana. A presente invenção fornece proteínas pré-pró-elastase e pró-elastase (incluindo, mas não se limitando a, proteínas pré-pró-elastase e pró-elastase variantes des- critas aqui), tais como as proteínas exemplificado nas modalidades de 1-39 e 68-69 ou as proteínas obtidas ou que possam ser obtidas pelo método de qualquer uma das modalidades de 89-224, 261-276 e 347-373 na Seção 8, compreendendo qualquer uma das combinações de polimorfismos estabele- cidos na Tabela 2 abaixo.

: [Posição | 10 | a | 59 | 2 | 23 | | Modaridade | QouH | WwouR | Mouv | vour | qour | RX Jo mw ll Mm | vy | a | 2 le w | m | v | R | 8 le | w | m | + | o | 4 Je | w lv | yvy | o | 6 le RR mM | v | o | 6 la w | m | 1 | Rg | lr /- e ww | v | +12 | a | e le R | vy | v | a | e le w | v | v | R | 6 Joe R | m | 0-2 | o | mo le | R | m | v | R | e Je | RR | v | 1 | q | Às la | R | vy | v | R | mo de RR | m a | RR | eo je Ww | vy | 1 | R | 6 | e RR | v | 6 | R | mo ds wmv |] o |

[Posição | 10 | 44 | 56 | 22% | 20 | o | Modalidade | QouH | WouR | Mouv | vout | QouR | eo ln bw Dm | v | R | | e on bw Dm Ta | ao | o nb wWw | vy | v | o | ar | nH | R | mM | v | eo | 2 | nn | w | mM | e | R | 8 nl w | vv | «1 | o | a mn | R | v | qv | e | 6 nm ww lv | v | R | 6 | HR | mM | «e | o | az mn | R | mM | v | R | e | nm RR | v | & | eo | : e | nl RR | v | v | RR | : 6 HR | mM 4 | RR | | ao Dn bw | v | 4 | R | 1 ln RR | v | 1 | R | Tabela 2: Variantes da elastase tipo | humana não-madura (pré- pró) e proteínas pró- elastase. A numeração da posição refere-se à posição no contexto da pré-pró-proteína da elastase tipo | humana nativa. Além disso, na Tabela 3 abaixo são apresentadas todas as combinações possíveis dos 4 polimorfismos da elastase tipo | humana que podem estar presentes em uma proteína elastase madura. A presente in- venção fornece proteínas elastases maduras (incluindo, mas não se limitado a, proteínas elastases maduras variantes descritas aqui), tais como as prote- Ínas elastases maduras obtidas ou que possam ser obtidas pelo método de qualquer uma das modalidades de 89-224, 261-276 e 347-373 na Seção 8, compreendendo qualquer uma das combinações de polimorfismos estabele- cidos na Tabela 3 abaixo.

| Posição | 44 | 56 | 220 | “23 | [Modalidade [ WouR | Monv | Vouwt | Gour |

SP E RT A A O

NR RA a RN NR | BR A a

EEN RC O SO EEE O a A A Í as A NR , e OOTR O va Tabela 3: As variantes das proteínas elastases tipo | humana maduras. A numeração da posição refere-se à posição no contexto da pré- pró-proteína elastase tipo | humana nativa. As elastases tipo | humana maduras da invenção podem ser pu- rificadas, por exemplo, para uso em composições farmacêuticas. Em moda- lidades específicas, as elastases são pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% puras.

As elastases tipo | humana maduras da invenção preferivelmen- te têm uma atividade específica de mais de 1, mais de 5, mais de 10, mais de20,maisde 25, ou mais de 30 U/mg de proteína, conforme determinado pela medição da taxa de hidrólise do substrato do peptídeo pequeno N- succinil-Ala-Ala-Ala-pNitroanilida (SLAP), que é catalisada pela adição de elastase. Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de elasta- se que catalisa a hidrólise de um micromol de substrato por minuto a 30ºC e aatividade específica é definida como a atividade por mg de proteína elasta- se (Uémg). Preferivelmente, uma elastase tipo | humana madura tem uma atividade específica dentro de uma faixa em que o limite inferior é de 1,2, 3,

Í 24

4,5,7, 10, 15 ou 20 U/mg de proteína e em que o limite superior é de, inde- : pendente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50 U/mg de proteína.

Em modali- dades exemplares, a atividade específica está na faixa de 1 a 40 U/mg de : proteína, 1 a 5 U/mg de proteina, 2 a 10 U/mg de proteína, 4 a 15 U mg de proteína, 5a30 U/mg de proteína, 10 a 20 U/mg de proteína, 20 a 40 U/mg de proteína, ou qualquer faixa cujos limites superiores e inferiores são sele- cionados de qualquer um dos valores anteriores.

Elastasetipo | porcina ma- dura preferivelmente tem uma atividade específica dentro de uma faixa em que o limite inferior é de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 ou 75 U/mg de proteina e em que o limite superior é de, independentemente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 90, 95 ou 100 U/mg de proteína.

Em modali- dades exemplares, a atividade específica da elastase porcina está na faixa de 10 a 50 U/mg de proteína, 20 a 60 U/mg de proteína, 30 a 75 U/mg de : proteína, 30 a 40 U/mg de proteína, 20 a 35 U/mg de proteína, 50 a 95 U/mg de proteína, 25 a 100 U/mg de proteína, ou qualquer faixa cujos limites infe- - riores e superiores são selecionados de qualquer um dos valores anteriores.

Portanto, certos aspectos da presente invenção referem-se a composições, tais como composições farmacêuticas, formulações de elasta- se e dosagens unitárias, tais como os exemplificados nas modalidades de 277-314,346,386 e415-420 ou aquelas obtidas ou que possam ser obtidas pelo método de qualquer uma das modalidades de 261-276 e 374-385 na

Seção 8 abaixo.

Em certas modalidades, as composições da invenção compre- endem proteínas elastases ativadas pela tripsina, por exemplo, proteínas ativadas pela tripsina feitas por qualquer um dos métodos divulgados aqui.

Em outras modalidades, as composições compreendem proteínas elastases autoativadas, por exemplo, proteínas elastases autoativadas feita por qual- quer um dos métodos descritos aqui.

Em certos aspectos, uma composição da invenção é caracterizada por pelo menos um, pelo menos dois, pelo me- nos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou pelo menos sete das seguintes propriedades: (a) a composição é livre de tripsina, (b) a composição é substancialmente livre de tripsina, (c) a composição é

' 25 livre de qualquer proteína consistindo na SEQ ID NOS: 70 e 71; (d) a com- posição é substancialmente livre de qualquer proteína consistindo na SEQ ID NOS: 2 e 3; (e) a composição é livre de proteínas bacterianas, (f) a com- 1 posição é substancialmente livre de proteínas bacterianas, (g) a composição é livrede proteinas de mamíferos exceto da proteína elastase madura; (h) o composição é substancialmente livre de proteinas de mamíferos exceto da proteína elastase madura; (i) a composição é livre ou substancialmente livre de uma, duas, três ou todas as quatro proteínas consistindo na SEQ ID NO: 85, 86, 94 e 95; (])) a composição é livre ou substancialmente livre de uma, duas ou todas as três proteínas consistindo da SEQ ID NO: 106, 107 e 108; (k) a composição contém níveis farmaceuticamente aceitáveis de endotoxi- nas (por exemplo, 10 EU/mg de elastase ou menos, ou 5 EU/mg de elastase ou menos); (1) a proteína elastase madura na composição é caracterizada E por uma atividade específica de 1 a 40 U/mg de proteína de qualquer outra faixa de atividade específica descrita aqui; (m) a atividade da tripsina na re- E ferida composição corresponde a menos de 4 ng por 1 mg de proteína elas- tase madura ou qualquer outra faixa de atividade da tripsina descritas aqui; (n) a composição compreende o polissorbato-80; (0) a composição compre- ende o dextrano; (p) a composição compreende íons de sódio, íons de po- tássio, íons de fosfato, ífons de cloreto e polissorbato-80, (q) a composição compreende íons de sódio, íons de potássio, íons de fosfato, íons de cloreto e dextrano; (r) a composição compreende íons de sódio, os íons de potássio, íons de fosfato, íons de cloreto, polissorbato-80, e dextrano; (s) da proteína elastase madura em referida composição exibe uma quantidade de estabili- dade descrita aqui, por exemplo, mantém 60% a 100% da sua atividade es- pecífica depois de pelo menos uma semana de armazenamento a 4ºC, de- pois de pelo menos um mês de armazenamento a 4ºC, depois de pelo me- nos dois meses de armazenamento a 4ºC, depois de pelo menos três meses de armazenamento a 4ºC, ou depois de pelo menos seis meses de armaze- namento a 4C; e (t)a composição compreende uma dosagem unitária de 0,0033 mg a 200 mg da referida proteína elastase madura, ou qualquer outra dosagem unitária da proteína elastase madura divulgada aqui.

É 26 Em certos aspectos, a composição é caracterizada por pelo me- F nos três características, pelo menos quatro características ou cinco caracte- rísticas independentemente selecionadas dos seguintes grupos de (i) a (v): (1) (a), (b) ou (m) (ii) (e) ou (f) (iii) (g) ou (h) (iv) (K) V) O) Em modalidades específicas, duas de pelo menos três ou pelo menos quatro referidas características são selecionadas dos grupos (i) e (iv) ou (v). Em outras modalidades, três de pelo menos quatro referidas caracte- rísticas são selecionadas dos grupos (i), (iv) e (v). Em modalidades específicas, a presente invenção fornece uma : composição incluindo, mas não se limitado a, uma composição farmacêutica, formulação da elastase ou dosagem unitária, compreendendo (i) uma quan- . tidade terapeuticamente eficaz da elastase tipo | humana, que é livre de trip- sina e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.

Alternativamente, a pre- sente invenção fornece uma composição compreendendo (i) uma quantida- de terapêutica eficaz da elastase tipo | humana que é substancialmente livre de tripsina e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em modalidades específicas, a elastase tipo | humana e/ou a composição compreende menos de 5 ng/ml de atividade da tripsina, menos de 4 ng/ml de atividade da tripsi- na, menos de 3 ng/ml de atividade de tripsina, menos de 2 ng/ml de ativida- de da tripsina, ou menos de 1,56 ng/ml de atividade da tripsina.

Nos exem- plos anteriores, ng/ml de atividade da tripsina pode ser analisada em uma composição ou preparação líquida da elastase tipo | humana contendo 1 mg/ml da proteína elastase tipo | humana.

Assim, as atividades da tripsina também podem ser descritas em termos de miligramas de proteína elastase, por exemplo, menos de 3 ng de atividade da tripsina/mg de proteína elasta- se, menos de 1,56 ng de atividade da tripsina/mg de proteína elastase etc.

À presente invenção fornece ainda uma composição compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz da elastase tipo | humana e (ii) um veículo farmaceuticamente - aceitável, em que a composição compreende menos de 5 ng de atividade da tripsina por mg de elastase, menos de 4 ng de atividade da tripsina por mg h de elastase, menos de 3 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, me- nosde?2 ng de atividade da tripsina por mg de elastase, ou menor de 1,56 ng de atividade da tripsina por mg de elastase.

A presente invenção fornece também métodos para melhorar a qualidade de proteínas elastases maduras produzidas por métodos de ativa- ção da tripsina (por exemplo, os métodos da modalidade 145 na Seção 8 abaixo), compreendendo purificar a proteína elastase madura em uma colu- na de resina Macro-Prep High S. Foi descoberto pelos presentes inventores que proteínas elastases maduras purificadas em coluna de resina Macro- Prep High S rende composições de elastase com níveis de atividade da trip- ] sina correspondente a 20-25 ng de atividade da tripsina/mg de proteína elas- tase, em comparação com a purificação em uma coluna Poros (Po- 7 li(Estireno-Divinilbenzeno)) que rende composições de elastase com níveis de atividade da tripsina correspondente a cerca de 1000 ng de atividade da tripsina/mg de proteína elastase. A presente invenção fornece ainda compo- sições de elastase compreendendo proteínas elastases maduras produzidas por proteínas elastases ativadas por tripsina purificadas de em uma coluna de resina Macro-Prep High S. A coluna de resina S de alta preparação Ma- cro está disponível em Biorad (Hercules, CA), de acordo com o qual uma coluna de metacrilato rígido suporta pouco encolhimento e enchimento. Ou- tras colunas semelhantes de troca de catiônica da mesma classe e/ou com o mesmo tamanho de leito (cerca de 50 um) podem ser usadas, tais como ou- tras colunas de metacrilato, podem ser adequadamente usadas.

Outros aspectos da presente invenção referem-se a composi- ções incluindo, mas não se limitado a, composições farmacêuticas, formula- ções da elastase ou dosagens unitárias, compreendendo elastase pancreáti- catipolporcina. Em modalidades específicas, a presente invenção fornece uma composição compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente efi- caz da elastase pancreática tipo | porcina que é livre de tripsina e (ii) um veí-

' 28 culo farmaceuticamente aceitável.

Alternativamente, a presente invenção B fornece uma composição compreendendo (i) uma quantidade terapeutica- mente eficaz da elastase pancreática tipo | porcina que é substancialmente À livre de tripsina e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em modalida- des específicas, a elastase pancreática tipo | porcina e/ou a composição compreende menos de 100 ng/ml de atividade da tripsina, menos de 75 ng/ml de atividade da tripsina, a menos de 50 ng/ml de atividade da tripsina, menos de 25 ng/ml de atividade da tripsina, menos de 15 ng/ml de atividade da tripsina, menos de 10 ng/ml de atividade da tripsina, menos de 5 ng/ml de atividade da tripsina, menos de 4 ng/ml de atividade da tripsina, menos de 3 ng/ml de atividade da tripsina, menos de 2 ng/ml de atividade da tripsina, ou menos de 1,56 ng/ml de atividade da tripsina.

Nos exemplos acima, o ng/ml de atividade da tripsina a pode ser analisadas em composição ou prepara- E ção líquida da elastase pancreática tipo | porcina contendo 1 mg/ml da elas- tase pancreática tipo | porcina.

Assim, as atividades da tripsina também po- é dem ser descritas em termos de miligramas de proteína elastase, por exem- plo, menos de 25 ng de atividade da tripsina /mg de proteína elastase, me- nos de 5 ng de atividade da tripsina/mg de proteína elastase etc.

A presente invenção fornece uma composição compreendendo (i) uma quantidade tera- peuticamente eficaz de elastase tipo | porcina e (ii) um veículo farmaceuti- camente aceitável, onde a composição compreende 100 ng de atividade da tripsina por mg de elastase, menos de 75 ng atividade da tripsina por mg de elastase, menos de 50 ng de atividade da tripsina por mg de elastase, me- nos de 25 ng de atividade da tripsina por mg de elastase, menos de 15 ng de atividade da tripsina por mg de elastase, menos de 10 ng de atividade da tripsina por mg de elastase, menos de 5 ng de atividade da tripsina por mg de elastase, menos de a 4 ng de atividade da tripsina por mg de elastase, menos de 3 ng de atividade da tripsina por mg de elastase, menos de 2 ng de atividade de tripsina por mg de elastase, ou menos de 1,56 ng de ativida-

dedatripsinapormg de elastase.

Em outras modalidades, a presente invenção fornece composi- ções de proteínas elastases, como proteínas elastase maduras, incluindo,

mas não se limitando a, composições farmacêuticas, formulações da elasta- - se ou dosagens unitárias, que são livres de variantes N-terminal correspon- dente a um, dois, três ou quatro da SEQ ID NOS: 70, 71, 104, 105. Em cer- K tas modalidades, a presente invenção fornece uma composição farmacêuti- cacompreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente efetiva da elastase tipo | humana madura, (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável, que as composição farmacêuticas são livres de qualquer proteína com SEQ ID

NOS: 70, 71, 104, 105. Em outras modalidades, a presente invenção fornece uma com- posição incluindo, mas não se limitado a, uma composição farmacêutica, uma formulação da elastase ou dosagem unitária, compreendendo (i) uma quantidade terapêutica eficaz de elastase humana tipo |, que é livre ou subs- tancialmente livre das proteínas variantes contendo aminoácidos específicos | adicionais na extremidade N- terminal da proteina elastase madura (SEQ ID NOS: 37, 38,70, 71,94, 95, 104, 105) e (ii) um veículo farmaceuticamente 7 aceitável.

Em outras modalidades, a presente invenção fornece uma compo- sição compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz da elasta- se tipo | humana, que é livre ou substancialmente livre de proteínas varian- tes sem aminoácidos N-terminal da proteína madura elastase (SEQ ID NOS: 2,3,37,38,70,71,85, 86, 94,95, 104, 105, 106, 107, 108) e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em modalidades específicas, a elastase tipo | humana e/ou a composição compreende menos de 25% de variantes N- terminal, menos de 20% de variantes N-terminal, menos de 15% de varian- tes N-terminal, menos de 10% de variantes N-terminal, a menos de 5% de variantes N-terminal, menos de 4% de variantes N-terminal, menos de 3% de variantes N-terminal, menos de 2% de variantes N-terminal, menos de 1% de variantes N-terminal, menos de 0,5% de variantes N-terminal, 0% de variantes N-terminal, ou compreende variantes N-terminal em uma quantida- de que varia entre duas das percentagens acima (por exemplo, 2%25% de variantes N-terminal, 0,5%-10% de variantes N-terminal, 5%-15% de varian- tes N-terminal, 0%-2% de variantes N-terminal etc.). Conforme usado aqui, o termo "menos de X% de variantes N-terminal" se refere à quantidade de va-

' 30 riantes N-terminal como uma percentagem da proteína elastase total. ' Em outras modalidades, a presente invenção fornece uma com- posição incluindo, mas não se limitado a, uma composição farmacêutica, À uma formulação da elastase ou uma dosagem unitária, compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz da elastase tipo | humana madura (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável, cuja composição farmacêutica é substancialmente livre de proteínas bacterianas e/ou é substancialmente livre de proteínas de mamíferos exceto a elastase tipo | humana madura.

Em modalidades específicas, a elastase tipo | humana madura e/ou a composi- ção compreende menos de 25% de proteínas bacterianas e/ou proteínas de mamíferos exceto da referida elastase tipo | humana madura, menos de 20% de proteínas bacterianas e/ou de proteínas de mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madura, menos de 15% de proteínas bacterianas e/ 7 ou proteínas de mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madura, menos de 10% de proteínas bacterianas e/ou proteínas de mamíferos exceto 7 a referida elastase tipo | humana madura, menos de 5% de proteínas bacte- rianas e/ou proteínas de mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madura, menos de 4% de proteínas bacterianas e/ou de proteínas de mamí- feros exceto a referida elastase tipo | humana madura, menos de 3% de pro- teínas bacterianas e/ou proteínas de mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madura, menos de 2% de proteínas bacterianas e/ou de prote- ínas mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madura, menos de 1% de proteínas bacterianas e/ou proteínas de mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madura, menos de 0,5% de proteínas bacterianas elouproteínas de mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madu- ra, 0% de proteínas bactérias e/ou proteínas de mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madura, ou compreende proteínas bacterianas e/ou proteínas de mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madura em uma quantidade que varia entre qualquer uma das duas das percentagens acima (por exemplo, 2%-25% de proteínas bacterianas e /ou proteínas de mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madura, 0,5%-10% de proteínas bacterianas e/ou proteínas de mamíferos exceto a referida elasta-

JENS| 31 se tipo | humana madura, 5%-15% de proteínas bacterianas e/ou proteínas . de mamíferos exceto a referida elastase tipo | humana madura, 0%-2% de proteínas bacterianas e/ou proteinas de mamíferos exceto a referida elasta- : se tipo | humana madura etc.) Conforme usado aqui, o termo "menos de X% de proteínas bacterianas e/ou proteínas de mamíferos exceto a referida elas- tase tipo | humana madura" refere-se à quantidade de proteínas de tais pro- teínas como uma porcentagem de proteína total em uma preparação de e- lastase ou na referida composição. Em certas modalidades, a elastase re- presenta pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, ou pelo menos 99,8% da proteí- na total em tais composições e preparações.

Os métodos para o tratamento e prevenção de doenças de tubos biológicos, compreendendo a administração de composições (por exemplo, .: composições farmacêuticas, formulações de elastase ou dosagem unitária), compreendendo uma elastase tipo | humana madura purificada da invenção Y de um paciente que necessite dos mesmos, também são fornecidos.

Além disso, são fornecidos vetores compreendendo ácidos nu- cleicos codificando qualquer uma das proteínas elastases da invenção ("áci- dos nucleicos da invenção"), células hospedeiras modificadas para expres- saros ácidos nucleicos da invenção. Em modalidades específicas, os veto- res compreendem uma sequência de nucleotídeos que regula a expressão da proteína elastase. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína da invenção pode ser operacionalmente ligada a um promotor induzível por metanol. Outros promotores adequados são exemplificados na Seção5.3 abaixo.

Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece um vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um qua- dro de leitura aberto, o quadro de leitura aberto compreendendo um peptí- deo sinal do fator a da levedura ou um peptídeo sinal da elastase tipo | (por exemplo, peptídeo sinal da elastase porcina) operacionalmente ligado a uma sequência da proteína elastase tipo | humana. Opcionalmente, o vetor com- preende ainda um promotor induzível por metanol operacionalmente ligado f 32 ao quadro de leitura aberto. " As células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos e vetores da invenção são fornecidas.

Em certas modalidades, o vetor ou do À ácido nucleico é integrado ao genoma da célula hospedeira; em outras mo- — dalidades, o vetor ou o ácido nucleico são extracromossomais.

Uma célula hospedeira preferida é uma célula Pichia pastoris.

Outras células hospedei- ras adequadas são exemplificadas na Seção 5.3 abaixo.

Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma célula hospedeira Pichia pastoris geneticamente modificada para codifi- carum quadro de leitura aberto compreendendo um peptídeo sinal do fator a da levedura ou um peptídeo sinal de elastase porcina operacionalmente li- gado a uma sequência de pró-enzima elastase tipo | humana.

Opcionalmen- te, o quadro de leitura aberto está sob o controle de um promotor induzível . por metanol.

A presente invenção também fornece métodos para produzir : uma proteína elastase madura ou não-madura da invenção compreendendo a cultura da célula hospedeira modificada para expressar um ácido nucleico da invenção sob condições nas quais a proteína pró-elastase é produzida.

Em certas modalidades, a proteína madura elastase também é produzida.

As condições de cultura preferidas para produzir a pró-elastase e proteínas maduras da invenção, em particular para a célula hospedeira Pichia pastoris, inclui um período de crescimento em um pH baixo.

Tipica- mente, o pH baixo é 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 ou qualquer faixa entre qualquer par dos valores anteriores.

Em modalidades específicas, o pH baixoéopH variando entre 2,0 a 6,0, 2,0 a 5,0, 3,0 a 6,0, de 3,0 a 5,0,4,0 a 6,0, ou 3,0 a 4,0. No final do período da cultura, o pH da cultura pode ser aumentado, de preferência a um pH de 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0 ou um pH variando entre dois dos valores anteriores com a finalidade de separar ou retirar a sequência de ativação da proteína elastase madura.

Em modalidades específicas, o pH da cultura é aumentado a um pH varian- do de 7,5 a 10,0 ou 8,0 a 9,0 e mais preferencialmente a um pH de 8,0. Quando a expressão de uma proteína pró-elastase da invenção

. ' 33 está sob o controle de um promotor induzível por metanol, as condições para : a produção de uma proteína elastase madura ou não-madura da invenção pode também compreender um período de indução do metanol.

Os métodos de produção da elastase da invenção podem com- preender ainda a etapa de recuperação da proteína expressa pela célula hospedeira.

Em certos casos, a proteína recuperada é uma pró-elastase compreendendo a sequência de ativação.

Em outros casos, a proteína recu- perada é a elastase madura sem a sequência de ativação.

Em certas condi- ções, tanto a pró-elastase quanto a proteína elastase madura são recupera- das.

De preferência, particularmente onde se deseja contornar a au- toativação de um pró-elastase autoativada, as condições de cultura para a expressão da pró-elastase podem incluir um período de crescimento e indu- m ção ao pH baixo.

Tipicamente, o pH baixo é de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0,5,5, ou 6,0, ou qualquer intervalo entre qualquer par de valores anterio- i res.

Em modalidades específicas, o pH baixo é um pH variando de 2,0 a 3,0, a de 4,0 a 5,0, 5,0 a 6,0 ou 6,0 a 7,0. Em modalidades particulares, o pH varia de 4,0 a 6,0 e é mais preferencialmente um pH de 5,5. De preferência, particularmente quando se deseja contornar a autoativação de um pró-elastase autoativada, as condições de cultura para a expressão da pró-elastase compreendem um período de crescimento e de indução em citrato de sódio, succinato de sódio ou de acetato de sódio.

Em modalidades específicas, uma concentração de 5 a 50 mM, 7,5 a 100 mM, 10 a 15 mM, 50 a 200 mM, 75 a 175 mM, 100 a 150 mM, 75 a 125 mm, ou de qualquer faixa cujos limites superiores e inferiores são selecionados de qualquer um dos valores anteriores (por exemplo, 50 a 75 mM, 75 a 100 mM, etc) é usada.

Em uma modalidade preferida, a concentração de citrato de sódio, succinato de sódio, ou acetato de sódio é de 90 a 110 mM e mais preferivelmente é de 100 mM.

Adicionalmente, em particular quando se deseja contornar a au- toativação de uma pró-elastase autoativada ou autodegradada por uma elas- tase madura, as condições de cultura para a expressão de uma proteína e-

' 34 lastase não-madura, pode compreender um período de crescimento e indu- : ção na extremidade inferior da faixa de temperatura adequada para a célula hospedeira em questão. Por exemplo, onde a célula hospedeira é uma célu- : la hospedeira Pichia pastoris, a faixa preferida é de cerca de 22 a 28ºC. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira Pichia pastoris é cultivada a 28ºC.

Além disso, particularmente quando se deseja contornar a de- gradação da proteína por célula hospedeira proteases, as condições da cul- tura para a expressão de uma proteína elastase não-madura podem com- preender um período de crescimento e indução na extremidade inferior da faixa de temperatura adequada para a célula hospedeira em questão. Por exemplo, onde a célula hospedeira é uma célula hospedeira Pichia pastoris, a faixa preferencial é de cerca de 22 a 28ºC. Em uma determinada modali- - dade, a célula hospedeira Pichia pastoris é cultivada a 28ºC. A ativação de uma proteína pró-elastase autoativada da inven- . ção pode ser iniciada pela adição de elastase extrínseca em uma pequena quantidade (catalisadora). Em certas modalidades, uma quantidade catalisa- dora de elastase extrínseca representa menos de 10%, menos de 5%, me- nos de 2%, menos de 1%, menos 0,5% ou menos de 0,1%, em ambas as bases de peso molecular ou molar, da elastase na amostra para a qual a elastase catalisadora é adicionada.

Alternativamente ou concomitantemente, a pró-elastase autoati- vada pode ser submetida ao pH 7-11 (mais de preferência pH 8), em que o peptídeo de ativação da pró-elastase autoativada é removido sem a neces- sidade da tripsina e resultando em elastase madura ativa. Em modalidades específicas, a base Tris é adicionada a uma concentração de 5-20 mM, 75- 175 MM, 100-150 MM, 75-125 mm, ou qualquer faixa cujos limites superio- res e inferiores são selecionados a partir de qualquer um dos valores anteri- ores (por exemplo, 50-75 mM, 75-100 mM, etc) durante a etapa de ativação.

Emuma modalidade preferida, a base Tris é adicionada a uma concentração de 90-110 mM, mais preferivelmente de 100 mM. O pH da base Tris é prefe- rencialmente de 7-11, em modalidades específicas, a base Tris está em um

Í 35 PH de 7,0-11,0, 7-9, 7,5-9,5, 7,5-10, 80-10, 8-9, ou qualquer faixa cujos limi- : tes superiores e inferiores são selecionados de qualquer um dos valores precedentes. Em uma modalidade preferida, a base Tris está em um pH de ] 7,5-8,5, mais de preferência 8,0. A expressão de uma sequência de elastase não-madura em al- guns casos pode render uma mistura de proteínas pró-elastases e proteínas * elastases maduras, bem como proteínas elastases variantes N-terminal. As- sim, a presente invenção fornece uma composição compreendendo pelo menos duas de (1) uma proteína pró-elastase, (2) uma proteína elastase madura, e (3) proteínas elastases variantes N-terminal.

Quando a elastase madura é produzida, ela pode ser liofilizada, por exemplo, para formulações farmacêuticas. Em uma modalidade exem- plar, a presente invenção fornece métodos para isolar uma elastase tipo | : madura liofilizada compreendendo as etapas: (a) cultivar uma célula hospedeira, como uma célula hospedeira ' Pichia pastoris, modificada para expressar uma molécula de ácido nucleico que codifica um quadro de leitura aberto da pré-pró-elastase sob condições em que o quadro de leitura aberto é expresso, em que, em uma modalidade específica, o referido quadro de leitura aberto é composto por sequências de nucleotídeo codificando, em uma direção 5' a 3' (i), um peptídeo sinal, por exemplo, um peptídeo sinal operacionalmente em Pichia pastoris, (ii) uma sequência de ativação compreendendo uma sequência de reconhecimento elastase; e (iii) a sequência de uma proteína elastase tipo | madura, produ- zindo assim uma proteína pró-elastase; (b) submeter a proteína pró-elastase a condições de autoativa- ção, produzindo assim uma elastase tipo | madura, onde as condições de autoativação incluem uma ou a combinação dos seguintes: (1) alterar o pH de uma solução (que pode ser um sobrenadante de cultura de célula), contendo a proteína pró-elastase, por exemplo, a um pHdeç6,5-11,de preferência de 8-9; (ii) purificar a proteína pró-elastase, por exemplo, por cromato- grafia de troca iônica, e submeter a conversão estendida da solução para h i 36 remover as variantes N-terminal, produzindo, assim, uma elastase tipo | hu- : mana madura; (iii) concentrar a proteína pró-elastase (por exemplo, 2 vezes, 3 á vezes, 5 vezes, 8 vezes, 10 vezes, 12 vezes, ou uma faixa em que os limites superiores e inferiores são selecionados independentemente dos níveis de concentração acima); (iv) submeter a proteína pró-elastase à temperatura alta (por e- xemplo, 29ºC, 30ºC, 32ºC, 35ºC, 40ºC, 45ºC ou 40ºC, ou uma faixa em que os limites superiores e inferiores são independentemente selecionados das temperaturas acima); (v) purificar a proteína pró-elastase (por exemplo, usando a Re- sina Macro-Prep High S) de um sobrenadante de cultura celular e incubar uma solução que compreende a proteína pró-elastase purificada à tempera- 7 tura ambiente (por exemplo, 22ºC a 26ºC) por um período de pelo menos umdia (por exemplo, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, ou ú seis dias, uma faixa de dias em que os limites superiores e inferiores são independentemente selecionados dos valores acima) (isso é influenciado pela presença de citrato/acetato, concentração, temperatura e pH na solu- ção, e pode ser facilmente determinado por um especialista na técnica). (oc) opcionalmente, purificar a elastase tipo | humana madura, por exemplo, etapa de cromatografia de troca iônica para cromatografia aperfei- çoada, e (d) liofilizar a elastase tipo | madura, isolando assim uma elasta- se tipo | humana madura liofilizada. Elastasetipo | madura é preferencial- mente uma elastase tipo | humana. Em certos aspectos, a elastase tipo | madura liofilizada é de preferência mais de 95% pura; em modalidades es- pecíficas, a elastase tipo | madura liofilizada é mais de 98% ou mais de 99% pura.

As proteínas elastases maduras da invenção podem ser formu- ladasem composições farmacêuticas. Assim, em modalidades exemplares, a presente invenção fornece um método para gerar uma composição farma- cêutica compreendendo uma elastase tipo | humana madura, o referido mé-

| 37 todo compreendendo (i) isolar uma elastase tipo | humana madura liofilizada . de acordo com os métodos descritos acima, e (ii) reconstituir a elastase tipo | humana madura liofilizada em um veículo farmaceuticamente aceitável. As Í elastases tipo | humana maduras da invenção preferivelmente têm uma ati- vidade específica de mais de 1, mais de 5, mais de 10, mais de 20, mais de 25, ou mais de 30 U/mg de proteína, conforme determinado pela medição da taxa de hidrólise do substrato N-succinil-Ala-Ala-Ala-pNitroanilida (SLAP)do peptídeo pequeno, que é catalisado pela adição de elastase. Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de elastase que catalisa a hidróli- sedeum micromol do substrato por minuto a 30ºC e a atividade específica é definida como a atividade por mg de proteína elastase (de U/mg). De prefe- rência, uma elastase tipo | humana madura da invenção tem uma atividade específica dentro de uma faixa em que o limite menor é de 1, 2, 3, 4, 5,7, - 10, 15 ou 20 U/mg de proteina e em que o limite maior é de, independente- mente, 5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50 U/mg de proteína. Em modalida- des exemplares, a atividade específica está na faixa de 1-40 U/mg de prote- ína, 1-5 U/mg de proteína, 2-10 U/mg de proteína, 4-15 U/mg de proteína, 50-30 U/mg de proteína, 10-20 U/umg de proteína, 20-40 U/ymg de proteína, ou qualquer faixa cujos limites inferiores e superiores são selecionados de qualquer um dos valores anteriores (por exemplo, 1-10 U/mg, 5-40 U mg, etc.).

As composições farmacêuticas da invenção são preferencial mente estáveis. Em modalidades específicas, uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica preparada por liofilização e reconstituição, como descrito acima), mantém pelo menos 50%, mais prefe- rivelmente pelo menos 60% e mais preferivelmente pelo menos 70% de sua atividade específica após uma semana de armazenamento a 4ºC. Em moda- lidades específicas, a composição farmacêutica mantém pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 95% de sua atividade es- pecífica após a reconstituição e uma semana de armazenamento a 4ºC. Esta invenção também fornece proteínas compreendendo uma sequência de aminoácido da pró-proteína elastase tipo | contendo uma se-

i 38 quência de domínio de clivagem da elastase.

Outros domínios de clivagem - que podem ser usados nesta invenção são qualquer uma das sequências descritas pela sequência consenso do domínio de clivagem (SEQ ID NO: 74) É Xaal Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8, onde Xaa1=P5, Xaa2=PA4, Xaa3=P3,Xaa4=P2,Xaa5=P1, Xaa6=P'1, Xaa7=P'2 e Xaa8=P'3, onde: - Xaa1l é o glutamato, a histidina, prolina, glicina, asparagina, li- sina ou alanina, ou, opcionalmente, um análogo dos mesmos; - Xaa2 é a treonina, alanina, histidina ou prolina ou, opcional- mente, um análogo das mesmas;

- Xaa3 é a alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, aspara- gina ou valina ou, opcionalmente, um análogo das mesmas, mas não é pre- ferível a glicina e a prolina;

- Xaa4 é a prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina ou - treonina ou, opcionalmente, um análogo das mesmas; - Xaa5 é a alanina, leucina, valina, isoleucina, ou serina, mas não a glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato ou lisina ou, opcionalmente, um análogo dos mesmos; - Xaa6 é alanina, leucina, valina, isoleucina ou serina ou, opcio- nalmente, um análogo das mesmas;

- Xaa7 é a glicina, alanina, ou valina ou, opcionalmente, um aná- logo das mesmas; e

- Xaa8 é valina, treonina, fenilalanina, tirosina ou triptofano ou, opcionalmente, um análogo dos mesmos.

Esta invenção também fornece um método de isolamento de uma elastase tipo! humana madura compreendendo: (a) cultura, sob condi- ções de cultura, uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma pró-proteina compreendendo (i) uma sequên- cia de ativação compreendendo uma sequência de reconhecimento da trip- sina operacionalmente ligada a (ii) sequência de aminoácido de uma proteí-

natendo a atividade da elastase sob as referidas condições de cultura em que as referidas condições de cultura compreendem um período de cresci- mento ou indução a um pH de 2 a 6; (b) recuperar a pró-proteíina expressa;

“= 39 (c) colocar proteína recuperada em contato com uma quantidade catalisado- ra da tripsina sob condições de pH nas quais a tripsina é ativa, e (d) isolar a elastase tipo | humana madura. Neste método, a elastase tipo | humana ma- dura pode consistir essencialmente da SEQ ID NO: 1, 4, 5, 84 ou 87. Em certas modalidades, as condições podem compreender (a) um período de crescimento ou indução ao pH de 4 a 6, (b) um período de crescimento ou indução de 22ºC a 28ºC; ou (c) as concentrações de citrato de sódio, succi- nato de sódio, ou de acetato de sódio de cerca de 50 mM a 200 mM ou uma concentração de citrato de sódio de 90 mM a cerca de 110 mM no meio de culturadas referidas células hospedeiras.

Deve-se observar que os artigos indefinidos "um" e "uma" e o ar- tigo definido "o" são usados no presente pedido, como é comum em pedidos de patente, para significar um ou mais a menos que o contexto claramente : determine o contrário. Além disso, o termo "ou" é usado no presente pedido, comoé comum em pedidos de patente, para significar a conjunção disjuntiva " "ou" ou conjuntiva "e".

Todas as publicações mencionadas neste relatório estão aqui incorporadas por referência. Qualquer discussão de documentos, atos, ma- teriais, dispositivos, artigos ou semelhante que tenha sido incluída no pre- sente relatório é exclusivamente para a finalidade de fornecer um contexto para a presente invenção. Não é para ser tomado como uma admissão que alguns ou todos estes assuntos fazem parte da base técnica anterior ou são de conhecimento geral comum no campo relevante para a presente inven- ção, tal como existia em qualquer lugar antes da data precedente do pedido.

As características e vantagens da invenção se tornarão ainda mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada das modalidades das mesmas.

4. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS As figuras 1A-1B: a figura 1A mostra a sequência ELA-1.2A humana sintética (ou seja, recombinante). A sequência da elastase-1 huma- na recombinante (isto é, elastase pancreática tipo | humana) contém uma região de codificação de 750 pares de base. Os sítios da enzima de restrição f 40 selecionados estão sublinhados.

As substituições de base estão duplamente sublinhadas, em negrito e os códons que os contêm estão duplamente subli- nhados.

Os códons de parada estão sombreados em cinza (mas não subli- nhados). A sequência pró-peptídica está em itálico.

A região de codificação resultada em uma proteína de 250 aminoácidos.

Após a clivagem d pró- peptídeo de 10 aminoácidos, a enzima madura resultante é de 240 aminoá- cidos.

A figura 1B mostra a região de fusão translacional pPPROT2A.

A fusão translacional entre o vetor e a região de codificação da ELA-1 é descrita.

À amplificação PCR da sequência ELA-1 fornece para a incorporação dos do- mínios de clivagem sinal da Kex2 e STE13 para produzir um produto secre- tado com um N-terminal esperado do primeiro aminoácido (em negrito) da sequência de ativação (em itálico). A figura 2: um esquema do N-terminal ao C-terminal (sobrepo- : sição) dos componentes principais das proteínas elastases da invenção, em que os componentes numerados representam: (1) sequência sinal (faixas É verticais), (2) pró-peptídeo opcional/sequência espaçadora (tijolos), (3) pró- peptídeo de elastase (listras diagonais, preenchimento cinza e padrão de diamantes combinados), (4) peptídeo de ativação (preenchimento cinza e padrão de diamantes combinados), (5) sequência de reconhecimento (pa- drãode diamante), (6) domínio de clivagem (preenchimento cinza, padrão de diamante e na porção esquerda da listras horizontais), (7) sítio de clivagem (preenchimento cinza, padrão de diamante e na porção esquerda da listras horizontais), (8) proteína pré-pró-elastase (esquema inteiro), (9) proteína pró-elastase (listras diagonais, preenchimento cinza, padrão de diamante e listras horizontais combinados) e (10) elastase proteína madura (listras hori- zontais). A tabela mostra as designações dos aminoácidos da região es- quemática estendida pela seta.

Não é desenhado à escala.

A nomenclatura é apenas para referência e não se destina a conotar uma determinada fun- ção, atividade ou mecanismo.

A figura 3: diagrama do vetor pPROT24-V. "Secreção do fator a" refere-se a um cassete contendo o peptídeo sinal do fator a da levedura, seguido por um sítio Kex2 e repetição STE13.

i 41 A figura 4: a análise SDS-PAGE das frações de cromatografia de captura de uma cultura 201-24-266-VU contendo pro-PRT-201 ativado pela tripsina.

Os números das faixas correspondem aos números de fração.

As frações 6-18 consistem primeiramente de pró-enzima glicosilada (banda superior) e pró-enzima não glicosilada (banda inferior). As frações 19-35 consistem primeiramente de pró-enzima não glicosilada.

M = marcadores de peso molecular.

FT = fluxo através da coluna.

A figura 5: tabela de dados da pró-proteína autoativada.

As se- quências de pró-peptídeo estão listadas na primeira coluna.

SDS-PAGE do sobrenadante após 1,2 e 3 dias de indução (faixas 1, 2 e 3, respectivamen- te) são mostrados na segunda coluna.

Os relativos rendimentos da pró- proteína baseados em SDS-PAGE estão listados na terceira coluna.

A esta- bilidade relativa da pró-proteína durante 3 dias de indução baseada em : SDS-PAGE estão listadas na quarta coluna.

As pró-proteínas com 42 e 48 sequências de pró-peptídeo são classificadas como tendo baixa estabilida- ' de, devido à presença da proteína madura durante a indução (observadas após 1, 2 e 3 dias para o variante 42 e depois de 2 e 3 dias para a variante de 48). As taxas de conversão relativas das pró-proteínas conforme determi- nado pelo tempo para alcançar a velocidade máxima de reação SLAP estão listadas na quinta coluna.

As porcentagens estimadas da proteína convertida que compreende as variantes N-terminal da proteína elastase madura estão listadas na sexta coluna.

A figura 6. Esquema de clonagem do pPROT55M3-V.

O p- PROT55M3-V foi modificado por ligação in vitro de dois cassetes de expres- são adicionais a espinha dorsal do vetor pPPROT55-V de 4,3 kb, dando um total de três cassetes de expressão acoplados.

O fragmento cassete de ex- pressão de 2,3 kb foi liberado do pPPROT55-V com um Bgalll e BamH! de res- trição digerido e purificado, seguido da ligação de duas cópias da expressão cassete para o pPPROT55-V linearizado com BamHl.

A figura 7: otimização de frasco agitado de clone 201-55M3- 006-VU.

Os meios de indução-padrão, BKME, foi preparado e suplementado com citrato de sódio para alcançar as concentrações finais de 0, 12,5,25e

50 mM de citrato de sódio, pH 5,5. Os meios foram utilizados para ressus- pender os grânulos de células de fase de crescimento usando uma faixa de 1 g de peso úmido da célula a 10 mL de meios de indução. As suspensões de célula de 25 mL cada foram colocadas em um balão não-Erlenmeyer de 250mLeincubadas a22ºC e 25ºC durante 3 dias com agitação de 275 rpm. O metano! foi adicionado duas vezes por dia para uma concentração final de 0,5% por volume. As alíquotas de sobrenadantes foram tomadas durante o período de 3 dias e analisadas para a expressão da proteína por SDS-PAGE e coloração por Coomassie. O Painel A mostra amostras induzidas a 22ºC e oPainelB mostra amostras induzidas a 25ºC. Em ambos os painéis, as fai- xas de 1-3 são sobrenadantes após 1, 2 e 3 dias de indução, respectivamen- te, contendo 0% de citrato de sódio; as faixas de 4-6 são semelhantes, exce- to com 12,5% de citrato de sódio; as faixas de 7-9 são semelhantes, exceto : com 25% de citrato de sódio e as faixas de 10-12 são semelhantes, exceto com50mM de citrato de sódio.

. A figura 8: análise SDS-PAGE de sobrenadantes fermentados 201-55-001-VU e 201-55M3-003-VU. As faixas 1, 2: sobrenadante 201-55- 001-VU; faixas 3, 4: sobrenadante 201-55M3-003-VU; faixa 5: vazia; faixa 6: marcadores de peso molecular.

A figura 9: Análise SDS-PAGE das frações da cromatografia de captura da pró-proteina PPROTSS5M3-V. Um total de 30 microlitros de cada fração de eluição foi misturado com 10 microlitros de tampão de carrega- mento de amostra 4X Laemmli suplementados com beta-mercaptoetanol. As proteínas foram submetidas à eletroforese em um gradiente linear de gel 816% seguido de coloração por Coomassie. Duas formas predominantes da PRT-201 foram observadas: a pró-proteína (frações 15-43) e PRT-201 ma- duro convertido espontaneamente (frações 15-44). Os números da faixa cor- respondem aos números de fração. M, marcador de peso molecular. BC, amostra da coluna anterior (pré-carga).

A figura 10: análise HIC-HPLC de conversão da pró-proteína purificada. Pró-PRT-201-55M3-003-VU purificado foi submetido à conversão a 26ºC. O gráfico mostra as quantidades relativas de PRT-201 maduros (se-

| 43 quência completa) e variantes N-terminal produzidas durante a conversão.

A figura 11: análise HIC-HPLC de conversão da pró-proteina em sobrenadante de fermentação realizada por filtração de fluxo tangencial. Sobrenadante de fermentação 201-55M3-003-VU purificado foi submetido à filtração de fluxo tangencial com 100 mM de Tris, pH 8,0, usando diafiltração a volume constante, à temperatura ambiente com membranas de celulose regeneradas. O gráfico mostra as quantidades relativas de pró-proteinas, PRT-201 madura (sequência completa) e variantes N-terminais presentes em vários pontos do tempo durante a conversão.

A figura 12: análise SDS-PAGE das frações de cromatografia de captura de conversão da pPPROT55M3-V. Um total de 30 microlitros de cada fração de eluição foi misturado com 10 microlitros de tampão de carre- gamento de amostra 4X Laemmli suplementados com beta-mercaptoetanol.

7 As proteínas foram submetidos à eletroforese em um gradiente linear de gel 8-16% seguido de coloração por Coomassie. Duas formas predominantes de 7 PRT-201 foram observadas: a forma madura glicosilada (frações 35-70), e a forma madura não-glicosilada (frações 75-160). Os números das faixas cor- respondem aos números de fração. M, marcador de peso molecular. BC, amostra da coluna anterior (pré-carga).

A figura 13: dependência de concentração de conversão pró. Pró-PRT-201 purificado do clone 201-55M3-003-VU (pró-PRT-201-55M3- 003-VU) foi submetido à conversão em concentrações de 0,2, 1,0, 1,6 e 1,8 mg/mL. As reações de conversão foram monitoradas por HIC-HPLC em tempo real até a pró-proteína ser < a 1% da proteína total. O gráfico mostra a quantidade relativa de PRT-201 maduro (sequência completa) (barras sombreadas mais claras) e variantes N-terminal (barras sombreadas mais escuras) produzida durante as conversões.

A figura 14: sequência de DNA da elastase pancreática tipo | porcina sintética (isto é, recombinante). A sequência recombinante contém uma região de codificação de 750 pares de base. Os sítios de restrição Sacll e Xbal como sublinhados foram incorporados para facilitar a clonagem. Os códons de parada estão sublinhados. A sequência de pró-peptídeo está em

E ae negrito.

A figura 15: sequência de aminoácidos da elastase pancreática tipo | porcina sintética (ou seja, recombinante). A região do pró-peptídeo está em negrito, enquanto o sítio de clivagem da tripsina está sublinhado. Após a clivagem do pró-peptídeo de 10 aminoácidos, a enzima que madura resul- tante é de 240 aminoácidos.

A figura 16: esquema de clonagem da elastase pancreática tipo | porcina sintética no vetor PV-1. Após a síntese da região de codificação da pró-proteína elastase pancreática tipo | porcina sintética, ela foi clonada no vetor Blue Heron pUC. Além de ampliar a sequência de codificação da elas- tase pancreática tipo | porcina sintética, o PCR foi usado para incorporar os sítios de restrição Xhol e Sacll para clonagem no vetor PV-1. O produto do PCR foi digerido, purificado em gel e ligado com o vetor PV-1 e digerido com : Xhol e Sacll, resultando assim em um vetor de expressão pPROT101-24-V codificando a pró-proteína elastase pancreática tipo | porcina ativada pela f tripsina.

A figura 17: análise de expressão dos clones pPPROT101-42-V autoativado e pPROT101-24-V ativado pela tripsina durante a indução da metanol por SDS-PAGE. Os sobrenadantes dos francos agitados após um diade indução foram analisados em um gel com gradiente 8-16%, seguido por coloração com coloração por Coomassie. As faixas 10/01 contêm sobre- nadantes de dez clones diferentes transformados com pPROT101-42-V. As faixas 12/11 contêm sobrenadantes de dois clones diferentes transformados com pPROT101-24-V. M, marcadores de peso molecular.

A figura 18: análise de expressão dos clones pPROT101-49-V autoativado e pPPROT101-55L-V durante a indução por metanol por SDS- PAGE. Os sobrenadantes dos frascos agitados após 1 e 2 dias de indução foram analisados em um gel de gradiente 8-16%, seguido pela coloração por Coomassie. As faixas 1-2 contêm sobrenadantes de um clone pPPROT101- 49-Vapós1e2diasda indução, respectivamente. As faixas 3-4 contêm so- brenadantes de um clone pPROT101-55L-V após 1 e 2 dias de indução, respectivamente. M, marcadores de peso molecular.

A figura 19: o curso do tempo de ativação das proteínas p- PROT101-49-V e pPROT101-55L-V através da análise de conversão de pe- quena escala, como determinado pela atividade elastase SLAP. As barras de erro representam + SD da média (n=4).

A figura 20: análise SDS-PAGE dos sobrenadante pPROT101- 49-V e pPPROT101-55L-V antes e depois da análise da conversão em pe- quena escala. Antes da eletroforese, as amostras foram misturadas com á- cido cítrico, agente redutor TCEP e amostra tampão LDS (Invitrogen, CA). As amostras foram aquecidas a 70ºC durante 10 minutos. As faixas 1-2: so- brenadante da análise de pré- e pós-conversão de pPROT101-49-V, respec- tivamente; faixas 3-4: sobrenadante da análise de pré e pós-conversão de PPROT101-55L-V, respectivamente. M, marcadores de peso molecular.

A figura 21: curva-padrão TrypZean. 7 A figura 22: um lado, vista parcialmente seccionada da modali- dadede um dispositivo médico descrito na Seção 5.9.

à A figura 23: uma visão semelhante à da figura 22 que ilustra o movimento dos atuadores do dispositivo médico. A figura 24: uma visão da seção final no plano da linha 2-2, figu- ra 22.

A figura 25: uma visão da seção final no plano da linha 3-3 na figura 22.

A figura 26: um diagrama da via líquida do dispositivo da figura 22, se estendendo das ligações Luer através dos tubos de distribuição de fluido para o reservatório e, em seguida, para os penetradores do tecido.

A figura 27: um lado, vista parcialmente seccionada de uma se- gunda modalidade do dispositivo da presente invenção mostrando os atua- dores em suas configurações restritas.

A figura 28: uma visão semelhante à figura 27, mas mostrando os atuadores em suas configurações sem restrições.

A figura 29: uma visão em perspectiva final da montagem ao longo da linha 3'-3'da figura 27.

A figura 30: uma visão em perspectiva final da montagem ao

É 46 longo da linha 4'-4' da figura 29 mostrando os penetradores do tecido.

A figura 31: uma visão lateral mostrando os detalhes da extre- midade proximal do dispositivo, mostrado à direita nas figuras 27 e 28.

A figura 32: uma visão parcial do exterior do dispositivo médico dafigura22em sua posição restrita.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a métodos para expressão re- combinante e produção de proteínas elastases maduras biologicamente ati- vas. A presente invenção fornece novos métodos eficientes para produzir proteinas elastases recombinantes ao cultivar células hospedeiras, incluindo as células hospedeiras preferidas, Pichia pastoris, compreendendo ácidos nucleicos que codificam as proteínas pró-elastase e as proteínas pré-pró- elastase. O uso de proteínas recombinantes para produzir composições far- z macêuticas para o tratamento e a prevenção de doenças de tubos biológicos (incluindo as artérias ou veias) também é fornecido.

ô Em certos aspectos, a presente invenção é dirigida a proteínas pró-elastases recombinantes autoativadas e ácidos nucleicos, células hos- pedeiras, e métodos de fabricação relacionados. Tais proteínas pró-elastase autoativadas são modificadas para conter um sítio de reconhecimento da elastase imediatamente N-terminal ao primeiro resíduo da proteína elastase madura. Sob condições de cultura específicas, como as descritas na Seção 6 abaixo, é possível reduzir a autoativação até que a ativação seja desejada. Também é possível reduzir a autoativação até a pró-elastase ser removida da cultura celular.

A presente invenção fornece expressão eficiente e processos de purificação para produzir proteínas elastases de grau farmacêutico. A pre- sente invenção também fornece métodos para tratar ou prevenir doenças de tubos biológicos usando as proteínas elastases da invenção.

A descrição na Seção 5 aqui é aplicável às modalidades da Se- ção8. Assim, por exemplo, uma referência a uma proteína elastase da in- venção inclui, mas não está limitada a, uma referência a uma proteína elas- tase de acordo com qualquer uma das modalidades de 1-39 e 68-69, ou uma

É 47 proteína elastase obtida ou que possa ser obtida pelo método de qualquer uma das modalidades de 89-224, 261-276 e 347-373. Da mesma forma, uma referência a um ácido nucleico da invenção refere-se, inter alia, a um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades de 40-67; re- ferênciaa um vetor se refere, inter alia, a uma referência a um vetor de a- cordo com qualquer uma das modalidades de 70-72; referência a uma célula se refere, inter alia, a uma célula de acordo com qualquer uma das modali- dades de 73-87, referência a um sobrenadante de cultura celular se refere, inter alia, a um sobrenadante de cultura celular de acordo com a modalidade 88; referência as composições, tais como composições farmacêuticas, for- mulações da elastase e dosagens unitárias, inclui, por exemplo, aquelas e- xemplificadas em modalidades de 277-314, 346, 386 e 415-420 ou aquelas obtidas ou que possam ser obtidas pelo método de qualquer uma das moda- e lidades de 261-276 e 374-385; e referências a métodos terapêuticos também incluem uma referência a métodos terapêuticos de acordo com qualquer i uma das modalidades de 387-414; e referência a um Kit inclui uma referên- cia, inter alia, a uma referência a um kit de modalidades de 421-425 da Se- ção 8.

5.1. Proteínas Elastases A presente invenção é direcionada, inter alia, aos métodos para expressão recombinante e produção de proteínas elastases maduras biolo- gicamente ativas. As proteínas elastases são geralmente expressas como pré-pró-proteínas, contendo, entre outras sequências, o peptídeo sinal, um peptídeo de ativação, e uma porção madura com atividade biológica. As se- —quências de proteínas elastases maduras adequadas são descritas na Se- ção 5.1.1 abaixo. As sequências peptídicas de ativação adequadas são des- critas na Seção 5.1.2 abaixo. As sequências sinal apropriadas são descritas na Seção 5.1.3 abaixo. Assim, em certos aspectos, as proteínas elastases da invenção são proteínas pré-pró-elastase. A remoção da sequência sinal da pré-pró- proteína sob secreção geralmente produz uma pró-proteína inativa contendo um peptídeo de ativação de uma proteína madura. As frases "sequência de

K 48 ativação" e "peptídeo de ativação" são utilizadas alternadamente aqui. As- sim, em outros aspectos, as proteínas elastases da invenção são proteínas pró-elastase compreendendo um peptídeo de ativação que é operacional- mente ligado a uma proteína elastase madura. Em uma modalidade exem- plar, um peptídeo de ativação ou sequência da elastase pancreática tipo | humana do tipo selvagem compreende os primeiros 10 aminoácidos N- terminal da pró-proteina elastase pancreática tipo | humana (SEQ ID NO: 22). Em certas modalidades, o peptídeo de ativação é um peptídeo da SEQ ID NO: 80. Os peptídeos de ativação ou sequências úteis para a prática des- tainvenção também incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NO: 23, 72 e 73. Ainda outras sequências de ativação úteis na prática desta invenção podem ser obtidas dos resíduos N-terminal 1-10 da SEQ ID NO :64-69 e 98-

103.

: A remoção do peptídeo de ativação da sequência pró-elastase gera uma proteína elastase madura. A etapa em que o peptídeo de ativação * é removido da sequência da pró-elastase/separado da sequência elastase madura para gerar uma proteína elastase madura é referida aqui como uma etapa de ativação. Assim, ainda em outros aspectos, as proteínas elastases da invenção são proteínas elastase maduras.

Os resíduos de aminoácido compreendendo o C-terminal (isto é, carbóxi terminal) do peptídeo de ativação e o N-terminal (isto é, amino termi- nal) da proteína madura que cercam a ligação de clivagem estão represen- tados na figura 2 e também identificados aqui como se segue. Primeiro, os resíduos localizados no C-terminal do peptídeo de ativação são designados PX..P5,P4,P3,P2eP1, onde P1 é o resíduo C-terminal do peptídeo de ativação. Os resíduos localizados no N-terminal da proteína madura são de- signados P1', P2', P3',...PX', onde P1' é o resíduo de aminoácido N-terminal da proteína madura. A ligação scissile que é clivada por proteólise (referida como a "ligação de clivagem" na figura 2) é a ligação peptídica entre o resi- —duoP1dopeptídeo de ativação e o resíduo P1' da proteína madura.

A região que abrange quatro aminoácidos do C-terminal do pep- tídeo de ativação (resíduos P4 a P1) até os primeiros 4 aminoácidos do N-

À 49 terminal da proteína madura (resíduos P1' a P4') é referida aqui como "sítio de clivagem". A região que abrange cerca de 5 aminoácidos do C-terminal do peptídeo de ativação (ou seja, resíduos P5 a P1) até aproximadamente os 3 primeiros aminoácidos do N-terminal da proteina madura (ou seja, os resí- duos P1' a P3') é referida aqui como "domínio de clivagem". Os exemplos de domínios de clivagem que podem ser usados no contexto da presente in- venção incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NOS: 42, 43, 48, 49, 52, 53, 54 ou 55. Outros domínios de clivagem que podem ser usados nesta invenção são algumas das sequências descritas pela sequência consenso do domínio clivagem Xaa, Xaa, Xaa; Xaa, Xaa; Xaa; Xaa; Xaas;, onde Xa- a,=P5, Xaax=P4, Xaa;=P3, Xaa,=P2, Xaas=P3, Xaas=P1', Xaa;=P2', e Xa- ag=P3', onde: : - Xaa, é o glutamato, histidina, prolina, glicina, asparagina, lisina, ou alanina ou, opcionalmente, um análogo dos mesmos; a - Xaa, é a treonina, alanina, prolina ou histidina ou, opcional- mente, um análogo das mesmas; - Xaa; é a alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, aspara- gina, ou valina ou, opcionalmente, um análogo das mesmas, mas não é pre- ferívelaglicinae a prolina; - Xaa, é a prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina, ou treonina ou, opcionalmente, um análogo das mesmas; - Xaa; é a alanina, leucina, valina, isoleucina, ou serina, mas não a glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato ou lisina ou, op- cionalmente, um análogo dos mesmos; - Xaa; É a alanina, leucina, valina, isoleucina ou serina ou, op- cionalmente, um análogo das mesmas; - Xaa; é a glicina, alanina, ou valina ou, opcionalmente, um aná- logo das mesmas; e - Xaag é a valina, treonina, fenilalanina, tirosina ou triptofano ou, opcionalmente, um análogo dos mesmos.

As três regiões de aminoácidos que abrange os resíduos P3, P2 e P1 do peptídeo de ativação são referidas aqui como um "sítio de reconhe- cimento da elastase". Exemplos de sítios de reconhecimento que podem ser usados no contexto dessa invenção incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NOS: 14-16 e 18-21. Outros sítios de reconhecimento contemplados por esta invenção incluem qualquer sítio de reconhecimento descrito pelos sítios consenso de reconhecimento da SEQ ID NO: 11, 12, 13 ou 93. A se- quência 1 consenso de reconhecimento da elastase SEQ ID NO: 11 é repre- sentada pela sequência de peptídeo Xaa, Xaa, Xaa;z, onde Xaa,=P3, Xa- asz=P2, Xaa;=P1, onde: - Xaa, é a alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, aspara- gina, ou valina ou, opcionalmente, um análogo das mesmas, mas não é pre- ferível a glicina e a prolina; - Xaa, é a prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina, ou : treonina ou, opcionalmente, um análogo das mesmas; - Xaa; é a alanina, leucina, valina, isoleucina, ou serina ou, op- . cionalmente, um análogo das mesmas, mas não é preferível a glicina, tirosi- na, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato e lisina. A sequência 2 consenso de reconhecimento elastase SEQ ID NO: 12 é representado pela sequência Xaa; Pro Xaa,, onde: - Xaa, é a alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, ou vali- na ou, opcionalmente, um análogo das mesmas, mas não é preferível a gli- cina e a prolina; - Pro é a prolina ou, opcionalmente, um análogo da mesma; - Xaa, é a alanina, leucina, valina, isoleucina, ou serina ou, op- —cionalmente, um análogo das mesmas, mas não é preferível a glicina, tirosi- na, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato e lisina.

A sequência 3 consenso de reconhecimento elastase SEQ ID NO: 13 é representada pela sequência de peptídeo Xaa;, Xaa, Xaaz, onde Xaa=P3, Xaa;=P2, Xaa;=P1, onde Xaa, é a asparagina ou alanina ou, op- —cionalmente, um análogo das mesmas; onde Xaa, é a prolina ou alanina ou, opcionalmente, um análogo das mesmas, e onde Xaa; é a alanina, leucina, ou valina ou, opcionalmente, um análogo das mesmas.

A sequência 4 consenso de reconhecimento elastase SEQ ID NO: 93 é representada pela sequência Xaa, Pro Xaa,, onde: - Xaa, é a alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, aspara- gina ou valina ou, opcionalmente, um análogo das mesmas, mas não é pre- ferivelaglicinae a prolina; - Pro é a prolina ou, opcionalmente, um análogo da mesma; - Xaa, é a alanina, leucina, valina, isoleucina, ou serina ou, op- cionalmente, um análogo das mesmas, mas não é preferível a glicina, tirosi- na, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato e lisina.

A referência a uma sequência como uma "sequência de cliva- gem", um "domínio clivagem", um "sequência de ativação", uma "sequência de reconhecimento da elastase", etc., é apenas para facilitar a referência e não se destina a implicar qualquer função da sequência ou o mecanismo : pelo qual a sequência é reconhecida ou processada.

As proteínas da invenção são geralmente compostas de amino- Ô ácidos e podem incluir em adição um ou mais (por exemplo, até 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 12 ou 15), análogos de aminoácidos. Geralmente, como usado aqui, um aminoácido se refere a uma ocorrência natural de L estereoisôme- ro. Um análogo de aminoácido se refere a um D-estereoisômero, um amino- ácido quimicamente modificado, ou outro aminoácido não natural. Por e- xemplo, os aminoácidos não naturais incluem, mas não estão limitados ao, ácido azetidinocarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, B- alanina, ácido aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4 aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-amino-heptanóico, ácido 2- — aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, butilglici- na terciário, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2" diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etilglicina, N- etilasparagi- na, homoprolina, hidroxilisina, allo-hidroxilisina,y 3-hidroxiprolinay, 4- hidroxiprolina, isodesmosina, allo-isoleucina, N-metilalanina, N- metilglicina, —N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N- metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico e tioprolina. Um aminoáci- do quimicamente modificado inclui um aminoácido que é quimicamente blo-

queado, reversível ou irreversivelmente, e/ou modificado em um ou mais de seus grupos laterais, átomos de carbono-a, grupo amino terminal, ou grupo ácido carboxílico terminal. A modificação química inclui a adição de metades químicas, criando novas ligações, e a remoção de metades químicas. E- xemplosde aminoácidos modificados quimicamente incluem, por exemplo, o sulfóxido de metionina, metionina sulfona, S-(carboximetil)-cisteína, S- (carboximetil)-cisteína sulifóxido e S-(carboximetil)-cisteína sulfona. As modi- ficações em grupos laterais dos aminoácidos incluem a acilação do grupo amino-e lisina, N-alquilação de arginina, histidina, ou lisina, alquilação dos grupos ácido carboxílico do glutamato ou aspartato, e desamidação da glu- tamina ou asparagina. Modificações do amino terminal incluem as modifica- ções de desamino, N-alquila inferior, N-di-alquila inferior, e N-acila. Modifica- ções do grupo carbóxi terminal incluem modificações da amida, alquil amida 7 inferior, dialquil amida e éster de alquila inferior. A alquila inferior é uma al- quila C1I-C4. Além disso, um ou mais grupos laterais, ou grupos terminal, : podem ser protegidos por grupos de proteção conhecidos pelo químico com conhecimento comum em proteína. O carbono-a de um aminoácido pode ser mono- ou dimetilado.

As proteínas da invenção podem ser modificadas ou derivatiza- das,talcomo modificadass por fosforilação e glicosilação, ou derivatizadas por conjugação, por exemplo, a um lipídio ou outra proteína (por exemplo, para alcance ou estabilização), ou similar. A presente invenção geralmente refere-se a uma proteína elas- tase "isolada" ou "purificada". Uma proteína elastase isolada é aquela que é removida de seu meio celular. A proteína elastase purificada é substancial- mente livre de material celular ou de outras proteinas contaminantes da fon- te de célula ou tecido da qual a proteína elastase é derivada, ou substanci- almente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. A linguagem "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de proteína elastase em que a proteína é separa- da de componentes celulares das células da qual é recombinantemente pro- duzida. Assim, a proteína elastase, que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína elastase tendo menos de cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (por peso seco) de proteína heteróloga (também referida aqui como uma "proteína contaminada"). Quando a proteína elasta- se é produzida por um processo em que é secretada em meio de cultura, é também, de preferência, substancialmente livre do meio de cultura, ou seja, o meio de cultura representa menos de cerca de 20%, 10%, ou 5% do volu- me da preparação da proteína elastase. Em certas modalidades, a elastase isolada ou purificada é adi- cionalmente livre ou substancialmente livre de DNA celular. Em modalidades específicas, o DNA genômico da célula hospedeira está presente em uma quantidade inferior a 10 picogramas, menos de 5 picogramas, menos de 3 picogramas, menos de 2 picogramas ou menos de um picograma de DNA por miligrama de proteína elastase em uma preparação da proteína elastase : isolada ou purificada, ou uma composição compreendendo a proteína elas- taseisolada ou purificada. Em uma modalidade, o DNA da célula hospedeira É é o DNA da Pichia pastoris.

As sequências de proteína elastase úteis são apresentadas na Tabela 1. Em uma modalidade específica, a invenção fornece uma proteína pró-elastase (incluindo, mas não se limitado a, uma proteína de qualquer umadasSEQID NOS: 6-9, 64-69, 88-91 e 98-103), compreendendo (i) uma sequência de ativação compreendendo uma sequência de reconhecimento da elastase operacionalmente ligada a (ii) sequência de aminoácido de uma proteína que tem atividade da elastase tipo |. Vários polimorfismos da elas- tase tipo | humana são conhecidos. Qualquer combinação de polimorfismos é contemplada nas sequências de proteína pró-elastase da presente inven- ção, incluindo, mas não limitado, as combinações de polimorfismos estabe- lecidas na Tabela 2. A proteína opcionalmente compreende ainda uma se- quência sinal operacionalmente ligada à referida sequência de ativação. Em certas modalidades específicas, a sequência sinal é operável em Pichia pas- toris,como um peptídeo sinal do fator a da levedura, exemplificada pela se- quência de aminoácido da SEQ ID NO: 34. O peptídeo sinal alternativo con- tendo as sequências são exemplificados na SEQ ID NOS: 50 e 96 (contendo

MI 54 um peptídeo sinal, um pró-peptídeo sem elastase e uma sequência espaça- dora) e SEQ ID NOS: 51 e 97 (contendo o peptídeo sinal e um pró-peptídeo sem elastase). Em outras modalidades específicas, a sequência de sinal é uma sequência sinal de secreção de mamíferos, como uma sequência sinal da elastase porcina. Preferencialmente, a sequência de reconhecimento da elastase é uma sequência de reconhecimento da elastase tipo |, mais prefe- rivelmente, uma sequência de reconhecimento da elastase tipo | humana. A presente invenção engloba ainda as variantes das proteínas elastase da invenção. As variantes podem conter substituições de aminoáci- dosem um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais previstos. Pre- ferivelmente, uma variante inclui não mais que 15, não mais que 12, não mais que 10, não mais que 9, não mais que 8, não mais que 7, não mais que 6, não mais que 5, não mais que 4, não mais de 3, não mais que 2 ou mais - do que 1 substituição conservadora do aminoácido em relação a uma ocor- rência natural da elastase madura e/ou não mais que 5, não mais que 4, não í mais que 3 ou não mais que 2 substituições não conservadoras de aminoá- cidos, ou mais do que 1 substituição não conservadora de aminoácido em relação a uma ocorrência natural da elastase madura.

Em modalidades específicas, a variante não tem mais de 10 ou mais preferiveimente não mais de cinco substituições conservadoras de a- minoácidos em relação a uma elastase madura, uma pró-elastase ou pré- pró-elastase da invenção, como no que refere-se a uma elastase madura da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 84 ou uma proteína pró-elastase da SEQ ID NO: 6-9, 64-69, 88-91 e 98-103. As sequências de aminoácidos da SEQ ID NOS:1eB84 contêm uma ou mais posições correspondentes aos polimor- fismos potenciais na sequência de elastase madura, nas posições 44 (W ou R), 59 (M ou V); 220 (V ou L); e 243 (Q ou R) (as posições referem-se às pré-proproteínas). A invenção abrange, assim, as proteínas elastases madu- ras com qualquer combinação dos quatro polimorfismos identificados na SEQID NO: 84. Cada uma dessas combinações é descrita na Tabela 3. À sequência de SEQ ID NOS: 88-91 e 98-103 contém ainda um polimorfismo potencial na sequência de pró-peptídeo, na posição 10 (Q ou H). A invenção o 55 abrange, assim, as sequências de pré-pró-elastase e de pró-elastase con- tendo qualquer combinação dos cinco polimorfismos identificados na SEQ ID NOS: 88-91 e 98-103. Cada uma dessas combinações é descrita na Tabela

2.

Uma "substituição conservadora do aminoácido" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Essas famí- lias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalani- : na, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tiro- í sina, fenilalanina, triptofano). As proteínas elastases variantes da invenção podem incluir substituições de aminoácidos com análogos de aminoácidos, bem como a- minoácidos, tal como descrito aqui.

Em modalidades específicas, a proteína da invenção compreen- de ou consiste essencialmente de uma variante de uma elastase tipo | hu- mana madura, por exemplo, uma variante que é, pelo menos, cerca de 75%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96% , 97%, 98% ou 99% idêntica as pró-proteinas elastase ou proteínas elastases maduras listadas na Tabela 1, tais como, mas nãolimitadoa,pró-proteínas elastases da SEQ ID NOS: 6-9, 64-69, 88- 91 e 98-103, e retém atividade da elastase quando expressa para produzir uma proteína elastase madura da SEQ ID NO: 1,4, 5, 84 ou 87.

Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para finsde comparação ideal (por exemplo, espaços podem ser introduzidos na sequência de um primeiro aminoácido ou na sequência de ácido nucleico para o alinhamento ideal com uma segunda sequência de aminoácido ou de ácido nucleico). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições correspondentes de aminoácidos ou nucleotídeos são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelos mesmos resí- duos de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na se- gunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A identi- dade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posi- ções idênticas compartilhadas pelas sequências (%identidade=(ft de posi- ções idênticas/f total de posições sobrepostas) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências são do mesmo comprimento. Em outras modalidades, asduas sequências diferem de comprimento por não mais que 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% do comprimento da mais longa das duas sequências.

A determinação da identidade percentual entre duas sequências z pode ser alcançada usando um algoritmo matemático. Um exemplo preferi- do, não limitante de um algoritmo matemático usado para a comparação de É duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos progra- mas NBLAST e XBLAST de Altschul ef a/. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. As pesquisas de nucleotíideo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, comprimento da palavra = 12 para obter as sequên- cias de nucleotídeos homólogos às moléculas de ácido nucleico da inven- ção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o progra- ma XBLAST, escore = 50, comprimento da palavra = 3 para obter as se- —quênciasde aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos espaçados para fins de comparação, BLAST espa- çado pode ser usado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para execu- tar uma pesquisa reiterada que detecte as relações distantes entre as molé- —culas(/d). Quando se utiliza os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI- Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, X- BLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver http:/Mww.ncbi.nlm.nih.gov.

É 57 Outro exemplo preferido, não limitante de um algoritmo matemá- tico usado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Mil- ler, CABIOS (1989). Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão

2.0), que faz parte do pacote de software de alinhamento de sequência CGC. Quando se utiliza o programa ALIGN para comparar as sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma falta de compri- mento de espaço 12, e uma falta de espaço 4 podem ser usados. Algoritmos adicionais para a análise da sequência são conhecidos na técnica e incluem ADVANCE e ADAM conforme descrito em Torellis e Robotti, 1994, Comput.

Appl. Biosci. 10:3-5; e FASTA descrito em Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup é uma opção de controle que define a sensibilidade e a velocidade de pesquisa. Se ktup = 2, as regi- ões semelhantes nas duas sequências que estão sendo comparadas são : encontradas olhando pares de resíduos alinhados; se ktup = 1, aminoácidos alinhados sozinhos são examinados. ktup pode ser definido como 2 ou 1 Á para as sequências de proteína, ou de 1 a 6 para sequências de DNA. O padrão se ktup não for especificado é de 2 para proteínas e de 6 para DNA. Para uma descrição mais detalhada dos parâmetros FASTA, ver http://bioweb.pasteur.fr/docs/man/man/fasta.1.htmlftsect2, os conteúdos do qualsão incorporados aqui por referência.

A identidade percentual entre as duas sequências pode ser de- terminada usando técnicas semelhantes àquelas descritas acima, com ou sem permitir espaços. No cálculo de identidade percentual, normalmente as correspondências exatas são contadas.

As proteínas elastases da invenção podem apresentar modifica- ções pós-translacionais, incluindo, mas não limitado a, glicosilações (por e- xemplo, glicosilações N-ligadas ou O-ligadas), miristilações, palmitilações, acetilações e fosforilações (por exemplo, serina/treonina ou tirosina). Em uma modalidade, as proteínas elastases da invenção exibem níveis reduzi- dos de glicosilação O-ligada e/ou glicosilação N-ligada em relação às proteí- nas elastases endogenamente expressas. Em outra modalidade, as proteí- nas elastase da invenção não apresentam glicosilação O-ligada ou glicosila-

E 58 ção N-ligada.

5.1.1. A SEQUÊNCIA DA ELASTASE MADURA As sequências da elastase madura da presente invenção são preferivelmente sequências da elastase de mamíferos, mais preferivelmente sequências de elastase humana. Em outras modalidades, as sequências da elastase madura de mamíferos são de outros mamíferos como o camundon- go, rato, porco, vaca ou cavalo. Nos métodos e composições da invenção, a sequência da elas- tase madura empregada é de preferência uma elastase pancreática tipo |, que cliva preferencialmente sequências de proteínas hidrofóbicas, preferi- velmente no lado carboxi dos pequenos resíduos hidrofóbicos, tais como a alanina. Exemplos de elastases pancreáticas tipo | incluem a enzima elasta- se humana | (NCBI Número de acesso NP 001962) que é expressa na pele E e a enzima elastase pancreática porcina | (NCBI Número de acesso CA- A2Z7670) que é expressa no pâncreas. SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 84 são exemplos de sequências da elastase tipo | humana madura. Alternativamente, a elastase tipo !l que pode clivar as sequên- cias de proteínas hidrofóbicas, preferivelmente no lado carbóxi de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos de médio a grande, podem ser usados. Exem- plosde elastases tipo Il incluem a enzima elastase humana IIA (NCBI Núme- ro de acesso NP254275) e a enzima elastase porcina Il (NCBI Número de acesso A26823), que são ambas expressas no pâncreas. As variantes de uma proteína elastase madura da invenção tam- bém são abrangidas. As variantes incluem proteínas compreendendo se- —quênciasde aminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas da sequên- cia de aminoácidos da proteína elastase madura da invenção e apresentam atividade biológica da elastase. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína elastase madura da invenção pode ser uma proteína que é, por e- xemplo, pelo menos 150, 160, 175, 180, 185, 190, 200, 210, 220, 230, 231, 232,233,234,235, 236, 237, 238, ou 239 de aminoácidos de comprimento. Além disso, outras porções biologicamente ativas, nas quais outras regiões da proteína são eliminadas, podem ser preparadas por técnicas recombinan-

i 59 tes e avaliadas por uma ou mais das atividades funcionais da forma nativa de uma proteína elastase madura da invenção.

Além disso, as proteínas elastases maduras compreendem qualquer combinação dos quatro polimorfismos da elastase tipo | humana são representadas pela SEQ ID NO: 84. As combinações possíveis são es- tabelecidas na Tabela 3.

5.1.2. SEQUÊNCIAS DE ATIVAÇÃO DA PROELASTASE A sequência de ativação da elastase é qualquer sequência cuja remoção de uma proteína pró-elastase resulta em uma proteína elastase madura biologicamente ativa.

As sequências de ativação contêm geralmente sítios reconheci- mento da protease adjacente ao local onde as pró-proteínas são clivadas para produzir proteínas maduras biologicamente ativas. Uma sequência de : ativação pode ser modificada para adicionar um sítio de reconhecimento da elastase ou protease, ou pode ser modificada para substituir um sítio de re- i conhecimento da protease existente com outro sítio de reconhecimento da protease. Os peptídeos ou sequências de ativação úteis na prática desta invenção incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NO: 23, 72 e 73. Ain- da outras sequências de ativação útil na prática desta invenção podem ser obtidas dos resíduos N-terminal de 1-10 da SEQ ID NO: 64-68. Em aspectos preferidos, a sequência de ativação da pró-elastase é modificada para conter uma sequência de reconhecimento para uma elastase tipo | ou tipo Il. Mais preferivelmente, a sequência de reconhecimento da elastase é reconhecida pela elastase madura a qual está operacionalmente ligada. Assim, em moda- lidades direcionadas para uma elastase tipo |l, a sequência de reconheci- mento é mais preferivelmente uma sequência de reconhecimento da elasta- se tipo Il. Por outro lado, em modalidades dirigidas a uma elastase tipo |, a sequência de reconhecimento é mais preferivelmente uma sequência de re- conhecimento da elastase tipo |. Em uma modalidade preferida, a sequência de reconhecimento é uma sequência de reconhecimento da elastase tipo | humana. As sequências de reconhecimento exemplar do tipo | incluem a sequência de aminoácido da SEQ ID NOS: 14-16 e 18-21. Outros sítios de au) 60 reconhecimento contemplados por esta invenção incluem qualquer sítio de reconhecimento descrito pelos sítios de reconhecimento consenso da SEQ ID NO: 11, 12 ou 13.

5.1.3. SEQUÊNCIAS SINAL As proteínas pró-elastases da invenção podem ainda conter uma sequência sinal que aumenta a secreção de uma proteína pró-elastase no meio de cultura da célula hospedeira na qual ela é expressa. A sequência sinal nativa da proteína elastase pode ser usada, particularmente para a expressão em uma célula hospedeira de mamíferos. Em outras modalidades, a sequência sinal nativa de uma proteína elastase da invenção pode ser removida e substituída por uma sequência sinal de outra proteína, tais como a sequência sinal da elastase tipo | porcina, a se- quência sinal da elastase tipo | humana, ou a sequência sinal do fator a da E levedura. Em certas modalidades específicas, o peptídeo sinal do fator a da levedura pode incluir ainda (1) pró-peptídeo do fator a da levedura, ou (2) Á um pró-peptídeo e sequência espaçadora do fator a da levedura, cada um respectivamente exemplificado pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NOS : 50 e 96 ou SEQ ID NOS: 51 e 97. Alternativamente, a sequência se- cretora gp67 da proteína do envelope do baculovírus pode ser usada como uma sequência sinal heteróloga (Protocolos atuais em Biologia Molecular (Ausubel et a/. Eds., John Wiley & Sons, 1992)). Outros exemplos de se- quências sinal heterólogas eucarióticas incluem as sequências secretoras da melitina e da fosfatase alcalina placental humana (Stratagene; La Jolla, Cali- fórnia). Em ainda outro exemplo, sequências sinal heterólogas procarióticas úteis incluem o sinal secretor phoA (Sambrook et a/., supra) e o sinal secre- tor da proteína A (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey).

5.2. ÁCIDOS NUCLEICOS DA ELASTASE Um aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácidos nuclei- cos recombinantes que codificam uma proteína elastase recombinante da invenção. Conforme usado aqui, o termo "molécula de ácido nucleico" tem a intenção de incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômi- co) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos de DNA ou RNA el 61 gerados usando de análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico pode ser de filamento simples ou filamento duplo, mas preferencialmente é o DNA de filamento duplo. A presente invenção é dirigida a ácidos nucleicos que codificam as proteínas elastases da invenção. Assim, em certas modalidades, a pre- sente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pró-elastase (in- cluindo, mas não limitado a, uma proteína de qualquer uma das SEQ ID NOS: 6-9, 64-69, 88-91 ou 98-103), que compreendendo (i) uma sequência de ativação compreendendo uma sequência de reconhecimento elastase operacionalmente ligada a (ii) uma sequência de aminoácidos de uma prote- ina tendo uma atividade de elastase tipo |. Em outras modalidades, a pre- sente invenção também fornece uma molécula de ácido nucleico compreen- : dendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que inclui ()uma sequência sinal operável em Pichia pastoris operacionalmente ligada ' a (il) uma sequência de ativação (incluindo, mas não limitado a, uma se- quência de aminoácido da SEQ ID NOS: 23, 72 ou 73) compreendendo uma sequência de reconhecimento da protease, que por sua vez é operacional- mente ligada a (ili) a sequência de aminoácidos de uma elastase tipo | hu- manamadura.

Um ácido nucleico da invenção pode ser purificado. A molécula de ácido nucleico "purificada", tal como uma molécula de cDNA, pode ser substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precur- sores químicos ou outros produtos químicos, quando sintetizada quimica- mente.

Nos casos em que a molécula de ácido nucleico é um cDNA ou RNA, por exemplo, mRNA, molécula, tais como as moléculas podem incluir uma "cauda" poli-A ou, alternativamente, pode não ter tal cauda 3'.

Uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser amplifi- cada, usando cDNA, mRNA ou do DNA genômico como um modelo e inicia- dores de oligonucleotídeos apropriados de acordo com técnicas de amplifi-

" 62 cação de PCR padrão. O ácido nucleico tão amplificado pode então ser clo- nado em um vetor apropriado e caracterizado por análise de sequência de DNA. Além disso, os oligonucleotídeos correspondentes à totalidade ou par- te de uma molécula de ácido nucleico da invenção podem ser preparados portécnicas sintéticas padrão, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado.

5.3. VETORES DE EXPRESSÃO E CÉLULAS HOSPEDEIRAS RECOMBI-

NANTES Os vetores ainda fornecidos compreendem qualquer um dos á- cidos nucleicos da invenção ou células hospedeiras modificadas para ex- pressar os ácidos nucleicos da invenção. Em modalidades específicas, os vetores compreendem uma sequência de nucleotídeos que regula a expres- são da proteína codificada pelo ácido nucleico da invenção. Por exemplo, a - sequência de nucleotídeos que codifica a proteína da invenção pode ser o- peracionalmente ligada a um promotor induzível por metanol.

' As células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos e vetores da invenção também são fornecidas. Em certas modalidades, o vetor ou o ácido nucleico é integrado ao genoma da célula hospedeira; em outras modalidades, o vetor ou o ácido nucleico é extracromossômico. A célula hospedeira preferida é uma célula de Pichia pastoris.

Como usado aqui, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico para o qual ele foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adi- cionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos têm uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomal). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomal) são integrados no genoma de uma célula hospe- deira sob introdução na célula hospedeira e, portanto, são replicados junta- mente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores, vetores de

Fed 63 expressão, são capazes de dirigir a expressão de sequências de codificação para os quais são operacionalmente vinculados. Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante são geralmente na forma de plasmídeos (vetores).

Os vetores de expressão recombinante da invenção compreen- dem sequências de nucleotídeos que codificam uma elastase madura, uma pró-elastase ou uma pré-pró-elastase da invenção em uma forma adequada para a expressão em uma célula hospedeira. Isto significa que os vetores de expressão recombinante incluem uma ou mais sequências regulatórias, se- lecionados com base nas células hospedeiras para serem usados para a expressão, que são operacionalmente ligados à sequência de ácidos nuclei- cos para ser expressos. Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operacionalmente ligado" tem o objetivo de significar que a sequência de | nucleotídeos de interesse está ligada à sequência(s) reguladora(s) de uma maneira que permite a expressão da sequência de nucleotídeos (por exem- : plo, em um sistema in vitro de transcrição/translação ou em uma célula hos- pedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo "se- quência regulatória" tem o objetivo de incluir promotores, reforçadores e ou- tros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenila- ção) Tais sequências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). As sequências regulatórias incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que direcionam a expres- são da sequência de nucleotídeos apenas em certas células hospedeiras (por exemplo, sequências regulatórias específicas do tecido). Será apreciado por aqueles especialistas na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira para ser transformada, o nível de expressão da proteína elastase desejada, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos nas células hos- pedeiras para produzir assim proteínas codificadas por ácidos nucleicos co- mo descrito aqui.

E 64 Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser designados para a expressão de uma proteína elastase da invenção em cé- lulas procarióticas (por exemplo, E. coli) ou eucarióticas (por exemplo, célu- las de inseto (usando vetores de expressão do baculovírus), células de leve- duras ou células de mamíferos). As células hospedeiras adequadas são dis- cutidas em Goeddel, supra. Alternativamente, o vetor de expressão recom- binante pode ser transcrito e translacionado em vitro, utilizando, por exem- plo, sequências regulatórias promotoras T7 e polimerase T7. A expressão de proteínas em procariontes é mais frequentemen- terealizado em E. coli com os vetores contendo promotores constitutivos ou induzidos dirigindo a expressão de proteínas de fusão ou sem fusão. Os ve- tores de fusão adicionam uma série de aminoácidos a uma proteína nela codificada, geralmente ao amino terminal da proteína recombinante. Tais - vetores de fusão tipicamente servem a três propósitos: 1) para aumentar a expressão da proteína elastase recombinante, 2) para aumentar a solubili- á dade da proteína elastase recombinante; e 3) para ajudar na purificação da proteína elastase recombinante, agindo como um ligante em purificação de afinidade. Muitas vezes, em vetores de expressão de fusão, um domínio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da metade da fusão e da prote- ína recombinante para permitir a separação da proteina recombinante da metade da fusão subsequente para a purificação da proteína de fusão. As- sim, a metade da fusão e o domínio de clivagem proteolítica juntos podem agir como uma sequência de ativação, incluindo um sítio de reconhecimento da protease, para a expressão recombinante de uma proteína elastase. As enzimas capazes de ativar tais proteínas de fusão e suas sequências de re- conhecimento cognatas incluem o fator Xa, a trombina e a enteroquinase. Os vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith e Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), que fundem a glutationa S-transferase (GST), proteína de ligação à E maltose ou proteína A, respec- tivamente, a proteína recombinante alvo.

Exemplos de vetores de expressão E. coli sem fusão adequados

| 65 r induzíveis inclui pTrc (Amann et a/., 1988, Gene 69:301-315) e pET-11d Es (Studier et a/., 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology ' 185, Academic Press, San Diego, California, 185:60-89). A expressão do gene alvo do vetor pTrc depende da transcrição polimerase do RNA hospe- deirodeum promotor de fusão trp-lac híbrido. A expressão do gene-alvo do vetor pET-11d depende da transcrição de um promotor de fusão T7gn10-lac mediado por uma polimerase do RNA viral coexpressa (T7 gn1). Esta poli- merase viral é fornecida por cepas hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) de um pró-fago A residente hospedando um gene T7 gn1 sob o con- trole transcricional do promotor lacUV 5.

Uma estratégia para maximizar a expressão da proteína elasta- se recombinante em E. coli é expressar a proteína em bactérias hospedeiras com uma capacidade debilitada para clivar proteoliticamente a proteína re- E combinante (Gottesman, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego , California 185:119-129). Ou- í tra estratégia é alterar a sequência de ácido nucleico do ácido nucleico para ser inserido em um vetor de expressão de modo que os códons para cada aminoácido são aqueles preferencialmente usados em E. coli (Wada et al, 1992, Nucleic Acids Res. 20. :2111-2118). Tal alteração das sequências de ácido nucleico da invenção pode ser realizada através de técnicas de sínte- se de DNA padrão.

Em outra modalidade, o vetor de expressão é um vetor de ex- pressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão em levedura S. cerevisiae e P. pastoris incluem pYepSec1 (Baldari et a/. 1987, EMBO J.

6:229-234), pMFA (Kurjan e Herskowitz, 1982, Célula 30:933-943), pJRY88 (Schultz et a/. 1987, Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), e pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA). Para a expressão em levedura, um promotor induzível por metanol é preferencialmente usado. Alteração da sequência de ácido nucleico do ácido nucleico para ser inserido emum vetor de expressão de modo que os códons individuais para cada aminoácido são aqueles preferencialmente usados em P. pastoris também são contemplados aqui. Mais especificamente, os códons da SEQ ID NO: 33

| 66 r ou SEQ ID NO: 81 podem ser substituídos por códons que são preferencial- : mente utilizados em P. pastoris.

' Alternativamente, o vetor de expressão é um vetor de expressão do baculovírus. Os vetores do baculovírus disponíveis para a expressão de proteínas em culturas de células de insetos (por exemplo, células Sf 9) in- cluem a série pAc (Smith et a/., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e a série PVL (Lucklow e Summers, 1989, Virology 170:31-39). Outra estratégia é alte- rar a sequência de ácido nucleico do ácido nucleico para ser inserido em um vetor de expressão de modo que os códons individuais para cada aminoáci- dosão aqueles preferencialmente usados em células de inseto.

Em ainda outra modalidade, uma proteína elastase é expressa em células de mamíferos usando um vetor de expressão em mamíferos. E- xemplos de vetores de expressão em mamíferos incluem pCDMB8 (Seed, | 1987, Nature 329(6142):840-2) e pMT2PC (Kaufman et al, 1987, EM- BOJ.6:187-195). Quando usado em células de mamíferos, as funções de i controle do vetor de expressão são muitas vezes fornecidas por elementos reguladores virais. Por exemplo, os promotores comumente usados são pro- venientes de polioma, Adenovírus 2, citomegalovírus e Simian Vírus 40. Pa- ra outros sistemas de expressão adequados para as células procarióticas e eucarióticas ver capítulos 16 e 17 de Sambrook et al., supracitado.

Em outra modalidade, o vetor de expressão de mamíferos re- combinante é capaz de dirigir a expressão do ácido nucleico, preferencial mente, em um tipo de célula em particular (por exemplo, elementos regula- dores específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Os elementos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica. Os exemplos não-limitantes de promotores específicos de tecido adequados incluem o promotor de albumina (específico de fígado; Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de linfóide (Calame e Eaton, 1988, Adv. Immunol . 43:235-275), em particular promotores de receptores de célulaT (Winoto e Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733) e imunoglobuli- nas (Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740, Queen e Baltimore, 1983, 33:741- 748 Cell), promotores específicos de neurônio (por exemplo, o promotor de

" 67 - neurofilamento; Byrne e Ruddle, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:5473- 5477), promotores específicos do pâncreas (Edlund et a/., 1985, Science É 230:912-916) e promotores específicos da glândula mamária (por exemplo, promotor do soro de leite; Patente US nº 4873316 e Publicação do pedido europeu nº EP264166). Os promotores regulados evolutivamente também são incluídos, como por exemplo, os promotores do camundongo Hox (Kes- sel e Gruss, 1990, Science 249:374-379) e o promotor de beta-fetoproteína (Campes e Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546) . Em certos aspectos da invenção, a expressão de uma proteína da invenção pode ser aumentada através do aumento da dosagem do gene correspondente, por exemplo, usando um vetor de expressão ou amplifica- ção do gene de alta cópia. A amplificação do gene pode ser obtida em célu- las CHO deficientes em diidrofolato redutase- ("dhfr-") por cotransfecção do 7 gene de interesse com o gene dhfr e por exposição ao meio seletivo com concentrações gradativamente aumentadas de metotrexato. Ver, por exem- A plo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology Unit 16,14 (John Wiley & Sons, Nova York, 1996). Um método alternativo para aumentar o número de cópias do gene é multimerizar um cassete de expressão (por e- xemplo, promotor com sequência de codificação) codificando a proteína e- lastase de interesse em um vetor antes de introduzir o vetor na célula hos- pedeira. Métodos e vetores para alcançar a multimerização cassete de ex- pressão são conhecidos nos sistemas de células hospedeiras de mamíferos e de levedura (ver, por exemplo, Monaco, Methods in Biotechnology 8:Animal Cell Biotechnology, pg. 39-348 (Humana Press, 1999); Vassileva et al, 2001, Protein Expression and Purification 21:71-80; Mansur et a/l., 2005, Biotechnology Letter 27 (5):339-45. Além disso, Kits para multi copiar a ex- pressão do gene estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, um kit de expressão Pichia multicópia pode ser obtido de Invitrogen (Carilsbad, Califór- nia). A multimerização de um cassete de expressão é exemplificada no E- xemplos, infra.

Assim, outros aspectos da invenção se referem às células hos- pedeiras dentro das quais um vetor de expressão recombinante da invenção

Í 68 - foi introduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombi- nante" são usados alternadamente aqui. Entende-se que tais termos não se ; referem apenas à célula particular do indivíduo, mas à progênie e à progênie potencial dessa célula. Porque algumas modificações podem ocorrer em sucessivas gerações devido à mutação ou influências ambientais, tais pro- gênies podem não ser, de fato, idênticas a da célula-mãe, mas ainda estão incluídas no escopo do termo como usado aqui.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica (por exemplo, E. coli) ou eucariótica (por exemplo, células de insetos, levedura oucélulasde mamíferos).

O vetor do DNA pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através de transformação convencional ou técnicas de transfec- ção. Como usado aqui, os termos "transformação" e "transfecção" tem o ob- z jetivo de se referirem a uma variedade técnicas reconhecidas para a introdu- çãode ácidos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira, incluindo a co- i precipitação do fosfato de cálcio ou do cloreto de cálcio, transfecção media- da por DEAE-dextrano, lipofecção, ou eletroporação. Os métodos adequa- dos para transformar ou transfectar células hospedeiras podem ser encon- trados em Sambrook et a/. (supra), e outros manuais de laboratório.

Para a transfecção estável de células de mamíferos, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e técnica de transfecção utilizados, apenas uma pequena fração de células pode integrar o DNA exógeno em seu genoma. A fim de identificar e selecionar esses integrantes, uma se- quência de codificação para um marcador selecionável (por exemplo, para resistência aos antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedei- ras junto com o quadro de leitura aberto de interesse. Os marcadores sele- cionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência a drogas, como o G418, higromicina, zeocina e metotrexato. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por —meioda seleção de medicamentos (por exemplo, as células que incorpora- ram a sequência de codificação do marcador selecionável irão sobreviver, enquanto as outras células morrem).

| 69 " Em outra modalidade, as características de expressão de uma sequência de codificação da elastase endógena dentro de uma célula, linha- Ê gem celular ou micro-organismo podem ser modificadas pela inserção de um elemento regulador de DNA heterólogo à sequência de codificação da elas- tase no genoma de uma célula, linhagem celular estável ou micro- organismos clonados de tal modo que o elemento regulatório inserido é ope- racionalmente ligado ao gene endógeno. Uma sequência heteróloga, contendo um elemento regulador, pode ser inserida em uma linhagem celular estável ou em micro-organismos clonados, de tal forma que é operativamente ligada à expressão e ativa a expressão de um gene endógeno da elastase, usando técnicas, tais como recombinação homóloga alvo, que são bem conhecidas pelos especialistas da técnica, e descrita, por exemplo, em Chappel, Patente US No. 5272071; : publicação PCT No. WO 91/06667, publicada em 16 de maio de 1991. A se- quência heteróloga pode incluir ainda os peptídeos sinal, as sequências de ' clivagem e/ou sequências de ativação da presente invenção.

5.4. MÉTODOS PARA PRODUZIR PROTEÍNAS ELASTASES MADURAS A célula hospedeira da invenção, como uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica em cultura, pode ser usada para produzir uma proteína elastase da invenção. Assim, a invenção também fornece métodos para produzir uma proteína elastase da invenção usando as células hospe- deiras da invenção. Em uma modalidade, o método compreende cultivar a célula hospedeira da invenção (em que um vetor de expressão recombinante codificando uma proteína elastase da invenção foi introduzido) em um meio adequado de modo que a proteína elastase é produzida. Em outra modali- dade, o método compreende ainda isolar a proteína elastase do meio ou da célula hospedeira. A presente invenção também fornece métodos para produzir proteínas elastases não-maduras da invenção compreendendo o cultivo de uma célula hospedeira modificada para expressar um ácido nucleico da in- venção sob condições em que a proteína pró-elastase é produzida. Em cer- tas modalidades, a proteína pré-pró-elastase também é produzida. A presen-

” 70 E te invenção também fornece métodos para produzir proteínas elastases ma- duras da invenção compreendendo a cultura de uma célula hospedeira mo- À dificada para expressar um ácido nucleico da invenção sob condições em que uma proteína pró-elastase é produzida e sujeitando a proteína pró- elastasea condições de ativação de tal modo que a proteína elastase madu- ra é produzida.

As condições de cultura preferidas para produzir as proteínas maduras e não-maduras da invenção, particularmente para a célula hospe- deira Pichia pastoris, incluir um período de crescimento a um pH baixo. Em modalidades específicas, o pH baixo é um pH de 2-6, um pH de 2-5, um pH de 3-6, um pH de 3-5, um pH de 4-6, um pH de 3-4 ou qualquer faixa cujos limites inferiores e superiores são selecionados a partir de qualquer um dos valores anteriores. No final do período de cultura, o pH da cultura pode ser - aumentado, de preferência a um pH de 7-11, mais preferivelmente a um pH de8.

Â Quando a expressão de uma proteína pró-elastase da invenção está sob o controle de um promotor induzível por metanol, as condições para produzir uma proteína elastase madura ou não-madura da invenção também podem compreender um período de indução do metanol.

Os métodos de produção da elastase da invenção podem ainda compreende a etapa de recuperação da proteína expressa pela célula hos- pedeira. Em certos casos, a proteína recuperada é uma pró-elastase, con- tendo a sequência de ativação. Em outros casos, a proteína recuperada é uma elastase madura sem a sequência de ativação. Sob certas condições, as proteínas pró-elastases e elastases maduras são produzidas. Em outros casos, a pré-pró-elastase é produzida.

De preferência, particularmente quando se deseja contornar a autoativação de uma pró-elastase autoativada, as condições de cultura para a expressão da pró-elastase compreendem um período de crescimento em citrato de sódio, succinato de sódio ou de acetato de sódio. Em modalidades específicas, uma concentração de cerca de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 MM, 50-200 MM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ou de qualquer fai-

| 71 R xa cujos limites superiores e inferiores são selecionados de qualquer um dos valores acima é usada. Em uma modalidade preferida, a concentração do citrato de sódio, do succinato de sódio, ou do acetato de sódio é de 90-110 MM, mais preferivelmente de 100 mM.

Adicionalmente, particularmente quando se deseja contornar a degradação protéica, as condições de cultura para a expressão da pró- elastase compreendem um período de crescimento e indução no extremo mais baixo da faixa de temperatura adequada para a célula hospedeira em questão. Por exemplo, quando a célula hospedeira é uma célula hospedeira Pichia pastoris, a faixa preferida é de cerca de 22-28ºC. Em modalidades específicas, a célula hospedeira Píchia pastoris é cultivada a uma temperatu- ra de cerca de 28ºC. O crescimento e a indução não precisam ser realizados na mesma temperatura; por exemplo, em uma modalidade onde é a Píchia z pastoris é usada como uma célula hospedeira, o crescimento pode ser reali- zadoa28ºC enquanto a indução pode ser realizada a 22ºC.

Í A ativação de uma proteína pró-elastase autoativada da inven- ção pode ser iniciada pela adição da elastase extrínseca em uma quantidade (catalítica) pequena. Alternativamente ou concomitantemente, a ativação de uma proteína pró-elastase autoativada da invenção pode ser iniciada pelo aumento do pH da solução contendo a proteína pró-elastase autoativada. O pH é preferivelmente de 7-11; em modalidades específicas, a solução está em um pH de 7-10, 7-9, 8-10, 8-9, ou qualquer faixa cujos limites superiores e inferiores são selecionados de qualquer um dos valores anteriores. Em uma modalidade preferida, o pH da solução de 7-9, mais preferivelmente 8.

Em modalidades específicas, a pró-elastase autoativada pode ser submetida à base Tris durante a etapa de ativação. Em modalidades es- pecíficas, a base Tris é adicionada a uma concentração de 5-50 mM, 7,5- 100 mM, 10-150 mM, 5-20 MM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ou de qualquer faixa cujos limites inferiores e superiores são selecionados a partir de qualquer um dos valores anteriores. Em uma modalidade preferida, a ba- se Tris é adicionada a uma concentração de 90-110 mM, mais preferivel- mente de 100 mM. O pH da base Tris é preferencialmente de 7-11; em mo-

dalidades específicas, a base Tris está em um pH de 7-10, 7-9, 8-10, 8-9, ou qualquer faixa cujos limites inferiores e superiores são selecionados a partir Ê de qualquer um dos valores anteriores. Em uma modalidade preferida, a ba- se Tris está em um pH de 7-9, mais preferivelmente 8.

Em certos aspectos da invenção, a temperatura para a autoati- vação da elastase é a temperatura ambiente, por exemplo, uma temperatura variando entre 22ºC a 26ºC. Em certas modalidades, a etapa de ativação da elastase é preferencialmente realizada com a pró-elastase em uma concen- tração inicial baixa, por exemplo, 0,1-0,3 mg/ml, para a exatidão ideal da re- açãode clivagem e formação mínima de variantes N-terminal.

Em certas modalidades da invenção, a adição de quantidades catalíticas da elastase não é obrigatória para converter a pró-elastase autoa- tivada para elastase madura, enquanto a pró-elastase pode sofrer autopro- 7 teólise. Em certas modalidades, a taxa de autoproteólise é a concentração independente. Sem querer ser limitado pela teoria, acredita-se que a auto- : proteólise independente da concentração de certas proteínas pró-elastases autoativadas é mediada através de um processo intramolecular onde a mo- lécula de pró-elastase cliva a si própria através de uma reação intramolecu- lar. No entanto, em outras modalidades, a ativação da pró-elastase autoati- vada é dependente da concentração. Sem querer ser limitado pela teoria, acredita-se que a autoproteólise dependente da concentração de certas pro- teínas pró-elastase de autoativadas é mediada através de uma reação in- termolecular onde a pró-elastase é clivada por outra pró-elastase e/ou por uma elastase madura. Ainda em outras modalidades, certas pró-proteinas elastases autoativadas apresentam uma combinação de ativação dependen- te de concentração e independente de concentração. Nesses casos em que a autoativação é dependente de concentração, a pró-proteína pode ser man- tida em uma forma mais diluída para reduzir a ativação se desejado. A ativa- ção de pró-proteínas elastases compreendendo o domínio de clivagem do pró-peptídeo de elastase da SEQ ID NO: 55, que incluem, mas não estão limitados a, a pró-proteína da SEQ ID NO: 69 podem ser controlados através da manutenção de tais pró-proteinas em uma forma diluída.

É 73 - Também é reconhecido que alguns variantes da sequência N- terminal indesejáveis da elastase madura podem se acumular no curso de i produção de proteínas elastases maduras desta invenção. Mais especifica- mente, as proteínas pró-elastases contendo o domínio de clivagem do pró- peptídeo da elastase SEQ ID NO: 42 que incluem a pró-proteína da SEQ ID NO: 6 pode produzir variantes da sequência N-terminal onde a clivagem o- correu na ligação do peptídeo que é C-terminal a qualquer um dos resíduos nas posições P3 ou P2. No entanto, a ocorrência de tais variantes N-terminal indesejáveis pode ser reduzida, colocando certos aminoácidos em certos locaisna sequência de ativação. Por exemplo, quando uma prolina está pre- sente na posição P2, a produção de variantes N-terminal com um ou dois aminoácidos N-terminal adicionais é reduzida ou eliminada. Além disso, a eliminação da necessidade da tripsina para a ativação reduz ou elimina a : produção de variante que faltam nove resíduos N-terminal. Adicionalmente, a ocorrência de variantes N-terminal indesejáveis pode ser reduzida ou eli- " minada conduzindo a reação de ativação sob certas condições.

Mais especificamente, em certas modalidades as condições de ativação incluem uma etapa de "conversão estendida" durante a qual as va- riantes N-terminal, produzidas durante a porção inicial da reação de conver- são, são subsequentemente e seletivamente degradadas. As quantidades relativas de espécies de proteína durante a "conversão estendida" podem ser monitoradas em tempo real por HIC-HPLC. A degradação seletiva das variantes N-terminal indesejadas aumenta a proporção da PRT-201 madura de sequência completa na reação de conversão e reduz a proporção de va- riantes N-terminal. Para proteínas pró-elastases contendo o domínio de cli- vagem do pró-peptídeo da elastase SEQ ID NO: 55, a etapa de conversão estendida é realizada durante 4 a 8 horas, e de preferência durante cerca de 6 horas. Para outras proteínas pró-elastases, a etapa de conversão estendi- da pode ser aumentada ou diminuída, dependendo da proporção de varian- tes N-terminal relativas à elastase madura (sequência completa) imediata- mente depois que todas as pró-elastases tenham sido convertidas. Quando a conversão ocorre em meio complexo, como o caldo de fermentação, o pe-

é 74 - ríodo de conversão estendida pode ser aumentado devido à competição no sítio ativo da elastase madura por outras proteínas e peptídeos na solução. : Alternativamente, uma mistura de elastase madura e elastase variante N- terminal pode ser recuperada do meio complexo antes da etapa de conver- são estendida, reduzindo assim a competição do sítio ativo e o tempo ne- cessário para remover a espécie variante N-terminal.

Conforme mencionado acima, durante uma reação de conversão para a pro-PRT-201-55M3-003-VU, há uma reação colateral que leva a pro- dução de variantes N-terminal. No caso específico da pro-PRT-201-55M3- —003-VU, estas variantes N-terminal não possuem as duas primeiras valinas e têm pouca ou nenhuma atividade de elastase. Para outras pró-proteinas mu- tantes, há outras variantes N-terminal produzidas, algumas com adições e outras com diferentes eliminações. Uma etapa de remoção do N-terminal foi 7 desenvolvida que reduz as variantes N-terminal de uma faixa de 0-2%. O desenvolvimento desta etapa de remoção evoluiu de uma variedade de ex- Í perimentos e observações. Como mencionado anteriormente, durante a oti- mização dos experimentos de condição da conversão com pro-PRT-201-42 foi observado que as reações de conversão mais longas levaram a um per- centual muito baixo de variantes N-terminal. Foi subsequentemente determi- nado que as reações de conversão mais longas permitissem a PRT-201 ma- dura para degradar seletivamente as variantes N-terminal. A descoberta da capacidade PRT-201 para seletivamente degradar as variantes N-terminal, sob certas condições teve um benefício tremendo, ajudando a produzir um produto PRT-201 mais purificado com menos variantes N-terminal. Esta eta- pade remoção da variante N-terminal foi implementada em um processo de produção de grande escala pelo estabelecimento de condições que permi- tam a pro-PRT-201 se converter em PRT-201 madura e então permitir que a PRT-201 degrade as variantes N-terminal.

Um exemplo representativo de tal etapa é mostrado na figura 10, — enquanto foi monitorado em tempo real por HIC-HPLC. Em aproximadamen- te 50 minutos, a pró-PRT-201-55M3 100% estava completamente convertida em aproximadamente 86% da PRT-201 madura e 14% de variantes N-

i 75 - terminal.

A reação de conversão foi estendida o que permitiu a PRT-201 madura seletivamente degradar as variantes N-terminal, resultando em uma ' diminuição das variantes de 14% para 2%. Com mais incubações mais lon- gas, as variantes N-terminal podem ser seletivamente degradadas a um ní- vel indetectável.

Quando o nível da variante N-terminal é suficientemente baixo, a atividade da PRT-201 é suprimida com citrato de sódio e ajuste de reação do pH de 5,0. Uma vez purificada, a elastase madura foi obtida, a enzima ativa pode ser colocada em uma solução na qual a proteína elastase é relativa- mente inativa e colocada em um tampão para posterior cromatografia em coluna, por exemplo, cromatografia de troca catiônica, etapas de purificação.

Em geral, a proteína elastase pode ser colocada em citrato de sódio a uma concentração de cerca de 5 a 25 mM e um pH de cerca de 2 a 5. Em uma : modalidade específica, a elastase é colocada em 20 mM de citrato de sódio, pH5.As frações eluídas são, então, opcionalmente analisadas por um mé- todo, mais de um método ou todos os métodos seguintes: (1) espectrofoto- metria a A280 para determinar a concentração, (2) SDS-PAGE para avaliar a pureza, (3) análise de atividade, por exemplo, análise SLAP, para avaliar a atividade específica da elastase, e (4) HIC-HPLC para detectar a elastase madura e variantes N-terminal, e frações com características adequadas (por exemplo, atividade específica aceitável, níveis baixos aceitáveis (de pre- ferência ausência) de glicoformas detectáveis, e níveis baixo aceitáveis (de preferência ausente) de variantes N-terminal detectáveis) são unidas.

Uma vez que a elastase madura purificada seja obtida, a enzima ativapode ser colocada em uma solução adequada para liofilização.

Em ge- ral, a proteína elastase pode ser colocado em um buffer de 1 X de solução salina tamponada com fosfato ("PBS") (137 mM de cloreto de sódio, 10 mM de fosfato de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio pH 7,4) antes da liofiliza- ção.

Em certas modalidades, a proteína elastase pode ser colocada em um tampão de 0,1X PBS (13,7 mM de cloreto de sódio, 1,0 mM de fosfato de sódio, 0,27 mM de fosfato de potássio pH 7,4) antes da liofilização.

A expressão de uma sequência de pró-elastase pode, em algu-

: 76 . mas instâncias, render uma mistura de pró-elastase e proteínas elastases maduras. Assim, a presente invenção fornece uma composição compreen- : dendo tanto uma proteína pró-elastase quanto uma proteína elastase madu- ra.

5.5 COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS As proteínas elastases maduras da invenção podem ser incorpo- radas em composições farmacêuticas adequadas para a administração. Tais composições tipicamente incluem a proteína elastase e ingredientes farma- ceuticamente inertes, por exemplo, um veículo farmaceuticamente aceitável.

Conforme usado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" tem o objetivo de incluir todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revesti- mentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retar- dadores de absorção, e semelhantes, compatíveis com a administração far- - macêutica. Também considerados como ingredientes farmaceuticamente inertes estão os excipientes convencionais, veículos, preenchedores, agluti- Á nadores, desintegrantes, solventes, agentes de solubilização, e agentes co- rantes. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Salvo à medida que qualquer meio conven- cional ou agente é incompatível com uma proteína elastase madura, a sua utilização nas composições é contemplada. Os compostos suplementar ati- vos também podem ser incorporados nas composições.

Assim, certos aspectos da presente invenção referem-se a com- posições farmacêuticas. Em modalidades específicas, a presente invenção fornece uma composição compreendendo (i) uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma elastase tipo |! humana madura e (ii) um veículo farma- ceuticamente aceitável. Elastasel tipo humana madura que pode ser usada na composição inclui, mas não está limitada às proteínas da SEQ ID NO: 1, 4, 5, 84, 87. Elastasetipo | humana madura pode conter qualquer uma das combinações de polimorfismos estabelecidos na Tabela 3 acima.

Em outras modalidades, a presente invenção fornece uma com- posição farmacêutica compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz da elastase tipo | humana madura (ii) um veículo farmaceuticamente ee 77 - aceitável, cuja composição farmacêutica é livre de tripsina, ou de fragmentos de tripsina. Em outras modalidades, a composição farmacêutica é substan- á cialmente livre de tripsina ou fragmentos de tripsina. Como usado aqui, a expressão "livre de tripsina" refere-se a uma composição na qual a tripsina não6é usada em qualquer porção do processo de produção. Como usado aqui, a expressão "substancialmente livre de tripsina" refere-se a uma com- posição na qual a tripsina está presente em um percentual final (ou seja, pe- so da tripsina/peso da composição total) não mais que cerca de 0,0025%, ou mais preferivelmente menos que cerca de 0,001% em uma base peso/peso. Conforme usado aqui, a expressão "livre de" tripsina se refere a uma com- posição na qual a variante é indetectável, por exemplo, por meio de um en- saio enzimático ou ELISA.

Em certos aspectos, uma composição da invenção tem menos : atividade de tripsina que o equivalente de 3 ng/ml de tripsina, medida por um ensaio BENZ, de preferência menos atividade de tripsina que o equivalente de 2,5 ng/ml de tripsina, medida por um ensaio BENZ, e ainda mais preferi- velmente menos atividade de tripsina que o equivalente de 2 ng/ml de tripsi- na, medida por um ensaio BENZ. Em uma modalidade específica, a presen- te invenção fornece uma composição compreendendo uma quantidade tera- peuticamente eficaz de proteína elastase na qual a atividade de tripsina é o equivalente de menos de 1,6 ng/ml de tripsina, medida por um ensaio BENZ. Exemplos de composições de elastase com menos atividade de tripsina do que o equivalente de 1,6 ng/ml de tripsina, medida por um ensaio BENZ, são fornecidos no Exemplo 8. Em certas modalidades, a atividade ng/ml de trip- sina pode ser analisada em uma composição líquida de elastase tipo | hu- mana ou em uma preparação contendo 1 mg/ml de proteína elastase tipo | humana. Assim, as atividades da tripsina também podem ser descritas em termos de miligramas de proteína elastase, por exemplo, menos de 3 ng de atividade da tripsina/mg da proteína elastase, menos de 1,56 ng de atividade datripsina/mg da proteína elastase, etc. A presente invenção também fornece composições farmacêuti- cas que são livres ou substancialmente livres de variantes N-terminal indese-

- jáveis da elastase madura.

As variantes N-terminal indesejáveis incluem, mas não estão limitadas a, variantes produzidas por clivagem na ligação do É peptídeo que é C-terminal a qualquer um dos resíduos nas posições P5, P4, P3, P2, P'1, P'2, P'3, P'4, P'6 e/ou P'9. Certas variantes N-terminal indesejá- veissão produzidas pela ativação da tripsina; outras são produzidas por au- toativação da sequências de pró-elastase que não continham sequências de ativação otimizadas.

Em certas modalidades, a composição farmacêutica é livre ou substancialmente livre de uma, mais de uma ou todas as variantes N- terminal da elastase madura que incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NOS: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, 108. Em cer- tas modalidades, a presente invenção fornece uma composição farmacêuti- ca compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz da elastase : tipo | humana madura (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável, cuja composição farmacêutica é livre ou substancialmente livre de qualquer pro- ' teina com SEQ ID NOS: 2 , 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107 ou 108. Em outras modalidades, a composição farmacêutica é substan- cialmente livre de variantes N-terminal da elastase madura que incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NOS: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105,106,107 ou 108. Como usada aqui, a expressão "livre de uma variante particular" se refere a uma composição na qual a variante é indetectável, por exemplo, por meio da análise HPLC de troca catiônica, análise HPLC de in- teração hidrofóbica, ou espectrometria de massa combinada com cromato- grafia líquida.

Conforme usada aqui, a expressão "substancialmente livre" se refereauma composição na qual a variante N-terminal está presente em um percentual final (ou seja, o peso da variante N-terminal/peso da composição total) de pelo menos de cerca de 0,5%. Em certas modalidades preferidas, a composição que é substancialmente livre da variante N-terminal é uma com- posição na qual a concentração da variante N-terminal é menor do que cerca de01% ou menor que cerca de 0,01%, ou mais de preferência, até menor que cerca de 0,001% em uma base de peso/peso.

Em certos aspectos, a presença de variantes N-terminal é detectada por meio de análise HPLC de í 7o troca catiônica, análise HPLC de interação hidrofóbica, ou espectrometria de massa combinada com cromatografia líquida. É Em certas modalidades específicas, uma composição farmacêu- tica que é livre de variantes N-terminal da SEQ ID NO: 70, 71, 104 e 105 é produzida pela ativação de uma pró-elastase que não contém uma arginina na posição P1 e/ou uma alanina na posição P2.

Em outras modalidades, a presente invenção fornece uma com- posição farmacêutica compreendendo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz da elastase tipo | humana madura (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável, cuja composição farmacêutica é substancialmente livre de proteí- nas bacterianas e/ou substancialmente livre de proteínas de mamíferos ex- ceto da referida elastase tipo | humana madura. Conforme usado aqui, a ex- pressão "substancialmente livre de proteínas de mamíferos" ou "substanci- almente livre de proteínas bacterianas" refere-se a uma composição na qual essas proteínas estão presentes em um percentual final (ou seja, peso da proteínas de mamíferos (exceto a elastase e, opcionalmente, um veículo de proteína como a albumina) ou proteínas bacterianas/peso da composição total) de pelo menos de cerca de 0,5%. Em certas modalidades preferidas, a composição que é substancialmente livre de tais proteínas é uma composi- ção na quala concentração da proteína indesejáveis é menor que cerca de 0,1% ou menor que cerca de 0,01%, ou mais preferivelmente, até menor que cerca de 0,001% em uma base peso/peso.

Em certos aspectos, uma composição farmacêutica que é "livre de proteínas de mamíferos" (exceto a elastase) contém elastase que é pro- duzidade uma linhagem celular recombinante que não seja uma célula de mamíferos e em que nenhuma proteína com uma sequência de mamíferos ou substancialmente uma sequência de mamíferos está presente em qual- quer porção do processo de produção. Em certos aspectos, uma composi- ção farmacêutica que está "livre de proteínas bacterianas" contém elastase que é produzida de uma linhagem celular recombinante que não seja uma célula bacteriana e em que nenhuma proteína com uma sequência bacteria- na ou substancialmente uma sequência bacteriana está presente em qual-

. quer porção do processo de produção.

Elastasetipo | humana madura (incluindo variantes) da invenção É são mais preferencialmente purificadas para uso em composições farmacêu- ticas.

Em modalidades específicas, as elastases são pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% puras.

Em outras modalidades especiífi- Cas, as elastases são até 98%, 98,5%, 99%, 99,2%, 99,5% ou 99,8% puras.

Para a formulação em composições farmacêuticas, as elastases tipo | humanas maduras da invenção preferivelmente têm uma atividade es- pecífica de mais de 1, mais de 5, mais de 10, mais de 20, mais de 25, ou maisde 30 U/mg de proteína, conforme determinado pela medição da taxa de hidrólise do substrato do peptídeo pequeno N-succinil-Ala-Ala-Ala- pNitroanilida (SLAP), que é catalisada pela adição de elastase.

Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de elastase que catalisa a hidróli- z se de 1 micromol de substrato por minuto a 30ºC e a atividade específica é definida como a atividade por mg de proteína elastase (U/mg). Preferencial- : mente, uma composição farmacêutica compreende uma elastase tipo | hu- mana madura que tem uma atividade específica dentro de uma faixa em que o limite inferior é de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 ou 20 U/mg de proteína e em que o limite superior é de, independentemente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 50 U/mg de proteina.

Em modalidades exemplares, a atividade específica está na faixa de 1-40 U/mg de proteína, 1-5 U/mg de proteína, 2-10 U/mg de pro- teina, 4-15 U/mg de proteína, 5-30 U/mg de proteína, 10-20 U/mg de proteí- na, 20-40 U/mg de proteína, ou qualquer faixa cujos limites inferiores e supe- riores são selecionados a partir de qualquer um dos valores anteriores.

As composições farmacêuticas da invenção são preferencial mente estáveis.

Em modalidades específicas, uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica preparada por liofilização aci- ma) mantém pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60% e mais preferivelmente pelo menos 70% de sua atividade específica após uma se- —mana,mais preferivelmente depois de um mês, ainda mais preferivelmente depois de 3 meses, e mais preferivelmente após seis meses de armazena- mento a 4ºC.

Em modalidades específicas, a composição farmacêutica man-

" 81 - tém pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou de pelo menos 95% de sua atividade específica após uma semana, mais É preferivelmente depois de um mês, ainda mais preferivelmente depois de 3 meses, e mais preferivelmente depois de seis meses de armazenamento a 4Cc.

Composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a sua via prevista de administração. Métodos para adminis- trar a elastases para tratar ou prevenir doenças de tubos biológicos são des- critos nos WO 2001/21574; WO 2004/073504 e WO 2006/036804. A via mais preferida de administração é a parenteral, por exemplo, a administra- ção direta na parede do vaso, incluindo a administração local na superfície externa adventícia dos vasos expostos cirurgicamente e a administração local na parede do vaso usando um cateter de distribuição do fármaco. As e soluções ou suspensões usadas para a administração parenteral pode incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, como a água para a injeção, solução salina, solução salina tamponada de fosfato, açúcares como a saca- rose ou dextranos, óleos fixos, glicóis de polietileno, glicerina, propileno gli- col, polissorbato-80 (também conhecido como tween 80), ou outros solven- tes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como os parabenos de metila; antioxidantes como o ácido ascórbico ou bissuifito de sódio, agentes quelan- tes como o ácido etilenodiaminotetracético; tampões, como os fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade, tais como o cloreto de sódio ou dextro- se. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como o ácido clorídri- co ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser inclusa em am- —polas, seringas descartáveis ou frascos de dose única ou múltipla feitos de vidro ou de plástico. A preparação parenteral também pode ser inclusa em um cateter de distribuição do fármaco. Em todos os casos, a composição deve ser estéril.

Em modalidades específicas, uma composição farmacêutica da invenção é uma formulação líquida compreendendo um ou mais dos seguin- tes excipientes: dextrose (por exemplo, 2-10% w/v), lactose (por exemplo, 2- 10% w/v); manitol (por exemplo, 2-10% w/v), sacarose (por exemplo, 2-10%

A 82 - wlv); trealose (por exemplo, 2-10% w/v), ácido ascórbico (por exemplo, 2-10 mM), cloreto de cálcio (por exemplo, 4-20 mM), dextrano-70 (por exemplo, 2- Ê 10% wiv); poloxâmero 188 (por exemplo, 0,2-1% w/v); polissorbato-80 (por exemplo, 0,001-5% wiv, mais preferivelmente 0,1-5%), glicerina (por exem- plo, 0,2-5% wWv), arginina (por exemplo, 2-10% w/v), glicina (por exemplo, 2- 10% wiv); dextrano-44 (por exemplo, 2-10% w/v) e dextrano-18 (por exem- plo, 2-10% wW). Em certas modalidades, a concentração, isoladamente ou em conjunto, de dextrose, lactose, manitol, sacarose, trealose, dextrano-70, glicerina, arginina, glicina, dextrano-44 ou dextrano-18 está dentro de um intervalo em que o limite inferior é de 2,5, 4, 5 ou 7% wWv, em que o limite superior é de, independentemente, 4, 5, 6, 8, ou 10% wWv.

Formulação líquida pode ser feita adicionando água a uma for- mulação seca contendo uma proteína elastase madura, uma ou mais rea- . gentes tampão e/ou um ou mais excipientes. Formulação seca pode ser feita liofiizando uma solução compreendendo a proteína elastase madura, uma ou mais reagentes tampão e/ou um ou mais excipientes.

Formulação líquida pode ser feita, por exemplo, reconstituindo as proteínas elastases liofilizadas da invenção com água esterilizada ou so- lução tampão. Exemplos de uma solução tampão incluem soluções estéreis de salina ou salina tamponada com fosfato. Em uma modalidade específica, depois da reconstituição de uma formulação seca compreendendo a proteí- na elastase madura para a concentração de proteína desejada, a solução contém aproximadamente 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, fosfato de sódio de 10 mM (a concentração da solução salina tam- —ponada com fosfato que é considerada 1X) e o pH da solução é de aproxi- madamente 7,4. Em certos aspectos, a formulação seca compreendendo a proteína elastase madura também contém íons de sódio, de cloreto e de fos- fato em quantidades tal que apenas a água seja necessária para a reconsti- tuição.

Formulação líquida também pode ser feita, por exemplo, recons- tituindo as proteínas elastases liofilizadas com uma solução tampão conten- do um ou mais excipientes. Exemplos de excipientes incluem o polissorbato-

- 80 e o dextrano. Em uma modalidade específica, após a reconstituição de uma formulação seca compreendendo a proteína elastase madura para a : concentração de proteína desejada, a solução resultante contém aproxima- damente 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, 10 mM defosfato de sódio, 0,01% de polissorbato-80, e o pH da solução é de apro- ximadamente 7,4. Um ou mais excipientes podem ser misturados com a pro- teína elastase madura antes da liofilização ou após a liofilização, mas antes da reconstituição. Assim, em certos aspectos, a formulação seca compreen- dendo a proteína elastase madura também contém excipientes como o po- lissorbato-BO ou o dextrano.

Em certos aspectos, a presente invenção fornece uma formula- ção líquida compreendendo: 0,001-50 mg/ml de proteína elastase madura em uma solução de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de po- t tássio, 10 mM de fosfato de sódio e compreendendo 5-10%, mais preferi- velmente 6-9% de um excipiente selecionado da dextrose, lactose, glicose, õ manitol, sacarose, trealose, dextrano-70, glicerina, arginina, glicina, dextra- no-44 ou dextrano-18.

Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação líquida compreendendo: 0,001-50 mg/mi de proteína elasta- semaduraem uma solução de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fos- fato de potássio, 10 mM de fosfato de sódio com pH de 7,4.

Em outra modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação líquida compreendendo: 0,001-50 mg/ml de proteína elasta- se madura em uma solução de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fos- fato de potássio, 10 MM de fosfato de sódio e compreendendo 0,01% de polissorbato-80, com um pH de 7,4.

Em outra modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação líquida compreendendo: 0,001-50 mg/ml de proteína elasta- se madura em uma solução de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fos- fato de potássio, 10 mM de fosfato de sódio e compreendendo 0,01% de polissorbato-80 e 8% de dextrano-18, com um pH de 7,4. Em outra modalidade específica, a presente invenção fornece

" 84 - uma formulação líquida compreendendo: 0,001-50 mg/ml de proteína elasta- se madura em uma solução de 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fos- : fato de potássio, 10 mM de fosfato de sódio e compreendendo 8% de dex- trano-18, com um pH de 7,4.

As formulações líquidas da invenção preferivelmente contêm uma concentração final de proteínas elastases maduras dentro de uma faixa em que o limite inferior é de 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15 ou 20 mg/ml e em que o limite superior é de, independentemente, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000 ou 1.500 mg/ml.

Em certos aspectos, a presente invenção fornece uma formula- ção líquida compreendendo: 0,0001-500 mg/ml (mais preferivelmente 1-100 mg/ml, e ainda mais preferivelmente 0,5-20 mi/mg) de proteína elastase ma- dura em uma solução de 0,5X PBS-1,5X PBS (mais preferivelmente 1X E PBS), a solução compreendendo 5-10% (mais preferivelmente 6-9%) de um excipiente selecionado da dextrose, lactose, glicose, manitol,sacarose, trea- lose, dextrano-70, glicerina, arginina, glicina, dextrano-44 ou dextrano-18 e tendo um pH de 6,5-8,5. Em uma modalidade específica, a formulação líqui- da corresponde a 0,5 mg/ml de proteína elastase madura e 8% de dextrano- 18 em 1X PBS, pH 7,4. Em uma modalidade específica, a formulação líquida compreende 5 mg/ml de proteína elastase madura e 8% de dextrano-18 em 1X PBS, pH 7.4.

Formulação líquida da invenção tem preferivelmente uma osmo- lalidade dentro de uma faixa em que o limite inferior é de 100, 125, 150, 175, 200, 250 ou 275 mOsm/kg e em que o limite superior é de, independente- mente, 500,450, 400, 350, 325, 300, 275 ou 250 mOsm/kg. Em modalidades específicas, a osmolaridade de uma formulação líquida da invenção preferi- velmente tem uma osmolaridade de aproximadamente 125 a 500 mOsm/kg, mais preferencialmente de aproximadamente 275 a 325 mOsm/Kkg, por e- xemplo, como medida pelo método da depressão do ponto de congelamen- to É especialmente vantajoso formular composições parenteral, tais como composições que possam ser feitas nas formulações líquidas da in-

- venção, em forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade da dose. A forma de unidade de dosagem como usada aqui se õ refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o sujeito a ser tratado; cada unidade contém uma quantidade prede- terminada de proteína elastase madura calculada para produzir o efeito tera- pêutico desejado, em associação com o veículo farmaceuticamente neces- sário. Conforme definido aqui, uma quantidade terapeuticamente efi- caz de proteína elastase madura (ou seja, uma dose eficaz) varia de cerca de0,0033mg - 200mg. Para vasos com menor diâmetro e paredes mais fi- nas, como as da fístula arteriovenosa radiocefálica, doses menores (por e- xemplo, de 0,0033mg - 2,0mg) são preferíveis. Para os vasos com um maior diâmetro e paredes mais espessas, como as artérias femorais, doses maio- - res (como 2,05-100mg) são preferíveis. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem é ser incluídas em um recipiente, embalagem, distribuidor, ou cateter. Ainda em outras modalidades, as composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem, distribuidor, ou cateter, junto com instruções para administração. As instruções para a administração podem ser incluídas em letras de forma dentro ou em cima de um recipiente, embalagem, distri- buidor, ou por cateter. Alternativamente, as instruções para a administração podem ser incluídas ou dentro ou em cima de um recipiente, embalagem, distribuidor, ou o cateter em forma de uma referência para outro documento impresso ou acessível pela internet que fornece as instruções.

Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou distribuidor. Em ainda outras modalidades, as composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou distribuidor junto com as instruções para a admi- nistração. As instruções para a administração podem ser incluídas em letra de forma dentro ou em cima de um recipiente, embalagem, ou distribuidor. Alternativamente, as instruções para administração podem ser incluídas den- tro ou em cima de um recipiente, embalagem ou distribuidor em forma de

S 86 - referência para outro documento impresso ou acessível pela internet que fornece as instruções. : A invenção inclui métodos para preparar composições farmacêu- ticas. Uma vez que a elastase madura é produzida de acordo com a inven- ção, ela pode ser liofiizada e armazenada até que seja reconstituída em uma formulação farmacêutica adequada para a administração. Em uma mo- dalidade exemplar, a presente invenção fornece um método para isolar uma elastase tipo | humana madura liofilizada compreendendo: (a) cultura de uma célula hospedeira, como uma célula hospedeira Pichia pastoris, modifi- cada para expressar uma molécula de ácido nucleico que codifica um qua- dro de leitura aberto da pré-pró-elastase sob condições nas quais o quadro aberto de leitura é expresso, em que o referido quadro aberto de leitura é composto por sequências de nucleotídeos codificando, na direção de 5' a . 3'(i) um peptídeo sinal operável em Pichia pastoris; (ii) uma sequência de ativação compreendendo uma sequência de reconhecimento da elastase; e | (iii) a sequência da proteína elastase tipo | madura, produzindo assim uma proteína pró-elastase; (b) submeter a proteína pró-elastase a condições de autoativação, produzindo assim uma elastase tipo | madura, em que as con- dições de autoativação incluem, por exemplo: (i) alterar o pH de uma solu- ção contendo a proteína pró-elastase, por exemplo, a um pH de 6,5-11, pre- ferivelmente de 8-9; ou (ii) purificar a proteína pró-elastase, por exemplo, por cromatografia de troca iônica, e submetendo a conversão da solução esten- dida para remover as variantes N -terminal, produzindo assim a elastase tipo | humana madura; (c) opcionalmente, purificar a elastase tipo | humana ma- dura,por exemplo, etapa de cromatografia por troca iônica pela cromatogra- fia aperfeiçoada; e (d) liofilizar a elastase tipo | madura, isolando assim a elastase tipo | humana madura liofilizada. Elastasetipo | madura é preferen- cialmente uma elastase tipo | humana. Em certos aspectos, a elastase tipo | madura liofilizada é preferencialmente mais de 95% pura; em modalidades específicas, a elastase tipo | madura liofiizada é mais de 98% ou mais de 99% pura.

As proteínas elastases maduras da invenção podem ser formu-

Doo 87 - ladas em composições farmacêuticas. Assim, em modalidades exemplares, a presente invenção fornece um método para produzir uma composição far- É macêutica compreendendo uma elastase tipo | humana madura, tal método compreendendo (i) isolar uma elastase tipo | humana madura liofilizada de acordo com os métodos descritos acima (por exemplo, na Seção 5.4); e (ii) reconstituir a elastase tipo | humana madura liofilizada em um veículo farma- ceuticamente aceitável.

5.6 DOSE EFICAZ A presente invenção geralmente fornece o benefício da adminis- tração parenteral, preferivelmente local, de proteínas elastases recombinan- tes, isoladamente ou em combinação com outros agentes, para tratar ou prevenir doenças em condutos biológicos. Em certas modalidades, como uma alternativa à administração parenteral, a administração oral de agentes para tratar ou prevenir doenças —nostubos biológicos pode ser usada.

n A toxicidade e eficácia terapêutica das proteínas elastases usa- das na prática dos métodos da invenção podem ser determinadas por pro- cedimentos farmacêuticos-padrão em culturas de células ou animais experi- mentais, por exemplo, para determinar a LD50 (dose letal para 50% da po- pulação)e ED50 (dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). À taxa da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e ele pode ser expresso como a relação LD50/ED50. Tal informação pode ser usada para determinar com mais precisão as doses úteis em seres huma- nos.

57. MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO A invenção refere-se a composições farmacêuticas compreen- dendo novas proteínas elastase e aos métodos de uso das mesmas para prevenir ou tratar doença em tubos biológicos. Tais composições farmacêu- ticas podem ser formuladas de maneira convencional como descrito na Se- ção5.5acima.

As composições da elastase da presente invenção podem ser administradas ao segmento desejado do tubo biológico a ser tratado por um

Mo 88 - dispositivo conhecido por um especialista na técnica para ser aceitável para distribuir as soluções na parede de uma artéria ou veia, por exemplo, uma í seringa, um cateter de distribuição do fármaco, uma agulha de distribuição do fármaco, um polímero de distribuição do fármaco implantado, como uma preparação de microesfera ou de folha, um cateter implantável, ou um stent vascular revestido de polímero, de preferência um stent autoexpansível.

Em certas modalidades, a administração para o segmento dese- jado pode ser guiado por visualização direta, ultrassonografia, tomografia computadorizada, guiada por fluoroscopia, ressonância magnética ou guiada porendoscopia.

Em certos aspectos da presente invenção, a administração de uma elastase a um tubo biológico compreende aplicar uma formulação líqui- da de elastase diretamente na superfície adventícia externa de uma artéria r ou veia exposta cirurgicamente. Em aspectos específicos desta invenção, a administração é realizada com uma seringa.

: Em certos aspectos da presente invenção, a administração de uma elastase a um tubo biológico compreende localizar um aparelho de dis- tribuição, em proximidade estreita ao segmento do tubo biológico a ser trata- do. Em algumas modalidades, durante a distribuição da proteína elastase porum aparelho de distribuição, uma porção do aparelho de distribuição po- de ser inserida na parede do tubo biológico. Em algumas modalidades, o lúmen do tubo biológico pode ser pressurizado, enquanto a proteína elastase é distribuída para o segmento pressurizado do tubo biológico. Em algumas modalidades, lúmen do tubo biológico é pressurizado por ação mecânica.

Em algumas modalidades, o lúmen do tubo biológico é pressurizado com um cateter-balão. Em algumas modalidades, a pressão é aplicada à parede in- terna do tubo biológico por um membro de autoexpansão que faz parte de um cateter ou um dispositivo. Em algumas modalidades, a proteína elastase é administrada e a pressurização é realizada pelo mesmo dispositivo. Em algumas modalidades, o tubo biológico é cirurgicamente exposto e a proteí- na elastase é distribuída no lúmen ou é aplicada à superfície externa do tubo biológico in vivo. Em modalidades envolvendo distribuição luminal, o sangue

MO 89 - que flui através do vaso pode ser parado com uma pinça ou para permitir a elastase ficar em contato com a parede do vaso por longos períodos de É tempo e para evitar a inibição da elastase pelo soro. Em algumas modalida- des, o tubo biológico é cirurgicamente removido e a elastase é distribuída à superfície luminal e/ou à superfície externa do tubo in vitro. O tubo tratado pode, então, em certas modalidades, ser devolvido ao organismo.

Em outros aspectos da presente invenção, a administração de uma elastase a um tubo biológico implica o uso de uma formulação de polí- mero que é colocado como um stent dentro do vaso a ser tratado, uma pinça oufita aplicada à superfície externa do tubo biológico, ou um envoltório no ou ao redor do vaso a ser tratado, ou outro dispositivo no, ao redor ou perto do vaso a ser tratado.

Ainda em outros aspectos da presente invenção, uma elastase é : injetada percutaneamente, em uma região tecidual com a finalidade de dila- taras artérias e/ou veias dentro dessa região, incluindo artérias colaterais.

À Em outros aspectos, a elastase é percutaneamente injetada diretamente na parede de uma artéria ou veia ou nos tecidos circundantes com a finalidade de dilatar um segmento específico do vaso. Em modalidades voltadas para o tratamento de vasos do coração, uma proteína elastase pode ser distribuída percutaneamente ao espaço pericárdico ou aplicada diretamente aos vasos coronarianos expostos cirurgicamente.

Os dispositivos médicos que podem ser usados para administrar as proteínas elastases da invenção para os vasos sanguíneos são descritos na Seção 5.9 abaixo.

58.Kits A presente invenção fornece kits para o exercício dos métodos da presente invenção. Um kit "terapêutico" da invenção compreende em um ou mais recipientes um ou mais dos agentes descritos aqui como úteis para tratar ou prevenir doença nos tubos biológicos, opcionalmente, junto com quaisquer agentes que facilitam a sua distribuição. Um kit alternativo da in- venção, o kit de "fabricação", compreende em um ou mais recipientes um ou mais dos agentes descritos aqui como úteis para produzir proteínas elasta-

eo 90 . ses recombinantes. O kit terapêutico da invenção pode opcionalmente compreender componentes adicionais úteis para realizar os métodos da invenção. A título de exemplo, o kit terapêutico pode incluir veículos farmacêuticos úteis para formularos agentes da invenção. O kit terapêutico também pode compreen- der um dispositivo ou um componente de um dispositivo para realizar os mé- todos terapêuticos da invenção, por exemplo, uma seringa ou agulha. A in- clusão de dispositivos como cateteres de injeção intramural ou perivascular ou cateteres de injeção intraluminal em kits terapêutico é também contem- plado. Em certas modalidades, os agentes da invenção podem ser forneci- dos em doses unitárias. Em adição ou em alternativa, os kits da invenção podem fornecer um material de instrução que descreve o desempenho de um ou mais métodos da invenção, ou um aviso na forma prescrita por uma agência governamental regulamentando a produção, o uso ou a venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação da a- Ê gência de produção, uso ou venda para administração a seres humanos. Materiais de instrução podem ser incluídos em forma impressa, dentro ou sobre um ou mais recipientes do kit. Alternativamente, os materiais de ins- trução podem ser incluídos dentro ou sobre um ou mais recipientes do kit na forma de referência para outro documento impresso ou acessível pela inter- net que fornecem os materiais de instrução. Em modalidades específicas, um kit da invenção compreende um dispositivo médico como descrito na Seção 5.9 abaixo. O kit para produção da invenção pode opcionalmente compre- ender componentes adicionais úteis para a realização dos métodos da in- venção.

5.9 DISPOSITIVOS MÉDICOS ÚTEIS PARA A ADMINISTRAÇÃO DAS

PROTEÍNAS ELASTASES Fornecidos aqui estão os dispositivos médicos que podem ser usados para administrar as proteínas elastases da presente invenção a um tubo biológico, como uma artéria ou veia. Tais dispositivos são descritos a- baixo e no pedido provisório nº 61/025 084, depositado em 31 de janeiro de te Ex : 2008, pedido provisório nº 61/025 463, depositado em 1 de fevereiro de 2008, e pedido provisório nº 61/075 710, depositado em 25 de junho de í 2008, cada um dos quais é incorporado por referência aqui na sua totalida- de. As proteínas elastases da presente invenção também podem ser admi- —nistradas aos tubos biológicos através de cateteres convencionais.

Em uma modalidade, um dispositivo médico útil para a adminis- tração de proteínas elastases tem um eixo longitudinal central, e compreen- de um ou mais atuadores, onde um ou mais atuadores podem existir em uma configuração restrita em que um comprimento um ou mais dos referidos atuadores é orientado substancialmente paralelo ao eixo longitudinal do refe- rido dispositivo médico e uma configuração irrestrita em que pelo menos uma porção do comprimento de um ou mais dos referidos atuadores é orien- tado substancialmente não-paralelo ao eixo longitudinal central do dispositi- : vo. Depois que o dispositivo é posicionado em um sítio alvo adjacente à pa- rede de um tubo biológico, um ou mais atuadores (e, se desejado, todos os : atuadores) podem ser liberados de uma configuração restrita e permitidos a adotar uma configuração irrestrita, fazendo assim contato com a parede do tubo biológico. Um ou mais atuadores podem ser de qualquer forma, e em modalidades preferidas, o movimento de um ou mais atuadores da configu- ração restrita para a configuração irrestrita ocorre após a liberação de uma força restrita pelo operador do dispositivo, mas sem a entrada pelo operador de quaisquer forças deformantes para o dispositivo ou para o tecido alvo.

Em uma primeira modalidade específica, mostrada na figura 22, o dispositivo é um cateter de distribuição de fluido 10 compreendendo um ou mais atuadores que são formados como um par de ranhuras alongadas 12, 14, as regiões intermediárias das quais são móveis entre uma configuração restrita, que é orientada substancialmente paralela ao eixo longitudinal cen- tral 15 da montagem do cateter e uma configuração irrestrita em que pelo menos uma porção do par de ranhuras é orientada substancialmente não- paralela ao referido eixo longitudinal central (ver as porções esquerda L e direita R dos comprimentos da ranhura na figura 23). Uma ou mais ranhuras 12, 14 podem ser construídas como bandas alongadas ou fios que cada uma fe 92 - tem extremidades proximais e distais opostas.

Em uma modalidade preferi- da, as ranhuras têm superfícies interiores opostas planas 24, 26, e superfi- cies exteriores opostas planas viradas para fora 28, 30. Nesta modalidade, as ranhuras 12, 14 podem alternar entre as posições restritas e as posições irrestritas, como mostradas respectivamente nas figuras 22 e 23. Em uma modalidade, o par de ranhuras é posicionado de costas um para o outro em suas configurações restritas como mostrado na figura 22. O cateter 10 compreende ainda um ou mais penetradores de te- cido 16, 18 seguros a uma ou mais superfícies de uma ou mais ranhuras 12, 14, um componente do cateter central 20 tendo um comprimento alongado, e um componente do cateter exterior 22 que podem proteger o penetrador ou penetradores de tecido durante o movimento do cateter no tubo biológico.

Os penetradores de tecido 16, 18 pode ser construídos de qual- * quer material adequado.

Os exemplos preferidos de tais materiais incluem, mas não estão limitados a, níquel, alumínio, aço e ligas dos mesmos.

Em í uma modalidade específica, os penetradores de tecido são construídos de nitinol.

O componente do cateter central 20 e o componente do cateter exterior 22 podem ser construídos com materiais tipicamente empregados na construção de cateteres.

Exemplos de tais materiais incluem, mas não estão limitados a, silicone, poliuretano, náilon, Dacron, e PEBAXº.

Os atuadores são preferivelmente construídos de um material flexível, resistente.

Em uma modalidade preferida, o material flexível, resis- tente é capaz de ser restrita sobre a aplicação de uma força restrita, por e- xemplo, quando os atuadores estão na configuração restrita, e adotam suas formas originais irrestritas quando a força restrita é removida, por exemplo, quando os atuadores estão em uma configuração irrestrita.

Qualquer um desse material flexível, resistente pode ser usado incluindo, mas não limita- do a, aço cirúrgico, alumínio, polipropileno, materiais olefínicos, poliuretano e outras borrachas sintéticas ou materiais plásticos.

Um ou mais atuadores são mais preferivelmente construídos de um material com memória de for- ma.

Exemplos de tais materiais com memória incluem, mas não estão limita-

te o3 - dos a, ligas de cobre-zinco-alumínio-níquel, ligas de cobre-alumínio-níquel e ligas de titânio (NiTi). Em uma modalidade preferida, o material com memó- é ria de forma é o nitinol. Em uma modalidade preferida, quando o par de ra- nhuras assume a configuração irrestrita, as propriedades do material com memória de forma do material do qual cada ranhura é formada causa as ra- nhuras, sem a aplicação de qualquer força deformadora externa, para cur- var-se radialmente longe um do outro em um único plano como mostrado na figura 23. Uma ou mais das ranhuras (e preferivelmente cada uma das ra- nhuras) tem um tubo flexível de distribuição de fluido 32, 34 que se estende ao longo da ranhura, ou dentro da ranhura, como mostrado na figura 24. Conforme as ranhuras 12, 14 se movem de suas configurações restritas em linha reta a suas configurações irrestritas curvadas, os tubos de distribuição de fluido 32, 34 também mudam de configurações em linha reta para confi- gurações curvadas. Em uma modalidade, os tubos de distribuição de fluido 32, 34 são tubos tubulares separados que são seguros ao longo dos com- primentos do par de ranhuras 12 de 14. Em outra modalidade, os tubos de distribuição de fluido são tubos formados em ou dentro do material das ra- nhuras.

Uma ou mais das ranhuras (e preferivelmente cada uma das ra- nhuras 12,14) também é formada com um trilho de fecho 36, 38 que se es- tende ao longo do comprimento da ranhura (figura 24). Os trilhos de fecho 36, 38 são formados do mesmo material das ranhuras 12, 14, ou de um ma- terial que se flexiona com as ranhuras 12, 14.

Um ou mais dos penetradores de tecido 16, 18 está seguro às superfícies exteriores 28, 30 do par de ranhuras 12, 14 (figura 24). Os pene- tradores de tecido 16 e 18 estão conectados a e se comunicam com os tu- bos de distribuição de fluido 32, 34 que se estendem ao longo dos compri- mentos das ranhuras 12, 14. Os penetradores de tecido 16, 18 são posicio- —nados para projetarem substancialmente perpendiculares da superfície exte- rior 28, 30 das ranhuras 12, 14. Os penetradores de tecido 16, 18 têm orifíi- cios interiores ocos que se comunicam com os tubos de distribuição de fluido f 32, 34 das ranhuras. As extremidades distais dos penetradores de tecido : têm portas de distribuição de fluidos que se comunicam com os orifícios inte- riores dos penetradores de tecido. O dispositivo permite a distribuição de fluidos em ou através de uma ou mais camadas distintas de uma parede de um tubo biológico, por exemplo, uma parede vascular. A parede vascular compreende numerosas estruturas e camadas, incluindo a camada endotelial e camada da membra- na basal (coletivamente a camada íntima), a lâmina elástica interna, a ca- mada média e camada adventícia. Estas camadas são dispostas de modo queo endotélio é exposto ao lúmen do vaso e a membrana basal, a lâmina elástica interna, o meio e a adventícia são sucessivamente postas em ca- madas sobre o endotélio, como descrito na publicação do pedido de patente U.S. nº 2006/0189941A1. Com os dispositivos médicos da presente inven- : ção, a profundidade para a qual os penetradores de tecido 16, 18 podem À 15 penetrar é determinada pelo comprimento de cada penetrador de tecido 16, É 18. Por exemplo, se a camada alvo for a camada adventícia, os penetrado- res de tecido 16, 18 tendo um comprimento suficiente definido para a pene- tração na profundidade da camada adventícia sobre a implantação do dispo- sitivo são usados. Da mesma forma, se a camada alvo é a camada média, os penetradores de tecido 16, 18 tendo um comprimento definido suficiente para a penetração na profundidade da camada média sobre a implantação do dispositivo são usados.

Na modalidade específica, o comprimento dos penetradores de tecido 16, 18 podem variar de cerca de 0,3 mm a cerca de 5 mm para apli- cações vasculares, ou até cerca de 20 mm a 30 mm para aplicações envol- vendo outros espaços ou tubos biológicos, por exemplo, em aplicações de cólon. Os penetradores de tecido 16, 18 preferivelmente têm um diâmetro de cerca de 0,2 mm (33 gauge) a cerca de 3,4 mm (10 gauge), mais preferivel mente de 0,2 mm a 1,3 mm (de cerca de 33 a 21 gauge). As extremidades distais dos penetradores de tecido podem ter um bisel padrão, um bisel cur- to, ou um bisel verdadeiramente curto. Em uma modalidade alternativa, os penetradores de tecido aderidos a qualquer uma das ranhuras não são de

' comprimentos idênticos, mas podem ser configurados de modo que suas ; extremidades distais se alinhem para que sejam equidistante da parede do tubo biológico quando o dispositivo médico está na posição irrestrita, por exemplo, durante o uso.

O componente do cateter central 20 tem um comprimento alon- gado com extremidades distais e proximais opostas, mostrados à esquerda e direita, respectivamente, na figura 22. Em uma modalidade, o componente do cateter central 20 tem uma superfície cilíndrica exterior que se estende ao longo de seu comprimento alongado.

As extremidades proximais das ranhu- ras 12,14 estão ligadas, por exemplo, soldadas ou coladas à extremidade distal do componente central do cateter 20, enquanto as extremidades dis- tais das ranhuras 12, 14 estão ligadas, por exemplo, soldadas ou coladas, a uma ponta da guia do cateter 40. A ponta 40 tem uma superfície lisa exterior : que é desenhada para se mover facilmente no tubo biológico.

Um orifício do . 15 fioguia48 estende através do comprimento do cateter central 20 e da ex- Ú tremidade 40. O orifício do fio guia é dimensionado para receber um fio guia deslizante através do orifício.

Um par de lumens de distribuição de fluido 44, 46 se estende a- través do interior do componente do cateter central 20 pelo comprimento total do componente do cateter (figura 25). Na extremidade distal do compo- nente do cateter central 20, o par de lumens de distribuição de fluido 44, 46 se comunica com o par de tubos de entrega de fluido 32, 34 que se esten- dem ao longo dos comprimentos das ranhuras 12, 14 aos penetradores de tecido 16, 18. Um orifício de fio guia 48 também se estende através do inte- riordo componente do cateter central 20 da extremidade proximal à extremi- dade distal do componente do cateter central (figura 25). A extremidade pro- ximal do componente do cateter central 20 é fornecida com um par de liga- ções Luer 50, 52 (figura 22). Em uma modalidade, cada ligação Luer 50, 52 se comunica com um dos lumens de distribuição de fluidos 44, 46 se esten- dendo através do comprimento do cateter central.

Cada ligação Luer 50, 52 é desenhada para ser conectada com uma fonte de distribuição de fluido para fazer a comunicação de um fluido através de cada ligação Luer 50, 52,

então através de cada lúmen de distribuição de fluido 44, 46 se estendendo através da componente do cateter central 20, em seguida, através cada tubo de distribuição de fluido 32, 34 se estendendo ao longo do comprimento do par de ranhuras 12, 14, e depois através dos penetradores de tecido 16, 18 seguros a cada um dos pares das ranhuras.

Em outra modalidade, cada |li- gação Luer 50, 52 independentemente se comunica com ambos os lumens de distribuição de fluidos 44, 46 estendendo-se através do comprimento do componente do cateter central.

Nesta configuração, um primeiro fluido pode ser distribuído através de uma primeira ligação Luer para ambos os penetra- dores de tecido 16, 18 e um segundo fluido pode ser distribuído através de uma segundo ligação Luer para ambos os penetradores de tecidos 16, 18. À distribuição de fluido para ambos os penetradores de tecidos de cada liga- ção Luer pode ser alcançada por um tubo independente que se estende de * cada ligação Luer para um reservatório comum distal 61, como mostrado na . 15 figura32. Este reservatório se comunica com ambos os penetradores de tecido 16, 18. Alternativamente, em outra modalidade, o dispositivo médico da presente invenção compreende apenas uma única ligação Luer conecta- da a um único lúmen de distribuição de fluido estendendo-se através do ca- teter central, que é então acoplado a um reservatório comum distal, permi- tindoa distribuição de um único fluido para ambos os penetradores de tecido

16,18. O componente do cateter exterior 22 tem uma configuração tu- bular que envolve o par de ranhuras 12, 14 e uma maioria do cateter central 20 (figura 22). O componente do cateter 22 tem um comprimento alongado que se estende entre as extremidades distais e proximais opostas do com- ponente do cateter mostrados à esquerda e à direita, respectivamente, na figura 22. A extremidade distal do componente do cateter é dimensionada para se acoplar a uma engrenagem segura com a ponta da guia 40, onde a superfície exterior da ponta 40 se funde com a superfície exterior do compo- —nente do cateter 22, quando a extremidade distal do componente do cateter é acoplada com a ponta.

A configuração tubular do componente do cateter 22 é dimensionada de modo que uma superfície interior do componente do

; cateter 22 é espaçada externamente da pluralidade dos penetradores de tecido 16, 18 no par de ranhuras 12, 14, nas posições restritas do par de ranhuras. A extremidade proximal do cateter central 20 se estende para a- lém da extremidade proximal do componente do cateter 22 quando a extre- — midade distal do componente do cateter se acopla com a ponta da guia do cateter 40.

Uma conexão mecânica 54 é fornecida entre a extremidade pro- ximal do componente do cateter exterior 22 e a extremidade proximal do componente do cateter central 20 que permite o componente do cateter ex- terior ser movido para trás ao longo do comprimento do par de ranhuras 12, 14 e do componente do cateter central 20 fazendo com que a extremidade distal do componente do cateter exterior 22 se separe da ponta da guia 40 e passe por cima do par de ranhuras 12, 14 e para frente por cima do compri- : mento do componente do cateter central 20 e por cima dos comprimentos do parderanhuras 12, 14 para acoplar a extremidade distal do componente do cateter exterior 22 com a ponta 40 (figura 22). A conexão mecânica 54 pode ser fornecida por uma alavanca ou botão que desliza manualmente o com- ponente do cateter exterior 22 sobre o componente do cateter central 20. A conexão 54 também pode ser fornecida por um mecanismo de roda de acio- namento manual ou de gatilho. Além disso, a conexão 54 pode ser fornecida com um indicador sonoro ou tátil (como um clique) do movimento incremen- tal do componente do cateter exterior 22 em relação ao componente do cate- ter central 20. E Em uma modalidade, o componente do cateter exterior 22 é for- —necidocom um único fecho 56, que se estende ao longo de todo o compri- mento de um lado do componente do cateter exterior 22 na superfície interior do componente do cateter exterior (figura 24). O fecho 56 no interior do componente do cateter exterior 22 se acopla em uma engrenagem de desli- zamento com o trilho de fecho 36, 38 em um lado de cada uma das ranhuras 12,14. Avançando o componente do cateter exterior 22 para frente ao longo do comprimento do componente do cateter central 20 e dos pares de ranhu- ras 12, 14, em direção à ponta da guia 40 da montagem do cateter faz com

" que o fecho 56 do componente do cateter exterior deslize ao longo dos tri- ã lhos 36, 38 do par de ranhuras 12, 14. Isso move o par de ranhuras 12, 14 da sua configuração irrestrita curvada, mostrado na figura 23 em direção à sua configuração restrita de costas um para o outro, mostrada na figura 22. A engrenagem dos trilhos da ranhura 36, 38 no fecho 56 do componente do cateter exterior 22 segura o par de ranhuras 12, 14, em suas posições relati- vas de costas um para o outro mostrado na figura 22. Com o componente do cateter exterior 22 empurrado para frente sobre o componente do cateter central 20 e o par de ranhuras 12, 14, para onde a extremidade distal do componente do cateter exterior 22 se engata com a ponta da guia 40, os penetradores do tecido 16, 18 são cobertos e a montagem do cateter da presente invenção pode ser seguramente movida para frente ou para trás em um tubo biológico. O componente do cateter exterior 22 cobre os pene- . tradores de tecido 16, 18 projetando do par de ranhuras 12, 14 e a engrena- gemdo componente do cateter exterior 22 com a ponta da guia distal 40 for- É nece a montagem do cateter com uma superfície lisa exterior que facilita a inserção da montagem do cateter dentro e através de um tubo biológico, como um vaso sanguíneo. Em outra modalidade, o componente do cateter exterior 22 é fornecido com dois fechos a 180 graus uma da outra que se estendem ao longo de todo o comprimento do componente do cateter exteri- or 22 na superfície interior e as ranhuras têm trilhos em ambos os lados. Um fio guia 58 é usado com a montagem do cateter (figura 22). O fio guia 58 se estende através do orifício do fio guia do componente do cateter central 48, ao longo das ranhuras 12, 14, e através da saída da ponta daguia42. Em certas modalidades, o fio guia 58 tem um núcleo sólido, por exemplo, aço inoxidável ou nitinol superelástico. O fio guia pode ser constru- ido de material radiopaco, quer seja em sua totalidade ou na sua porção dis- tal (por exemplo, o mais distal de 1 mm a 25 mm ou mais distal de 3 mm a 10 mm). O fio guia 58 pode ser opcionalmente revestido com um revestimen- tomedicamente inerte como o TEFLONº.

No uso deste dispositivo, o fio guia 58 é posicionado no tubo bio- lógico por métodos em conhecidos na técnica. O fio guia 58 se estende do

, tubo biológico, através do fio guia de saída 42 na extremidade 40 da monta- : gem, através do cateter de proteção exterior 22 passando os penetradores de tecido 16, 18, e através do orifício do fio guia 48 do cateter central 20. Em outras modalidades, a montagem do cateter é uma montagem de cateter de trocarápida, em que o lúmen do fio guia é presente na extremidade distal da ponta da guia 40 do cateter, mas não se estende ao longo o comprimento total do dispositivo médico.

Após o posicionamento do fio guia, o dispositivo é avançado no tubo biológico ao longo do fio guia anteriormente posicionado 58. Um ou maismarcadores radiopacos podem opcionalmente ser fornecidos no dispo- sitivo para monitorar a posição do dispositivo no tubo biológico. Qualquer material que impede a passagem de radiação eletromagnética é considerado radiopaco e pode ser usado. Os materiais radiopacos preferidos incluem, : mas não estão limitados a, platina, ouro ou prata. O material radiopaco pode - 15 serrevestido na superfície de toda ou parte da extremidade 40, em toda ou é parte das ranhuras 12, 14 ou outros atuadores, no fio guia 58, ou em alguma combinação das estruturas anteriores. Alternativamente, um anel do material radiopaco pode ser acoplado à ponta 40. O dispositivo pode ser opcional- mente fornecido com imagens acopladas, como ultrassom intravascular ou tomografia de coerência óptica. A ponta do dispositivo pode ser opcional- mente fornecida com lentes que são usadas para determinar a posição do dispositivo ou características do tubo biológico circundante. Quando o dispositivo está em sua posição desejada no tubo bio- lógico, o operador usa conexão mecânica 54 para recolher o componente do cateter exterior 22 para trás distante da ponta da guia 40. Em uma modali- dade preferida, enquanto o componente do cateter exterior 22 é retirado dos penetradores de tecido 16, 18, o fecho 56 do componente do cateter exterior 22 é retirado dos trilhos 36 e 38, do par de ranhuras 12, 14. Esse movimento libera o par de ranhuras 12, 14 de sua configuração restrita, de costas uns paraos outros, mostrado na figura 22, e permite que o material com memó- ria de forma das ranhuras 12, 14 se adapte a suas configurações irrestritas, curvadas mostradas na figura 23. Enquanto as ranhuras 12, 14 se movem

' para as suas configurações irrestritas, curvadas, as ranhuras entram em Ê contato com a superfície interna da(s) parede(s) do tubo biológico e os pene- tradores de tecido 16, 18 na superfície exterior 28, 30 das ranhuras 12, 14 são pressionados na superfície interior do tubo biológico na posição do dis- positivo.

Depois que os penetradores de tecido 16, 18 entraram na cama- da desejada da parede de um tubo biológico, um fluido pode ser distribuído através dos lumens de distribuição de fluidos 44, 46 no componente do cate- ter central 20, através dos tubos de implantação de fluido 32, 34 no par de ranhuras 12, 14, e através dos penetradores de tecido 16, 18. Quando a dis- tribuição do fluido está completa, o operador usa a conexão mecânica 54 para mover o componente do cateter exterior 22 (que também pode ser refe- rido como um componente de proteção) para frente por cima o componente : do cateter central 20 e por cima do par de ranhuras 12, 14 em direção à pon- - 15 ta40 Enquanto o componente do cateter exterior 22 avança sobre o par de É ranhuras 12, 14, do fecho 56 no interior do componente do cateter exterior 22 passa por cima dos trilhos de 36, 38 no par de ranhuras 12, 14, causando as ranhuras 12, 14 para se moverem de sua configuração irrestrita, curvada, de volta a sua configuração irrestrita. Quando o componente do cateter exte- rior 22 avançar totalmente sobre o par de ranhuras 12, 14 e novamente se acoplar à ponta da guia 40, o fecho 56 no componente do cateter exterior 22 segura as ranhuras 12, 14 em sua configuração restrita. O dispositivo pode então ser reposicionado para liberar em outro local no tubo biológico ou ou- tro tubo biológico, ou retirado do organismo.

A forma e o comprimento das ranhuras 12, 14 são selecionados de tal forma que várias modalidades do dispositivo podem ser usadas em espaços biológicos ou tubos de vários tamanhos ou diâmetros. Em certas modalidades, as ranhuras podem ser planas ou arredondadas. Ranhuras planas têm preferivelmente uma largura variando de cerca de 0,2 mm a 20 mm, uma altura variando de cerca de 0,2 mm a cerca de 5 mm, e um com- primento variando de cerca de 10 mm a 200 mm, dependendo da aplicação particular. Ranhuras arredondadas têm preferivelmente um diâmetro varian-

do de cerca de 0,2 mm a cerca de 20 mm e um comprimento variando de ' cerca de 10 mm a 200 mm, dependendo da aplicação particular. Em modali- dades específicas, as ranhuras planas são de 3,5 mm a 5 mm, 5 mm a 10 mm, 10 mm a 15 mm, 15 mm a 20 mm de largura, ou em qualquer intervalo dentrodesses (por exemplo, 3,5 mm a 10 mm); 3,5 mm a 5 mm, 5 mm a 10 mm, 10 mm a 15 mm, 15 mm a 20 mm de altura, ou em qualquer intervalo dentro desses (por exemplo, 3,5 mm a 10 mm); e 10 mm a 20 mm, 20 mm a 40 mm, 40 mm a 80 mm, 80 mm a 120 mm, 120 mm a 150 mm e 150 a 200 mm de comprimento, ou qualquer intervalo dentro desses (por exemplo, 10 mmad40mm), ou qualquer permutação dos anteriores (por exemplo, uma largura de 5 mm a 10 mm, uma altura de 3,5 a 5 mm, e um comprimento de a 40 mm). Em outras modalidades, as ranhuras arredondadas são de 3,5 mm a 5 mm, 5 mm a 10 mm, 10 mm a 15 mm, 15 mm a 20 mm de diâmetro, £ ou qualquer faixa dentro dessas (por exemplo, 3,5 mm a 10 mm) e 10 mm a - 15 20mm, 20mma40mm,40mm a 80 mm, 80 mm a 120 mm, 120 mm a 150 É mm ou 150 mm a 200 mm de comprimento, ou qualquer faixa dentro dessas (por exemplo, 10 mm a 40 mm), ou qualquer permutação dos anteriores (por exemplo, um diâmetro de 5 mm a 10 mm e um comprimento de 2 a 40 mm). Em uma segunda modalidade específica, mostrada na figura 27, 20 odispositivo da presente invenção é um cateter de distribuição de fluido 110 compreendendo um componente do cateter central 112 tendo um compri- mento alongado com um eixo longitudinal 113, um ou mais (e de preferência dois) atuadores flexíveis, resistentes que, nesta modalidade específica, são formados como tubos de apresentação de penetradores de tecido 114, 116 que se estendem da porção distal componente do cateter central 112. Pelo menos uma porção dos tubos de apresentação do tecido 114, 116 é móvel entre uma configuração restrita, que é substancialmente orientada paralela ao eixo central longitudinal 113 da montagem do cateter e uma configuração irrestrita que é substancialmente orientada não-paralelamente ao eixo longi- tudinal central 113 do cateter.

O cateter compreende ainda um ou mais (e de preferência dois) penetradores de tecido alongados flexíveis 118, 120 que se estendem atra-

x vés de dois tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116, e um ã tubo de implantação exterior 122 que se estende por porções dos compri- mentos do componente do cateter central 112, os tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 e o trilho do meio 132.

O componente do cateter central 112 e o tubo de implantação exterior 122 podem ser construídos de qualquer material adequado para a construção de cateteres. Exemplos de tais materiais incluem, mas não estão limitados a, silicone, poliuretano, náilon, Dacron, e PEBAXº.

Os penetradores de tecido 118, 120 se conectam para as liga- çõesrespectivas 166, 168 (figura 31). Um ou mais de um par dos penetrado- res de tecido 118, 120 têm preferivelmente um diâmetro de cerca de 0,2 mm (33 gauge) a cerca de 3,4 mm (10 gauge), mais preferivelmente de 0,8 mm a 1,3 mm (cerca de 18 a 21 gauge). Um ou mais de um par de penetradores . de tecido pode ter um bisel padrão, um bisel curto ou um bisel verdadeira- - 15 mente curto. O par de penetradores de tecido 118, 120 é de preferência Ê construído com materiais que permitem os penetradores de tecido se flexio- narem ao longo de seu comprimento. Exemplos de tais materiais incluem, mas não estão limitados a, níquel, alumínio, aço e ligas dos mesmos. Em uma modalidade específica, os penetradores de tecido são construídos de nitinol. O comprimento total dos penetradores de tecido 118, 120 podem ser construídos de um único material, ou as extremidades distais (por exemplo, 1 mm distal a 20 mm distais), incluindo as pontas 156, 158, dos penetrado- res de tecido 118, 120 podem ser construídos de um material e conectados às ligações respectivas 166, 168 através de uma tubulação construída de umrmaterial diferente, por exemplo, de plástico.

Um ou mais do par de tubos de apresentação de penetradores de tecido 114, 116 é preferencialmente construído de um material flexível resistente. Tal material flexível e resistente pode ser deformado, por exem- plo, quando os tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 es- tão na configuração restrita em linha reta da figura 27, mas retoma a sua forma original quando a força de deformação é removida, por exemplo, quando os tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 estão na

. configuração irrestrita curvada como mostrado na figura 28. Qualquer um : desse material flexível resistente pode ser usado incluindo, mas não se limi- tado ao, aço cirúrgico, alumínio, polipropileno, materiais olefínicos, poliureta- no e outros materiais plásticos ou borracha sintética.

O par de tubos de a- presentação do penetrador de tecido 114, 116 é mais preferivelmente cons- truído de um material com memória de forma.

Exemplos de tais materiais com memória de forma incluem, mas não limitado a, ligas de cobre-zinco- alumínio-níquel, ligas de cobre-alumínio-níquel, e ligas de niquel-titânio (Ni- Ti). Em uma modalidade preferida, o material com memória de forma é o nitinol.

O componente do cateter central 112 tem um comprimento alon- gado flexível, com extremidades proximal 124 e distal 126 opostas( figura 27). A extremidade distal 126 do componente do cateter central é formado : como uma ponta da guia que tem uma configuração de forma exterior que - 15 guiaráa extremidade distal 126 através de um tubo biológico.

Um orifício do À fio guia 128 no meio do trilho 132 se estende até o centro do cateter central 112 da extremidade proximal 124 e da extremidade distal 126. O orifício do fio guia 128 recebe um fio guia alongado flexível 130 para o movimento de deslizamento do orifício 128 por cima do fio (figura 29). O fio guia 130 é usa- do para guiar a montagem do cateter através de um tubo biológico.

Em al- gumas modalidades, o fio guia 130 tem um núcleo sólido, por exemplo, aço inoxidável ou nitinol superelástico.

O fio guia pode ser opcionalmente cons- truído de material radiopaco, quer seja na sua totalidade ou na sua porção distal (por exemplo, mais distal de 1 mm a 25 mm ou mais distal de 1 nm a 3mm) Ofioguia 130 pode ser opcionalmente revestido com um revestimen- to médico inerte como o TEFLONºS.

Em outras modalidades, a montagem do cateter é uma montagem de cateter de troca rápida onde um fio guia é posi- cionado na extremidade distal da ponta da guia 126 e se estende da mesma.

Um trilho médio estreito 132 em torno do orifício do fio guia 128 se estende da ponta da guia da extremidade distal do cateter 126 em dire- ção à extremidade proximal do cateter 124. O trilho médio 132 conecta a ponta da guia 126 a uma porção da base 138 do componente do cateter

' central.

: A porção da base do componente central do cateter 138 tem uma superfície externa cilíndrica que se estende ao longo do comprimento total da porção da base. A porção da base 138 se estende ao longo da maio- riado comprimento total do componente do cateter central 112. Conforme mostrado na figura 29, o orifício do fio guia 128 se estende através do centro da porção da base do componente do cateter central 138. Além disso, um par de lumens de penetradores de tecido 140, 142 também se estendem por todo o comprimento da porção da base do componente do cateter central 138 aolado do orifício do fio guia 128. No final proximal 124 do componente do cateter central, um par de portas 144, 146 se comunicam ao par de lu- mens 140, 142 com o exterior do componente do cateter central 112 (figura 27).

- Em uma modalidade alternativa, o dispositivo médico da figura - 15 27 também pode compreender um atuador único resistente flexível, que é : formado como um tubo de apresentação do penetrador de tecido, um pene- trador de tecido único alongado flexível, que se estende através do tubo de apresentação do penetrador de tecido e se conecta a uma ligação, e um tu- bo de distribuição exterior que se estende por porções dos comprimentos do componente do cateter central, do tubo de apresentação do penetrador de tecido, e do trilho do meio.

O par do primeiro e do segundo tubo de apresentação do pene- trador de tecido 114, 116 projeta da porção da base do componente do cate- ter central 138 em direção da extremidade distal do cateter 126. Cada um dos tubos de apresentação do penetrador de tecido é formado como um tu- bo alongado estreito, tendo uma extremidade proximal que é segura a por- ção da base do componente do cateter central 138, e uma extremidade dis- tal oposta 148, 150. Cada um do primeiro e do segundo tubo de apresenta- ção do penetrador de tecido 114, 116 tem um orifício interior 152, 154 que se — comunica com o respectivo primeiro lúmen penetrador de tecido 140 e se- gundo lúmen penetrador de tecido 142 na porção da base o componente do cateter central 138.

Conforme mostrado nas figuras 29 e 30, as configurações exter- : nas dos tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 são com- patíveis com o trilho do meio 132 para que os comprimentos dos tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 possam ser posicionados ladoalado,em lados opostos do trilho do meio 132. As extremidades distais do tubo do penetrador de tecido 148, 150 podem ser formadas como super- fícies da ponta da guia que também facilitam a passagem do cateter através de um sistema vascular. As extremidades distais do tubo do penetrador de tecido 148, 150 são preferivelmente maiores em diâmetro do que os tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116. Em uma modalidade es- pecífica, as pontas distais do tubo do penetrador de tecido 148, 150 são pon- tas arredondadas e bulbosas. Tais pontas não são traumáticas e os tubos não perfurarão inadvertidamente a parede de um tubo biológico. As pontas í 148, 150 são expostas e não se estendem exteriormente além do diâmetro - 15 dapontadaguia 126.

Ú Cada um dos tubos do penetrador de tecido 114, 116 é preferi- velmente, construído de material com memória de forma, tal como o nitinol. Os tubos 114, 116 são formados com configurações irrestritas curvadas, mostrados na figura 28. Os tubos 114, 116 se movem para as configurações irrestritas curvadas mostradas na figura 28 quando nenhuma força restrita é aplicada contra os tubos. Para que os tubos de apresentação 114, 116 se estendam em configurações restritas em linha reta, ao longo do trilho do meio 132, uma força restrita deve ser aplicada aos tubos para mantê-los em suas posições restritas em linha reta, mostrado na figura 27. Como cada um dos tubos 114, 116 se movimentam de sua configuração restrita em linha reta, mostrada na figura 28, para sua configuração irrestrita curvada, mos- trada na figura 28, os furos do penetrador de tecido 152, 154 se estendem através dos tubos também se movem das configurações em linha reta às configurações curvadas. O par de penetradores de tecido 118, 120, de suas pontas dis- tais às ligações 166, 168 tem comprimentos que são ligeiramente mais lon- gos do que os comprimentos combinados dos lumens do penetrador de teci-

do 140, 142 que se estende através da porção da base do cateter central * 138 e os orifícios do penetrador de tecido 152, 154 que se estende através dos tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116. As pontas 156, 158 dos penetradores de tecido 118, 120 estão posicionadas adjacente a exiremidade distal 148, 150 dos tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 e estão posicionados no interior dos orifícios 152, 154 dos tubos na configuração restrita da figura 27. As extremidades proximais opos- tas da penetração do tecido 118, 120 se projetam para fora através das por- tas laterais 144, 146 do cateter central 112. O par de penetradores de tecido 118,120 são dimensionados para deslizar facilmente através dos lumens do penetrador de tecido 140, 142 da componente do cateter central 112 e dos orifícios do penetrador de tecido 152, 154 dos tubos de apresentação do pe- netrador de tecido 114, 116. As portas laterais 144, 146 da componente do : cateter central 112 são preferivelmente em ângulo de 20º a 90º para a ex- - 15 tremidade proximal do cateter central 124, mais preferivelmente em ângulos : de 30º a 60º para a extremidade proximal do cateter central 124.

Um par de movimento do operador manual para controladores de movimento linear 162, 164 pode ser conectado as extremidades proxi- mais dos penetradores de tecido 118, 120 e pode ser segurado às portas do cateter central 144, 146 (figura 31). Os controladores 162, 164 podem ser construídos para converter o movimento do operador em movimento linear controlado dos penetradores de tecido 118, 120 através dos lumens do pe- netrador de tecido do cateter central 140, 142 e através dos orifícios do tubo de apresentação do penetrador de tecido 152, 154. Em uma modalidade, há controladores de rotação 162, 164 que podem ser movidos manualmente em uma direção, de modo que as pontas de injeção do penetrador de tecido 156 de 158 nas extremidades distais do penetrador de tecido podem ser posicio- nados de modo ajustável para estender um comprimento desejado para fora dos orifícios do tubo do penetrador de tecido 152, 154 nas extremidades dis- taisdo tubo do penetrador de tecido 148, 150. Ao rodar os controladores na direção oposta, os penetradores de tecido 118, 120 podem ser recolhidos de volta nos orifícios do tubo do penetrador de tecido 152, 154. Cada um dos movimentos do operador aos controladores do movimento linear 162, 164 . pode ser fornecido com uma ligação 166, 168 que se comunica com o interi- or do orifício se estendendo através dos penetradores de tecido 118, 120 e pode ser usado para conectar uma seringa ou tubo contendo uma solução deum agente de diagnóstico ou terapêutico.

O tubo de implantação exterior 122 tem um comprimento tubular que envolve o cateter central 112, os tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116, e o trilho do meio 132. O tubo de implantação 122 pode ser montado no componente do cateter central 112 e o par de tubos de a- presentação do penetrador de tecido 114, 116 para o movimento de desli- zamento para uma posição para frente do tubo de implantação 122, onde uma extremidade distal aberta 172 do tubo de implantação é posicionada adjacente à extremidade distal 148, 150 dos tubos de apresentação do pe- - netrador de tecido 114, 116, conforme mostrado na figura 27, e uma posição —paratrás do tubo de implantação 122, onde a extremidade distal do tubo 172 está posicionado adjacente à conexão dos tubos de apresentação do pene- trador de tecido 114, 116 com o componente do cateter central 112 mostra- do na figura 28. A extremidade proximal oposta 174 do tubo de implantação 122 pode ser fornecida com uma conexão mecânica 176 para o cateter cen- tral 112. A conexão mecânica 176 permite que o tubo de implantação 122 seja movido entre as suas posições para a frente e para trás em relação ao cateter central 112 e ao tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 (figuras 27 e 28). Tal conexão pode ser fornecida por uma roda de acio- namento manual, uma conexão de deslizamento, um gatilho ou botão, ou alguma outra conexão que seja operável manualmente para fazer com que o tubo de implantação 122 se mova em relação ao cateter central 112 e 114 e os tubos de apresentação 116. Quando o tubo de implantação 122 é movido para sua posição para frente mostrada na figura 27, a extremidade distal do tubo 172 passa por cima dos comprimentos dos tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 e move os tubos de apresentação para as suas posições restritas se estendendo ao longo dos lados opostos do trilho do meio do cateter central 132. Quando o tubo de implantação 122 é movido para a sua posição para trás mostrada na figura 28, a extremidade distal 172 do tubo de implantação é recolhido do comprimento dos tubos de apresenta- ção do penetrador de tecido 114, 116 e, gradualmente, permite que os tubos de apresentação 114, 116 liberem sua energia restrita e se movam para su- asconfigurações irrestrita curvadas, mostradas na figura 28.

No uso do cateter 110, o tubo de implantação 122 está na posi- ção para frente mostrada na figura 27. O fio guia 130 é posicionado em um tubo biológico (tal como uma artéria ou veia) em uma maneira conhecida. O cateter é então avançado para o tubo biológico sobre o fio guia. O fio guia 130 se estende do tubo biológico, e entra na extremidade distal do compo- nente do cateter central 126 através do lúmen do fio guia 128. O fio 130 a- travessa o comprimento do cateter central 112 e emerge na extremidade proximal do componente do cateter central adjacente às portas do cateter : 144, 146, onde o fio guia 130 pode ser manipulado manualmente. seo O cateter 110 pode ser avançado através do tubo biológico e É pode ser guiado pelo fio guia 130. Os marcadores rádio-opacos podem ser opcionalmente fornecidos na montagem para monitorar a posição da monta- gem no tubo biológico. Qualquer material que empeça a passagem de radia- ção eletromagnética é considerado rádio-opaco e pode ser usado. Os mate- riais radiopacos úteis incluem, mas não estão limitados a, platina, ouro ou prata. O material rádio-opaco pode ser revestido na superfície da totalidade ou em parte da ponta 126, na totalidade ou em parte dos tubos de apresen- tação 114, 116, na totalidade ou em parte dos penetradores de tecido 118, 120, no fio guia 130, ou em qualquer combinação das estruturas anteriores. Alternativamente, um anel do material radiopaco pode ser acoplado à ponta

126. A montagem pode ser, opcionalmente, fornecida com imagens acopla- das, como o ultrassom intravascular ou tomografia de coerência óptica. À ponta da montagem pode ser, opcionalmente, fornecida com lentes que são úteis para determinar a posição da montagem ou as características do tubo biológico circundante. Quando a montagem está a uma desejada posição, o tubo de implantação exterior 122 pode ser movido de sua posição para fren- te mostrada na figura 27 em direção a sua posição para trás mostrada na

| 109 figura 28 por manipulação manual da conexão mecânica 176.

" Como o tubo de implantação 122 é retirado do par dos tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116, a energia restrita dos tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 é liberada e os tubos se movem em direção as suas configurações irrestritas curvadas mostradas na figura 28. Este movimento posiciona os orifícios do penetrador de tecido 152, 154 nas extremidades distais do tubo do penetrador de tecido 148, 150 con- tra as superfícies interiores do tubo biológico no qual a montagem 110 foi inserida.

O movimento do operador para os controladores de movimento linear 162, 164 pode ser então operado manualmente para estender as ex- tremidades distais do penetrador de tecido 156, 158 dos orifícios do pene- trador de tecido 152, 154 nas extremidades distais do tubo apresentação do ã penetrador de tecido 148, 150. Um gauge pode ser fornecido em cada um do - 15 movimento do operador para controladores de movimento linear 162, 164 H que fornece uma indicação visual da extensão da projeção das pontas do penetrador de tecido 156, 158 das extremidades do tubo do penetrador de tecido 148, 150, enquanto os controladores 162, 164 são rodados. Os con- troladores também podem fornecer um som audível ou sentido tátil, como um clique, para indicar etapas de distância incrementais dos movimentos dos penetradores de tecidos. Isto implanta as pontas do penetrador de teci- do 156, 158 a uma distância desejada nas paredes do tubo biológico.

Em uma terceira modalidade específica, um dispositivo médico da presente invenção é um cateter de distribuição de fluido compreendendo um oumais penetradores de tecido construído de um material resistente fle- xível. Em certos aspectos, o dispositivo médico da presente invenção possui um eixo central longitudinal, e compreende um ou mais penetradores de te- cido, no qual um ou mais penetradores de tecido pode existir em uma confi- guração restrita na qual um comprimento de um ou mais dos referidos pene- tradores de tecidos é orientado substancialmente e paralelamente ao eixo longitudinal do referido dispositivo médico e uma configuração irrestrita na qual pelo menos uma porção do comprimento de uma ou mais dos referidos f penetradores de tecido é orientado substancialmente e não paralelamente : ao eixo longitudinal do dispositivo central.

Depois que o dispositivo é posi- cionado em um sítio alvo adjacente à parede de um tubo biológico, um ou mais dos penetradores de tecidos (e, se desejar, todos os penetradores de tecido) podem ser liberados de uma configuração restrita e permitidos a ado- tar uma configuração irrestrita entrando, assim, em contato com a parede do tubo biológico.

Um ou mais dos penetradores de tecido pode ser de qualquer forma, e em modalidades preferidas, o movimento de um ou mais dos pene- tradores de tecido da configuração restrita para a configuração irrestrita o- corresob a liberação de uma força restrita pelo operador do dispositivo, mas sem a entrada pelo operador de quaisquer forças deformadoras no dispositi-

vo ou no tecido-alvo.

Em uma modalidade preferida, os penetradores de tecido são : construídos de material resistente flexível que é capaz de ser restrito sob a - 15 aplicaçãode uma força de restrição, por exemplo, quando os penetradores é de tecido estão na configuração restrita, e adotam sua forma original irrestri- ta, quando a força restrita é removida, por exemplo, quando os penetradores de tecido estão na configuração irrestrita.

Quaisquer desses materiais resis- tentes flexíveis podem ser usados incluindo, mas não se limitado a, aço ci- rúrgico, alumínio, polipropileno, materiais olefínicos, poliuretano e outras bor- rachas sintéticas ou materiais plásticos.

Um ou mais dos penetradores de tecido são mais preferivelmente construídos de material com memória de forma.

Exemplos de tais materiais com memória de forma incluem, mas não estão limitados a, ligas de cobre-zinco-alumínio-níquel, ligas de cobre- —alumínio-níquel, e ligas de níquel-titânio (NiTi). Em uma modalidade preferi- da, o material com memória de forma é o nitinol.

Em uma modalidade prefe- rida, quando os penetradores de tecido assumem a configuração irrestrita, as propriedades de memória de forma do material do qual cada penetrador de tecido é formado, faz com que os penetradores de tecido, sem a aplica- ção de qualquer força deformadora externa, movam de uma posição subs- tancialmente paralela ao eixo longitudinal do dispositivo médico para uma posição substancialmente perpendicular ao eixo longitudinal do dispositivo f médico.

é: Em uma modalidade preferida, os penetradores de tecido são mantidos na configuração restrita por um componente do cateter exterior tendo uma configuração tubular que envolve os penetradores do tecido. Uma conexão mecânica é fornecida entre o componente do cateter exterior e o componente do cateter central para o qual os penetradores de tecido são acoplados. A conexão mecânica permite que o componente do cateter exte- rior seja movido para trás ao longo do comprimento do componente do cate- ter central, descobrir assim um ou mais dos penetradores de tecidos restritos e permitindo que um ou mais dos penetradores de tecidos assumam uma configuração irrestrita onde fazem contato com o sítio de distribuição alvo. Um especialista na técnica apreciaria que esta modalidade específica pode ser de imediato adaptada para incorporar marcadores radiopacos para facili- : tar o posicionamento do dispositivo ou alteração rápida das características - 15 parafacilitaro uso do dispositivo.

À O dispositivo médico da presente invenção, em suas várias mo- dalidades, permite a distribuição de fluidos em camadas distintas da parede vascular. A parede vascular consiste de numerosas estruturas e camadas, estruturas e camadas incluindo a camada endotelial e a camada da mem- brana basal (coletivamente a camada íntima), a lâmina elástica interna, a camada medial e a camada adventícia. Estas camadas são organizadas de tal forma que o endotélio é exposto ao lúmen do vaso e a membrana basal, a íntima, a lâmina elástica interna, a média e a adventícia cada uma é su- cessivamente colocada em camadas sobre o endotélio, como descrito na publicação do pedido de patente U.S. nº 2006/0189941A1. Com os dispositi- vos médicos da presente invenção, a profundidade para a qual as pontas dos penetradores de tecido 156, 158 podem penetrar no tecido-alvo pode ser controlado pela rotação dos controladores 162, 164. Por exemplo, se a camada-alvo for a camada adventícia, a energia restrita dos tubos de 114, 116 é liberada, os tubos adotam suas configurações irrestritas curvadas mostradas na figura 28, e as pontas dos penetradores de tecido 156, 158 são avançados com os controladores para um comprimento suficiente para

| 112 E penetração na profundidade da camada adventícia. Da mesma forma, se a Sê camada alvo for a camada média, a energia restrita dos tubos 114, 116 é liberada, os tubos adotam suas configurações irrestritas curvadas mostradas na figura 28, e as pontas do penetrador de tecido 156, 158 são avançadas comos controladores para um comprimento suficiente para a penetração na profundidade da camada média.

Com os penetradores de tecido embebidos na camada desejada da parede do tubo biológico, um fluido pode ser distribuído assim através dos penetradores de tecido 118, 120. Quando a distribuição do fluido é com- pleta, os controladores 162, 164 podem ser operados para retirar as pontas do penetrador de tecido 156, 158 de volta para o orifício interior 152, 154 dos tubos apresentação do penetrador de tecido 114, 116. O tubo de implanta- ção 122pode ser então movido para sua posição para a frente, onde a ex- : tremidade distal do tubo de implantação 172 move os tubos de apresentação do penetrador de tecido 114, 116 de volta a suas posições restritas mostra- : das na figura 27. Quando o tubo de implantação 122 foi movido para sua posição para frente total mostrada na figura 27, a montagem pode então ser reposicionada ou retirada do organismo.

O dispositivo médico da presente invenção também permite a distribuição de fluidos para depósitos de placas no interior da parede do tubo biológico ou dentro da parede do tubo biológico.

O dispositivo médico da presente invenção permite também a distribuição de fluidos para os espaços extracelulares ou tecidos situados fora da parede externa do tubo biológico (por exemplo, para a superfície ex- teriorde um vaso sanguíneo ou para o músculo posicionado contra a super- fície externa do vaso, tais como o miocárdio).

Uma característica vantajosa dos dispositivos da presente in- venção é que os atuadores, por força do seu desenho, fazem contato com menos do que a circunferência completa da parede interna de um tubo bio- lógico após suas implantações no mesmo. Em modalidades preferidas, os atuadores fazem contato com menos de 100% da circunferência da parede interna de um tubo biológico em que estão implantados. Mais preferencial

' 113 E mente, os atuadores fazem contato com menos de 75%, 50% ou 25% da circunferência da parede interna de um tubo biológico no qual são implanta- dos. Mais preferivelmente, os atuadores fazem contato com menos de 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% ou 0,1% da circunferência da parede interna de um tu- — bobiológico em que estão implantados.

Os dispositivos podem ser usados para distribuírem fluidos com- preendendo uma variedade de agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico pa- ra uma parede de um tubo biológico. Os agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados à, proteínas, substâncias químicas, pequenas molécu- las, células e ácidos nucleicos. Um agente terapêutico distribuído pelo dis- positivo pode incluir uma micropartícula ou uma nanopartícula, ser composto com uma micropartícula ou uma nanopartícula, ou ser ligado a uma micro- partícula ou uma nanopartícula. Os agentes da proteína incluem elastases, : agentes antiproliferativos, e agentes que inibem o vasoespasmo. O uso dos - 15 dispositivos para a distribuição de uma elastase é especificamente contem- í plado. Vários pedidos de patente publicados (WO 2001/21574; WO 2004/073504; e WO 2006/036804) ensinam que a elastase, isoladamente e em combinação com outros agentes, é benéfica no tratamento de doenças de tubos biológicos, incluindo a obstrução de tubos biológicos e vasoespas- mo.Os agentes de diagnóstico incluem, mas não estão limitados a, contras- te, micropartículas, nanopartículas ou outros agentes de imagem.

Uma variedade de métodos de distribuição de fluido distintos pode ser praticada com o dispositivo. Em certas aplicações, os fluidos distin- tos podem ser distribuídos através de cada penetrador de tecido do disposi- tivo simultaneamente ou sequencialmente. Em outras aplicações, o mesmo fluido pode ser distribuído por ambos os penetradores de tecido simultanea- mente ou sequencialmente. As modalidades e/ou os métodos em que um primeiro fluido é distribuído através de ambos os penetradores de tecido se- guido pela distribuição de um segundo fluído através de ambos os penetra- dores de tecidotambém estão contemplados.

Os métodos para usar os dispositivos para distribuir os fluidos dentro ou através de uma parede de um tubo biológico também são especifi-

| 114 f camente contemplados. Estes métodos compreendem as etapas de introdu- : ção do dispositivo no tubo biológico, avançar o dispositivo para um sítio alvo dentro do tubo, liberando os atuadores de suas posições restritas, opcional- mente avançando os penetradores de tecido através de lumens nos atuado- res para penetrar a uma profundidade desejada na parede de um tubo bioló- gico, distribuindo, pelo menos, um fluido dentro ou através da parede, opcio- nalmente retornando os penetradores de tecido de volta para dentro dos lu- mens dos atuadores, retraindo os atuadores para suas posições restritas, reposicionando o dispositivo no mesmo tubo ou em tubo diferente para a distribuição do fluido adicional, se assim desejado, e remover o dispositivo do tubo.

6. EXEMPLOS Esta seção descreve os métodos para produção da elastase tipo | | recombinante para uso clínico, por exemplo, como um agente para aumen- taro diâmetro dos vasos sanguíneos e, com isso, o lúmen dos vasos san- Ã guíneos. Elastasepancreática tipo | humana exibe 89% de identidade de a- minoácido em todo o comprimento total da elastase pancreática tipo | porci- na, com completa conservação da "tríade catalítica" e resíduos de determi- nação de especificidade de substrato. Elastasetipo | porcina é inicialmente sintetizada como uma pró-enzima enzimaticamente inativa que é ativada pela tripsina para produzir a enzima madura que contém quatro ligações de dissulfeto interna e sem glicosilação (ver Shotton, 1970, Methods Enzymol 19:113-140, Elastase; e Hartley e Shotton, 1971, Biochem. J. 124(2): 289- 299, Elastase Pancreática. As enzimas 3:323-373 e referências das mes- mas) Os exemplos abaixo demonstram o desenvolvimento de esque- mas de purificação e expressão da elastase tipo | humana e porcina recom- binante escalonáve! e eficientes adequados para a fabricação cGMP destas enzimas para estudos clínicos e não-clínicos e o uso comercial farmacêutico.

— Elastaseporcina madura foi chamada de PRT-102. Elastasetipo | humana madura foi chamada de PRT-201.

6.1 TERMINOLOGIA E ABREVIAÇÕES

Í 115 7 Conforme usado aqui, os termos PRT-101, PRT-102, PRT-201 e E pró-PRT-201 devem dizer o que se segue: PRT-101: elastase pancreática porcina. Salvo indicação em con- trário, a elastase pancreática porcina empregada nos exemplos é a elastase pancreática porcina altamente purificada comprado de Elastin Products Company, Inc, Owensvílle, MO, catálogo % EC134.

PRT-102: elastase pancreática porcina tipo | recombinante ma- dura. Deve-se observar que os vetores com a designação "PPROT101-XXX" codificam a PRT-102.

PRT-201: o elastase pancreática humana tipo | recombinante madura.

pró-PRT-201: pró-enzima forma da elastase pancreática tipo | humana recombinante contendo uma sequência de pró-peptídeo.

- As seguintes abreviações são utilizadas na Seção 6 do pedido: ss BKGY: meio complexo do glicerol tamponado BKME: meio complexo do metanol tamponado CHO: ovário de hamster chinês E. coli: Escherichia coli ELA-1: elastase pancreática tipo | HEK: rim de embrião humano hELA-1: ELA-1 humana HIC: cromatografia de interação hidrofóbica MBP:: proteína de ligação da maltose PELA-1: ELA-1 porcina P. pastoris: Pichia pastoris PCR: reação em cadeia da polimerase PMSF: flúor fenilmetilsulfonil RP: fase reversa S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio SEC: cromatografia por exclusão de tamanho

| | 116 É USP: United States Pharmacopeia é YPDS: meio de extrato de levedura sorbitol dextrose peptona

6.2 EXEMPLO 1: SÍNTESE DO DNA DA ELASTASE A sequência de codificação da elastase-1 humana foi obtida da Patente U.S. Nº 5162205 (Takiguichi et a/., 1992). Várias alterações na se- quência foram feitas para facilitar a clonagem em vetores de expressão (figu- ra 1A). As mudanças da base enquadram-se na degeneração do código ge- nético de modo que nenhum resíduo de aminoácido foi alterado. Um segun- do códon de parada foi adicionado imediatamente após o códon de parada nativo para minimizar a leitura potencial do ribossomo. A sequência de codificação modificada foi sintetizada pela Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA) usando uma técnica não-PCR "longo oli- go" sob licença da Amgen (Thousand Oaks, CA). O DNA recombinante, : chamado ELA-1.2A (SEQ ID NO: 81), foi clonado no vetor Blue Heron pUC, - 15 umderivadodopUC119,e o plasmídeo resultante foi chamado de pPPROT1. : O pPROT1 foi sequenciado em ambos os filamentos para confirmar a se- quência correta. Os dados de sequenciamento de alta qualidade com exten- siva sobreposição em ambos os filamentos permitiram atribuições de base inequívocas em toda a sequência, que foram cobertas por um mínimo de quatro reações de sequenciamento com pelo menos uma reação para cada filamento.

6.3 EXEMPLO 2: EXPRESSÃO DO PRT-201 NA E.COLI Uma variedade de estratégias de expressão foi tentada em um esforço para obter elastase humana solúvel e enzimaticamente ativa em E. coli Um conjunto de vetores de expressão da E. coli compreendeu fusões de estrutura de elastase pancreática tipo | humana (ELA-1) com a terminação carbóxi da proteína de ligação à Maltose (MBP) que por sua vez foi fundida a um peptídeo de secreção N-terminal. Tanto as sequências de codificação da pró-enzima e ELA-1 humana madura foram clonadas como fusões de estrutura C-terminal para a sequência de codificação MBP do plasmídeo pMAL-p2G (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) para produ-

Pa 1n17 f zir ou o PPROT3 (ELA-1 madura) ou o pPROTS5 (pró-enzima ELA-1). A cons- trução do pPROT3 foi realizada inicialmente obtendo da mutagênese por PCR um fragmento codificado pela ELA-1 humana madura 6,6 kb com um sítio SnaBl no códon da valina N-terminal da ELA-1 humana madura e um sítio Hindlll localizado a 3' aos códons da terminação da ELA-1 madura.

Es- ta mutagênese por PCR usou um modelo pPROT1 compreendendo as se- quência de codificação da ELA-1.2A (SEQ ID NO: 81) e dois iniciadores de oligonucleotídeos (5' ATC TAC GTA GTC GGA GGG ACT GAG, GCC, SEQ ID NO: 75; e 5' gtc gac aag ctt atc agt tag agg cega t, SEQ ID NO: 76). O fragmento da PCR 6,6 kb resultante foi isolado, digerido com SnaBlI e Hindll- 1, e subsequentemente clonado em Xmal/Hindlll digerido pelo vetor pMAL- p2G para produzir o pPROT3. A construção do pPROTS foi realizada clo- nando o fragmento Scal/Hindlll do pPPROT1 e se ligando dentro do vetor : PMALp2G que tinha sido digerido com SnaBlI e Hindlll.

A fusão resultante —operacionalmente liga o N-terminal da região que codifica a pró-enzima ELA- í 1 humana ao C-terminal do MBP do pMAL-p2G em pPROTS.

O domínio de * clivagem da tripsina da pró-proteina ELA-1 humana é preservado em p- PROTS5. : A cepa de E. coli TB1 foi transformada com pPROT3 e pPROTS e, subsequentemente, induzida com IPTG para determinar se a proteína de fusão ou a ELA-1 humana enzimaticamente ativa poderiam ser produzidas.

No caso da pPROT3, todas as proteínas de fusão MBP-ELA-1 produzida era insolúvel.

Nenhuma proteína de fusão MBP-ELA-1 enzimaticamente ativa ou solúvel foi detectada no material periplásmico obtido por choque osmótico da E. colicontendo pPPROT3 induzida.

No caso do pPROTS, os níveis baixos da proteina MBP-proELA-1 recombinantes solúveis podem ser detectados no material periplásmico obtido por choque osmótico da E. coli contendo p- PROTS induzida através do uso do SDS-PAGE e coloração por Coomassie ou pelo uso de anticorpos anti-MBP em um Western blot (New England Bio- labs,Inc., Beverly, MA). A proteína MBP-proELA-1 recombinante solúvel po- de ser digerida com tripsina para produzir tanto o MBP quanto a ELA-1 ma- dura humana.

A ELA-1 humana madura obtida por induções de pPROTS foi

"OS 118 Ss: subsequentemente analisada para a atividade de elastase com substrato de Sã peptídeo SLAP. A atividade da elastase foi observada em extratos periplás- micos do pPROTS5. Esta atividade enzimática da elastase era dependente da ativação da tripsina (isto é, nenhuma atividade foi observada na ausência da tripsinae a quantidade de atividade é aumentada pelo aumento do período de ativação da tripsina). Além disso, a atividade de elastase era dependente de pPROTS5 à medida que nenhuma atividade foi observada nos extratos do controle do vetor pMAL-p2G tratados em paralelo com a tripsina. Finalmente, a atividade da elastase pPROTS foi inibida por PMSF (um inibidor conhecido daprotease de serina).

A proteína de fusão MBP-proELA-1 recombinante foi subsequen- temente purificada e clivada com tripsina para obter uma ELA-1 humana madura derivada do pPPROTS5 enzimaticamente ativa. A proteína de fusão foi : purificada em cromatografia de afinidade em amilose, seguida por eluição - 15 commaltose. O MBP-proELA-1 purificado foi então tratado com tripsina imo- À bilizada. Após a etapa de ativação da tripsina, o MBP-proELA-1 clivado foi * purificado por cromatografia por troca catiônica SP Sepharose. Entretanto, experimentos subsequentes com ELA-1 humana madura derivada da p- é PROTS de afinidade purificada indicam que apenas quantidades muito limi- tadas de elastase enzimaticamente ativa e solúvel pode ser obtida da E. coli contendo a pPROTS5. Além disso, a atividade específica da ELA-1 humana madura derivada da pPROTS5 de afinidade purificada era muito baixa, vari- ando de 0,27-0,38 U/mg (U = micromol do substrato SLAP hidrolisado por minuto).

Uma estratégia alternativa para obter a ELA-1 enzimaticamente ativa e solúvel em E. coli também foi buscada. Em resumo, o vetor pPPROT8 que codifica uma proteína de fusão compreendendo os primeiros oito resí- duos de aminoácidos da subunidade alfa lacZ da E. coli mais 5 aminoácidos dos resíduos codificados pelo poliligante seguido pela pró-enzima N- terminal ELA-1 humana foi construído. Este vetor foi construído ligando um fragmento BamHI/Ncol contendo a sequência de codificação da ELA-1 hu- mana do pPROT1 (ou seja, um vetor contendo a sequência ELA-1.2A, SEQ

O 119 É 1D NO: 81) ao pBlueHeron pUC (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA, . USA), que foi digerido com BamHI/Ncol. A cepa EC100 da E. coli (EPICENTRE Biotechnologies, Madi- son, WI) foi transformada com pPROT8 e, subsequentemente, induzida com IPTG para determinar se a proteína de fusão ou a ELA-1 humana enzimati- camente ativa poderia ser produzida. No caso de células transformadas EC100, todas as proteína de fusão LacZ-proELA-1 derivadas do pPROT8 eram produzidas insolúveis (ou seja, encontradas em organismos de inclu- são). Uma cepa de E. coli contendo mutações nos genes trxB e gor (A cepa Origami?, Takara Mirus Bio, Inc., Madison, WI) foi subsequentemente trans- formada com pPROTB8 visto que é conhecido que as cepas da E. coli com mutações nessas sequências de codificação promovem a recuperação de proteínas recombinantes enzimaticamente ativas e solúveis. Embora algu- : mas proteínas de fusão LacZ-proELA-1 derivados de pPROT8 solúvel na - 15 cepa trxB/gor cepa da E. coli tenham sido recuperadas na indução com À IPTG, ela não poderia ser convertida para ELA-1 humana enzimaticamente fe ativa com tripsina.

6.4 EXEMPLO 3: EXPRESSÃO DA PRT-201 EM LINHAGENS CELULA-

Ê RES DE MAMÍFEROS Várias estratégias de expressão foram tentadas em um esforço para obter elastase pancreática tipo | humana enzimaticamente ativa e solú- vel (ELA-1) em linhagens celulares de mamíferos. O vetor pcDNA3.1 (Invi- trogen) de expressão de mamífero de alta cópia contendo o promotor CMV foi usado como uma espinha dorsal para dois vetores de expressão da elas- tase ELA-1 humana, pPROT30 e pPROT31. Para construir o pPROT30, se- quência da pró-enzima ELA-1 humana foi amplificada por PCR e fundida a uma sequência sinal da elastase pancreática porcina incorporado no inicia- dor dianteiro da PCR. Usando sítios de restrição incorporados nos iniciado- res da PCR, o produto da PCR foi digerido e ligado usando os correspon- dentes sítios de restrição no vetor pc/DNA3.1. O pPROT31 foi construído de forma semelhante, exceto que a sequência de codificação da ELA-1 madura humana foi usada em vez da sequência de codificação da pró-enzima em

E 120 uma tentativa de direcionar a expressão da enzima madura. A E. coli foi : transformada com as reações da ligação e clones foram selecionados para a triagem de minipreparação. Um clone para cada vetor de expressão foi sele- cionado com base nos padrões de digestão de restrição esperado para a inserção correta. O DNA plasmidial foi preparado para cada clone e as se- quências de codificação do vetor de expressão foram confirmadas pelo se- quenciamento de DNA. As linhagens celulares de mamífero CHO, COS, HEK293 e HEK293T foram transfectadas transitoriamente e separadamente com p- PROT30 e pPROT31. Depois de vários dias, os sobrenadantes da cultura celular foram colhidos e analisados para expressão da pró-proteína ELA-1 humana (pPROT30) ou da proteína madura (pPROT31) por Western blot. Um anticorpo policlonal da elastase pancreática anti porcina foi reagido de : forma cruzada com uma banda de peso molecular esperada para a pró- - 15 proteina ELA-1 humana em sobrenadantes pPPROT30 e para a proteína E- É LA-1 humana madura em sobrenadantes pPROT31. " Os sobrenadantes pPROT30 e pPROT31 foram analisados para a atividade da elastase por análise SLAP. Para o pPROT30, os sobrenadan- Á tes foram inicialmente tratados com tripsina para converter a pró-enzima pa- raPRT-201 maduro. Nenhuma atividade da elastase foi detectada em qual- quer um dos sobrenadantes para qualquer vetor usando a análise SLAP.

6.5 EXEMPLO 4: EXPRESSÃO DA PRT-201 ATIVADA PELA TRIPSINA EM P. PASTORIS O vetor para a expressão secretada da P. pastoris, PV-1, foi sin- tetizado pela Blue Heron e usado para primeiro clonar a sequência de codifi- cação da ELA-1 humana do tipo selvagem. O vetor PV-1 foi desenhado para simples clonagem, seleção e expressão de alto nível da proteína recombi- nante. O vetor contém o gene de resistência Zeocinº para seleção direta de integrantes multicópia. A fusão do N-terminal do pró-peptídeo da elastase a uma sequência do tipo fator a de cruzamento da levedura, compreendendo o sinal de secreção da levedura, o pró-peptídeo e as sequências espaçadoras, conforme mostrado na figura 1B, permite a secreção das proteínas expres-

oO 121 É sas nos meios de cultura. A pró-proteína elastase secretada pode ser facil- : mente separada dos grânulos da célula, um primeiro passo importante na direção da purificação. Adicionalmente, a forma da pró-enzima da ELA-1 humana contendo o sítio de clivagem da tripsina foi selecionada para a ex- pressão para evitar expressar diretamente a enzima madura ativada que pode levar ao dobramento incorreto de proteínas ou à toxicidade para as células que expressam a enzima recombinante. A clonagem da expressão constrói a pPROT24-V para dirigir a expressão da pró-enzima ELA-1 foi realizada da seguinte forma. A região codificadora da ELA-1 humana, (SEQ ID NO: 81) foi amplificada a partir do Blue Heron pUC ELA-1 por PCR (Expand High Fidelity PCR System, Roche, Indianápolis, IN). O iniciador dianteiro 20F incorporou um sítio Xhol(5'ggctegagaaaagagaggctgaagetactcaggaccttccggaaaccaatgcecga-3', - SEQ ID NO: 35) O primer 24R incorporou um sítio Sacll (5'- - 15 gggccgegacttateagttagaggegatgacat-3';, SEQ ID NO: 36). O produto da PCR resultante foi purificado em gel e clonado no pCR2.1-TOPO (Invitrogen). À - sequência de codificação da ELA-1 foi isolada usando Xhol e Sacll, purifica- do em gel, e clonada no vetor PV-1 nesses sítios para produzir o pPROT24- É V (figura 3).

O produto ligado ao pPROT24-V foi amplificado em cepa TOP10 da E. coli. A mistura de células foi plaqueada em placas LB de baixo sal su- plementada com 25 microgramas/mL de Zeocin. O DNA plasmidial foi prepa- rado (Qiagen, Valencia, CA) e a inserção da ELA-1 humana foi identificada pela digestão de restrição. A sequência de codificação do pPROT?24 foi veri- ficada por sequenciamento de ambos os filamentos de DNA purificado com maxi-preparação com múltiplas reações sobrepostas. Os dados de sequen- ciamento de alta qualidade permitiram atribuições de base ambíguas e con- firmou a sequência correta de codificação. Os estoques de glicerol do p- PROT24-V/ITOP10 foram feitos e armazenados a -80ºC.

A cepa NRRL Y-11430 da P. pastoris tipo selvagem obtida do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, Peoria, IL, EUA) foi utilizada para a transformação. O DNA plasmídico do pPROT24-V foi |li-

o 122 nearizado com Sacl e a digestão completa foi confirmada pela execução de uma pequena alíquota da reação em gel de agarose. A eletroporação foi u- sada para transformar a P. pastoris com DNA plasmidial pPPROT24-V. As misturas de células foram plaqueadas em placas YPDS contendo 100 mi- crogramas/mL de Zeocina. Depois de três dias, as colônias começaram a se formar e foram selecionadas ao longo de vários dias a mais para riscar no- vamente em placas frescas. Em geral, os transformantes resistentes a medicamentos foram selecionados para a expressão em 1L do balão de Erlenmeyer. Uma única colôniafoi usada para inocular 200 mL do meio BKGY. Composição da solu- ção BKGY foi a seguinte: 10 g/L de glicerol, 13,4 g/L de base nitrogênio de levedura com sulfato de amônio e sem aminoácidos (Invitrogen), 20 g/L de peptona de soja, 10 g/L de extrato de levedura, 0,4 mg/L de biotina em 0,1 M de tampão fosfato de potássio (pH 5,0). A cultura cresceu durante dois dias - 15 a28ºC com agitação a 275 rpm. As culturas foram granuladas por centrifu- Ê gação a 650xg por 10 min em temperatura ambiente. Os grânulos das célu- . las foram ressuspensos com meios de indução BKME, pH 5,0, ressuspen- dendo os grânulos na proporção de 1 g de células úmidas a 5 mL de meio É de indução. Uma suspensão celular de 50 mL foi colocada em um balão não Erlenmeyer de 500 mL para obter uma razão de 1:10 de suspensão celular para volume de balão. As células foram incubadas a 22ºC com agitação a 275 rpm durante 1-3 dias. O metanol no meio de indução foi reposto a uma concentração final de 0,5%, duas vezes por dia ao longo do curso da indu- ção.

Ao selecionar para a expressão 1 mL de alíquotas foi retirada, transferida para 1,5 mL de tubos de microcentrífuga e centrifugada por 5 min a 20.000 xg em uma microcentrífuga. Os sobrenadantes foram transferidos para tubos frescos e armazenados a -80ºC. Para a análise SDS-PAGE, as alíquotas sobrenadantes foram descongeladas e misturadas com tampão 4X Laemmlisuplementados para 5% de volume com o agente de redução beta- mercaptoetanol. As amostras foram fervidas por 5 min, gentilmente centrifu- gadas, e carregadas em 8-16% do gradiente Tris-HCI pré-moldado em gel

À í 123 A em um sistema de eletroforese Criterion (Bio-Rad). Após a eletroforese, o . gel foi manchado com Coomassie e analisado para a expressão da pró- enzima ELA-1 humana. O clone 201-24-266-VU foi selecionado como um clone de alto rendimento para avaliação posterior. Um banco de células de — desenvolvimento consistindo por estoques de glicerol 201-24-266-VU foi preparado e armazenado em -80ºC.

Para a produção ampliada da pró-enzima ELA-1 humana usando o clone 201-24-266-VU, várias execuções de produção foram realizadas que geralmente seguiram os métodos descritos abaixo. Quando aplicável, as variações de execução-para-execução nos métodos são observadas.

Para a cultura celular, uma série de balão de agitação de Erlen- meyer de 2 L (tipicamente variando de 20-40 balões) contendo meio de cul- tura de 500 mL BKGY foram inoculadas com 250 microlitros de estoque de : glicerol 201-24-266-VU descongelado. As culturas foram crescidas a 28ºC - 15 pordoisdiasem uma incubadora de agitação a 250 - 300 rpm. Depois de Ê dois dias, as células foram granuladas por centrifugação e o sobrenadante - foi descartado. As células foram ressuspensas em meio de indução BKME, pH 5,0, a uma taxa de 1 g de peso celular para 5 mL de meio. Um volume de : 200-400 mL de suspensão celular foi colocado em 2 L de balão não Erlen- meyere cultivado por três dias em um incubador de agitação (250-300 rpm) a 22ºC. O metanol no médio foi reposto a 0,5% do volume duas vezes por dia durante o curso de indução. No final da indução, as culturas do frasco agitado foram centrifugadas para granular as células. O sobrenadante foi removido e imediatamente filtrado em temperatura ambiente através de uma membrana de polietersulfona de 0,22um usando 1L de unidades de filtração a vácuo para remover qualquer detritos celulares restantes. O filtrado foi ar- mazenado a 2-8ºC por até 1,5 mês. Com base na análise HIC-HPLC, o ren- dimento da pró-enzima ELA-1 humana do clone pro-PRT-201-24-266-VU no sobrenadante clarificado foi tipicamente de 200 a 250 mg/l.

A captura do pro-PRT-201-24-266-VU do sobrenadante foi reali- zada como se segue. Primeiro, o sobrenadante de várias rodadas de cultu- ras do frasco agitado (tipicamente 4 a 10 rodadas) foi combinado (tipicamen-

oO 124 e te 8 a 25 L total), diluído oito vezes com água e ajustado ao pH 5,0 com 1 M : de HCl. O sobrenadante diluído foi então carregado em uma coluna de cap- tura de troca iônica Macro-Prep High S de volume de leito de 2 L equilibrado a 2-8ºC a uma taxa de 100 mL/min (taxa de fluxo linear 76 cm/h). O progra- made cromatografia compreendeu as seguintes etapas: 1. Coluna de lava- gem com 10 L (5 volumes de coluna [CVs]) de Tampão A (20 mM de citrato de sódio, pH 5,0.) a 100 mL/min (76 cm/h); 2. Colunas de lavagem com 4 L (2 CVs) de uma mistura de 90% de Tampão A e 10% do Tampão B (500 mM de cloreto de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0) para uma composi- çãode tampão final de 50 mM de cloreto de sódio, 20 mM de citrato de só- dio, pH 5,0 a 100 mL/min (76 cm/h); 3. Coluna de lavagem com 6 L (3 CVs) de uma mistura de 80% do Tampão A e 20% do Tampão B para uma com- posição de tampão final de 100 mM de cloreto de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0 em 100 mi/min (76 cm/h); 4. Coluna de lavagem com 6 L (3 - 15 CVs), de um gradiente linear, começando a partir de 75% do Tampão A e À 25% do Tampão B a 68% do Tampão A e 32% do Tampão B, a 100 ml/min - (153 cm/h); 5. Eluir com um gradiente linear de 30 L (15 CVs) começando a partir de 68% do Tampão A e 32% do Tampão B a 0% do Tampão A e 100% É do Tampão B, a 100 ml/min (76 cm/h). O eluato foi coletado em frações de —500-1000 mL cada.

Tipicamente, duas espécies de proteína predominante foram ob- servadas por SDS-PAGE seguido de coloração por Coomassie: a pró- enzima ELA-1 humana glicosilada e a pró-enzima ELA-1 humana não- glicosilada, conforme determinado pela subsequente análise LC/MS, tipica- mente eluídaem cerca de 320 mM de cloreto de sódio, mostrado na figura 4. Em algumas execuções de produção uma proteína ligeiramente menor do que a pró-enzima ELA-1 humana foi observada como uma espécie menor. À subsequente análise LC/MS dessas frações mostrou que a maioria das pro- teínas não era pró-enzima de sequência completa, mas em vez disso estava faltando vários aminoácidos no N-terminal. Essas variantes N-terminal foram purificadas e submetidas à análise da atividade da elastase, que revelou que elas tinham menor atividade da elastase do que a PRT-201 de sequência o 125 ' completa. As variantes N-terminal podem originar da pró-enzima ELA-1 hu- mana exibindo um nível baixo de atividade da elastase durante a cultura ce- lular e operações de cromatografia de captura e clivando a si própria através de uma reação intramolecular ou clivando outra molécula da pró-enzima E- LAI humana através de uma reação intermolecular. As condições de cliva- gem não-satisfatórias durante essas operações podem levar a um nível ele- vado de clivagem imprecisa da pró-enzima (às vezes referida como conver- são espontâneas ou não controlada), resultando na maior parte em variantes N-terminal, ao invés de PRT-201 inteiras, de sequência completa.

Após a inspeção dos resultados SDS-PAGE, um subconjunto de frações foi agrupado para obter pró-PRT-201 não glicosilado purificado para processamento posterior. As frações contendo pró-enzima glicosilada ou PRT-201 de sequência completa e/ou variantes N-terminal (que co-migram : em SDS-PAGE) foram tipicamente excluídas do agrupamento. O pró-PRT- - 15 201 agrupado foi tipicamente armazenado em uma proveta de plástico de 5 õ L a 2-8ºC por várias horas durante a noite antes da conversão da pró- - enzima para enzima madura. A conversão da Pró-PRT-201 para PRT-201 madura pela tripsi- na imobilizada foi realizada como se segue. As frações da pró-PRT-201 a- grupadas foram dialisadas em 20 mM de fosfato de sódio, pH 5,0, durante a noite a 2-8ºC. Esta etapa prepara para a remoção do citrato, que inibe a trip- sina. Após a diálise, a pró-PRT-201 passou por uma coluna de tripsina re- combinante (TrypZean) imobilizada para contas de agarose pré-equilibradas com 20 mM de fosfato de sódio, pH 5,0. Tipicamente, o tempo de contato entreapró-PRT-201 e o TrypZean imobilizado era de 3,5 a 5 min. O material pós-conversão resultante foi analisado por SDS-PAGE para confirmar a con- versão e, subsequentemente, carregados em uma coluna aperfeiçoada Ma- cro-Prep High S. A coluna foi lavada sequencialmente com 5 CVs de 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0; 2 CVs de 20 mM de citrato de sódio, 50 mM de cloreto de sódio, pH 5,0; e 3 CVs de 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, pH 5,0. A coluna foi lavada ainda com um gradiente linear de 125 mM de cloreto de sódio a 160 mM de cloreto de sódio em 20 mM de tda 126 F citrato de sódio, pH 5,0. A PRT-201 foi eluída em um gradiente linear de 165 - mm a 500 mM de cloreto de sódio em 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0 e coletada em frações. As frações foram analisadas para proteína por SDS- PAGE seguida de coloração por Coomassie e para atividade de elastase por análise SLAP. Tipicamente, as frações com uma atividade específica de 90% ou maior do que a da fração com maior atividade específica foram a- grupadas. Em subsequente análise LC/MS, as frações de eluição tardia com menor atividade específica revelou ser enriquecida em variantes N-terminal PRT-201.

Frações agrupadas com alta atividade específica foram diafiltra- das em tampão de formulação composta de 0,1X PBS (13,7 mM de cloreto de sódio, 1 mM de fosfato de sódio, 0,27 mM de fosfato de potássio) em pH 5,0. Após a concentração da PRT-201 para Img/mL, o pH foi ajustado para : TA. A solução foi então aliquotada em frascos de vidro de soro com uma - 15 rolhade elastômero e liofilizado. A liofilização foi tipicamente realizada com É um ciclo de secagem primária de -30 a -50ºC e um ciclo de secagem secun- - dário a -15ºC. Após a liofilização, os frascos foram fechados sob vácuo e frisado com um selo de alumínio. Os frascos foram, então, tipicamente ar- É mazenados a 2-8ºC ou -80ºC.

Para avaliar a estabilidade da PRT-201 liofiizada em frascos, dois lotes que foram fabricados em produto de medicamento GMP estéril foram colocados em um programa de estabilidade. O programa de estabili- dade consiste no armazenamento do produto medicamentoso a -15ºC e re- moção periódica de um subconjunto de frascos para o teste pelos seguintes métodos analíticos indicando estabilidade (as especificações estão entre parênteses): aparecimento de material liofilizado (pó branco a esbranquiça- do), aparecimento após a reconstituição (solução incolor, clara, livre de par- tículas), atividade específica pela análise SLAP (25-45 U/mg), pureza por RP-HPLC (pureza total: não inferior a 93%; impureza individual: não mais de 2%), pureza pela redução SDS-PAGE (não inferior a 93%), pureza pela não- redução SDS PAGE (não inferior a 93%), injeções de matéria particulada (conforme USP), agregados por SEC-HPLC (não superior a 3%), conteúdo

' : 127 õ por frasco (4,5-5,5 mg), pH (6,5-8,5), umidade (não superior a 5%) e esterili- - dade (conforme USP). Até hoje, ambos os lotes atenderam às especifica- ções indicadas em todos os pontos testados (lote CO807117 por 12 meses e lote C1007132 por 9 meses). Estes resultados indicam que a PRT-201 é es- tável por pelo menos 12 meses quando armazenada liofilizada em frascos a -15ºC.

O uso de citrato de sódio, pH 5,0, durante a cromatografia de captura da pró-PRT-201 e a cromatografia aperfeiçoada da PRT-201 conver- tida foi baseado em dados que mostram que o citrato de sódio inibiu a ativi- dade da elastase da PRT-201 purificada e, portanto, também pode inibir a atividade da elastase da pró-PRT-201 e da PRT-201 durante as operações de processamento. Tal inibição poderia minimizar a conversão espontânea da pró-PRT-201 para variantes N-terminal e minimizar a auto degradação da : PRT-201. Em um experimento em que o tampão da análise SLAP contendo 115 mM de citrato de sódio, pH 5,0, a atividade específica da PRT-201 foi | inibida em 91%. : Ocasionalmente, o material eluído da coluna de captura da pró- PRT-201 não foi submetido à conversão pela tripsina, como descrito acima, Â mas em vez disso usado para obter preparações ricas em várias espécies de proteína. Por exemplo, agrupamentos de frações contendo primariamente pró-PRT-201 glicosilada, pró-PRT-201 não glicosilada ou proteínas resultan- tes da conversão espontânea foi feita a partir do eluato da coluna de captu- ra. Tipicamente, esses agrupamentos de frações foram diafiltrados em 10 mM de fosfato de sódio, pH 5,0, liofilizado, e armazenados a -80ºC.

Um estudo foi realizado para determinar o efeito do pH e da temperatura na estabilidade da pró-PRT-201 purificada ao longo do tempo. À pró-PRT-201 liofilizada foi reconstituída em 10 mM de fosfato de sódio em pHs variando de 3,0 a 8,4, seguido de incubação a 4ºC ou 25ºC por 7 dias. Após 7 dias, as amostras da pró-PRT-201 sob condições de pH 4,0-8,0 e 25ºC mostraram um enriquecimento em PRT-201 madura, que aumentou com o aumento do pH como mostrado por SDS-PAGE e coloração por Co- omassie. Sob as condições de pH 8,4 e 25ºC, a conversão completa da pró-

: í 128 201-PRT em PRT-201 madura foi observada. As amostras a 4ºC, do pH 4,0 . a 8,4 mostrou pouca ou nenhuma conversão. No pH 3,0, nenhuma conver- são foi observada a 4ºC e a 25ºC. Tem sido relatado na literatura (Hartley e Shotton, 1971, Elastase pancreática. Enzimas 3:323-373) que a elastase pancreática porcina é irreversivelmente inativada após armazenamento pro- longado em pHs inferiores a 3,0. Assim, com base nesses resultados deste estudo e para evitar a PRT-201 irreversivelmente inativada, as condições úteis para minimizar a conversão da pró-PRT-201 purificada são armazena- das a 4ºC entre o pH 3,0-4,0.

6.6EXEMPLO 5: EXPRESSÃO DA PRT-201 AUTOATIVADA EM P. PAS-

TORIS Para obter uma pró-enzima variante capaz de autoativação, eli- minando assim a necessidade de ativação da tripsina, uma variedade de vetores variantes de domínios de clivagem da elastase foi construída e ana- - 15 lisadaem cultura de pequena escala e em experimentos de conversão. Os é vetores variantes foram criados por mutagênese por PCR sítio-dirigida do . vetor pPROT24-V e subsequente vetores derivados. A mutagênese sítio- dirigida foi realizada usando Pfu Turbo DNA polimerase (Stratagene). A cepa XL10-Gold da E.coli foi transformada com os plasmídeos resultantes. As misturas de células transformadas foram semeadas em placas LB de baixo sal suplementadas com 25 microgramas/mL de Zeocin. Os clones resisten- tes aos medicamentos foram escolhidos e o DNA do plasmídeo foi prepara- do (Qiagen, Valencia, CA). Os clones foram confirmados para as mudanças do códon esperadas pelo sequenciamento de ambos os filamentos do DNA do plasmídeo na região do pró-peptídeo com reações de sobreposição múl- tipla. A P. pastoris foi transformada com os vetores variantes e os clones foram selecionados conforme descrito no Exemplo anterior. Um resumo dos variantes de domínio de clivagem da elastase que foram criados é fornecido na Tabela 4 abaixo:

o 129 sequência, do pró- peptídeo | 2 | Gu| tm | An Am| Ag) va va | Gy | | 40 | eu) mm EE ne EE | 4 | Gu) Tm | an as [DNSNNE va | o) | | 43 | Gu| TM An a=[EES] va va | cy) | 4 | e) Tm EE a NES va | o | | as | eu| tm SINA va | va | ey | o as [eo] 7 PRESS va [va | o) | | 52 | eu) mm DRESS va va | o) | | | 3 | Gu) m ESSES va | va | ey | | ss ES Tm | as RSA va [va | ey | | s6 ES cn ESSO va va | o) | [os E mas SERA] va ja | o» |

EEN ET RECINT

EM ET EEE EE EM o 2 RECENT | 62 RS rm ONENOTE va | va | o) | [| ss EM T+ EE va va | o) | Tabela 4: Variantes do domínio de clivagem da elastase Para Tabela 4 acima, a listagem da primeira coluna "Nome da sequência do Pró-Peptídeo" corresponde à SEQ ID NO para o domínio de o 130 clivagem da elastase indicado. Assim, 24 corresponde ao domínio de cliva- gem da tripsina do tipo sevagem SEQ ID NO: 24. Números 40-49, 52-63 correspondem, respectivamente, aos domínios de clivagem da elastase vari- ante da SEQ ID NOS: 40-49, e 52-63.

Para a cultura de clones variantes, as condições de cultural do frasco agitado desenvolvido para o clone 201-24-266-VU ativado pela tripsi- na descrito no exemplo anterior foram geralmente seguidas. Vários métodos para converter as pró-proteínas variantes secretadas no sobrenadante do frasco agitado para amadurecer a PRT-201 foram testados. A primeira estra- tégiade conversão consistiu em purificar cromatograficamente a pró-enzima variante primeiro, seguido por clivagem controlada em um tampão de con- versão específico. Devido a mudanças de aminoácidos nas pró-proteíinas variantes resultar em apenas pequenas alterações nos pontos isoelétricos : teóricos em comparação com a pró-enzima do tipo selvagem, a cromatogra- - 415 fiadetrocacatiônica foi realizada geralmente, conforme descrito no exemplo É anterior. Os sobrenadantes das culturas do clone variante foram preparados , para a cromatografia, quer pela diluição com água, em geral conforme des- crito no exemplo anterior, ou por concentração seguida de diafiltração do É sobrenadante usando filtração de fluxo tangencial no tampão de carrega- mento da coluna. Após a purificação por cromatografia, as frações eluídas foram analisadas por SDS-PAGE seguida de coloração por Coomassie. A análise de gel demonstrou quantidades maiores da proteína madura conver- tida para pró-proteína nas frações comparadas ao sobrenadante inicial, indi- cando que uma quantidade considerável de conversão espontânea da pró- proteina tinha ocorrido. Na purificação subsequente, a proteína convertida espontaneamente foi determinada por LC/MS para consistir principalmente de variantes N-terminal, que mostraram ter pouca ou nenhuma atividade de elastase na análise SLAP.

A segunda estratégia de conversão consistiu em converter a pró- proteína variante antes da purificação do sobrenadante da cultura, seguida de purificação cromatográfica da enzima madura. Esta estratégia de conver- são foi inicialmente testada em uma análise em pequena escala e, subse-

í 131 quentemente, ampliada para acomodar volumes maiores de conversão.

Para a conversão em pequena escala, o sobrenadante clareado de culturas de clone variante foi tipicamente concentrado 5 vezes por centrifugação a 2-8ºC em um dispositivo de filtragem ultracentrifugal.

Após a concentração, o re- tentado foi diluído cinco vezes com tampão Tris a uma concentração final de 100 mM de Tris-HCI tipicamente em uma variação de pH de 8,0 a 9,0. As amostras foram incubadas em temperatura ambiente em uma plataforma de balanço.

A atividade da elastase foi monitorada pela análise SLAP normal- mente até a velocidade de reação de atividade atingir um platô.

Em alguns casos, a velocidade de reação aumentou tão lentamente que o monitora- mento SLAP foi interrompido antes de um platô ser atingido.

As amostras convertidas foram analisadas para as espécies de proteínas (por exemplo, pró-proteina e PRT-201 / variantes N-terminal) por SDS-PAGE.

Para ampliar : essa estratégia de conversão, o sobrenadante contendo a pró-proteína vari- - 15 antefoiconcentrada por 10 vezes usando filtração de fluxo tangencial segui- Ê do por diafiltração com 100 de mM Tris-HCI variando em pH de 6,0 a 9,0. O e progresso da reação de conversão foi monitorado ao longo do tempo pela análise HIC-HPLC em que a pró-proteína, PRT-201, e espécies variantes N- terminal foram quantificadas.

Quando o pH do tampão de diafiltração estava entre8,0e9,0 houve geralmente taxas mais elevadas de conversão.

As pró-proteínas elastases listadas na Tabela 5 foram expressas em P. pastoris como descrito e testado para sua capacidade de se submeter a autoconversão em análises de conversão em pequena escala, como des- crito na segunda estratégia de conversão acima.

| 133 Nome da Uso d: sequên- | Rendimen- | Estabilida- % Varian- tá e ã Taxa de tripsina cia do todo fras- | dedo fras- tes N- s o: conversão em proce- pró- co agitado | co agitado Terminal . dimentos peptídeo Intermediá- | Intermediá- | Lenta Não testa- rio — Alto ria do Intermediá- | Alta Lenta Não testa- rio — Alto do Não aplicá- | Não apli- Não apli- vel cável cável Alto Alta Nenhuma Não apli- conversão | cável detectada Não aplicá- | Não apli- Não apli- vel cável cável " Tabela 5: Resultados da expressão das pró-proteinas elastases em P. pas- . toris Na Tabela 5 acima, a lista da primeira coluna do "Nome da se- f quência do pró-peptídeo" corresponde a SEQ ID NO para o domínio de cli- vagem da elastase indicado.

Assim, 24 corresponde ao domínio de clivagem da elastase ativada pela tripsina do tipo selvagem da SEQ ID NO: 24. Os números de 40-49 e 52-63 correspondem respectivamente aos domínios de clivagem da elastase variante da SEQ ID NOS: 40-49, e 52-63. A coluna "Rendimento do frasco agitado" corresponde à quantidade da pró-proteína correspondente no sobrenadante da cultura ao longo de 3 dias de indução como determinado pela análise SDS-PAGE.

A coluna "Estabilidade do fras- co agitado" corresponde à estabilidade da pró-proteína correspondente no sobrenadante do meio de cultura do frasco agitado ao longo de 3 dias de indução como determinado pela quantidade de variantes PRT-201/N- terminal vista na análise SDS-PAGE.

A coluna "Taxa de conversão" corres- ponde à taxa relativa de conversão da pró-proteina em PRT-201, conforme indicado pelo tempo para atingir a velocidade de reação SLAP máxima (Rá- pida: menos de 60 minutos; Intermediária: 60 a 120 minutos; e Lenta: supe- rior a 120 minutos). O curso do tempo de conversão das pró-proteínas vari-

A 134 antes foi determinado usando a análise de conversão em pequena escala descrita acima e comparado ao curso do tempo de conversão de 24 pró- proteínas determinadas pela ativação usando tripsina imobilizada. A coluna "% Variantes N-Terminal" refere-se à porcentagem de proteína convertida que compreende variantes N-terminal da proteína elastase madura (ou seja, variantes compreendendo a clivagem na ligação C- terminal para qualquer sítio exceto P1). Para ilustrar os sistemas relativos de classificação usados na Tabela 5, os exemplos de análises SDS-PAGE, de taxa de conversão e de variante N-terminal para um subconjunto de variantes autoativados são mostrados na figura 5.

A análise das várias variantes revelou que as pró-proteínas elas- tases compreendendo o domínio de clivagem da elastase variante da SEQ ID NO: 48 ou a SEQ ID NO: 55 forneceu elastases autoativadas com quali- : dades superiores incluindo rendimentos intermediários a altos de frasco agi- tado alto e baixas percentagens de variantes sob conversão. Análise poste- rior de pró-proteínas elastases compreendendo o domínio de clivagem da - elastase variante da SEQ ID NO: 48 e da SEQ ID NO: 55 revelou que a au- toativação das pró-proteínas correspondentes (ou seja, as pró-enzimas elas- ' tases da SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 69, respectivamente) produziu ape- nas uma classe da variante N-terminal com uma clivagem na ligação peptí- dica C-terminal ao resíduo P'2. Análise posterior da pró-proteína elastase revelou que a pró-proteína compreendendo ao domínio de clivagem da elas- tase variante da SEQ ID NO: 55 era mais estável que a pró-proteina com- preendendo o domínio de clivagem da elastase variante da SEQ ID NO: 48. Os experimentos iniciais para otimizar as condições para a cli- vagem controlada da pró-PRT-201 purificada foram realizados usando a pró- proteína com a sequência do pró-peptídeo 42 (SEQ ID NO: 6). Esta pró- proteína purificada foi submetida à conversão em uma matriz de condições incluindo pH (7,7 a 8,9), composição tampão (0,4 a 10 mM de citrato de só- dio), concentração de proteína (0,14 a 0,23 mg/mL) e tempo de reação (5 a 24 horas). No final do período de conversão, as reações foram resfriadas, por adição de ácido fórmico para reduzir o pH para 3,0. As quantidades rela-

* É 135 tivas das espécies da proteína em cada reação foram determinadas por es- pectrometria em massa. Com base nesses resultados, as condições de con- versão que resultaram na menor porcentagem de variantes N-terminal inclu- iu um pH de 8,3, uma composição tampão de 100 mM de Tris e menos de 1 mM de citratode sódio, uma concentração de proteínas de 0,2 mg/mL, e um tempo de reação de 5 a 24 horas. Neste estudo, apenas os pontos finais da reação foram analisados. Assim, os dados em tempo real sobre qualidade de conversão não foram obtidos, e o resultado final pode ter refletido tanto na produção inicial de variantes N-terminal quanto em uma quantidade subs- tancial de tempo para essas variantes para terem sido degradadas. Subse- quentemente, uma análise HIC-HPLC foi desenvolvida para permitir o moni- toramento em tempo real da reação de conversão. Estudos posteriores de otimização de conversão, incluindo aqueles usando monitoramento HIC- : HPLC em tempo real, são descritos no Exemplo 6.

- 15 67 EXEMPLO 6: EXPRESSÃO DA PRT-201 AUTOATIVADA EM P. PAS-

TORIS USANDO UM VETOR VARIANTE MULTICÓPIA é A integração multicópia de genes recombinantes em P. pastoris tem sido usada para aumentar a expressão da proteína desejada (ver, por exemplo, Sreekrishna et al. 1989, 28:4117-4125 Bioquímica; Clare et al. 1991, Bio/ Tecnologia 9:455-460; Romano et al. 1991, Vacina 9:901-906). No entanto, em certos casos, os níveis de expressão obtidos dos integrantes do vetor de cópia única forão eficiente e não foi melhorado pelos integrantes do vetor multicópia (Cregg et al. 1987, Bio/Tecnologia 5:479-485). Os even- tos de integração do plasmídeo multicópia espontâneos ocorrem in vivo em uma frequência baixa em P. pastoris. Para obter a integração genômica de múltiplas cópias de um gene e possivelmente aumentar a expressão da pro- teína, um método de ligação in vitro pode ser usado para produzir inserções acopladas do gene em um vetor de expressão, seguido por transformação P.

pastoris.

Para obter um integrante multicópia da variante pPPROT55-V, um método de ligação in vitro foi usado para construir um vetor contendo múlti- plas cópias do pPROT55-V que foi subsequentemente usado para transfor-

o 136 mação P. pastoris. Para fazer o vetor multicópia, o vetor pPPROT55-V foi di- gerido com Bglll e BamHl para liberar o cassete de expressão 2,3 kb que codifica o gene pró-PRT-201, o promotor AOX1, e a sequência de termina- ção da transcrição AOX1. O cassete de expressão foi, então, ligado com uma preparação do vetor PPROT55-V que tinha sido linearizado com BamHlI e tratado com fosfatase alcalina de intestino de bezerro (New England Bio- labs, MA, USA) para evitar autoligação. A mistura de ligação foi incubada durante a noite a 16ºC. A cepa TOP10 da E.coli (Invitrogen, CA, USA) foi transformada com a reação de ligação. O mix de transformação foi plaquea- doem LB de baixo sal na presença de 25 microgramas/mL de Zeocina. Os transformantes resistentes aos medicamentos foram escolhidos e o DNA do plasmídeo foi preparado.

Para determinar o número de cassetes de expressão nos clones : resultantes, o DNA do plasmídeo foi digerido com Balll e BamHlI e analisado - 15 por eletroforese em gel de agarose com um marcador de tamanho-padrão É de DNA. Um clone contendo uma única banda de inserção definida com o - tamanho consistente com três cassetes de expressão 2,3 kb foi identificado e chamado de pPROT55M3-V. O mapeamento da enzima de restrição foi ' usado para confirmar a orientação de uma formação multímera linear do iní- cioaofimparao vetor pPROTSS5SM3-V. A figura 6 mostra o esquema de clo- nagem pPROT55M3-V.

A cepa P. pastoris do tipo selvagem NRRL Y-11430 foi usada para transformação, que foi realizada conforme descrito no Exemplo 4, exce- to que o vetor pPPROT55M3-V foi linearizado com Bagll em vez de Sacl an- tes da transformação. Os transformantes resistentes aos medicamentos fo- ram cultivados e selecionados para expressão da pró-proteina PPROTS55M3 como descrito no Exemplo 4. A otimização das condições de cultura do frasco agitado foi rea- lizada para minimizar a clivagem espontânea durante indução. A otimização do frasco agitado se concentrou sobre duas variáveis, a temperatura de in- dução e composição média de indução. Primeiro, verificou-se que realizar a indução a 22ºC em relação aos 25ºC resultou em uma taxa maior de pró-

A 137 enzima para enzima madura no sobrenadante de cultura para todas as com- posições dos meios testados. Segundo, a adição de citrato de sódio para aumentar a força do tampão dos meios de indução resultou na ausência da enzima madura espontaneamente convertida no sobrenadante da cultura em todasas concentrações de citrato de sódio testadas (12,5 a 50 mM). Os efei- tos destas variáveis sobre o rendimento da expressão da pró-proteína e es- tabilidade no sobrenadante do frasco agitado ao longo do tempo são ilustra- dos na figura 7. O clone 201-55M3-003-VU de três cópias de alta expressão foi selecionado para análise de fermentação ampliada usando procedimentos de fermentação estabelecidos para o clone 201-55-001-VU descrito a seguir. A fermentação do clone 201-55-001-VU foi realizada por descongelar um frasco do banco de célula e usá-lo para inocular um frasco de agitação con- - tendo 500 ml! de meio de crescimento BKGY em pH 5,7. A cultura das se- - 15 mentes foi crescida por 24 horas com agitação a 28ºC até o peso celular : úmido ser de aproximadamente 40 g/L. O fermentador contendo meio de - crescimento BKGY em pH 5,7 foi esterilizado em autoclave. Depois que os meios foram resfriados a 28ºC, suplementos incluindo base de nitrogênio de É levedura e biotina foram acrescentadas. O fermentador foi inoculado na pro- porção de 01:33da cultura de sementes de meio de crescimento BKGY.

O processo de fermentação começou com um lote descontínuo alimentado de glicerol e alimentação de glicerol em pH 5,7 a 28ºC. O pH foi controlado por soluções de 10% de ácido fosfórico e 30% de sulfato de a- mônio. A cultura foi agitada de 300 a 1000 rpm com aeração para controlar o oxigênio dissolvido a 40%. Depois que o lote inicial de glicerol foi depletado e o oxigênio dissolvido bloqueado, indicando a depleção do glicerol do sis- tema, 50% de glicerol adicional foi alimentado a 131 g/h até que o peso de célula úmida alcançou preferencialmente de 200g/L a 300g/L. Depois que o peso de célula úmida chegou a 200g/L-300 g/L, a indução foi iniciada ime- diatamente com um bolo de metanol de 0,025 mL por grama de biomassa úmida. Após a depleção do bolo de metanol e do aumento de oxigênio dis- solvido, a indução foi continuada pela adição de quantidades limitadoras do

Ê í 138 metanol com uma taxa de alimentação constante 0,0034 g de metanol/g de peso de célula úmida/h. No início da alimentação de metanol constante, o PH do caldo de fermentação foi alterado de 5,7 a 5,5 e a temperatura foi alte- rada de 28ºC a 22ºC. A fermentação foi colhida após 70 horas de indução.

Para determinar os rendimentos relativos de clones únicos e de três cópias, o clone 201-55-001-VU, contendo um integrante genômico da cópia única do vetor pPROT55-V, foi fermentado em paralelo com o clone 201-55M3-003-VU, contendo um integrante genômico do vetor de 3 cópias PPROTS5SM3-V. As fermentações foram realizadas como descrito acima, exceto que o pH da cultura foi mantido a 5,7 durante a indução. Os sobrena- dantes colhidos das fermentações 201-55-001-VU e 201-55M3-003-VU fo- ram analisados pelo gradiente SDS-PAGE seguido por coloração azul coloi- dal (figura 8), que mostrou que a maior expressão da pró-proteína foi obtida 7 do clone multicópia 201-55M3-003-VU em relação ao clone de cópia única - 15 201-55-001-VU. Os resultados de SDS-PAGE foram confirmados com análi- Ê se HIC-HPLC da concentração da pró-proteína no sobrenadante da fermen- ” tação, demonstrando que o clone 201-55M3-003-VU produziu aproximada- mente 600 mg/L da pró-proteina secretada enquanto o clone 201-55-001-VU É produziu aproximadamente 400 mg/L. Assim, o clone multicópia 201-55M3- 003-VU contendo três cassetes de expressão produziu aproximadamente 50% mais pró-proteinas comparado ao clone de cópia única 201-55-001-VU contendo um cassete de expressão único.

Duas estratégias de conversão foram testadas usando o sobre- nadante 201-55M3-003-VU produzido a partir da fermentação. Estas estra- tégias geralmente seguem as estratégias descritas para outras variantes da pró-proteina no Exemplo 5, exceto que elas foram realizadas em uma escala maior. Na primeira estratégia, a pró-proteina foi capturada do sobrenadante por cromatografia de troca catiônica, seguida por conversão da proteina ma- dura e cromatografia aperfeiçoada. Na segunda estratégia, a pró-proteína foi convertida para a proteína madura antes da purificação, seguida de capta- ção usando cromatografia de troca catiônica, estendeu a conversão para remover as variantes N-terminal, e posterior cromatografia aperfeiçoada.

EA 139 Ambas as estratégias também incluíram uma etapa de incubação estendida em um tampão em pH 8,0 após conversão para realizar a degradação seleti- va de variantes N-terminal.

Usando a primeira estratégia, a captura da pró-proteína seguida pela conversão e purificação aperfeiçoada da PRT-201 foi realizada da se- guinte forma. O sobrenadante 201-55M3-003-VU foi colhido da cultura de fermentação e congelado a -80ºC. Aproximadamente 7 L de sobrenadante clareador congelado(3,5 L da fermentação 201-55M3-003-VU descrito acima e 3,5 L de culturas de frasco agitado 201-55M3-003-VU preparado geral- mente como descrito nos Exemplos 4 e 5) foram descongelados e diluídos oito vezes com água deionizada e 1 M de citrato de sódio, pH 4,3, a 2-8ºC para obter uma concentração final de 25 mM de citrato de sódio. O pH da solução foi ajustado para 4,7. A solução foi carregada em uma coluna de : troca catiônica Macroprep High S de 2,3 L de leito em 76 cm/h a 2-8ºC. À - 15 colunafoilavadacom5 CVs de 25 mM de citrato de sódio, pH 4,7, seguida por 5 CVs de 160 mM de cloreto de sódio, 25 mM de citrato de sódio, pH . 4,7. A pró-proteina foi eluída com 15 CV de um gradiente linear iniciando a partir de 160 mM de cloreto de sódio a 500 mM de cloreto de sódio em 25 É mM de citrato de sódio, pH 4,7, a 87 mi/min (67 cm/hr). O eluato foi coletado emfrações. As frações foram analisadas por SDS-PAGE para teor de prote- ina (figura 9). Uma pequena quantidade da proteína convertida espontane- amente foi observada por SDS-PAGE. As frações contendo a pró-proteína foram agrupadas para processamento adicional. O material agrupado foi submetido a análise HIC-HPLC, que mostrou que ele consistia em 92% de pró-proteinae 8% de PRT-201 madura. Para iniciar a conversão, o material agrupado foi alterado por tampão usando filtração de fluxo tangencial em 100 mM de cloreto de sódio, 20 mM de Tris, pH 4,0, usando diafiltração de volume constante a 10-12ºC. A filtração de fluxo tangencial foi realizada com membranas de celulose re- generadas, uma pressão transmembrana de 103,4KPa(15 psi), uma taxa de fluxo cruzado de 20 Limin e um fluxo de 800 mL/min. Três diavolumes do tampão a 2-8ºC foram adicionados na mesma taxa que o fluxo. Subsequen-

Ê À 140 temente, três volumes adicionais de tampão em temperatura ambiente, fo- ram adicionados na mesma taxa que o fluxo para elevar a temperatura da solução de conversão para o alvo de 26ºC.

A filtragem de fluxo tangencia! foi usada para concentrar a solução de conversão para o alvo de 1,5 mg/mL, usando as condições de pressão transmembrana de 15 psi, taxa de fluxo cruzado de 1,2 L/min, e fluxo de 76 mi/min.

Entretanto, após cerca de 2 mi- nutos do início do processo de concentração, a precipitação inesperada foi observada e o processo de concentração foi interrompido.

A concentração da proteína da solução de conversão foi determinada para ser de 1,1 mg/ml por absorção de UV a 280 nm em um volume de 570 mL.

Para minimizar a precipitação posterior, a solução de conversão foi diluída a 1 mg/ml com 100 mM de cloreto de sódio, 20 mM de Tris, pH 4,0, e filtrado através uma membrana de 0,22 mícron.

Dezesseis mL de 3 M de Tris, pH 9,0 foi adicio- - nado à solução de conversão.

A solução de conversão foi colocada em ba- - 15 nho-maria a 26ºC.A reação de conversão foi monitorada pela análise HIC- i HPLC.

Após 30 minutos, HIC-HPLC mostrou que a maioria das pró- : proteínas havia sido convertida em PRT-201 e em algumas variantes N- terminal (figura 10). Depois de uma hora, a reação de conversão consistiu É em 0% de pró-proteína, 86% de PRT-201 de sequência completa e 14% de variantes do N-terminal.

O material de conversão foi incubado ainda por mais 4 horas, nesse tempo a análise HIC-HPLC mostrou que o material de conversão consistiu de 98% de PRT-201 de sequência completa e 2% de variantes N-terminal.

O material de conversão foi diluído quatro vezes com água deio- nizadae1M de citrato de sódio, pH 4,3, a uma concentração final de 25 mM de citrato de sódio.

O pH da solução foi ajustado para 5,0 em preparação para o carregamento na coluna aperfeiçoada.

A solução foi carregada em uma coluna de troca catiônica Macroprep High S de leito de 600 mL em 27 mlL/min (83 cm/h). A coluna foi lavada com 5 CVs de 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0 seguida de 5 CVs de 160 mm de cloreto de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0. A PRT-201 foi eluída com 15 CVs de um gradiente linear de 160 mm a 500 mm de cloreto de sódio a em 25 mM de citrato de

' ' 141 sódio, pH 5,0, a 87 mL/min (67 cm/h). O eluato foi coletado em frações. As frações foram analisadas por SDS-PAGE para o teor de proteína e por análi- se SLAP para atividade específica. As frações contendo PRT-201 com uma atividade específica de > 30 U/umg foram agrupadas. As frações agrupadas da PRT-201 foram diafiltradas por filtração de fluxo tangencial em tampão formula3tion (0,1X PBS, pH 5,0). O pH da PRT-201 diafiltrada foi ajustado a pH 7,4 e a concentração da proteína foi ajustada a 1 mg/mL por filtragem de fluxo tangencial. Os frascos foram preenchidos e liofilizados como descrito para PRT-201 produzida do clone 201-24-266-VU no Exemplo 4.

Usando a segunda estratégia, a conversão da pró-proteína se- guida pela purificação da PRT-201 foi realizada da seguinte forma. Aproxi- madamente 7L do sobrenadante clareador congelado da fermentação 201- 55M3-003-VU descrito acima foi descongelado e a reação de conversão foi : iniciada pela filtragem de fluxo tangencial com um tampão de conversão con- - 15 tendo 100mM de Tris, pH 8,0, usando diafiltração de volume constante em : temperatura ambiente com membranas de celulose regeneradas. Dois dia- EF volumes de 100 mM de Tris-HCl, pH 8,0 foram suficientes para alterar o pH do retentado de pH 5,0 a 8,0 e realizar conversão. Um experimento também * foi realizado ajustando diretamente o pH do sobrenadante clareador para 8,0 pela adição de uma base Tris para uma concentração final de 100 mM e a- justando o pH para 8,0 com 1 N de hidróxido de sódio. Isso resultou na for- mação de precipitados e um sobrenadante turvo, possivelmente devido à precipitação dos componentes do caldo que não era desejável. Método pre- ferido de conversão usando a filtração de fluxo tangencial não resultou em precipitação.

A reação de conversão foi monitorada pela análise HIC-HPLC em tempo real. Após o início da conversão, a pró-PRT-201 convertida para PRT-201 madura lentamente ao longo das duas primeiras horas, seguida de uma aceleração da conversão (figura 11). Em 4,5 horas, a reação de con- versão consistiu de aproximadamente 4% de pró-PRT-201, 75% de PRT-201 madura e 21% de variantes N-terminal. Em 6,5 horas, a reação de conver- são consistiu em aproximadamente 1% de pró-PRT-201, 83% de PRT-201

' 142 madura e 16% de variantes N-terminal. A redução nas variantes N-terminal de 21% a 16% de 4,5 horas para 6,5 horas pode ser devido à degradação das variantes N-terminal pela PRT-201 ativa de comprimento total, mas isso não foi completo e não tão rápido como a redução das variantes N-terminal vistas durante a conversão da pró-PRT 201 purificada. Nesta segunda estra- tégia, estendendo a reação de conversão pode não eliminar totalmente as variantes N-terminal devido às proteínas competidoras no sobrenadante que compete para o sítio ativo da elastase. Para melhorar a reação de conver- são, o material de pós-conversão foi capturado e subsequentemente diafil- trado em um tampão adequado para iniciar a conversão estendida em pH 8,0, para degradação seletiva de variantes N-terminal conforme descrito a- baixo. A captura da PRT-201 do material de conversão foi realizada da - seguinte forma. O material de conversão foi alterado por tampão em 20 mM - 15 decitratode sódio, pH 5,0 e carregado em uma coluna de cromatografia de : troca catiônica Macro-Prep High S. A coluna foi lavada com 5 CVs de 20 mM Fr de citrato de sódio, pH 5,0 seguida de 5 CVs de 20 mM de citrato de sódio, 160 mM de cloreto de sódio, pH 5.0. A PRT-201 foi eluída com um gradiente É linear de 160 mM a 500 mM de cloreto de sódio em 20 mM de citrato de só- dio pH5,0.As frações foram analisadas por SDS-PAGE para o teor de pro- teina, HIC-HPLC para variantes N-terminal, absorvância UV a 280 nm para concentração de proteína, e análise SLAP para atividade da elastase. Duas bandas predominantes de proteínas foram detectadas por SDS-PAGE, cor- respondendo a PRT-201 e glicoforma da PRT-201, como mostrado na figura

12. As frações que contêm as glicoformas da PRT-201 como determinado por SDS-PAGE ou variantes N-terminal conforme determinado por HIC- HPLC foram excluídas do agrupamento. As frações que apresentaram relati- vamente atividade específica baixa (menos de 30 U/mg) como determinada pela análise SLAP também foram excluídos do agrupamento. As frações restantes contendo a PRT-201 foram agrupadas para processamento poste- rior. A análise HIC-HPLC das frações agrupadas revelaram que este material consistiu de aproximadamente 98% da PRT-201 de sequência completa e t 143 de 1-2% de variantes N-terminal. O material agrupado foi armazenado entre 2-8ºC por 12-16 h. Dada a observação prévia de que variantes N-terminal parece- ram diminuir ao longo de um prolongado período de conversão como descri- to acima, o material da PRT-201 agrupado foi submetido a uma etapa de incubação estendida em pH 8,0. A incubação estendida foi realizada por dia- filtração e filtração de fluxo tangencial com 100 mM de Tris, 300 mM de clo- reto de sódio, pH 8,0, por 2,5 horas em temperatura ambiente. Após 2,5 ho- ras, o material de conversão consistiu em 100% de PRT-201 madura, como mostrado pela análise HIC-HPLC. O material de conversão foi submetido à diafiltração e filtração de fluxo tangencial em 20 mM de citrato de sódio, pH 5,0, para suprimir a atividade da elastase e preparar para a cromatografia de coluna. O material da PRT-201 diafiltrada foi armazenado por aproximada- : mente 64 horas a 2-8ºC.

A purificação por cromatográfica aperfeiçoada da PRT-201 foi realizada da seguinte forma. O material da PRT-201 diafiltrada foi carregado - em uma coluna de troca catiônica Macro-Prep Alto S e lavada com 5 CVs de Tampão C (20 mM de citrato de sódio, pH 5.0), seguido por 5 CVs de sódio É de 160 mM de cloreto, 20 mM de citrato de sódio, pH 5.0. A eluição da PRT- 201 foirealizada com um gradiente linear de 15 CVs começando de 68% do Tampão C e 32% do Tampão D (160 mM de cloreto de sódio, 25 mM de ci- trato de sódio, pH 5.0) para 0% do Tampão C e 100% do Tampão D (500 mM de cloreto de sódio, 25 mM de citrato de sódio, pH 5.0), a 50 mi/min (153 cm/h). O eluato foi coletado em frações. A PRT-201 eluída como um pico simétrico a 37 mS/cm (330 mM de cloreto de sódio). As frações foram analisadas por análise SDS-PAGE para o conteúdo de proteínas, absorvân- cia de UV em 280 nm para a concentração da proteína e ensaio SLAP para atividade específica. As frações contendo PRT-201 que tinha uma atividade específica de 30,1-38,8 Ulmg foram agrupadas. As frações PRT-201 agru- padas foram diafiltradas por filtração de fluxo tangencial em formulação tam- pão (0,1X PBS, pH 5,0). O pH da PRT-201 diafiltrada foi ajustado para pH

7.4 e a concentração da proteína foi ajustada para 1 mg/mL por filtração de

: f 144 fluxo tangencial.

Os frascos foram preenchidos e liofilizados conforme des-

crito para a PRT-201 produzida do clone 201-24-266-VU no Exemplo 4. As condições para os procedimentos de conversão descritos a- cima foram escolhidas baseadas em estudos de otimização de conversão que examinaram a concentração de proteína, temperatura, composição do tampão, diavolume e variáveis de pH.

No primeiro estudo, o efeito da con- centração da pró-proteina na produção de variantes N-terminal durante a conversão foi analisado.

A pró-PRT-201 purificada do clone 201-55M3-003 WU (pró-PRT-201-55M3-003-VU) em uma concentração de partida de 0,2 mg/ml em 20 mM de fosfato de sódio, pH 5,0 foi aliquotada e concentrada a 1,0, 1,6, e 1,8 mg/mL usando dispositivos de concentração centrífuga como determinado por absorvância de UV a 280 nm.

A conversão da pró-proteina foi feita pela adição de Tris e cloreto de sódio para 100 mM de cada uma das : quatro amostras de concentração, ajustando o pH de 5,0 a 8,0, e incubando - 15 asamostrasem temperatura ambiente.

A reação de conversão foi monitora- À da por HIC-HPLC em tempo real até que a pró-proteína fosse < 1% da prote- ina total (figura 13). Neste ponto, a amostra de 0,2 mg/mL consistiu de apro- ximadamente 8% de variantes N-terminal, enquanto que as amostras de 1,0 A mg/mL, 1,6 e 2,0 mg / mL consistiram de variantes N-terminal de aproxima- damente 14%, 19% e 29%, respectivamente.

O restante da proteína em ca- da amostra consistiu em PRT-201 de sequência completa.

Estes resultados demonstram que aumentando as concentrações da pró-PRT-201-55-003-VU durante a conversão leva à formação de mais variantes N-terminal e menos PRT-201 de sequência completa.

Outros estudos têm sugerido que a con- versão da pró-PRT-201-55M3-003-VU ocorre através de reações intramole- culares e intermoleculares.

Assim, para esta pró-proteína variante, é prová- vel que as reações intramoleculares, que são favorecidas em soluções de pró-proteínas mais diluídas, dão origem a conversão mais precisa enquanto que reações intermoleculares, favorecidas em soluções de pró-proteína mais concentradas, resulta em conversão menos precisa, ou seja, a formação de uma percentagem mais elevada de variantes N-terminal em relação a PRT-

201 de sequência completa.

f 145

No segundo estudo, o efeito da temperatura sobre a produção de variantes N-terminal durante a conversão foi analisado.

A pró-PRT-201 purificada do clone 201-55M3-VU (chamada pró-PRT-201-55M3-003-VU) foi produzida em uma concentração de 1,6 mg/mL foi submetida a conversão como descrita acima em 15ºC ou 26ºC.

As reações de conversão foram mo- nitoradas em tempo real por HIC-HPLC e permitida a progredir até que a pró-proteina composta por <1% da proteína total.

O tempo necessário para atingir esta redução na pró-proteína foi de aproximadamente 30 minutos a 26ºC e aproximadamente 90 minutos a 15ºC.

Nesses tempos, uma percen- tagem semelhante de variantes N-terminal (cerca de 20% da proteína total) para as duas temperaturas foi observada.

Assim, a maior temperatura de 26ºC resultou em uma reação de conversão mais rápida em comparação à menor temperatura de 15ºC, enquanto produz um perfil do produto de rea-

ção idêntico essencial.

O terceiro estudo examinou o efeito da composição do tampão ; na solubilidade da pró-proteína durante a reação de conversão.

A pró-PRT- Ss 201 purificada (pró-PRT-201-55M3-003-VU) em uma concentração de 1,0 mg/mL foi submetida à conversão sob as condições listadas na Tabela 6. As " reações de conversão foram realizadas em temperatura ambiente, exceto parauma (composição do tampão de 20 mM de Tris-HCl, 100 mM de cloreto de sódio, pH 4,0) que foi realizada de 2 a 8ºC.

As reações de conversão fo- ram inspecionadas visualmente para precipitação.

Como observado na Ta- bela 6, as composições do tampão que não resultam em precipitação incluí ram 100 mM de Tris-HCI, pH 8,0; 100 mM de Tris-HCI, 100 mM de cloreto de sódio, pH 5,0; e 100 MM de Tris-HCIl, 300 mM de cloreto de sódio, pH 8,0. As composições do tampão com concentrações menores de Tris ou sem cloreto de sódio a pH mais baixo (ou seja, pH 5,0) apresentaram precipita-

ão.

Composição do tampão Temperatu- | Precipi- | Solúvel (Ne- ra tação nhuma Preci- o E ENA vada servada)

[TmmaeTrsHOLpHSO — fammene + |

W ? 146 ra tação nhuma Preci- Obser- pitação — Ob- vada servada) [25 mae TrsHCipHSO —Jamwens |+| [ioomM de TristicipH50. fambente [8 [oomMdeTrsHCLpHAO fambente | [5 [dedoss asa ado 1 de cloreto de sódio, pH 4,0 [arena ana 1 de nd de cloreto de sódio, pH 5,0 [cesoec desmente lo | de cloreto de sódio, pH 8,0 Tabela 6: Efeito da composição do tampão na precipitação durante conver- são é No quarto estudo, o efeito do número de diavolume da filtração : de fluxo tangencial na precipitação durante a conversão do sobrenadante contendo a pró-proteina (pró-PRT-201-55M3-003-VU) foi analisado.

A solu- : ção usada para a troca de tampão foi de 100 mM de Tris-HCIl, 100 mM de cloreto de sódio, pH 8,0. Além disso, um ajuste de pH direto do sobrenadan- te do pH 5,0 ao 8,0 sem a filtração de fluxo tangencial foi testado.

Como ob- servado na Tabela 7, o ajuste de pH direto do sobrenadante resultou em uma grande quantidade de precipitação.

Com um diavolume de troca, algu- ma precipitação foi observada.

Nenhuma precipitação foi observada quando 2 a 5 diavolumes foram usados. lo [msorprecigtação — = | Tabela 7: Efeito do número de diavolume na precipitação durante a troca do tampão No quinto estudo, o efeito do pH na atividade da elastase da

, : 147 PRT-201 madura foi analisado. Esse estudo foi desenhado para identificar uma faixa de pH útil para a conversão que não resultaria em uma perda irre- versível da atividade da elastase do produto de conversão da PRT-201 ma- dura. As soluções de 1 mg/ml de PRT-201 em 20 mM de Tris-HCI, 20 mM de fosfato de potássio foram preparadas do pH 1 ao 14. As soluções foram mantidas em temperatura ambiente por 0,5, 2, 24 e 48 horas. Nos pontos do tempo indicados, as soluções foram testadas para atividade da elastase na análise SLAP. A atividade da elastase foi amplamente estável do pH 3 ao 8 em todos os pontos do tempo. Em pHs inferiores a 3 e superiores a 8, a ati- vidade da elastase foi reduzida em todos os pontos do tempo, com uma cor- relação entre os pontos do tempo mais longos e a menor atividade da elas- tase. Estes resultados indicaram que uma reação de conversão realizada fora de uma faixa de pH de 3 a 8 poderia impactar negativamente a atividade : da elastase do produto de conversão da PRT-201. - 15 68 EXEMPLO 7: PRODUÇÃO DA ELASTASE PANCREÁTICA TIPO |

PORCINA RECOMBINANTE AUTOATIVADA À Um vetor codificando a pró-enzima ELA-1 porcina autoativada foi expresso em P. pastoris. A ELA-1 porcina autoativada resultante foi compa- - rado com uma proteína ELA-1 porcina expressa como uma pró-protina do tiposelvagem ativada pela tripsina.

Para construir o vetor da ELA-1 porcina ativada pela tripsina, a região de codificação da ELA-1 porcina foi sintetizada pela Blue Heron Bio- technology (Bothell, WA), usando uma técnica de "oligo longo" não-PCR sob licença da Amgen (Thousand Oaks, CA) . O gene recombinante foi clonado no vetor pUC Blue Heron, um derivado do puUC119. O gene da ELA-1 porci- na foi sequenciado em ambos os filamentos para confirmar a sequência cor- reta. Os sítios de restrição Sacll e Xba1i foram incorporados como sítios de clonagem potenciais flanqueando o gene da ELA-1 porcina, como mostrado na figura 14. Um segundo códon de parada também foi adicionado imedia- tamente após o códon de parada nativo para minimizar o potencial de leitura do ribossomo. A figura 15 mostra a sequência de aminoácido de natureza idêntica da pró-enzima da ELA-1 porcina, que contém o sítio ativado pela

É 148 tripsina.

A região codificadora da ELA-1 porcina foi amplificada por PCR usando um par de oligonucleotídeos contendo sítios de restrição Xhol e Sa- cll para facilitar a clonagem. O produto da PCR foi digerido com Xhol e Sacll e purificado por eletroforese em gel de agarose. O fragmento da ELA-1 por- cina foi clonado no vetor PV-1 nos sítios de restrição Xhol e Sacll. A cepa TOP10 da E. coli foi transformada com a mistura de ligação. A mistura de células foi semeada em placas LB de baixo sal suplementada com 25 mg/ml de Zeocina. Os clones resistentes aos medicamentos foram escolhidos e o DNA do plasmídeo foi preparado (Qiagen, CA). Baseado na análise de res- trição, um clone contendo a inserção do gene da ELA-1 porcina foi identifi- cado e o vetor foi chamado de pPROT101-24-V. A sequência de codificação desse vetor foi confirmada por sequenciamento de DNA. O esquema de clo- 7 nagem para o pPPROT101-24-V é mostrado na figura 16. - 15 Usando vetor ppPROT101-24-V ativado pela tripsina, três diferen- í tes clones autoativados foram modificados alterando o sítio de clivagem de tripsina na região do pró-peptídeo da ELA-1 porcina para o sítio de clivagem da elastase. A metagênese sítio-dirigida foi realizada normalmente, confor- ” me descrito no Exemplo 4, usando iniciadores de oligonucleotídeos sintéti- cos contendo as mutações desejadas, conforme descrita na Tabela 8. Todas as mutações na região do pró-peptídeo foram confirmadas pelo sequencia- mento de DNA de fita dupla. truído madura ddddddddda pPROT101- 24-Vativada Phe | Pro | Glu | Thr | Asn | Ala | Arg | Val | Val | Gly [115 pela tripsina rea PPROT101- Phe | Pro | Glu | Thr | Asn | Ala FASO Vai | val 42V autoa- EE Gy | 116 tivada Es

, , 149 truído madura

FEFFFE EEE pPROT101- Í 49-Vv Phe | Pro | Glu | Thr | Asn EIS, pa Val | Val | Gly | 117 autoativada Dn Sis ER EE k: o 55L-V IRESUE Pro EMISE: Thr | Asn [dsroaleóaad Val | Val | Gly | 118 autoativada | s E [S e sa Tabela 8: Sequências do domínio de clivagem dos vetores da ELA-1 porcina autoativada e ativada pela tripsina. Os códons mutagênicos estão sombrea- dos. A ligação clivada está entre P1 e P'1. - A cepa de P. pastoris NRRL Y-11430 do tipo selvagem foi trans- 1 5 formadaetransformantes resistentes aos medicamentos foram cultivados e selecionados para a expressão de pró-proteínas ELA -1 porcina, conforme ã descrito no Exemplo 3. Com base na análise por SDS-PAGE e coloração por Coomassie (ver figura 17 e figura 18), os clones pPROT101-24-V ativados É pela tripsina do tipo selvagem tinha os mais altos níveis de expressão em relação aos clones autoativados. Dos clones autoativados, os clones p- PROT101-49-V tiveram o maior nível de expressão, seguido pelos clones PPROT101-55L-V e depois pelos clones pPPROT101-49-V. As pró-proteínas autoativadas pPPROT101-42-V e pPROT101-55L-V apresentaram conversão espontânea substancial durante a indução, enquanto que as pró-proteínas pPROT101-24-V ativada pela tripsina e pPPROT101-49-V autoativada apre- sentaram maior estabilidade nos meios de indução.

Os estudos da atividade da elastase da PRT-102 produzida pela ativação de tripsina da proteína pró-elastase expressa de pPROT101-24-V apresentaram maior atividade específica do que a PRT-201, como mostrada naTabela9 abaixo: [Atividade conforme me-| 346 | o18 | oo | 1007 | proteína) (Réplicas) o a ce rd e [Desvoparão — | os [| 32 1 s2 [67] Tabela 9: Atividade da elastase de três amostras diferentes da elastase pancreática tipo | porcina madura (ativada pela tripsina) comparada com a elastase pancreática tipo | humana madura. Um experimento de conversão em pequena escala foi usado pa- ra determinar se as pró-proteinas pPPROT101-55L-V e pPROT101-49-V po- dem ser convertidas para enzimas maduras exibindo atividade da elastase. Os sobrenadantes de frasco agitado pPROT101-55L-V e pPROT101-49-V foram concentrados 10 vezes com uma unidade de filtragem de centrífuga e . diluídos 5 vezes com 100 mM de Tris-HCl, pH 9,0. A conversão foi permitida Ao para proceder em temperatura ambiente e a atividade da elastase foi monito- rada durante o tempo pela análise SLAP. A variação média em absorbância por minuto foi determinada de cada ponto do tempo e relatada como veloci- dade de reação não-normalizada (figura 19). A conversão de ambos os so- brenadantes pPPROT101-49-V e pPROT101-55L-V resultou em um aumento À 15 na atividade da elastase. As amostras do ponto do tempo final de cada clone foram analisadas por SDS-PAGE seguida de coloração por Coomassie e comparadas às amostras de pré-conversão (figura 20). Os resultados de SDS-PAGE confirmaram que quase toda a pró-proteina PPROT101-49-V foi convertida em proteina madura ao final da análise de conversão. Os resulta- dosdeSDS-PAGE também mostraram que quase toda a pPPROT101-55L-V tinha sido espontaneamente convertida em proteína madura antes do ensaio da conversão.

As preparações purificadas das pró-proteinas PPROT101-24-V e PPROT101-49-V e das enzimas maduras foram submetidas à Danforth Plant Science Center, MO para análise de peso molecular intacta. As pró- proteínas foram purificadas por cromatografia de troca catiônica (Macroprep High S, Bio-Rad). Para a análise da enzima madura, as pró-proteínas de ambos os clones foram primeiramente tratadas para produzir enzimas madu-

* 151 ras e então purificadas por cromatografia de troca catiônica. A pró-proteina ativada pela tripsina foi tratado com tripsina, enquanto a pró-proteína autoa- tivada foi convertida na presença de 100 mM de Tris-HCl, pH 9,0, seguida por cromatografia de troca catiônica. Os picos maiores obtidos pela da análi- sede espectrometria de massa estão listados na Tabela 10. vada pela tripsina ativada pela tripsina toativada Ê autoativada F Tabela 10: pesos moleculares esperados e observados para as proteínas ELA-1 porcina. . SDS-PAGE, atividade da elastase e resultados de espectrome- tria de massa demonstraram que formas autoativadas da elastase pancreáti- f 10 ca porcina tipo | podem ser produzidas pela modificação da sequência do pró-peptídeo para substituir o sítio de clivagem da tripsina por um sítio de clivagem da elastase. Os níveis de expressão dessas formas autoativadas da elastase pancreática tipo | porcina são menores do que a forma ativada pela tripsina do tipo selvagem. Dos clones autoativados testados, aqueles com sequência do pró-peptideo pPPROT10149-V apresentaram o maior nível de expressão e a menor conversão espontânea. A conversão dos clones PPROT10149-V e pPROT101-55L-V resultou na produção de proteínas maduras com atividade de elastase substancial. A análise de espectrometria de massa revelou que os pesos moleculares da pró-proteina pPPROT101-49- Vetipolporcina madura corresponderam às massas esperadas.

6.9 EXEMPLO 8: ANÁLISE DA ATIVIDADE DA TRIPSINA DA ELASTASE- 1 HUMANA RECOMBINATE MADURA PELO TESTE DO SUBSTRATO

PEPTÍDEO COLORIMÉTRICO BENZ

; » 152 Um teste de hidrólise colorimétrica usando o substrato de peptí- deo pequeno N-benzoil-Phe-Val-Arg-pNitroanilida (BENZ) foi realizado para determinar se a proteína elastase madura purificada produzida pelo clone autoativado 201-55M3-003-VU possui a atividade de tripsina.

Três frascos de PRT-201 liofiizado purificado do clone 201-55M3-003-VU foram obtidos de armazenamento de -80ºC e reconstituídos com água para obter 1 mg/ml da PRT-201 em 0.1X PBS, pH 7,4. As concentrações de proteína foram con- firmadas medindo a absorvância de UV a 280 nm.

A solução do estoque TrypZean (10 mg/mL) foi usada para gerar uma curva padrão para a ativida- de da tripsina.

Uma amostra PRT-201 ativada pela tripsina testada previa- mente foi incluída como um controle positivo.

Além disso, algumas amostras controle e experimental foram bloqueadas com TrypZean para determinar a recuperação da atividade da tripsina na presença da PRT-201. Um subcon- : junto de amostras bloqueadas e desbloqueadas foi tratado com o inibidor de - 15 tripsina de soja (SBTI) para determinar a capacidade do SBTI para inibir qualquer atividade de tripsina intrínseca ou bloqueada.

Os TrypZean pa- Ê drões também foram tratados com SBTI para confirmar a eficácia do inibidor.

Ver Tabela 11 abaixo para um resumo das amostras incluídas neste estudo. : Descrição Nenhuma Com Com SBTI | Com blo- adição | bloqueio | (para 10 queio TrypZean) ugiml) TrypZean (para100 e SBTI ng/mL) PRT-201 do clone y y V y 55M3 Frasco f1 PRT-201 do clone V y y y 55M3 Frasco f2 PRT-201 do clone V y V V 55M3 Frasco t3 PRT-201 do clone ati- Vy V V J vado pela tripsina Tampão apenas (0,1 V Não feito V Não feito M de Tris, pH 8,3) TrypZean padrão, 1,56 Y Não feito y Não feito ng/ml f f 153 adição | bloqueio | (para 10 queio TrypZean ug/mL) TrypZean (para100 e SBTI ng/mL) ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml í Tabela 11: as diluições de TrypZean para a curva padrão foram preparadas usando o tampão de análise (0,1 M de Tris, pH 8,3). A curva pa- ' drão para soluções de TrypZean é mostrada na figura 21. A solução de substrato foi preparada (0,4 mg/ml de N-benzoil- 1 5 — Phe-Val-Arg-pNitroanilida lote 7733 em 0,1 M de Tris, pH 8,3) e pré- aquecida a 30ºC em banho-maria.

Em triplicado, 100 microlitros de cada amostra foram pipetados em uma microplaca de 96 poços.

Usando um pipe- tador multicanal, 200 microlitros de solução de substrato foram pipetados em cada poço e a microplaca foi colocada imediatamente em uma leitora de mi- croplaca preaquecida a 30ºC.

A leitora de microplaca registrou a absorvân- cia a 405 nm para cada poço uma vez por minuto durante 60 minutos.

As amostras da PRT-201 também foram testadas para atividade da elastase na análise SLAP.

A solução de substrato SLAP foi preparada (4,5 mg/mL de SLAP em 0,1 M de Tris, pH 8,3) e preaquecida a 30ºC em banho-maria.

As amostras de 1 mg/ml de PRT-201 foram diluídas 20X com água a 0,05 mg/mL.

Em triplicado, 10 microlitros de cada diluição da amostra foram pipetados em uma microplaca de 96 poços.

Usando um pipetador mul- ticanal, 300 microlitros de solução de substrato SLAP foram pipetados em t 154 cada poço e a microplaca foi colocada imediatamente em uma leitora de mi- croplaca preaquecida a 30ºC.

A leitora de microplaca registrou a absorvân- cia a 405 nm para cada poço uma vez por minuto durante 5 minutos.

Os resultados das análises da atividade BENZ e SLAP são, res- pectivamente, apresentados nas Tabelas 12 e 13 abaixo.

Descrição Nenhuma | Com bloqueio | Com SB- | Com blo- adição TrypzZe- Tli(para 10 queio an(para100 ugimL) | TrypZeane ng/mL) SBTI PRT-201 do clone |<1,56[a] 118,7 <1,56[a] | <1,56[a] 55M3 Frasco ff1 PRT-201 do clone|<1,56[a] 122,4 <1,56 [a] <1,56 [a] 55M3 Frasco tff2 PRT-201 do clone |<1,56[a] 122,8 <1,56[a] | <1,56[a] 55M3 Frasco f3 PRT-201 do clone|87 130,0 <1,56[a] | <1,56/ a] É ativado pela tripsina Tampão apenas (0,1|1,3 Não feito <1,56 [a] Não feito M de Tris, pH 8,3) TrypZean padrão, | 2,7 Não feito <1,56 [a] Não feito 1,56 no/ml Trypzean padrão, | 3,7 Não feito <1,56 [a] Não feito 3,13 ng/ml TrypZean padrão, | 6,5 Não feito <1,56 [a] Não feito 6,25 ng/ml TrypZean padrão, | 11,2 Não feito <1,56 [a] Não feito 12,5 no/mL Tr5ypZean padrão, 25 | 23,5 Não feito <1,56 [a] Não feito ng/ml TrypZean padrão, 50 | 49,4 Não feito <1,56 [a] Não feito ng/ml TrypZean padrão, 100 | 102,4 Não feito <1,56 [a] Não feito no/ml Tabela 12. A atividade média da tripsina relatada como equiva- lente da concentração da TrypZean (ng/mL). [a] Coeficiente de regressão <0,8. Nenhuma adição PRT-201 do clone 55M3 Frasco f1 t « 155 PRT-201 do clone 55M3 Frasco 42 PRT-201 do clone 55M3 Frasco 3 PRT-201 do clone ativado pela tripsina Tabela 13. A atividade média da SLAP relatada como U/mg O nível de atividade da tripsina da PRT-201 do clone 201-55M3- 003-WVU foi abaixo da faixa da curva-padrão na análise da atividade da tripsi- na (<1,56 ng/mL). Além disso, os coeficientes de regressão para as reações de hidrólise triplicadas foram pobres (<0,8), suportando ainda a ausência da atividade da tripsina nesta proteína elastase madura autoativada. Em con- trapartida, o nível de atividade da tripsina da amostra controle ativada pela tripsina foi determinada para ser 8,7 ng/mL.

NA GQOLAQTLAQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM valina' onde: VCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV

TSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYISWINNVIASN " X=VouL 2 | Elastase | huma- | Aminoácido, | VGGTEAGRNSWPSOISLOYRSGGSRYHTCGGTLI

RONWVMTAAHCVDYOKTFRVVAGDHNLSQNDGT na madura, me- | formato —de| EOYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAOSV mosaprimeia letra única, | TNSWOCUPOESALANNSceVTaNeITc "valina" onde: VCAGGDOVRSGCAGOSGGPLHCLVNGKYSXHGV

TSFVSSRGONVSRKPTVFTOQVSAYISWINNVIASN X=Voul 3 | Elastase | huma- | Aminoácido, | GGTEAGRNSWPSOISLOYRSGGSRYHTCGGTLIR

QNWVMTAAHCVDYQKTFRYVAGDHNLSONDGTE na madura, me- formato de QYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSVT ai SS N nos as primeiras |letra única, | NS E A AS GS VAWVGETURNTRO duas "valinas" onde: CAGGDGVRSGCAGOSGGPLHCLVNGKYSXHGVT

SFVSSRGCNVSRKPTVETOAVSAYVISWINNVIASN X=VouLl 4 Elastase | huma- | Aminoácido, | AVGGTEAGRNSWPSOISLOYRSGGSRYHTCGGTL

IRQNWVMTAAHCVDYOKTFRVVAGDHNLSQNDGT na madura, com | formato —de | EQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAOSV imeira "vali- ni TLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCY|TGWGKTKTN a primeira "vali | letra única, | qo agTLOGAYLPSVOYAICSSSSYWGSTVKNTIM na", substituída | onde: VCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCGLVNGKYSXHGV ad TSFVSSRGCNVSRKPTVFETQVSAYISWINNVIASN pela "alanina' X=Voul

+ 156 Descrição Tipo de se- | Sequência quência Elastase | huma- | Aminoácido, | VVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGGSRYHTCGGTL o IRQNWVMTAAHOVDYGKTFRVVAGDHNLSONDGT na madura (isoti- | formato — de | EQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV S nha ni TLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKTKTN po 2), incluindo a | letra única GOLAQTLOQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM primeira "valina” VCAGGDGSSLWMPG Pró-proteína da Aminoácido, | TODLPETNAAWGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG ; SRYHTCGGTLIRONWVMTAAHCVDYOKTFRVVAG elastase modifi- | formato — de | DHNLSQNDGTEQYVSVQKIVVHPYWNSDNVAAGY úni DIALLRLAOSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCY] ProTAR vanan- [onde RESPONSES Cada PI 42 varian- | onde:

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTOVSAVYIS te) X=Voul | WNNVIASN Y Pró-proteína da Aminoácido, TODLPETNAAAVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG s SRYHTCGGTLIRONWVYVMTAAHCVDYOKTFRYVVAG elastase modifi- | formato — de | DHNLSONDGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY ni DIALLRLAOSVTLNSYVOLGVLPOEGAI/LANNSPCY| cada no. 2 letra única, | TewektKTNGOLAQTLACAYLPSVDYAICSSSSY onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCOLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTOVSAYIS - X=VouL WINNVIASN Pró-proteína da | Aminoácido, | TODLPETAMAVVGGTEAGRNSWPSOISLOYRSGG - nº ITOGGTURONWVM YOKTFI elastase modifi- | formato — de DENLSONDSTEQYSVAIVVHoYANSDNVAAOY cada no: 3 letra — única, | TENGKTKTNGALAQTLAGAVLPSVDYAICSSSSY . onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGEPLHCLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKFTVFTOQVSAYIS xXx=VouL WINNVIASN Pró-proteína da | Aminoácido, | TADLPETNNAPVGGTEAGRNSWPSOISLOYRSGG " SRYHTCGGTLIRONWYVMTAAHCVDYOKTFRYVAG elastase modifi- | formato — de | puNLSQNDGTEGYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY ni DIALLRLAQSVTLNSYVOLGVLPQEGAILANNSPCY| cada NO. 4 letra — única, | rewekTKkTNGALAGTLAGAYLPSVOYAICSSSSY onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTOVSAYIS X=VouL WINNVIASN Pró-proteíina da | Aminoácido, | TADLPETNARVVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG ; SRYHTCGGTLIRONWVMTAAHCVDYOKTFRYWVAG elastase do tipo | formato — de | DHNLSONDGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY úni DIALLRLAOSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCY] selvagem no. 5 E única, TEWSKTKTNGOLAQTLOGAYLPSVDYAICSSSSY roduzida da onde: WGSTVKNTMVE IDGVRSGCAG! IPLHOLV P 2 Eh NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS sequência ativa- X=VouL WINNVIASN da pela tripsina PPROT24) Sequência de Aminoácido, |Xaa, Xaa, Xaa; reconhecimento formato de |xXaa,= alanina, leucina, isoleucina, me- da S dito con três letras h, asparagina ou valina senso 1 (Posi- : S ÃO ções Xaa,=P3, a = sp alanina, leucina, isoleu- Xaa,=P2, Xa- valina, ou treonina a;=P1) Xaa; = alanina, leucina, valina, isoleu-

à. 157 Descrição Tipo de se- | Sequência quência LL e ac ousenha Sequência de Aminoácido, |Xaa, Pro Xaa, reconhecimento | formato — de | x22, = alanina, leucina, isoleucina, me- da elastase con- | trêsletras — | pu valina senso 2 (Posi- Xago = alanina, Íeuci lina, isolstici ções P3-P2-P1) (aa, = alanina, leucina, valina, isoleuci- 13 | Sequência de Aminoácido, |Xaa, Xaa, Xaa; reconhecimento | formato —de |x22,= asparagina ou alanina da elastase con- | três letras a senso 23 (Posi- Xaa, = prolina ou alanina ções P3-P2-P1) Xaa; = alanina ou leucina ou valina Sequência de Aminoácido, | AlaAlaAla : reconhecimento |formato de E da elastase 1 três letras (Posições P3- P2-P1) : Sequência de Aminoácido, | AsnálaAla reconhecimento | formato de da elastase 2 três letras . (Posições P3- P2-P1) Sequência de Aminoácido, | AsnAlaPro reconhecimento | formato de da elastase 3 três letras (Posições P3- P2-P1) 17 | Sequência de Aminoácido, | asnAlsArg reconhecimento | formato de da tripsina de três letras tipo selvagem (PPROT24) (Po- sições P3-P2- P1) Sequência de Aminoácido, | aAlaPro Ala reconhecimento | formato — de da elastase 5 três letras (Posições P3- P2-P1)

' 159 Descrição Tipo de se- | Sequência quência Sítio de clivagem | Aminoácido, | ThrGly Ala Giy te Vaí Giy Gy PPROT44 formato — de três letras | sítio de clivagem | Aminoácido, | Thrval Pro Gly Val Val Gly Gy pPROT45 formato — de três letras 31 sítio de clivagem | Aminoácido, | ThrAla Pro Gy Vai Val Gly Gly PPROT46 formato — de três letras 32 | sítio de clivagem | Aminoácido, | ThrAsnPro Gy Val Val Gly Gly pPpPROT47 formato — de três letras 33 Re- | Nucleotídeo | ACCCAGGACCTTECGGAAACCAATGCCCGCGTA E: çã A GTCGGAGEGACTGAGGCCEGGAGGAATICOTG x gião de codifica- GCCCTCTCAGATITCCCTCCAGTACCGGTCTGG ã AGGTTCCCGGTATCACACCTGTGGAGGGACCCT ão de uma elas TATCAGACAGAACTGGGTGATGACAGCTGCTCA ' tase-1 humana CTGCGTGGATTACCAGAAGACTTTCCGCGTGGT : GGCTGGAGACCATAACCTGAGCGAGAATGATGG (NCBI No. de CACTGAGCAGTACGTGAGTGTGCAGAAGATCOGT

GGTGCATCCATACTGGAACAGCGATAACGTGGC - acesso TGCCGGCTATGACATGGCCOTGCTGCGCCTEGE NM 001971 CCAGAGCGTTACCCTCAATAGCTATGTCCAGCTE HA ) GGTGTICTGCCCCAGGAGGGAGCCATCCTGGCT

AACAACAGTCCCTGCTACATCACAGGCTEGEGÇ - AAGACCAAGACCAATGGEGCAGCTGGCCÇAGACO CTGCAGCAGGCTTACCTGCCCTCTGTGGACTAC GCCATCTGCTCCAGCTCOTCCTACTGGEGCTCO ACTGTGAAGAACACCATGGTGTGTGCTGETGGA GATGGAGTTCGCTCTGGATGCCAGGGTGACTCT GEGGGGCCCCCTCCATTGCTTGGTGAATGGCAAG TATTCTGTCCATGGAGTGACCAGCTTTGTGTCCA GCCGEGEGCTGTAATGTCTCCAGGAAGCCTACAG TCTTCACCCAGGTCTCTGCOTTACATO TCOTGGAT

ARATAATGTCATCGCCTCCAACTGA 34 | Peptídeo sinal do | Aminoácido, | Met-Arg-Phe-Pro-Ser-lle-Phe-Thr-Ala-Val-Leu-Phe- Ala-Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala-Ata-Pro-ValAsn-Thr- fator alfa da le- formato — de vedura três letras | 20F primer Nucleotídeo | ggctegaganaaagagaggcigaagetactcaggaccttocgganac caatgcoccag 37 | Elastase variante | Aminoácido, AAVVGGTEAGRNSWPSOQISLOYRSGGSRYHTCG ” A GTLIRQONWVMTAAHCVDYQKTFRYVAGDHNLSON do sítio de cliva- | formato — de | DGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLA gempPROT42 [letra única, | RR AA ANDES GOTA P3 onde: X = V | NTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLVNGKYSX ul HGVTSFYSSRGONVSRKPIVETONSATISWINNVIA

N

Descrição Tipo de se- | Sequência quência 38 | Elastase variante | Aminoácido, A RSINONTA MONEY TE VWOASOANHÓNOS do sítio de cliva- | formato — de | TEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAOS Rr VTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKTKT gempPROT42 letra Única, | NGOLAQTLOQAYLPSVOYAICSSSSYWGSTVKNT P2 onde: MVCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLVNGKYSXHG

VTSFVSSRGONVSRKPTVFTOVSAYISWINNVIASN X=VouLl 39 | Elastase pancre- | Aminoácido, | VWGGTEADGRNSWPSQISLOYRSGSSWAHTCGGTL 2 . IRQNWVMTAAHCVDRELTFRVYVYGEHNLNONDGT ática porcina formato — de | EQYVGVOKIVVHPYWNTDDVAAGYDIALLRLAQSV

EF GenBank Acesso VCAGGDGYRSGCOGDSGGPLHCLVNGOYAVHGVY

TSFVSRLGONVTRKPTVFTRVSAYISWINNVIASN PO0772.1) 40 | Domínio de cli- Aminoácido, Glu Thr Ala Ala Ata Vai Val Gly vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras : ante da elastase 40 í: 41 Domínio de cli- Aminoácido, | GluThrAsnAla Ala Ala Va! Gly vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante da elastase . 41 42 | Domínio de cli- Aminoácido, | GluThrAsnAla Ala Vai Val Gly vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante da elastase 42 43 | Domínio de cli- Aminoácido, | GluThrAsn Ala Pro Val Val Gly vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante da elastase 43 44 | Domínio decli- | Aminoácido, | GluThrGly Ala Giy Ne Val Gly vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante da elastase 44 45 | Domínio decli: | Aminoácido, | Giu ThrVal Pro Giy Val Val Gly vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras

Descrição Tipo de se- | Sequência quência ante da elastase ds 46 | Domínio de cli- Aminoácido, | Glu Thr Ala Pro Gty Val Vai Gty vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante da elastase 46 47 | Domínio de cli- Aminoácido, | GluThrAsnPro Gly Vai Val Gy vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante da elastase 47 48 | Domínio de cli- Aminoácido, | GluThrAsn Pro Als Vai Vai Gly vagem do pró- formato — de : peptídeo da vari- | três letras ante da elastase : 48 Domínio de cli- Aminoácido, | GluThrAsn His Ala Val Val Gly f vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras 7 ante da elastase 49 Sequência do Aminoácido, Ea O A COTAS TO NO ASTINO pró-peptídeo, formato — de | ThrTheGlu-Asp-Glu-Thr-Ala-Gln-lle-Pro-Ala-Glu- peptídeo e espa- | três letras ERRA EVA ouTS Nac AGR: gador sinal do REG Neta TA e SESiaRA, fator a de cru- Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala zamento da le- vedura 1 51 | Sequência do Aminoácido, a AA CASCA OLA AN TRONO | pró-peptídeo, e formato — de SONO E LOIACE ISA Carol ASSES: peptídeo sinal do | três letras Asp VarAla-Vatl eu-Pro-bhe-Serhsn-õe r-Thr-Ásn- fator a de cru- radiações Preço AR ar SA A pia zamento da le- vedura 2 52 | Domínio de cli- Aminoácido, | Glu ThrLys Pro Ala Val Val Gly vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante de elastase

Descrição Tipo de se- | Sequência quência DA a SA E Es aa 53 | Domíniodecli: | Aminoácido, | GluThrHis Pro Ala Val Val Giy vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 53 Domínio de cli- Aminoácido, | GluHis Asn Pro Ala Vel Val Gly vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 54 Domínio de cli- Aminoácido, | His ThrAsn Pro Ala Val Val Gly vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 55 Domínio de cli- Aminoácido, | ProThr His Pro Ala Val Val Gly vagem do pró- formato — de f peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 56 57 | Domínio de cli- Aminoácido, | ProThrAsn Pro Ala Val Val Gty vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 57 58 | Domínio de cli- Aminoácido, | His ThrHis Pro Ala Val Val Gy vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 58 Domínio de cli- Aminoácido, | Glu Th Phe Pro Ala Vai Vai Gly vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 59 Domínio de cl: | Aminoácido, | His ThrPhe Pro Ata Vai Vai Gly vagem do pró- formato — de

Descrição Tipo de se- | Sequência quência peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 60 61 Domínio de cli- Aminoácido, | GtyThrPhe Pro Ala Val Val Gty vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 61 62 | Domínio de cli- Aminoácido, | His Thr Gly Pro Ala Vai Vai Ghy vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 62 : 63 | Domínio de cli- Aminoácido, | His ThrLys Pro Ala Val Val Gty - vagem do pró- formato — de peptídeo da vari- | três letras ante de elastase 63 Í Pró-enzima elas- Aminoácido, TODLPETNPAVVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG " SRYHTCGGTLIRONWVMTAAHCVDYQOKTFRVVAG tase com domí- formato de | DHNLSONDGTEOYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY : R i ni DIALLRLAQSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCY| nio de clivagem | letra única, | rewGkTKTNGQLAQTLAQAYLPSVOYAICSSSSY variante 48 onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVETOQVSAYIS X=VouL WINNVIASN Pró-enzima elas- Aminoácido, TODLPETNHAVYWVGGTEAGRNSYWPSOISLOYRSGG : SRYHTCGGTLIRONWYMTAAHCVDYOKTFRVVAG tase com domí- formato — de | DHNLSONDGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY B i úni DIALLRLAOSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCYI nio de clivagem | letra única, | TewGkTKTNGOLAGTLOQAYLPSVDYAICSSSSY variante 49 onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS X=VouL WINNVIASN Pró-enzima elas- | Aminoácido, | TADLPETKPAWGGTEAGRNSWPSOISLOYRSGG r SRYHTCGGTLIRONWVMTAAHCVDYQKTFRVYVAG tase com domí- |formato de DHNLSGNDSTEGYWSVQKNVIPYWNSDANVARGY : pão | AQSVTLNSYVOL EGAILANN nio de clivagem | letra única, | Te WGkTKTNGALAGTLAQAYLPSVDYAICSSSSY variante 52 onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVETQVSAYIS X=VouL WINNVIASN

Descrição Tipo de se- quência 67 | Pró-enzima elas- | Aminoácido, TARURETHPAWOGIEAGRNSWPSAISLOVRSGO r TCGG' ONWWV! ICVYDYOKTFRVYVAG tase com domí- | formato — de | DHNLSQNDGTEQYVSVOKIVVHPYIWANSDNVAAGY i i úni: DIAL RLAGSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCY| nio de clivagem | letra única, | Te WGKTKTNGALAQGTLAGAYLPSVDYAICSSSSY variante 53 onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDPSGGPLHCLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS X=VouL WINNVIASN Pró-enzima elas- | Aminoácido, SRA EE AENCOOS i HTCGGTLIRONWV KTFRVV, tase com domí- |formato de DHNLSONDSTEQYVSVOKIVVLPYWNSONVARGY i i úni IALLRLAGSVTLNSYVOL: IEGAILANNSPCY| nio de clivagem | letra Única, | TEWEkKTKTNGOLAQTLAGAYLPSVDYAICSSSSY variante 54 onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHOLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTOVSAYIS X=VouL WINNVIASN Pró-enzima elas- | Aminoácido, ESUAITINDAVSGTEAGRNSNPSCISLOVASOS RYHTCGGTLIRONWVMTAAH| YOKTFI tase com domí- | formato — de DIINESQNDSTEGWSVAKNVÍEYANSDIVARGY o PM RAROS AQSVTLN: HEGAILANN: - nio de clivagem | letra única, | TEWGKTKTNGOLAQTLAGAYLPSVDYAICSSSSY : variante 55 onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLV.

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTOVSAYIS é X=VouL WINNVIASN 70 | Elastase dotipo | Aminoácido, | ARVVGGTEAGRNSWPSOISLOYRSGGSRYHTCG : : GTLIRANWYMTAAHCVDYOKTFRYVAGDHNLSON selvagem + vari- | formato — de | DGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLA i úni QSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKT ante de clivagem | letra — única, | KTNGALAGTLODAYL PSVOYAICSSSSYWGSTVK - AlaArg onde: NTMVCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLVNGKYSX

HGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTOVSAYISWINNVIA X=VouL SN 71 | Elastase dotipo | Aminoácido, | RVWGGTEAGRNSWPSOISLOYRSGGSRYHTCGG ã TURONWVMTAAHCVDYOKTFRYVYAGDHNLS1 selvagem + vari- | formato — de | STEGYVSVOKNNPYANSDNVAAGYDIALURLAO i ni SVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKTK ante de clivagem | letra — única, | Tica AQTLOAAVL PSVDYAICSSSSYWOSTVKNT +Arg onde: MVCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLVNGKYSXHG

Descrição Tipo de se- | Sequência quência nio de clivagem | três letras glicina, asparagina, lisina, ou alanina da elastase hu- Xaa, = treonina, alanina, prolina ou Mana; cones histidina ponde aos resi- fiEES duos P5, P4, P3, Xaa; = alanina, leucina, isoleucina, me- P2.P1 Pq po tionina, lisina, asparagina ou valina e P'3 de um do- Xaa, = prolina, alanina, leucina, isoleu- mínio de cliva- cina, glicina, valina, ou treonina gem da elastase Xaas = alanina, leucina, valina, isoleu- cina, ou serina Xaa; = alanina, leucina, valina, isoleu- cina ou serina Xaa;, = glicina, alanina, ou valina É Xaa; = valina, treonina, fenilalanina, tirosina, ou triptofano 75 | Primer dameta- | Ácido Nucle- | ATC TAC GTA GTC GGA GGG ACT GAG GCC gêneses por ico

PCR 76 | Primer dameta- | Ácido Nucle- | stegac ag ct ste agt tos sgg cga t é: gêneses por ico

PCR 77 | Variante C- Proteína, VWVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGESRYHTCGETL

S IRQNWVMTAAHCVDYOKTFRVVAGDHNLSONDGT terminal da ELA1 | formato — de | EQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV madura de Talas | letra única ALAONGOAA PS SOVA CSS SVAWGSTANIA et al. VCAGGDGVRSGCAOGDSGGPPPLLGEWOVFSPW

Ê SDOLCVOPGL 78 | Variantes da Proteína, VVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGGSBYHTCGGTL ELA-1 madura — | formato de | ESYVSVeKVVHPAWNSDNVAAGYDIALLRLACSY letra única, | TLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPOYITGWGKTKTN ” | GOLAGTLOGAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM onde: VCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV.

TSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN B=WouR J=MouV X=Voul Z=QouR 79 | Variantes do Proteína, TUDLPETNAR peptídeo de ati- | formato — de vação (tipo sel- letra — única, vagem, tripsina

Descrição Tipo de se- | Sequência quência Clivável) onde U= QouH Variante do pep- | Proteína, Th Xaa, Asp Leu Pro Xaa; Xaa; Xaa, Xaa, Xaa; tídeo de ativação | formato — de | xaa, = glutamina ou histidina consenso três letras SS a, ; Xaa, = glutamato, histidina, prolina, glicina, asparagina, lisina, ou alanina Xaa; = treonina, alanina, prolina ou histidina Xaa, = alanina, leucina, isoleucina, me- tionina, lisina, asparagina ou valina Xaas= prolina, alanina, leucina, isoleu- cina, glicina, valina, ou treonina Xaa; = alanina, leucina, valina, isoleu- cina, ou serina Região de codifi- | Nucleotídeo | ACTCAGGACCTTCCGGAMACCAATGCCCGGGTA . GTCGGAGEGACTGAGECCGGGAGGAACTCCTGE cação da ELA- GCCCTCTCAGATITCCCTCCAGTACCGGTCTGG

1.2A AGGTTCCTGGTATCACACCTGTGGAGGGACCCT : TATCAGACAGAACTGGGTGATGACAGOTGCACA - CTGCGTGGATTACCAGAAGACTTTCCGCGTGGT

GGCTGGAGACCATAACCTGAGCCAGAATGATEG CACTGAGCAGTACGTGAGTGTGCAGAAGATCGT GGTGCATCCATACTGGAACAGCGATAACGTGGC TGCAGGCTATGACATCGCCCTECTECECCTEGO CCAGAGCGTTACCCTCAATAGCTATGTCCAGCTE GGTGTTCTGCCOCAGGAGGGAGCCATCCTGGCT AACAACAGTCCCTGCTACATCACAGECTEGAGC AAGACCAAGACCAATGGGCAGCTGECCCAGACG TTGCAGCAGGCTTACCTGCCCTCTGTGGACTAT GCCATCTGCTCCAGUTCCTCCTACTGBGGGCTCE ACTGTGAAGAACACTATGGTGTGTGCTGGTGGA GATGGAGTICGCTCTGGATGTCAGEGTEACTCT GGEGECCCCCTCCATTGCTTGGTGAATGGCAAG TATTCTCTICATGGAGTGACCAGCTITGTGTCCA GCCGEGGGCTGTAATGTCTCTAGAMAGCCTACAG TCTTCACACGGGTCTCTGCTTACATOTCCTGGAT

AAATAATGTCATCGCCTCCAAGTGATAA - TODLPETNARVVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG 62 | Produto ds trans= | Proteina, SWYHTCGGTLIRONWVMTAAHCVDYOKTFRVVAG lação da ELA- formato — de | DHNLSQNDGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCY!

1.2A letra única TGWGKTKTNGOLAQTLOQAYLPSVDYAICSSSSY a WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLV (sequência p- NGKYSLHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTRVSAYIS PROT?24 ativada pela tripsina)

Descrição Tipo de se- quência Variant í TUDLPETNARVVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG 93 Variantes do Proteína, SEYHTCGGTLIRONWYVJTAAHCVDYOKTFRVVAG produto de trans- | formato — de | DHNLSQNDGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY = Pansr DIALLRLAQSVTLNSYVOLGVLPQEGAILANNSPCY| lação da ELA- letra — única, | TGWGKTKTNGALAQTLOGAYLPSVDYAICSSSSY

1.2A onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHOLV : NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVETZVSAYIS (sequência p- U=QouH VINHAM detendo! . B=WouR pela tripsina; J=MouV X=VouLl Z=QouR Elastase | hu- Aminoácido, | VWGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGGSBYHTCGGTL

IRQNWVITAAHCVDYQKTFRVVAGDHNLSQNDGT mana madura, formato — de ANG NLPGEACENNSPENHTANSOICIN a 5 ã as TLNSYVOLGVLPOEGA!LANN: T IKTKTN incluindo a pri — [letra — única, | GOLAGTLAGAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM : meira "valina" onde: VCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV

À TSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAVISWINNVIASN B=WouR : J=MouV X=VouLl “ Z=QouR - 85 | Elastase! hu- Aminoácido, Ddr copa caro a geaççdidameçto MWVJTAAHCVDYOKTFRVVAGDHNLSO! mana madura, formato — de O VSVORN NH TNSSENRACYDIAIBCIGSOT, Tai únis LNSYVQLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKTKTNG sem e pnimera letra unica, OLAQTLOCAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTMY "valina" onde: CAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLVNGKYSXHGVT

SFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN B=WouR J=MouV X=VouLl Z=QouR Elastase | hu- Aminoácido, | GGTEAGRNSWPSQISLOVYRSGESBYHTCGGTLIR

ONWVITAAHCVDYOKTFRVVAGDHNLSONDGTE mana madura, formato — de | OyVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSVT mei ani LNSYVOLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTNG sem as primeiras | letra única, | o AGTLOQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTMVY duas "valinas" onde: CAGGDGVRSGCAGOSCGPLHOLVNGKYSXHGVT

SFVSSRGCNVSRKPTVETZVSAYISWINNVIASN B=WouR J=MouV X=VouL Z=QouR

Descrição Tipo de se- | Sequência r quência - 87 | Elastase!| hu- Aminoácido, trrdor gemas iam enáditics-ios mana madura, formato — de | EQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV mel ani TLNSYVOLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTN comaprimeira letra única, | goraGTLOAAYLPSVOYAICSSSSYWOSTVKNTM "valina" substitu- | onde: A SEN NORRE TOFISVOATININNMRSN ida pela "alani- B=WouR na" J=MouV X=VouLl Z=QouR 88 | Pró-proteina Aminoácido, SATAN ANSIOSO TONAERIVAS elastase modifi- | formato — de NS ANS VO OESTE ; ni DIALLRLAGSVTLNSYVOL EGAILANNSPCY] cada no. 1 (vari- [letra única, TGWGKTKTNGOLAATLOOAYLPSVOYAICSSSSY : WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCAGUSGGPLHCLV. ante pPROTAZ) onde: NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS & U=QouH WINNVIASN B=WouR f J=MouV X=Voul Z=QouR . Pró-proteína Aminoácido, sta Hs ape a dpi veia radritica elastase modifi- | formato — de | DHNLSQNDGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY Uni DIALLRLAQSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCY1 cada no. 2 letra única, | TewGKTKTNGOLAOTLOCAYLPSVDYAICSSSSY onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVETZVSAYIS U=QouH WINNVIASN B=WouR J=MouV X=VouL Z=QouR Pró-proteína Aminoácido, | TUDLPETARAVVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG elastase modifi- | formato — de | ShNsaNDGTEGYVSVOKIVVFPYIANSDNVARGY úni DIALLRLAOSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCY| cadano. $ letra única, | TEWGKTKTNGALAQTLOOAYLPSVOVAICSSSSY onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHOLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAVIS U=QouH WINNVIASN B=WouR J=MouV

Descrição Tipo de se- | Sequência ” quência - X=VouLl Z=QouR Pró-proteina Aminoácido, | TUDLPETNNAPVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG " SEBYHTCGGTLIRONWVJITAAHCVDYQKTFRVYVAG elastase modifi- | formato — de | DHNLSQNDGTEQYVSVOQKIVVHPYWNSDNVAAGY ni DIALLRLAGSVTLNSYVOLGVLPQEGAILANNSPCYI cada no. 4 letra — única, | TGWGKTKTNGOLAQTLOCAYLPSVDYAICSSSSY onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCONVSRKPTVETZVSAYIS U=QouH | WNNVASN B=WouR J=MouV X=Voul Z=QouR 92 | Pró-proteina Aminoácido, | TUOLPETNARVWGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG - SEYHTOGGTLIRQNWVJTAAHOVDYQKTFRVVAG - elastase modifi- | formato — de | DHNLSONDGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY úni DIALLRLAQSVTLNSYVOLGVLPQEGAILANNSPCY| cada no. 5(se- [letra única, AI NS ALA ESUDIAÇÕESSY. : ria ah . x * quência ativada onde: NOVOS IVCAG: E CONVERIE A aSATIS pela tripsina p- U=QouH WINNVIASN : PROT24) B=WouR J=MouV X=VouLl Z=QouR 93 | Sequência de Aminoácido, | Xaa, Pro Xaa, reconhecimento | formato —de |x22, = alanina, leucina, isoleucina, me- da elastase con trêsletras — À asparagina ou valina senso 2 (Posi- x fanina. Jeuci fina, iso ções P3-P2-P1) (aa, = alanina, leucina, valina, isoleu- Cina, ou serina Elastase variante | Aminoácido, | ANVVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGGSBYHTCG ” A GTLIRONWYWTAAHCVDYQKTFRVYAGDHNLSON do sítio de cliva- | formato — de | DGTEOYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLA ni QSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKT gempPROT42 letra Única, | KTNGOLAGTLOQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVK P3 onde: NTMVCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLVNGKYSX

HGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIA B=WouR | J=MouV X=VouL Z=QouR

SS VTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKTKT gempPROT42 | letra única, | NGOLAGTLGQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNT P2 onde: MVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLVNGKYSXHG

VTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN B=WouR J=MouV X=VouL Z=QouR Sequência do Aminoácido, Met-Arg-Phe-Pro-Ser-lle-Phe-Thr-Ala-Val-Leu-Phe- À o AAta-Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala-Ala-Pro-Val-Asn-Thr- pró-peptídeo, formato — de | Thr-TneGly-Asp-Glu-Thr-Ala-Gln-lle-Pro-Ala-Glu- de Ala-Vat-lle-Ghy-Tyr-Ser-Asp4 eu-Ghi-Gly-Asp-Phe- peptídeo e espa- | três letras “Asp-Val-Ala-Vall eu-Pro-bhe-Ser-Aen-Ser. Th çador sinal do AsnGiyLeu-Leu-Phelle-Asn-Thr-Thelle-Ala-Serile- Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-Gly.Val-SerLeu-Glu- fator a de cru- Glu-Ala-Glu-Alá Y aa " zamento da le- vedura f 97 | Sequência do Aminoácido, | Met-Arg-Phe-Pro-Ser-lie-Phe-Thr-Ala-Val-Leu-Phe- à. Ala-Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala-Ala-Pro-Val-Asn-Thr- pró-peptídeo e formato — de | Thr-The-Glu-Asp-Glu-Thr-Ala-Gin-lle-Pro-Ata-Glu- . i Ala-Val-lie-Gly-Tyr-Ser-Asp-Leu-Glu-Gly-Asp-Phe- peptídeo sinal do | três letras Asp Vel-Ala ValLeu Pro-Phe Ser-Asn-Ber-Thr fator a de cru- apro aa a tao Ada o setenta -Ala-Lys-Glu-Glu-Gly-Val MLeu-G * zamento da le- n vedura Pró-enzima elas- | Aminoácido, | TUDLPETNPAVVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG : SBYHTCGGTLIRONWVITAAHCVDYOKTFRVVAG tase com domií- | formato — de | DHNLSQNDGTEQYVSVQKIVVHPYWNSDNVAAGY i i ni DIALLRLAOSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCY) nio de clivagem letra — única, TEWGKTKTNGALAQTLOQAYL PSVOYAICSSSSY it o WESTVKNTMVYCAGGDGVRSGCQOGDS: PLHCLV Se Vanants 48 Onda: NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS U=QouH | WINNVIASN B=WouR J=MouV X=VouLl Z=QouR Pró-enzima elas- | Aminoácido, | TUDLPETNHAVVGGTEAGRNSWPSOISLOYRSGG í SBYHTCGGTLIRONWVJTAAHCVDYQKTFRYVAG tase com domí- | formato — de | pHNLSQNDGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVARGY i i áni DIALLRLAGSVTLNSYVOLGVLPQEGAILANNSPCY] nio de clivagem |letra única, | TEWGKTKTNGOLACTLOGAYLPSVDYAICSSSSY da variante 49 onde: WESTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS U=QouH WINNVIASN B=WouR

» 171 Descrição Tipo de se- | Sequência . quência - J=MouV X=Voul Z=QouR Pró-enzima elas- | Aminoácido, | TUDLPETKPAYVGGTEAGRNSWPSQGISLOYRSGG ; SBYHTCGGTLIRONWVISTAAHCVDYQKTFRVVAG tase com domí- | formato — de | DHNLSONDGTEGYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY i is ni DIALLRLAOSVTLNSYVOLGVLPOQEGAILANNSPCY| nio de clivagem | letra única, | *EWekKTKTNGOLAGTLAGAYLPSVDYAICSSSSY da variante 52 onde: WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS U=QouH | WINNVIASN B=WouR J=MouV X=VouLl Z=QouR S 101 | Pró-enzima elas- | Aminoácido, | TUDLPETHPAVWVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG

SEYHTCGGTLIRONWVJTAAHCVDYOKTFRVVAG tase com domí- | formato — de | DHNLSONDGTEQYVSVAKIVVHPYWNSDNVAAGY : i i áni DIALLRLAQSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCY! : nio de clivagem | letra única, | TóWGKTKTNGOLAQTLAQAYLPSVDYAICSSSSY da variante 53 onde: WGSTVKNTMYCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHOLV

NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVETZVSAYIS . U=QouH | WNNVIASN B=WouR J=MouV X=VouL Z=QouR Pró-enzima elas- | Aminoácido, | TUDLFEHNPAVVGGTEAGRNSWPSQISLAYRSGG . SEYHTCGGTLIRONWVITAAHCVDYOKTFRVVAG tase com domí- | formato — de ALON RISO POSEUUANNEREI f i úni DIALLRLAGSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCYI nio de clivagem |letra única, | T&wGKTKTNGOLAGTLAGAYLPSVDYAICSSSSY : : WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCAGUSGGPLHCLV da variante 54 onde: nã ã A ONVERIO SE U=zQouH | WINNVIASN B=WouR J=MouV X=VouL Z=QouR

Descrição Tipo de se- | Sequência - quência - ó-enzil - inoáci TUDLPHTNPAVVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGG 103 | Pró-enzima elas- | Aminoácido, ã SR NSNWODS OVA o tase com domí- | formato — de | DHNLSOQNDGTEQYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGY nio de clivagem |letra única, | PEMGKTNGOL AO TLGGAVLPSVOYAICSSSSY À: í WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLV da variante 85 onde: NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS U=QouH WINNVIASN B=WouR J=MouV X=Voul Z=QouR 104 | Elastase de tipo | Aminoácido, | ARVVGGTEAGRNSWPSOISLOYRSGGSBYHTCG | GTLIRONWWITAAHCVDYQOKTFRVVAGDHNLSON selvagem + vari- |fomato — de | peTEOYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLA i Áúúni OSVTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKT ante de clivagem | letra — única, | KTNGOLAGTLOQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVK - AlaArg onde: NTMVCAGGDGVRSGCAGDSGGPLHCLVNGKYSX

HGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIA B=WouR | SN : J=MouV X=VouLl Y Z=QouR Elastase de tipo | Aminoácido, | RVVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGGSBYHTCGGT . à: LIRONWVYJTAAHCVDYOKTFRYVAGDHNLSONDG selvagem + vari- | formato — de | TEGYVSVOKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAOS i nie VTLNSYVOLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKTKT ante de clivagem | letra — única, | Não AGTLAQAYLPSVOYAICSSSSYWGSTVKNT Arg onde: MVCAGGDGVRSGCOGDSGGPLHCLVNGKYSXHG

VTSFVYSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN B=WouR J=MouV X=Voul Z=QouR 106 | Elastase | huma- | Aminoácido, | TEAGRNSWPSOISLOYRSGGSBYHTCGGTLIRON

WWVJITAAHCVDYOKTFRVVAGDHNLSQNDGTEQYY na madura, me- | formato — de | svOKIVVHPYWNSDONVAAGYDIALLRLAOSVTLNS Ann as YVOLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKTKTNGOLA nos sequência N | letra única, | oT/GoAYLPSVOYAICSSSSYWGSTVKNTMVCAG inal "VVGG" | onde: GDGVRSGCAGDSGGPLHOLVNGKYSXHGVTSFV terminal AVEEN andas 'SSRGCNVSRKPTVETZVSAYISWINNVIASN B=WouR J=MouV X=VouL Z=QouR

Descrição Tipo de se- | Sequência r quência is je il 3d AGRNSWPSQISLOYRSGGSBYHTCGGTLIRONWV 107 | Elastase | huma- | Aminoácido, A ESAOCVOYEN TPAVNSGBRNESÔNDS TEQNVSY na madura, me- | formato — de | OKIVVHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSVTLNSYY ani, E QLGVLPOEGAILANNSPCYITGWGKTKTNGOLAQT nos sequência N | letra única, LEOGAVLPSVDYAICSSSSYWSSTVKNTMVCAGSD terminal USO! onde: RGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN TE B=WouR J=MouV X=VouLl Z=QouR [= | huma- | Aminoácido, | NSWPSOISLOYRSGGSBYHTCGGTLIRONWVJTA 109 | Elasfãss + | AHCVDYOKTFRVVAGDHNLSONDGTEQYVYSVOKI na madura, me- | fomato — de E DENSO ANSPGIISNENRONCOLAA adultas ” mm VLPOEGA/LANNSPOYITGWGI Ti nos sequência N | letra — Única, | AavLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTMVCAGGDGVR inal " * : SGCAGDSGGPLHCLVNGKYSXHGVTSFVSSRGC amina, 'WES onde: NVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN - TEAGR B=WouR J=MouV X=Voul Z=QouR É Sequência da Ácido Nucle- | GAATTCAGTACTCAGGACCTTCCGGAAACCAATO ã CCCGGGTAGTCGGAGGGACTGAGECCEGGAGG Figura 1A ico AACTCCTGGCCCTCTCAGATITOCOTCCAGTACO 4 GGTCTGGAGEGTTCCTGGTATCACACCTGTGGAG

GGACCCTTATCAGACAGAACTGGGTGATGACAG CTGCACACTGCGTGGATTACCAGAAGACTITCC GCGTEGTGECTEGAGACCATAACCTGAGCCAGA ATGATGGCACTGAGCAGTACGTGAGTGTGCAGA AGATCGTGGTGCATCCATACTGGAACAGCGATA ACGTGGCTGCAGGCTATGACATOGCCCTGCTEC GCCTGGCCCAGAGCGTTACCOTCAATAGCTATG TCCAGCTGGGTGTTCTGCCCCAGEAGGGAGCCA TCCTGGCTAACAACAGTCCCTGCTACATCACAGE CTGGEEGCAAGACCAAGACCAATGGGCAGCTEG CCCAGACCTTGCAGCAGGCTTACCTGCCCTCTE TGGACTATGCCATCTGCTCCAGCTCCTCCTACTE GGGCTCCACTGTGAAGAACACTATGGTGTGTGC TGGTOGAGATGGAGTTCGCTCTGGATGTCAGEG TGACTCTGGGGGCCCCCTCCATTGCTTGGTGAA TGGCAAGTATICTCTTCATGGAGTGAGCAGOTTT GTGTCCAGCCGGGGCTGTAATGTCTCTAGAAAG CCTACAGTCTICACACGGGTCTCTGCTTACATOT CCTGGATAMATAATGTCATCGCCTCCAACTGATA

AGCTIGGATCCGTCGAC 110 | Sequência da Aminoácido, | MKRILAIHOAMEGAPRVTLTSRANSISTSTHHSVLH à. SGAPVGGAGADGIVHRGQOVSLLOGLGOL PIGLGLA Figura 1A formato — de | PACDVAGTYWSODGSLLGONTOLDIAIEGNALGOA letra úni: OQOGDVIACSHVIAVPVWMHHDLLHTHVLLSANILAQ letra única VMVSSHHAESLLVIHAVOSCHHPVLSDKGPSTGVI

RGTSRPVLEGNLRGPGVPPGLSPSDYPOIGFRKVL

Descrição Tipo de se- | Sequência - quência r 111 | Sequência da Ácido Nucle- | ACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGEG : GTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCOTACT Figura 1B ico CAGGACCTTCCGGAAACCAATGCCCGGGTAGTC

GEECEEG 112 | Sequência da Aminoácido, | THRILEALASERILEALAALALYSGLUGLU GLY

VAL SERLEU GLU LYS ARG GLU ALA GLU ALA Figura 1B formato — de | THRGLN ASP LEU PRO GLU THR ASN ALA ARG três letras VAL VACGDEGIY 113 | Sequência da Ácido Nucle- | COGCGGACCCAGGACTITCCAGAMACCAACGCC : À CGGETAGTTGGAGGGACCGAGGCTCAGAGGAA Figura 13 ico TTCTTGGCCATOTCAGATITOCCTCCAGTACCGG

TCTGGAAGTTCGTGGGCTCACACCTGTEGAGEG ACCCTCATGAGGCAGAACTGGGTGATGACAGCC GCTCACTGCGTGGACAGAGAGTTGACCTTCCGT GTGGTGGTTGGAGAGCACAACOTGAACOAGAAC GATGGCACCGAGCAGTACGTGGGGGTGCAGAA GATCGTGGTGCATCCCTACTGGAACACGCGACGA CETEGGCTGCAGGCTATGACATOGOCOTGCTGCG CETEGGCCCAGAGTGTAACCCTCAAÇAGCTACGT CCAGCTGGGTGTTCTGCCAAGGGCTGGGACCAT CCTGGCTAACAACAGTCCCTGCTACATCACAGE * GTEGGEGGCCTGACCAGGACCAATGGGCAGCTEG CCCAGACCCTGCAGCAGGCTTACCTGCCÇACOG TGGACTACGCCATCTGCTCCAGCTCCTCGTACT GGGECTCCACCGTGAAGAACAGCATGGTGTGCG : CCGEAGEGGACEGAGTTCECTCTGGATETÇAG GGTGATTCTGGGGECCCCCTTCATIGCTTGGTG AATGGTCAGTATGCTGTCCACGGTGTAACCAGCT

TCGTGTCCCGCCTGEGCTGTAATGTCACCAGGA fr AGCCCACAGTCTTCACCAGGGTCTCTGCTTACAT

CTOTTGGATAMATAACGTCATTGCCAGCAACTGA

TAATCTAGA . : inoáci: TODFPETNARVVGGTEAGRNSWPSQISLOYRSGS 114 Seq Nena da Aminoácido, | SEA TCCGTURQNWYMTAAHCVDRELTFRVVWVG Figura 14 formato — de | EHNLNONDGTEOYVGVOKIVVHPYWNTDDVAAGY a DIALLRLAGSVTLNSYVOLGVLPRAGTILANNSPCY1 letra única TGWGLTRTNGOLAQTLOQAYLPTVDYAICSSSSY

WGSTVKNSMVCAGGDGVRSGCAGOSGGPLHCLV NGQYAVHGVTSFVSRLGCNVTRKPTVETRVSAYIS

WINNVIASN 115 | Sequência do Aminoácido, | Phe Pro Glu Thr Asn Ala Arg Vel Val Gly domínio de cli- formato — de vagem da p- três letras PROT101-24-V ativada pela trip- sina 116 | Sequência do Aminoácido | Phe Pro Glu Thr Asn Ala Ala Vai Val Gly domínio de cli- vagem da p- PROT10142-V autoativada 117 | Sequência do Aminoácido | Leu Pro His Thr Asn Pro Ala Vai Vai Gly domínio de cli-

: 175 e este - quência " vagem da p- PROT101-49-V

A domínio de cli- vagem da p- PROT101-55L-V autoativada

8. MODALIDADES ESPECÍFICAS, CITAÇÕES DE REFERÊN-

CIAS A presente invenção é exemplifica pelas modalidades específi- cas abaixo. : 5 1. Uma proteína que compreende (i) uma sequência de ativação - da elastase compreendendo uma sequência de reconhecimento da elastase É operacionalmente ligada a (ii) sequência de aminoácido de uma elastase madura.

2. A proteína da modalidade 1, em que a sequência de reconhe- cimento da elastase compreende a SEQ ID NO: 11.

3. A proteína da modalidade 1, em que a sequência de reconhe- cimento da elastase compreende a SEQ ID NO: 12.

4. A proteína da modalidade 1, em que a sequência de reconhe- cimento da elastase compreende a SEQ ID NO: 13.

5. A proteína da modalidade 1, em que a sequência de reconhe- cimento da elastase compreende a SEQ ID NO: 93.

6. A proteína da modalidade 1, modalidade 2 ou modalidade 4, em que a sequência de reconhecimento da elastase compreende qualquer uma das SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 ouSEQIDNO:21.

7. A proteína da modalidade 1, em que a sequência de ativação compreende a SEQ ID NO: 80.

8. A proteína da modalidade 1 ou da modalidade 7, em que a sequência de ativação compreende a SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 72, ou É SEQ ID NO: 73. . 9. A proteina da modalidade 1, em que a proteína compreende um domínio de clivagem compreendendo a SEQ ID NO: 74.

10. A proteína da modalidade 1 ou da modalidade 9, em que o domínio de clivagem compreende qualquer uma das SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55.

11. A proteína de qualquer uma das modalidades de 1 a 5e7, que compreende a SEQ ID NO: 64.

12. A proteína de qualquer uma das modalidades de 1 a 5e7, que compreende a SEQ ID NO: 69.

13. Uma proteína pró-elastase tipo | compreendendo uma se- O. quência de domínio de clivagem da SEQ ID NO: 74. - 15 14. A proteína pró-elastase tipo | da modalidade 13, em que o domínio de clivagem compreende qualquer uma das SEQ ID NO: 42, SEQ * ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO: 55. í 15. A proteína pró-elastase tipo | da modalidade 13 ou modali- dade 14, em que a sequência de elastase madura compreende uma se- quência tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequên- cia de aminoácido da posição 6 (por exemplo, C-terminal ao resíduo P5' de acordo com as denominações do aminoácido da elastase aqui) até o final da SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO:1.

16. A proteína pró-elastase tipo | da modalidade 13 ou da moda- lidade 14, que compreende uma sequência tendo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da posição 6 (por exemplo, C- terminal ao resíduo P5' de acordo com as denominações do aminoácido da elastase aqui)até o final da SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 1.

17. A proteína pró-elastase tipo | da modalidade 13 ou da moda- lidade 14, que compreende uma sequência tendo pelo menos 98% de iden- tidade de sequência com a sequência de aminoácido da posição 6 até o final da SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 1. õ 18. A proteína pró-elastase tipo | da modalidade 13 ou da moda- : lidade 14, em que a elastase madura compreende uma sequência tendo até 10 alterações conservadoras de aminoácido relativa à sequência de aminoá- cidoda posição 6 até o final da SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 1.

19. A proteína pró-elastase tipo | da modalidade 13 ou da moda- lidade 14, que compreende uma sequência tendo até 7 alterações conserva- doras de aminoácido relativa às sequência de aminoácido da posição 6 até o final da SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 1.

20. A proteína pró-elastase tipo | da modalidade 13 ou da moda- lidade 14, que compreende uma sequência tendo até 5 alterações conserva- doras de aminoácido relativa à sequência de aminoácido da posição 6 até o final da SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 1. : 21. A proteína pró-elastase tipo | de qualquer uma das modali- - 15 dadesde13a20,em que o resíduo de aminoácido indicado por "Xaa1" na SEQ ID NO: 74 é o glutamato ou a histidina. f 22. A proteína pró-elastase tipo | de qualquer uma das modali- dades de 13 a 21, em que o resíduo de aminoácido indicado por "Xaa4" na SEQ ID NO: 74 é a prolina.

23. A proteína pró-elastase tipo | de qualquer uma das modali- dades de 13 a 22, em que o resíduo de aminoácido indicado por "Xaa5" na SEQ ID NO: 74 é a alanina.

24. A proteína pró-elastase tipo | de qualquer uma das modali- dades de 13 a 23, em que o resíduo de aminoácido indicado por "Xaa1" na SEQIDNO:74é a histidina, por "Xaa4" na SEQ ID NO: 74 é a prolina, e por "Xaa5" na SEQ ID NO: 74 é a alanina.

25. A proteína pró-elastase tipo | de qualquer uma das modali- dades de 13 a 24 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 103.

26. A proteína pró-elastase tipo | da modalidade 25 que compre- ende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 64.

27. A proteína pró-elastase tipo | da modalidade 25 que compre-

Í 178 ende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 69. " 28. A proteína de qualquer uma das modalidades de 1 a 27, que e é isolada.

29. A proteína de qualquer uma das modalidades de 1 a 27 que compreende uma sequência sinal.

30. Uma proteina compreendendo (i) uma sequência sinal; (ii) um sequência de ativação da elastase incluindo uma sequência de reconhe- cimento da elastase; e (iii) a sequência de aminoácido de uma elastase ma- dura.

31. A proteína da modalidade 30, em que a sequência sinal é operável em Pichia pastoris.

32. A proteína da modalidade 30, em que a sequência sinal é um peptídeo sinal do fator a da levedura.

: 33. A proteína da modalidade 32, em que o peptídeo sinal do fa- - 15 torada levedura compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

34. - 34. A proteína da modalidade 30, em que a sequência sinal é uma sequência sinal de secreção de mamífero. " 35. As proteínas da modalidade 34, em que a sequência sinal de secreção de mamífero é uma sequência sinal da elastase tipo | porcina.

36. A proteína da modalidade 34, em que a sequência sinal de secreção de mamífero é uma sequência sinal da elastase tipo | humana.

37. A proteína da modalidade 1 ou da modalidade 30 em que a sequência de reconhecimento da elastase é uma sequência de reconheci- —mentoda elastase tipo! humana.

38. A proteína da modalidade 1 ou da modalidade 30 em que a elastase matura é uma elastase tipo | humana.

39. A proteína da modalidade 1 ou da modalidade 30 em que a elastase madura é uma elastase tipo | porcina.

40. Um ácido nucleico que codifica uma proteína de qualquer uma das modalidades de 1 a 39.

41. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma se-

quência de nucleotídeo que codifica uma proteína, tal proteína compreen- Ê dendo (i) uma sequência de ativação incluindo uma sequência de reconhe- . cimento da elastase operativamente ligada à (ii) sequência de aminoácido de uma elastase.

42. A molécula de ácido nucleico da modalidade 41, em que a proteína compreende ainda uma sequência sinal operativamente ligada à referida sequência de ativação.

43. A molécula de ácido nucleico da modalidade 41 ou da moda- lidade 42, em que a sequência sinal é operável em Pichia pastoris.

44. O ácido nucleico de qualguer uma das modalidades de 41 a 43, em que a sequência de reconhecimento da elastase é uma sequência de reconhecimento da elastase tipo |.

45. O ácido nucleico de qualquer uma das modalidades de 41 a ; 44, em que a sequência de reconhecimento da elastase é uma sequência de - 15 reconhecimento da elastase tipo |! humana. À 46. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali- dades de 41 a 45 em que a sequência de reconhecimento da elastase com- preende a SEQ ID NO: 11.

47. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali- dadesde41ad45em que a sequência de reconhecimento da elastase com- preende a SEQ ID NO: 12.

48. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali- dades de 41 a 45 em que a sequência de reconhecimento da elastase com- preende a SEQ ID NO: 13.

49. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali- dades de 41 a 45 em que a sequência de reconhecimento da elastase com- preende a SEQ ID NO: 93.

50. O ácido nucleico de qualquer uma das modalidades de 41 a 46 e 48, em que a sequência de reconhecimento da elastase compreende — qualquer uma das SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

51. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali-

| 180 dades de 41 a 50, em que a sequência de ativação compreende a SEQ ID NO: 80. - 52. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali- dades de 41 a 45 e 51, em que a sequência de ativação compreende a SEQ 1IDNO:23, SEQID NO: 72, ou SEQ ID NO: 73.

53. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali- dades de 41 a 46, em que a proteína compreende um domínio de clivagem compreendendo a SEQ ID NO: 74.

54. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali- dadesde41a46e53,emque o domínio de clivagem compreende qualquer uma das SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55.

55. O ácido nucleico de qualquer uma das modalidades de 41 a f 54, em que a elastase é uma elastase madura tipo |! humana. 5 56. O ácido nucleico de qualquer uma das modalidades de 41 a 54, em que a elastase é uma elastase madura tipo | porcina.

57. O ácido nucleico de qualquer uma das modalidades de 41 a 54, em que a elastase compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 87 e SEQ ID NO: 39.

58. O ácido nucleico da modalidade 57, em que a elastase com- preende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4.

59. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali- dades de 42 a 58, em que a sequência sinal é um peptídeo sinal do fator a da levedura.

60. A molécula de ácido nucleico da modalidade 59, em que a proteína compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 96 e SEQ ID NO:

97.

61. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali- dades42ede44as58,em que a sequência sinal é uma sequência sinal de secreção de mamífero.

62. A molécula de ácido nucleico da modalidade 61 em que a

: 181 sequência sinal de secreção de mamífero é uma sequência sinal da elastase é tipo | porcina.

. 63. A molécula de ácido nucleico da modalidade 61 em que se- quência sinal de secreção de mamífero é uma sequência sinal da elastase tipolhumana.

64. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modali- dades de 41 a 63, em que a proteína compreende a sequência de aminoáci- do de qualquer uma das SEQ ID NOS.: 88 a 91 e 98 a 103.

65. A molécula de ácido nucleico da modalidade 64, em que a proteina compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das NOS SEQID.: 6a 9 e 64 a69.

66. A molécula de ácido nucleico da modalidade 64, em que a proteina compreende qualquer uma das combinações de polimorfismos de elastase estabelecidos na Tabela 2.

To 67. A molécula de ácido nucleico de modalidade 64, em que a proteína compreende qualquer uma das combinações de polimorfismos de elastase estabelecidos na Tabela 3.

68. A proteína codificada pela molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades de 41 a 67.

69. A proteína da modalidade 68 que está isolada.

70. Um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades de 41 a 67.

71. O vetor da modalidade 70 compreende ainda uma sequência de nucleotídeo que controla a expressão do gene é operativamente ligada à sequência de nucleotídeo que codifica a referida proteína.

72. O vetor da modalidade 70 ou da modalidade 71, em que a sequência de nucleotídeo que codifica a referida proteína é multimerizada.

73. Uma célula hospedeira compreendendo o vetor de qualquer uma das modalidades de 70 a 72.

74. A célula hospedeira da modalidade 73 na qual pelo menos uma cópia do referido vetor é integrado no genoma da célula hospedeira.

75. A célula hospedeira da modalidade 74 na qual uma cópia do

| 182 referido vetor é integrado no genoma da célula hospedeira. f 76. A célula hospedeira da modalidade 74 na qual de duas a . cinco cópias do referido vetor estão integradas no genoma da célula hospe- deira.

77. A célula hospedeira da modalidade 74 ou 76 na qual duas cópias do referido vetor estão integradas no genoma da célula hospedeira.

78. A célula hospedeira da modalidade 74 ou 76 na qual três có- pias do referido vetor estão integradas no genoma da célula hospedeira.

79. A célula hospedeira compreendendo pelo menos uma cópia damolécula de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades de 41 a 67 integrada em seu genoma.

80. A célula hospedeira da modalidade 79 na qual uma cópia da referida molécula de ácido nucleico está integrada em seu genoma.

81. A célula hospedeira da modalidade 79 na qual de duas a - 15 cincocópias da referida molécula de ácido nucleico tá integrada em seu ge- noma.

82. A célula hospedeira da modalidade 79 na qual duas cópias da referida molécula de ácido nucleico está integrada em seu genoma.

83. A célula hospedeira da modalidade 79 na qual três cópias da referida molécula de ácido nucleico está integrada em seu genoma.

84. Uma célula geneticamente modificada para expressar a mo- lécula de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades de 41 a 67.

85. A célula da modalidade 84, em que a sequência de nucleotí- deo é operativamente ligada a um promotor induzível por metanol.

86. Uma célula Pichia pastoris geneticamente modificada para expressar a sequência de nucleotídeo de qualquer uma das modalidades de 41 a67.

87. A célula Pichia pastoris da modalidade 87, na qual a se- quência de nucleotídeo é operativamente ligada a um promotor induzível por metanol.

88. Um sobrenadante de cultura celular compreendendo a prote- ina de qualquer uma das modalidades de 1 a 27 ou da modalidade 68.

À 183

89. Um método para produzir uma proteína elastase, compreen- É dendo a cultura da célula hospedeira da modalidade 84 sob condições nas - quais a proteína é produzida.

90. Um método para produzir uma proteína elastase, compreen- dendo a cultura da célula hospedeira da modalidade 85 sob condições nas quais a proteína é produzida.

91. Um método para produção uma proteína elastase, que com- preendendo a cultura da célula hospedeira da modalidade 86 sob condições nas quais a proteína é produzida.

92. Um método para produzir uma proteína elastase, compreen- dendo a cultura da célula hospedeira da modalidade 87 sob condições nas quais a proteína é produzida.

93. Método da modalidade 91 ou da modalidade 92, onde as re- feridas condições incluem um período de crescimento ou indução a um pH - 15 de2as6.

94. Método da modalidade 91 ou da modalidade 92, onde as re- feridas condições compreendem um período de crescimento ou indução a uma temperatura de 22ºC a 28ºC.

95. Método de qualquer uma das modalidades de 89 a92, em quea célula hospedeira é cultivada em meio complexo.

96. Método da modalidade 95, em que o meio complexo é o meio complexo de metanol tamponado ou o meio complexo de glicerol tam- ponado.

97. Método de qualquer uma das modalidades de 89 a 96, em quea célula hospedeira é cultivada na presença de um composto de citrato, succinato ou acetato.

98. Método da modalidade 97, em que o composto de citrato, succinato ou acetato é o citrato de sódio, succinato de acetato de sódio, res- pectivamente.

99. Método da modalidade 97 ou modalidade 98, em que um composto de citrato, succinato ou acetato está presente na referida cultura a uma concentração de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50-200 mM, 100-

À 184 150 MM, 75-125 mm, ou de 90-110 mM. E 100. Método da modalidade 97 ou da modalidade 98, em que : mais de um composto de citrato, succinato ou acetato está presente na refe- rida cultura, e em que a concentração total dos compostos de citrato, succi- natoou acetato na referida solução é de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50 - 200 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ou de 90-110 mM.

101. Método de qualquer uma das modalidades de 89 a 100 compreendendo ainda a recuperação da proteína.

102. Método da modalidade 95, em que a proteína é recuperada pelarecuperação do sobrenadante.

103. Método da modalidade 95, em que a proteína é recuperada do sobrenadante.

104. Método da modalidade de qualquer uma das modalidades í de 95 a 104, em que a proteína recuperada não possui a sequência sinal. MS 105. Método da modalidade de qualquer uma das modalidades : de 95 a 104, em que a proteína recuperada não tem nem a sequência sinal nem a sequência de ativação.

106. Método de qualquer uma das modalidades de 89 a 92 e 93 a 105, compreendendo ainda a elevação do pH de uma solução contendo a proteinaaumpHde6a12.

107. Método de qualquer uma das modalidades de 89 a 92 e 93 a 106, que compreende ainda colocar a proteina em contato com uma quan- tidade catalítica de uma elastase.

108. Método de qualquer uma das modalidades de 89 a 92 e 93 a106,que compreende ainda sujeitar a proteína a condições de autoativa- ção, colocando a proteína em contato com uma quantidade catalítica de uma elastase, ou ambos.

109. Método da modalidade 108, em que a proteína é submetida a condições de auto-ativação.

110. Método da modalidade 109, em que a proteína está no so- brenadante quando sujeitada a condições de autoativação.

111. Um método para produzir uma proteína elastase, compre-

: 185 endendo: Ú (a) a cultura de uma célula hospedeira capaz de expressar uma - proteína pró-elastase recombinante na presença de um primeiro composto de citrato, succinato ou acetato; (b) a recuperação da proteína pró-elastase recombinante da re- ferida cultura da célula hospedeira; e (c) opcionalmente, expondo a proteína pró-elastase recombinan- te a condições de ativação para produzir uma proteína elastase madura.

Produzindo então uma proteína elastase.

112. Método da modalidade 111, em que o método compreende a etapa de expor a proteína pró-elastase recombinante a condições de ati- vação para produzir uma proteína elastase madura.

113. Método da modalidade 112, em que a proteína pró-elastase : recombinação é purificada anterior a referida exposição para condições de - 15 ativação.

114. Método da modalidade 113, em que a referida proteína pró- elastase recombinante é purificada na presença de um segundo composto de citrato, succinato ou acetato, de tal forma que uma solução compreen- dendo a referida proteína pró-elastase purificada e o segundo composto de citrato, succinato, ou acetato é produzida.

115. Método de qualquer uma das modalidades de 111 a 114, em que o referido primeiro composto de citrato, succinato ou acetato é citra- to de sódio, succinato de sódio, ou acetato de sódio, respectivamente.

116. Método da modalidade 114 ou modalidade 115, em que o referido segundo composto de citrato, succinato, ou acetato é citrato de só- dio, succinato de sódio ou acetato de sódio, respectivamente.

117. Método de qualquer uma das modalidades de 114 a 116, em que o referido primeiro e segundo compostos de citrato, succinato ou acetato são os mesmos.

118. Método de qualquer uma das modalidades de 114 a 116, em que o referido primeiro e segundo compostos de citrato, succinato ou acetato são diferentes.

—

À 186

119. Método de qualquer uma das modalidades de 114 a 118, Ê em que um composto de citrato, succinato ou acetato está presente na refe- : rida cultura a uma concentração de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50- 200 mM, 100-150 mM, 75-125 mm, ou de 90-110 mM.

120. Método de qualquer uma das modalidades de 114 a 118, em que mais de um composto de citrato, succinato ou acetato estão presen- tes na referida cultura, e em que a concentração total de compostos de citra- to, succinato ou acetato na referida cultura é de 5-50 mM, 7,5-100 mM, mM 10-150, 50-200 mM, 100-150 mM, 75-125 mm, ou de 90-110 mM.

121. Método de qualquer uma das modalidades de 111 a 120, em que um composto de citrato, succinato ou acetato está presente na refe- rida solução a uma concentração de 5-50 mM, 7,5-100 MM, 10-150 mM, 50- 200 mM, 100-150 MM, 75-125 mM, ou 90-110 mM. : 122. Método de qualquer uma das modalidades de 111 a 120, - 15 emquemaisde um composto de citrato, succinato ou acetato estão presen- tes na referida solução, e em que a concentração total dos compostos de citrato, succinato ou acetato na referida solução é 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10- 150 MM, 50-200 mM, 100-150 mM, 75-125 mM ou 90-110 mM.

123. Método de qualquer uma das modalidades de 111 a 122, emquea célula hospedeira é cultivada em meio complexo.

124. Método da modalidade 123, em que o meio complexo é o meio complexo de metanol tamponado ou o meio complexo de glicerol tam- ponado.

125. Método de qualquer uma das modalidades de 111 a 124, em que a proteína pró-elastase é recuperada do sobrenadante da referida célula hospedeira.

126. Método de qualquer uma das modalidades de 111 a 125, em que as referidas condições de ativação compreendem exposição à tripsi- na.

127. Método de qualquer uma das modalidades de 111 a 125, em que as referidas condições de ativação são condições de auto-ativação.

128. Método de qualquer uma das modalidades de 111 a 127

| 187 que compreende ainda a etapa de isolamento da referida proteína elastase À madura. - 129. Método de qualquer uma das modalidades de 111 a 128, em que a proteína elastase madura é uma proteína elastase madura tipo |.

130. Método de modalidade 129, em que a proteína elastase madura tipo | é uma proteína elastase madura tipo | humana.

131. Método da modalidade 129, em que a proteína elastase madura tipo | é uma proteína elastase madura tipo | porcina.

132. Um método para produzir uma proteína elastase madura, compreendendo: (a) liofilizar uma proteína pró-elastase, (b) armazenar a proteína pró-elastase liofilizada; (c) reconstituir a proteína pró-elastase liofilizada; e (d) ativar a proteína pró-elastase reconstituída, produzindo assim uma proteína elastase “* 15 madura - 133. Método da modalidade 132, em que a proteína pró-elastase é recombinante.

134. Método da modalidade 133, em que a proteína pró-elastase é produzida ou obtida por um processo compreendendo (i) a cultura de uma célula hospedeira que é capaz de expressar a proteína pró-elastase sob condições nas quais a proteína pró-elastase é expressa; e (ii) a recuperação da proteína pró-elastase.

135. Método da modalidade 134, em que a célula hospedeira é cultivada num meio complexo.

136. Método da modalidade 135, em que o meio complexo é o meio complexo de metanol tamponado ou o meio complexo de glicerol tam- ponado.

137. Método de qualquer uma das modalidades de 132 a 136, em que a célula hospedeira é cultivada na presença de um composto de ci- trato, succinato ou acetato.

138. Método da modalidade 137, em que o composto de citrato, succinato ou acetato é citrato de sódio, succinato de sódio ou acetato de re

À 188 sódio, respectivamente.

139. Método da modalidade 137 ou da modalidade 138, em que - um composto de citrato, succinato ou acetato está presente na referida cultu- ra a uma concentração de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50-200 mM, —100-150 mM, 75-125 mM, ou de 90-110 mM.

140. Método da modalidade 137 ou da modalidade 138, em que mais de um composto de citrato, succinato ou acetato estão presentes na referida cultura, e em que a concentração total dos compostos de citrato, succinato ou acetato na referida solução é 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50-200 mM, 100-150 mM, 75-125 mm, ou de 90-110 mM.

141. Método de qualquer uma das modalidades de 132 a 140 em que a proteína pró-elastase é recuperada do sobrenadante da referida célula hospedeira.

142. Método de qualquer uma das modalidades de 132 a 141, À 15 emque a proteína pró-elastase é purificada antes da liofilização.

143. Método de qualquer uma das modalidades de 132 a 142, onde a proteína pró-elastase liofiizada é armazenada por um período de pelo menos um dia, ou pelo menos uma semana, ou pelo menos um mês ou pelo menos três meses.

144. Método de qualquer uma das modalidades de 132 a 143, em que a proteína pró-elastase é armazenada a uma temperatura de -80ºC aro.

145. Método de qualquer uma das modalidades de 132 a 144, em que a referida etapa de ativação compreende a ativação de tripsina.

146. Método de qualquer uma das modalidades de 132 a 144, em que a referida etapa de ativação compreende auto-ativação.

147. Método de qualquer uma das modalidades de 132 a 146 que compreende ainda a etapa de isolamento da referida proteína elastase madura.

148. Método de qualquer uma das modalidades de 132 a 147, em que a proteína elastase madura é uma proteína elastase madura tipo |.

149. Método de modalidade 148, em que a proteína elastase madura tipo | é uma proteína elastase madura tipo | humana.

150. Método de modalidade 148, em que a proteína elastase à. madura tipo | é uma proteína elastase madura tipo | porcina.

151. Um método para produzir uma proteína elastase madura ti- pol compreende sujeitar uma proteína elastase tipo | autoativada recombi- nante às condições de autoativação colocando em contato uma proteína e- lastase tipo | autoativada recombinante com uma quantidade catalítica de elastase, ou ambos, produzindo, assim, uma proteína elastase madura tipo |.

152. Método da modalidade 151, em que a referida proteína e- lastase tipo | autoativada recombinante é obtida ou pode ser obtida por um processo compreendendo: (a) a cultura da célula hospedeira da modalidade 84 ou 86 sob condições nas quais a proteína é expressa; e (b) recuperar a proteína expressa, produzindo assim uma proteí- naelastase tipo | autoativada recombinante. - 153. Método da modalidade 152, em que a célula hospedeira é cultivada em meio complexo.

154. Método da modalidade 153, em que o meio complexo é o meio complexo de metanol tamponado ou o meio complexo de glicerol tam- ponado.

155. Método de qualquer uma das modalidades de 152 a 154, em que a célula hospedeira é cultivada na presença de um composto citrato, succinato ou acetato.

156. Método da modalidade 155, em que o composto de citrato, acetato ou succinato é citrato de sódio, succinato de sódio e acetato de só- dio, respectivamente.

157. Método da modalidade 155 ou da modalidade 156, em que um composto de citrato, succinato ou acetato está presente na referida cultu- ra a uma concentração de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mm, 50-200 mM, —100-150 MM, 75-125 mM, ou de 90-110 mM.

158. Método da modalidade 155 ou da modalidade 156, em que mais de um composto de citrato, succinato ou acetato estão presentes na é 190 referida cultura, e em que a concentração total de compostos de citrato, suc- : cinato ou acetato na referida solução é de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 - MM, 50-200 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ou de 90-110 mM.

159. Método de qualquer uma das modalidades de 152 a 158, emquea recuperação da proteína expressa compreende a recuperação do sobrenadante.

160. Método da modalidade 159, em que a referida etapa de au- to-ativação é realizada no sobrenadante.

161. Método de qualquer uma das modalidades de 152 a 154, emquea proteína expressa é recuperada do sobrenadante.

162. Método da modalidade 161, em que a referida etapa de au- toativação é realizada no sobrenadante.

163. Método da modalidade 161, que compreende ainda a etapa de purificação da proteína expressa.

164. Método de qualquer uma das modalidades de 151 a 163, . em que sujeitando a proteína pró-elastase tipo | autoativada recombinante às condições de autoativação compreende a elevação do pH de uma solu- ção contendo o proteína recuperada.

165. Método da modalidade 164, em que o pH da solução é ele- vadoaum pH básico.

166. Método da modalidade 165, em que o pH é básico varia de 7a.

167. Método da modalidade 166, em que o pH básico é 8.

168. Método de qualquer uma das modalidades de 164 a 167, emquea proteina recuperada está em uma concentração de 10 mg/ml ou menos na referida solução.

169. Método de qualquer um das modalidades de 164 a 167, em que a proteína recuperada está em uma concentração de 5 mg/ml ou menos na referida solução.

170. Método de qualquer uma das modalidades de 164 a 167, em que a proteína recuperada está em uma concentração de 2 mg/ml ou menos na referida solução.

171. Método de qualquer uma das modalidades de 164 a 167, é em que a proteína recuperada está em uma concentração de 1 mg/ml ou " menos na referida solução.

172. Método de qualquer uma das modalidades de 164 a 167, emquea proteína recuperada está em uma concentração de 0,5 mg/ml ou menos na referida solução.

173. Método de qualquer uma das modalidades de 164 a 167, em que a proteína recuperada está em uma concentração de 0,25 mg/ml ou menos na referida solução.

174. Método de qualquer um das modalidades de 165 a 173, em que a proteína recuperada está em uma concentração de pelo menos 0,1 mg/ml na referida solução.

175. Método de qualquer uma das modalidades de 165 a 173, em que a proteína recuperada está em uma concentração de pelo menos 0,2mg/minareferida solução.

” 176. Método de qualquer uma das modalidades de 165 a 175 em que a proteína recuperada é exposta ao pH básico por um período de 0,5 a 8 horas.

177. Método da modalidade 174, em que a proteína recuperada é exposta ao pH básico por um período de 2 a 7 horas.

178. Método da modalidade 177, em que a proteína recuperada é exposta ao pH básico por um período de 6 horas.

179. Método de qualquer uma das modalidades de 165 a 178, em que a referida exposição a um pH básico é realizada a uma temperatura de22ºCa2z8C.

180. Método de modalidade 179, em que a referida exposição a um pH básico é realizada a uma temperatura de 26ºC.

181. Método da modalidade de 152 a 180, em que a proteína re- cuperada é armazenada antes da autoativação.

182. Método da modalidade 181, em que a proteína recuperada é liofilizada antes do armazenamento.

183. Método da modalidade 182, em que a proteína recuperada í 192 é purificada antes da liofilização. S 184. Método de qualquer uma das modalidades de 181 a 183, * em que a proteína recuperada é armazenada por um período de pelo menos um dia, pelo menos uma semana, pelo menos um mês ou menos pelo me- nostrêsmeses.

185. Método da modalidade 184, em que a proteína recuperação é armazenada a uma temperatura de 80ºC a +4ºC.

186. Método de qualquer uma das modalidades de 150 a 185 à medida que tais modalidades não dependam das modalidades 160 ou 162 emquea pró-elastase tipo | autoativada recombinante é purificada antes de submetê-la às condições de autoativação.

187. Método de qualquer uma das modalidades de 150 a 186, que compreende ainda a etapa de isolamento da referida proteína elastase madura tipo |.

Á 15 188. Método de qualquer uma das modalidades de 150 a 187, - em que a proteína elastase madura tipo | é uma proteína elastase madura tipo | humana.

189. Método de qualquer uma das modalidades de 150 a 187, em que a proteína elastase madura tipo | é uma proteína elastase madura tipolporcina.

190. Um método para produzir uma proteína elastase madura ti- po | compreende: (a) a cultura da célula hospedeira da modalidade 84 ou 86 sob condições nas quais a proteína é expressa; (b) recuperar a proteína expressa; (c) purificar da proteína recuperada; (d) elevar o pH de uma solução contendo a proteína ou colocar em contato a proteína recuperada com uma quantidade catalisadora de elas- tase para produzir um proteína elastase madura tipo |, produzindo assim uma proteína elastase madura tipo |.

191. Método da modalidade 190, em que a célula hospedeira é cultivada em meio complexo.

: 193

192. Método de modalidade 191, em que o meio complexo é o : meio complexo de metanol tamponado ou o meio complexo de glicerol tam- + ponado.

193. Método de qualquer uma das modalidades de 190 a 192, emquea célula hospedeira é cultivada na presença de composto de citrato, succinato ou acetato.

194. Método da modalidade 193, em que o composto de citrato, succinato ou acetato é citrato de sódio, succinato de sódio, ou acetato de sódio, respectivamente.

195. Método da modalidade 193 ou da modalidade 194, em que um composto de citrato, succinato ou acetato está presente na referida cultu- ra a uma concentração de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50-200 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ou de 90-110 mM.

196. Método da modalidade 193 ou da modalidade 194, em que maisde um composto de citrato, succinato ou acetato estão presentes na referida cultura, e em que a concentração total de compostos de citrato, suc- cinato ou acetato na referida solução é de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 MM, 50-200 mM, 100-150 mM, 75-125 mm, ou de 90-110 mM.

197. Método de qualquer uma das modalidades de 190 a 196, que compreende ainda a etapa (e) de purificação da referida elastase madu- ratipo |.

198. Método de qualquer uma das modalidades de 190 a 197, em que a proteína elastase tipo | madura é uma proteína elastase madura tipo | humana.

199. Método de qualquer uma das modalidades de 190 a 197, em que a proteína elastase tipo | madura é uma proteína elastase madura tipo | porcina.

200. Um método para produzir uma proteína elastase tipo | ma- dura compreende: (a) cultivar a célula hospedeira da modalidade 84 ou 86 sob condições nas quais a proteína é expressa; (b) recuperar a proteína expressa; e

À 194 (c) expor a proteína recuperada a um pH básico até uma proteí- : na madura ser produzida; & produzindo assim uma proteína elastase tipo | madura.

201. Método da modalidade 200, em que a célula hospedeira é cultivadaem meio complexo.

202. Método da modalidade 201, em que o meio complexo é o meio complexo de metanol tamponado ou omeio complexo de glicerol tam- ponado.

203. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 202, em que a célula hospedeira é cultivada na presença de composto de citrato, succinato ou acetato.

204. Método da modalidade 203, em que o composto de citrato, succinato ou acetato é citrato de sódio, succinato de sódio ou acetato de sódio, respectivamente.

ê 15 205. Método da modalidade 203 ou da modalidade 204, em que . um composto de citrato, succinato ou acetato está presente na referida cultu- ra a uma concentração de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50-200 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ou de 90-110 mM.

206. Método da modalidade 203 ou da modalidade 204, em que maisde um composto de citrato, succinato ou acetato estão presentes na referida cultura, e em que a concentração total de compostos de citrato, suc- cinato ou acetato na referida solução é de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 MM, 50-200 mM, 100-150 mM, 75-125 mm, ou de 90-110 mM.

207. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 206, emqueopHbásicoéde7ao.

208. Método da modalidade 207, em que o pH básico é 8.

209. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 208, em que a proteína recuperada está em uma concentração de 10 mg/ml ou menos quando exposta ao pH básico.

210. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 208, em que a proteína recuperada está em uma concentração de 5 mg/ml ou menos quando exposta ao pH básico.

À 195

211. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 208, : em que a proteína recuperada está em uma concentração de 2 mg/ml ou . menos quando exposta ao pH básico.

212. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 208, emquea proteína recuperada está em uma concentração de 1 mg/ml ou menos quando exposta ao pH básico.

213. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 208, em que a proteína recuperada está em uma concentração de 0,5 mg/ml ou menos quando exposta ao pH básico.

214. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 208, em que a proteína recuperada está em uma concentração de 0,25 mg/ml ou menos quando exposta ao pH básico.

215. Método de qualquer uma das modalidades de 209 a 214, E: em que a proteína recuperada está em uma concentração de pelo menos 0,1mg/ml quando exposta ao pH básico.

fio 216. Método de qualquer uma das modalidades de 209 a 214, em que a proteína recuperada está em uma concentração de pelo menos 0,2 mg/ml quando exposta ao pH básico.

217. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 214, em que a proteína recuperada é exposta ao pH básico por um período de 0,5 a 8 horas.

218. Método da modalidade 217, em que a proteína recuperada é exposto ao pH básico por um período de 2 a 7 horas.

219. Método da modalidade 218, em que a proteína recuperada é expostaao pH básico por um período de 6 horas.

220. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 219, em que a referida exposição a um pH básico é realizada a uma temperatura de 22ºC a 28ºC.

221. Método da modalidade 220, em que a referida exposição a um pH básico é realizada a uma temperatura de 26ºC.

222. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 221, que compreende ainda a etapa de (d) isolar a referida proteína elastase tipo

| 196 | madura. Ê 223. Método de qualquer uma das modalidades de 150 a 222, * em que a elastase tipo | madura é uma elastase tipo | porcina madura.

224. Método de qualquer uma das modalidades de 150 a 222, emquea8elastase tipo | madura é um a elastase tipo | humana madura.

225. Um método para produzir uma formulação de proteína elas- tase madura, compreendendo: (a) submeter uma proteína pró-elastase autoativada às condi- ções de autoativação para produzir a proteína elastase madura e (b) formular a proteína elastase madura, produzindo assim uma formulação de proteína elastase madura.

226. Método da modalidade 225, em que a proteína pró-elastase autoativada é recombinante.

: 227. Método da modalidade 226 compreende ainda, antes da etapade (a) recuperar a proteína pró-elastase da cultura de uma célula hos- ” pedeira capaz de expressar a referida proteína pró-elastase autoativada crescida sob condições nas quais a proteína pró-elastase é expressa.

228. Método da modalidade 225 ou da modalidade 226, com- preendendo ainda, antes da etapa (b), purificar a referida proteína elastase madura.

229. Método de qualquer uma das modalidades de 225 a 228, em que a referida etapa de formulação compreende a liofilização da referida proteína elastase madura.

230. Método da modalidade 229, em que a proteína elastase madura não é misturada com o tampão ou ingredientes tampão antes da liofilização.

231. Método de modalidade 230, em que a proteína elastase madura é misturada com um ou mais ingredientes tampão após a liofiliza- ção.

232. Método da modalidade 229, em que a proteína elastase madura é misturada com o tampão ou um ou mais ingredientes tampão an- tes da liofilização.

í 197

233. Método da modalidade 231 ou 232, em que o tampão é - uma solução salina tamponada com fosfato ("PBS") ou os ingredientes tam- pão são ingredientes tampão PBS.

234. Método de qualquer uma das modalidades de 231 a 233, emqueo tampão compreende o dextrano ou em que os ingredientes tam- pão compreendem o dextrano.

235. Método da modalidade 234, em que o dextran é o dextrano-

18.

236. Método de qualquer uma das modalidades de 230 a 235, emqueotampão compreende o polissorbato 80.

237. Método de qualquer uma das modalidades de 229 a 236, em que a referida etapa de formulação compreende ainda a reconstituição da proteína elastase madura liofilizada com um líquido.

é 238. Método da modalidade 237, em que o líquido é a água. É 15 239. Método da modalidade 237, em que o líquido é um tampão. ” 240. Método da modalidade 239, em que o tampão é um tampão de capacidade total, tampão maior do que a capacidade total ou tampão menor do que a capacidade total.

241. Método de qualquer uma das modalidades de 237 a 240, em que após a reconstituição de uma solução de proteína elastase madura em tampão de capacidade total, tampão maior do que a capacidade total ou tampão menor do que a capacidade total é produzido.

242. Método da modalidade 241, em que os ingredientes tampão estão presentes na liofilização, acrescentados na reconstituição, ou ambos.

243. Método de qualquer uma das modalidades de 240 a 242, em que o tampão de capacidade total compreende 1X PBS.

244. Método da modalidade 240 ou 241, em que o tampão me- nor do que a capacidade total compreende de 0,1X PBS a 0,5X PBS.

245. Método da modalidade 244, em que o tampão menor do quea capacidade total compreende 0,1X PBS.

246. Método da modalidade 244, em que o tampão menor do que a capacidade total compreende 0,5X PBS.

247. Método da modalidade 240 ou 241, em que o tampão maior . do que a capacidade total compreende de 1,1X PBS a 3X PBS. ” 248. Método da modalidade 247, em que o tampão maior do que a capacidade total compreende de 1,5X PBS a 2X de PBS.

249. Método de qualquer uma das modalidades de 241 a 248, em que o tampão inclui o dextran.

250. Método da modalidade 249, em que o dextran é o dextran

18.

251. Método de qualquer uma das modalidades de 241 a 250, emqueo tampão inclui o polissorbato 80.

252. Método de qualquer uma das modalidades de 241 a 251, em que o tampão está em um pH de 7 a 8.

253. Método da modalidade 252, em que o tampão está em um é pH de7,4.

254. Método de qualquer uma das modalidades de 237 a 253, fe. em que a proteína elastase madura é reconstituída a uma concentração de 0,001 mg/ml a 50 mg/ml.

255. Método da modalidade 254, em que a proteína elastase madura é reconstituída a uma concentração de 0,1 mg/ml a 40 mg/ml.

256. Método da modalidade 255, em que a proteína elastase madura é reconstituída a uma concentração de 5 mg/ml a 30 mg/ml.

257. Método da modalidade 256, em que a proteína elastase madura é reconstituída a uma concentração de 10 mg/ml a 20 mg/ml.

258. Método de qualquer uma das modalidades de 225 a 257, em que a referida formulação é uma composição farmacêutica compreen- dendo a referida proteína elastase madura.

259. Método de qualquer uma das modalidades de 225 a 258, em que a proteína elastase tipo | madura é uma proteína elastase madura tipo | humana.

260. Método de qualquer uma das modalidades de 225 a 258, em que a proteína elastase tipo | madura é uma proteína elastase madura tipo | porcina.

À 199

261. Um método para produzir uma elastase tipo | madura liofili- - zada, compreendendo: - (a) produzir uma elastase madura tipo | de acordo com o método de qualquer uma das modalidades de 151 a 181; (b) isolar a elastase madura tipo |; (c) liofilizar a referida elastase tipo | madura isolada, produzindo, assim, uma elastase tipo | madura liofilizada.

262. Método da modalidade 261, em que a elastase tipo | madu- ra liofilizada é de 95% a 100% pura.

263. Método da modalidade 261 ou da modalidade 262, em que a elastase tipo | madura liofilizada é pelo menos 95% pura.

264. Método da modalidade 261 ou da modalidade 262, em que a elastase tipo | madura liofilizada é pelo menos 98% pura. À 265. Método de qualquer uma das modalidades de 261 a 264, emquea elastase tipo | madura liofilizada é purificada para homogeneidade. ão 266. Método de qualquer uma das modalidades de 261 a 265, em que a proteína elastase tipo | madura é uma proteína elastase tipo | ma- dura humana.

267. Método de qualquer uma das modalidades de 261 a 265, emquea proteína elastase tipo | madura é uma proteína elastase madura tipo | porcina.

268. Método de qualquer uma das modalidades 130, 149, 188, 198, 223, 259 e 267, em que a proteína elastase tipo | humana madura con- siste essencialmente da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 84, ou SEQ ID NO: 87.

269. Método da modalidade 268, em que a proteína elastase tipo | humana madura consiste essencialmente da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:

4.

270. Método de qualquer uma das modalidades 131, 150, 189, 199, 224, 260 e 268, em que a proteína elastase tipo | porcina madura con- siste essencialmente da SEQ ID NO: 39.

271. Método de qualquer uma das modalidades de 111 a 128, 132 e 148, 151 a 197 e 225 a 257, em que a proteína pró-elastase é uma proteína de qualquer uma das modalidades de 13 a 27. É 272. Método de qualquer uma das modalidades de 200 a 222, - em que a proteína expressa é uma proteína de qualquer uma das modalida- des de 13 a 27.

273. Elastasetipo | humana madura produzida ou que pode ser obtida pelo método de qualquer uma das modalidades 149, 188, 198 e 223.

274. Elastasetipo | humana madura da modalidade 273 que tem uma atividade específica de 1 a 40 U/mg de proteína.

275. Elastasetipo | porcina madura produzida ou que pode ser obtida pelo método de qualquer uma das modalidades 150, 189, 199 e 224.

276. Elastasetipo | humana madura da modalidade 275, que tem uma atividade específica de 10 a 100 U/mg de proteína.

277. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz terapeuticamente da (a) elastase tipo | humana madura da modalida- : 15 de273ouda modalidade 274 ou (b) um formulação da elastase tipo | huma- " na madura produzida ou que pode ser obtida pelo método da modalidade

259.

278. Composição farmacêutica da modalidade 277, em que a proteína elastase tipo | humana madura consiste essencialmente da SEQ ID NO:5,SEQID NO: 84, ou SEQ ID NO: 87.

279. Composição farmacêutica da modalidade 278, em que a proteína elastase tipo | humana madura consiste essencialmente da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4.

280. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz terapeuticamente da (a) elastase tipo | porcina madura da modalidade 275 ou da modalidade 276 ou (b) uma formulação da elastase tipo | porcina madura produzida ou que pode ser obtida pelo método da modalidade 260.

281. Composição farmacêutica da modalidade 280, em que a proteína elastase tipo | porcina madura consiste essencialmente da SEQ ID NO:39.

282. Composição farmacêutica compreendendo (i) uma quanti- dade eficaz terapeuticamente da elastase tipo | madura humana e (ii) um

: 201 veículo farmaceuticamente aceitável, em que a composição farmacêutica é caracterizada por pelo menos uma das seguintes propriedades: (a) a composição é livre de tripsina; (b) a composição é substancialmente livre de tripsina; (c) a composição é livre de qualquer proteína consistindo da SEQ ID NOS: 2, 3, 37, 38, 70 e/ou 71; (d) a composição é substancialmente livre de qualquer proteína consistindo da SEQ ID NOS: 2, 3, 37, 38, 70 e/ou 71; (e) a composição é livre de proteínas bacterianas; (f) a composição é substancialmente livre de proteínas bacteria- nas; (g) a composição é livre de proteínas de mamíferos exceto a re- ferida elastase tipo | humana madura; Ê (h) a composição é substancialmente livre de proteínas de ma- " 15 míferos exceto a referida elastase tipo | humana madura.

- 283. Composição farmacêutica compreendendo (i) a quantidade eficaz terapeuticamente da elastase tipo | humana madura e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a composição farmacêutica é caracte- rizada por pelo menos uma das seguintes propriedades: (a) a composição é livre de tripsina; (b) a composição é substancialmente livre de tripsina, (c) a composição é livre de qualquer proteína consistindo na SEQ NOS ID: 70 e 71; (d) a composição é substancialmente livre de qualquer proteína consistindo na SEQ ID NOS: 2 e3; (e) a composição é livre de proteinas bacterianas; (f) a composição é substancialmente livre de proteínas bacteria- nas; (g) Composição é livre de proteínas de mamíferos que não seja areferida elastase tipo |! humana madura; (h) a composição é substancialmente livre de proteínas de ma- míferos que não seja a referida elastase tipo | humana madura.

284. Composição farmacêutica da modalidade 282 ou da modalidade 283, que é caracterizada por pelo menos duas das propriedades de (a) a (h).

285. Composição farmacêutica da modalidade 284, em que pelo menos duas das referidas propriedades inclui (a) e (c).

286. Composição farmacêutica da modalidade 284, em que pelo menos duas das referidas propriedades inclui (b) e (d).

287. Composição farmacêutica da modalidade 282 ou da moda- lidade 283, que é caracterizada por pelo menos três das propriedades de (a) a(b.

288. Composição farmacêutica da modalidade 284, em que pelo menos três das referidas propriedades inclui (a), (c) e (e).

289. Composição farmacêutica da modalidade 284, em que pelo menos três das referidas propriedades inclui (b), (d), e (9).

290. Composição farmacêutica da modalidade 282 ou da moda- ' lidade 283, que é caracterizada por pelo menos quatro das propriedades de (a) a (h).

291. Composição farmacêutica da modalidade 284, em que pelo menos quatro das referidas propriedades inclui (a), (c), (e) e (G).

292. Composição farmacêutica da modalidade 284, em que pelo menos quatro das referidas propriedades inclui (b), (d), (f), e (H).

293. Composição farmacêutica da modalidade 282 ou da moda- lidade 283, que é caracterizada por pelo menos cinco das propriedades de (a) a (h).

294. Composição farmacêutica da modalidade 282 ou da moda- lidade 283, que é caracterizada por pelo menos seis das propriedades de (a) a(h).

295. A farmacêutica composição da modalidade 282 ou da mo- dalidade 283, que é caracterizada por pelo menos sete das propriedades de (a)a(H).

296. Composição farmacêutica da modalidade 282 ou da moda- lidade 283 que é caracterizada por todas as propriedades de (a) a (h).

297. Composição farmacêutica de qualquer uma das modalida- des de 282 a 296, que é livre ou substancialmente livre de um, dois, três ou de todas as quatro proteínas consistindo nas SEQ ID NO: 85, 86, 94 e 95.

298. Composição farmacêutica de qualquer uma das modalida- desde282a297,que é livre ou substancialmente livre de proteínas consis- tindo na SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 86.

299. Composição farmacêutica de qualquer uma das modalida- des de 282 a 297, que é livre ou substancialmente livre de proteínas consis- tindo na SEQ ID NO: 94 e SEQ ID NO: 95.

300. Composição farmacêutica de qualquer uma das modalida- des de 282 a 297, que é livre ou substancialmente livre de uma, duas, ou todas as três proteínas consistindo na SEQ ID NO: 106, 107 e 108.

301. Composição farmacêutica de qualquer uma das modalida- õ des de 282 a 300, que contém níveis farmaceuticamente aceitáveis de endo- toxinas.

: 302. Composição farmacêutica da modalidade 301, em que a re- ferida composição farmacêutica é uma composição líquida e em que os refe- ridos níveis farmaceuticamente aceitáveis de endotoxinas são 8 EU/m! ou menos.

303. Composição farmacêutica da modalidade 302, em que os referidos níveis farmaceuticamente aceitáveis de endotoxinas são 5 EU/ml ou menos.

304. Composição farmacêutica da modalidade 301, em que a re- ferida composição farmacêutica é uma composição sólida e em que os refe- ridos níveis farmaceuticamente aceitáveis de endotoxinas são 10 EU ou me- nos por grama da elastase tipo | humana madura.

305. Composição farmacêutica da modalidade 304 em que os referidos níveis farmaceuticamente aceitáveis de endotoxinas são 5 EU ou menos por grama da elastase tipo | humana madura.

306. Composição farmacêutica de qualquer uma das modalida- des de 282 a 305 na qual a elastase tipo | humana madura é caracterizada por uma atividade específica de 1 a 40 U mg de proteína.

À 204

307. Composição farmacêutica da modalidade 306 na qual a e- lastase tipo | humana madura é caracterizada por uma atividade específica de 25 a 35 U mg de proteína.

308. Composição farmacêutica da modalidade 306em que a e- lastase tipo | humana madura é caracterizada por uma atividade específica superior a 10 U/mg de proteína.

309. Composição farmacêutica da modalidade 306 em que a e- lastase tipo | humana madura é caracterizada por uma atividade específica de mais de 20 U/mg de proteínas.

310. Composição farmacêutica de qualquer uma das modalida- des de 282 a 309, na qual a elastase tipo | humana madura consiste essen- cialmente da SEQ ID NO: 5, 84 ou 87.

311. Composição farmacêutica da modalidade 310, em que a e- : lastase tipo | humana madura consiste essencialmente na SEQ ID NO: 1 e SEQIDNO:4.

. 312. Composição farmacêutica de qualquer uma das modalida- des de 282 a 311 em que a atividade da tripsina corresponde a menos de 4 ng por 1 mg da proteína elastase tipo | humana madura.

313. Composição farmacêutica da modalidade 312 em que a ati- vidade da tripsina corresponde a menos de 2 ng por 1 mg da proteína elas- tase tipo | humana madura.

314. Formulação liofilizada de uma proteína consistindo essen- cialmente das SEQ ID NO: 5, 84, ou 87, que sob a reconstituição para uma concentração da referida proteína de 1 mg/ml da atividade da tripsina cor- responde a menos de 2 ng/ml de tripsina.

315. Formulação liofilizada da modalidade 314, em que o teor de umidade é inferior a 5%.

316. Formulação liofilizada da modalidade 315 que compreende íons de sódio, íons de potássio, íons de fosfato, e íons de cloreto.

317. Formulação liofilizada da modalidade 315 que compreende o polissorbato-80.

318. Formulação liofilizada da modalidade 315 que compreende o dextrano.

319. Formulação liofilizada da modalidade 318, em que o dex- tran é o dextrano-18.

320. Formulação liofilizada da modalidade 311, que compreende fíonsde sódio, íons de potássio, íons de fosfato, íons de cloreto e polissorba- to-80.

321. Formulação liofilizada da modalidade 314 que compreende íons de sódio, íons de potássio, íons de fosfato, íons de cloreto e dextran.

322. Formulação liofilizada de crédito 321, em que o dextran é o dextrano-18.

323. Formulação liofilizada da modalidade 314 que compreende íons de sódio, íons de potássio, íons de fosfato, íons de cloreto, polissorba- À to-80, e dextrano. is 15 324. Formulação liofilizada da modalidade 323, em que o dex- o tran é o dextrano-18.

325. Formulação líquida compreendendo uma solução de pelo menos 0,1 mg ml de uma proteína consistindo essencialmente da SEQ ID NO: 5, 84 ou 87 na qual a atividade da tripsina corresponde a menos de 2 no/mldetripsina.

326. Formulação líquida da modalidade 325, em que a solução é uma solução tamponada.

327. Formulação líquida da modalidade 326, em que a solução é tamponada a um pH de 7 a 8.

328. Formulação líquida da modalidade 326 em que a solução é PBS.

329. Formulação líquida da modalidade 328, em que a solução compreende 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de fosfato de potássio, e 10 mM de fosfato de sódio.

330. Formulação líquida de qualquer uma das modalidades de 325 a 329 que compreende ainda um ou mais excipientes.

331. Formulação líquida da modalidade 330, que um ou mais é 206 dos referidos excipientes compreende o dextrano-18.

332. Formulação líquida da modalidade 331 em que o dextrano- 18 está em quantidade de 8% peso/volume da referida solução.

333. Formulação líquida da modalidade 330 em que um ou mais dosreferidos excipientes compreende o polissorbato-80.

334. Formulação líquida da modalidade 333 em que o polissor- bato-80 está em quantidade de 0,01% peso/volume da referida solução.

335. Formulação líquida de qualquer uma das modalidades de 325 a 334 em que a concentração da referida proteína, na referida solução estána faixa de 0,001 mg/ml a 40 mg/ml.

336. Formulação líquida da modalidade 335 em que a concen- tração da referida proteína, na referida solução está na faixa de 0,1 mg/ml a mg/ml.

S 337. Formulação líquida de qualquer uma das modalidades de . 15 325a336 que compreende ainda um ou mais agente de preservação, solu- E bilização e coloração.

338. Formulação líquida de qualquer uma das modalidades de 325 a 337 que é substancialmente livre de proteinas de mamíferos exceto a referida proteína da SEQ ID NO: 5, 84 ou 87. 20 339. Formulação líquida de qualquer uma das modalidades de 325 a 338 que é substancialmente livre de proteínas bacterianas.

340. Formulação produzida ou que pode ser obtida pelo método de qualquer uma das modalidades de 225-258.

341. Formulação da modalidade 340 que é uma formulação |í- quida

342. Formulação da modalidade 340 ou 341 na qual a proteína elastase tipo | madura é uma proteína elastase madura tipo | humana.

343. Formulação da modalidade 342, em que a proteína elasta- se tipo | humana madura consiste essencialmente da SEQ ID NO: 5, SEQ ID —NO:84,ouSEQID NO: 87.

344. Formulação da modalidade 342, em que a proteína elasta- se madura tipo | humana é constituída essencialmente da SEQ ID NO: 1 ou

| 207 SEQID NO: 4.

345. Formulação da modalidade 340 ou 341 em que a proteína elastase madura tipo | é uma proteína elastase madura tipo | porcina.

346. Formulação da modalidade 345, em que a proteína elasta- semaduratipol porcina é constituída essencialmente da SEQ ID NO: 39.

347. Um método para remover uma ou mais proteína elastase madura processada incorretamente de uma mistura de proteína elastase madura processada corretamente e incorretamente, o referido método com- preende: (a) sujeitar uma composição compreendendo uma mistura de proteína elastase madura processada correta e incorretamente para um pH no qual a enzima madura processada corretamente é ativa; (b) manter tal pH até tal momento em que uma ou mais proteína elastase madura processada incorretamente é degradada, É 15 removendo assim uma ou mais da referida proteína elastase EA madura processada incorretamente de uma mistura da proteína elastase madura processada correta e incorretamente.

348. Método da modalidade 347, em que uma ou mais da referi- da proteína elastase madura processada incorretamente, contém pelo me- —nosum aminoácido adicional ou menos aminoácido na terminação N relativa à proteína elastase madura processada corretamente.

349. Método da modalidade 347 ou 348 onde o referido pH é en- tre 56 12.

350. Método de qualquer uma das modalidades de 347 a 349, emque uma ou mais da referida proteína elastase madura processada incor- retamente é degradada em 50% a 100%.

351. Método da modalidade 348, em que uma ou mais da referi- da proteína elastase madura processada incorretamente é degradada em 50% a 99%.

352. Método da modalidade 348, em que uma ou mais da referi- da proteína elastase madura processada incorretamente é degradada em 50% a 98%.

353. Método da modalidade 348, em que uma ou mais da referi- da proteína elastase madura processada incorretamente é degradada em 50% a 95%.

354. Método de modalidade 348, em que uma ou mais da referi- da proteina elastase madura processada incorretamente é degradada em 50% a 90%.

355. Método de qualquer uma das modalidades de 350 a 354, em que uma ou mais proteína elastase madura processada incorretamente é degradada em pelo menos 50%.

356. Método da modalidade 355, em que todas as proteínas e- lastase madura processadas incorretamente na mistura são degradadas em pelo menos 50%.

357. Método de qualquer uma das modalidades de 350 a 354 : em que pelo menos uma proteína elastase madura processada incorreta- mente é degradada em pelo menos 75%.

358. Método da modalidade 357, em que mais de uma proteína elastase madura processadas incorretamente é degradada em pelo menos 75%.

359. Método da modalidade 357, em que todas as proteínas e- lastase madura processadas incorretamente na mistura são degradadas em pelo menos 75%.

360. Método de qualquer uma das modalidades de 350 a 354 em que pelo menos uma proteína elastase madura processada incorreta- mente é degradada em pelo menos 90%.

361. Método da modalidade 360, em que mais de uma proteína elastase madura processada incorretamente é degradada em pelo menos 90%.

362. Método da modalidade 360, em que todas as proteínas e- lastase madura processadas incorretamente na mistura são degradadas em pelomenos 90%.

363. Método de qualquer uma das modalidades de 347 a 362, em que a composição é uma composição líquida em na qual a proteína elas-

tase total está em uma concentração de 10 mg/ml ou menos.

364. Método de qualquer uma das modalidades de 347 a 362, em que a composição é uma composição líquida na qual a proteína elastase total está em uma concentração de 5 mg/ml ou menos.

365. Método de qualquer uma das modalidades de 347 a 362, em que a composição é uma composição líquida na qual a proteína elastase total está em uma concentração de 2 mg/ml ou menos.

366. Método de qualquer uma das modalidades de 347 a 362, em que a composição é uma composição líquida na qual a proteína elastase totalestáem uma concentração de 1 mg/ml ou menos.

367. Método de qualquer uma das modalidades de 347 a 362, em que a composição é uma composição líquida na qual a proteína elastase total está em uma concentração de 0,5 mg/ml ou menos.

É 368. Método de qualquer uma das modalidades de 347 a 362, emquea composição é uma composição líquida na qual a proteína elastase . total está em uma concentração de 0,25 mg/ml ou menos.

369. Método de qualquer uma das modalidades de 363 a 368, em que a composição é uma composição líquida na qual a proteína elastase total está em uma concentração de pelo menos 0,1 mg/ml.

370. Método de qualquer uma das modalidades de 363 a 368, em que a composição é uma composição líquida na qual a proteína elastase total está em uma concentração de pelo menos 0,2 mg/ml.

371. Método de qualquer uma das modalidades de 347 a 370, em que a atividade da tripsina na referida composição é inferior a 4 ng/ml de tripsina por mg das proteínas elastases totais.

372. Método de qualquer uma das modalidades de 347 a 370, em que a atividade da tripsina na referida composição é inferior a 2 ng/ml de tripsina por mg de proteínas elastases totais.

373. Método de qualquer uma das modalidades de 347 a 372, emquea composição é livre ou substancialmente livre de uma proteína con- sistindo da SEQ ID NO: 104 e/ou é livre ou substancialmente livre de uma proteína consistindo na SEQ ID NO: 105.

: 210

374. Um método para produzir uma composição farmacêutica compreendendo uma elastase tipo | madura, o referido método compreen- dendo (i) produzir uma elastase tipo | madura liofilizada pelo método de qualquer uma das modalidades de 261 a 265; e (ii) reconstituir a uma elasta- setipol madura liofilizada em água ou em um veículo farmaceuticamente aceitável, produzindo assim uma composição farmacêutica compreendendo uma elastase tipo | humana madura.

375. Um método para produzir uma composição farmacêutica compreendendo uma elastase tipo | madura, o referido método compreen- dendo a reconstituição da formulação liofilizada de qualguer uma das moda- lidades de 314 a 324 em água ou em um veículo farmaceuticamente aceitá- vel, produzindo assim uma composição farmacêutica compreendendo uma elastase tipo | madura. À 376. Um método da modalidade 374 ou da modalidade 375, em f 15 queacomposição farmacêutica compreende o fosfato. o 377. Método de qualquer uma das modalidades de 374 a 376, em que a elastase tipo |! madura é uma elastase tipo | humana madura.

378. Método da modalidade 377 caracterizada por uma atividade específica de 1 a 40 U/mg de proteína.

379. Método da modalidade 377 em que a elastase tipo | madura é caracterizada por uma atividade específica de 25 a 35 U/mg de proteína.

380. Método de qualquer uma das modalidades de 377 a 379, em que a elastase tipo | humana madura na referida composição farmacêu- tica mantém 60% a 100% de sua atividade específica depois de pelo menos uma semana de armazenamento a 4ºC, depois de pelo menos um mês de armazenamento a 4ºC, depois de pelo menos dois meses de armazenamen- to a 4ºC, depois de pelo menos três meses de armazenamento a 4ºC, ou depois de pelo menos seis meses de armazenamento a 4ºC.

381. Método de qualquer uma das modalidades de 377 a 379, emquea celastase tipo | humana madura na referida composição farmacêu- tica mantém 60% a 98% de sua atividade específica depois de pelo menos uma semana de armazenamento em 4ºC, depois de pelo menos um mês de armazenamento a 4ºC, depois de pelo menos dois meses de armazenamen- to a 4ºC, depois de pelo menos três meses de armazenamento a 4ºC, ou depois de pelo menos seis meses de armazenamento a 4ºC.

382. Método de qualquer uma das modalidades de 377 a 379, emquea celastase tipo | humana madura na referida composição farmacêu- tica mantém 60% a 95% de sua atividade específica depois de pelo menos uma semana de armazenamento a 4ºC, depois de pelo menos um mês de armazenamento a 4ºC, depois de pelo menos dois meses de armazenamen- to a 4ºC, depois de pelo menos três meses de armazenamento a 4ºC, ou depoisde pelo menos seis meses de amazenamento a 4ºC.

383. Método de qualquer uma das modalidades de 377 a 379, em que a elastase tipo | humana madura na referida composição farmacêu- tica mantém 60% a 90% de sua atividade específica depois de pelo menos É uma semana de armazenamento a 4ºC, depois de pelo menos um mês de . 15 armazenamento a 4ºC, depois de pelo menos dois meses de armazenamen- ão to a 4ºC, depois de pelo menos três meses de armazenamento a 4ºC, ou depois de pelo menos seis meses de armazenamento a 4ºC.

384. Método de qualquer uma das modalidades de 377 a 379, em que a elastase tipo | humana madura na referida composição farmacêu- ticamantém 60% a 80% de sua atividade específica depois de pelo menos uma semana de armazenamento a 4ºC, depois de pelo menos um mês de armazenamento a 4ºC, depois de pelo menos dois meses de armazenamen- to a 4ºC, depois de pelo menos três meses de armazenamento a 4ºC, ou depois de pelo menos seis meses de armazenamento a 4ºC.

385. Método de qualquer uma das modalidades de 377 a 384, em que a elastase tipo | humana madura na referida composição farmacêu- tica mantém pelo menos 70% de sua atividade específica depois de uma semana de armazenamento a 4ºC.

386. Composição farmacêutica produzida ou obtida pelo método de qualquer uma das modalidades de 374 a 385.

387. Um método para aumentar terapeuticamente o diâmetro de uma artéria ou veia de um sujeito humano que necessita do mesmo, o méto-

Ê 212 do compreendendo: administrar localmente na parede da artéria ou veia do ser humano (a) a composição farmacêutica de qualquer uma das modalida- des de 277 a 313 e 386, (b) a formulação líquida de qualquer uma das mo- dalidades de 325 a 339, ou (c) a formulação da modalidade 341 em uma dose suficiente para aumentar o diâmetro da artéria ou veia.

388. Método da modalidade 387, em que o diâmetro do vaso, o diâmetro luminal do vaso, ou ambos, são aumentados.

389. Um método para prevenir ou tratar o vasoespasmo de uma artéria ou veia de um sujeito humano que necessite do mesmo, o método compreende: administrar localmente na parede da artéria ou veia do sujeito humano (a) a composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades de 277 a 313 e 386, (b) a formulação líquida de qualquer uma das modalida- des de 325 a 339, ou (c) a formulação da modalidade 341 em uma dose su- ã ficiente para prevenir ou tratar o vasoespasmo da artéria ou veia. Ê 15 390. Um método para tratar uma artéria ou veia obstruída em um = sujeito humano que necessite de tal tratamento, o método compreendendo: administrar localmente na parede da artéria ou veia do ser humano (a) a composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades de 277 a 313 e 386, (b) a formulação líquida de qualquer uma das modalidades de 325 a 339,ou(c)a formulação da modalidade 341, em que os referidos resultados da administração na proteólise da elastina na parede da artéria ou veia le- vando ao aumento do diâmetro da artéria ou veia.

391. Um método para tratar uma artéria ou veia conectada a um enxerto de hemodiálise arteriovenosa ou a uma fístula arteriovenosa em um ser humano que necessita de tal tratamento, o método compreende: admi- nistrar localmente na parede de artéria ou veia do sujeito humano (a) a com- posição farmacêutica de qualquer uma das modalidades de 277 a 313 e 386, (b) a formulação líquida de qualquer uma das modalidades de 325 a 339, ou (c) a formulação da modalidade 341, em que a referida administração resulta na proteólise da elastina na parede da artéria ou veia levando ao aumento do diâmetro da artéria ou veia.

392. Um método para tratar uma veia em um sujeito humano pa-

À 213 ra uso em hemodiálise, o método compreendendo: administrar localmente na parede da veia no ser humano (a) a composição farmacêutica de qualquer uma das modalida- des de 277 a 313 e 386, (b) a formulação líquida de qualquer uma das mo- dalidadesde 325 a 339, ou (c)a formulação da modalidade 341, em que a referida administração resulta na proteólise da elastina na parede da artéria ou veia levando ao aumento do diâmetro da artéria ou veia.

393. Método de qualquer uma das modalidades de 387 a 392, que compreende ainda inserir uma porção de um aparelho de distribuição na parede da artéria ou da veia para distribuir a elastase na parede da artéria ou veia.

394. Método de qualquer uma das modalidades de 387 a 393, em que a composição farmacêutica ou formulação líquida é administrada por é um cateter. : 15 395. Método de qualquer uma das modalidades de 387 a 394, . em que a composição farmacêutica ou a formulação líquida é administrada diretamente na parede da artéria ou veia.

396. Método de qualquer uma das modalidades de 387 a 395, em que a artéria ou veia é obstruída.

397. Método da modalidade 396, em que a artéria ou veia é obs- truída por estenose.

398. Método da modalidade 397, em que a obstrução permite a passagem de um volume insuficiente de sangue antes ao tratamento.

399. Método da modalidade 398, em que a obstrução é uma es- tenose.

400. Método da modalidade 399, onde a artéria ou veia está obstruída pela hiperplasia intimal.

401. Método de qualquer uma das modalidades de 387 a 400, em que a composição farmacêutica ou formulação líquida é administrada a uma artéria periférica ou coronariana obstruída.

402. Método de qualquer uma das modalidades de 387 a 395, em que a artéria ou veia é suscetível a obstrução por hiperplasia intimal.

: 214

403. Método de qualquer uma das modalidades de 387 a 400 e 402, em que a composição é administrada na parede de uma veia.

404. Método de modalidade 403, em que a veia é conectada a um enxerto de hemodiálise arteriovenosa ou a uma fístula arteriovenosa.

405. Método da modalidade 404, onde a veia é para uso em hemodiálise.

406. Método da modalidade 405, compreendendo ainda conec- tar diretamente a veia a uma artéria ou conectar a veia a uma artéria através de um enxerto.

407. Método de qualquer uma das modalidades de 387 a 394, em que a composição é administrada à superfície adventícia de uma artéria ou veia exposta cirurgicamente.

408. Método de qualquer uma das modalidades de 387 a 407, ã em que a proteína elastase tipo | madura na referida composição farmacêu- É 15 tica, formulação líquida ou formulação, respectivamente, é uma proteína e- lastase madura tipo | humana.

409. Método da modalidade 408, em que a proteína elastase tipo | humana madura consiste essencialmente da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 84, ou SEQ ID NO: 87.

410. Método da modalidade 408, em que a proteína elastase tipo | humana madura consiste essencialmente da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:

4.

411. Método de qualquer uma das modalidades de 387 a 407, em que a proteína elastase tipo | madura na referida composição farmacêu- tica, formulação líquida ou formulação, respectivamente, é uma proteína e- lastase tipo | madura porcina.

412. Método da modalidade 411, em que a proteína elastase tipo | madura porcina consiste essencialmente na SEQ ID NO: 39.

413. Uma dosagem unitária compreendendo 0,0033 mg a 200 mg da (a) elastase tipol|humana madura da modalidade 273 ou da modali- dade 274 ou (b) uma formulação da elastase tipo | humana madura produzi- da ou que pode ser obtida pelo método da modalidade 259.

| 215

414. A dosagem unitária da modalidade 413, em que a proteína elastase tipo | humana madura consiste essencialmente na SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 84, ou SEQ ID NO: 87.

415. Uma dosagem unitária compreendendo 0,0033 mg a 200 mg da(a)elastase tipo! porcina madura da modalidade 275 ou da modali- dade 276, ou (b) uma formulação da elastase tipo | porcina madura produzi- da ou que pode ser obtida pelo método da modalidade 260.

416. A dosagem unitária da modalidade 415, em que a proteína elastase tipo | porcina madura é constituída essencialmente da SEQ ID NO:

39.

417. A dosagem unitária de qualguer uma das modalidades de 413 a 416 que correspondem de 0,5 mg a 50 mg da elastase tipo | madura.

418. A dosagem unitária da modalidade 417, que compreende 1 : mg20 mg da referida elastase tipo | madura.

419. A dosagem unitária da modalidade 418, que compreende ' de 5 mg a 10 mg da referida elastase tipo | madura.420. A dosagem unitária de qualquer uma das modalidades de 413 a 419 que está em um recipiente, embalagem, dispensador, ou cateter.

421. Um kit compreendendo uma proteína elastase de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 39 e 68 a 69 ou obtida ou que pode ser obtida pelo método de qualquer uma das modalidades de 89 a 224, 261 a 276 e 347 a 373, um ácido nucleico de acordo com qualquer um das modalidades de 40 a 67, um vetor de acordo com qualquer um das modali- dades de 70 a 72, uma célula de acordo com qualquer uma das modalidades de73a87,um sobrenadante de cultura celular de acordo com a modalidade 88, uma formulação de elastase de acordo com qualquer uma das modali- dades de 314 a 346 ou obtida ou que pode ser obtida pelo método de qual- quer uma das modalidades de 261 a 276, uma composição farmacêutica de acordo com o método de qualquer uma das modalidades de 277 a 313 e 386, ou obtida ou que pode ser obtida pelo método de qualquer uma das modalidades de 374 a 385, ou uma unidade de dosagem de acordo com qualquer uma das modalidades de 415 a 420.

: 216

422. O kit da modalidade 421 que é um kit terapêutico.

423. O kit da modalidade 422 que inclui um recipiente, embala- gem, dispensador, ou cateter.

424. O kit da modalidade 423 que é um kit de fabricação.

A invenção também é exemplificada pelas seguintes Modalida- des específicas que dizem respeito às proteínas pró-elastases da SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 69:

425. Uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 69.

426. A proteína da Modalidade 425, que é isolada.

427. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma se- quência de nucleotídeo que codifica uma proteína da Modalidade 425.

428. A molécula de ácido nucleico da Modalidade 427 em que a E proteína compreende uma sequência sinal operacionalmente ligada a referi- " 15 da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 69. O 429. A molécula de ácido nucleico da Modalidade 428, em que a sequência sinal é operável em Pichia pastoris.

430. A molécula de ácido nucleico da Modalidade 429, em que a sequência sinal é um peptídeo sinal do fator a da levedura.

431. Um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das Modalidades 427 a 430.

432. O vetor da Modalidade 431 em que a sequência de nucleo- tídeo é multimerizada.

433. Uma célula hospedeira compreendendo o vetor da Modali- dade431.

434. A célula hospedeira da Modalidade 433, em que pelo me- nos uma cópia do referido vetor é integrado no genoma da célula hospedei- ra.

435. A célula hospedeira de Modalidade 434 em que de duas a cinco cópias do referido vetor estão integradas no genoma da célula hospe- deira.

436. A célula hospedeira da Modalidade 433, em que a sequên-

Á 217 cia de nucleotídeo é multimerizada.

437. A célula hospedeira da Modalidade 436, em que o vetor compreende de duas a cinco cópias da referida sequência de nucleotídeo.

438. Uma célula geneticamente engenheirada para expressar a —moléculade ácido nucleico de qualquer uma das Modalidades 427 a 430.

439. A célula da Modalidade 438, que é uma célula de Pichia pastoris.

440. A célula da Modalidade 439, em que a sequência de nucle- otídeo é operacionalmente ligada a um promotor induzível por metanol.

441. O sobrenadante de cultura celular compreendendo a prote- Ína da Modalidade específica 425.

442. Um método para produzir uma proteína de elastase, com- preendendo o cultivo de célula da Modalidade 429 sob condições em que a : proteína de SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 69 é expressa.

443. Método da Modalidade 442, em que as referidas condições . incluem um, dois, três ou quatro de: (i) um período de crescimento ou indu- ção a um pH de 2 a 6; (ii) um período de crescimento ou indução a uma temperatura de 22ºC a 28ºC; (iii) cultivo em meio complexo; ou (iv) cultivo na presença de compostos de citrato, succinato ou acetato.

444. Método de Modalidade 442 ou 443, que compreende ainda a recuperação da proteína.

445. Método de qualquer uma das Modalidades 442 a 444, que compreende ainda expor a referida proteína da SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 69 a condições de ativação para produzir uma proteína elastase madu- ra

446. Método da Modalidade 445, em que a referida proteina é purificada antes da referida exposição para condições de ativação.

447. Método da Modalidade específica 446, em que a referida proteína é purificada na presença de compostos de citrato, succinato ou ace- tato.

448. Método de qualquer um das da Modalidades 445 a 447, compreendendo ainda a purificação da proteína elastase madura.

Ê 218

449. Método da Modalidade 448, compreendendo ainda a liofili- zação da proteína elastase madura purificada.

450. Um método para produzir uma proteína elastase madura, compreendendo submeter um sobrenadante de cultura celular de acordo coma Modalidade 441 a condições de auto-ativação, produzindo assim uma proteína elastase madura.

451. Método da Modalidade 450, compreendendo ainda a purifi- cação da proteína elastase madura.

452. Método da Modalidade 451, compreendendo ainda a liofili- zaçãoda proteína elastase madura purificada.

453. Um método para produzir uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína elastase madura, reconstituindo um liofilizado compreendendo a proteína pró-elastase liofilizada produzida pelo método da É Modalidade 449 ou 452. , 15 454. Método da Modalidade 453, em que o liofilizado (a) com- Saad! preende um ou mais ingredientes tampão ou (b) não contém ingredientes tampão.

455. Método da Modalidade 454, em que o liofilizado é reconsti- tuído com água ou tampão.

456. Método da Modalidade 455, em que sob reconstituição uma solução de proteína elastase madura em tampão de força total, maior que o tampão de força total, ou menor que o tampão de força total é produzida.

457. Método da Modalidade 456, em que o tampão é a salina tamponada com fosfato.

458. Método de qualquer das Modalidades 453 a 457, em que a proteína elastase madura é reconstituída a uma concentração de 0,001 mg/ml a 50 mg/ml.

459. Método de qualquer das Modalidades 453 a 458, em que a proteína elastase madura tem uma atividade específica de 1 a 40 U/mg de proteina.

Composição460. Composição farmacêutica que compreende proteína elastase madura , que é caracterizada por pelo menos um, pelo

À 219 menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou pelo menos sete das seguintes propriedades: (a) a composição é livre de tripsina; (b) a composição é substancialmente livre de tripsina; (c) a composição é livre de qualquer proteína que consiste nas SEQ ID NOS: 70 e 71; (d) a composição é substancialmente livre de qualquer proteína que consiste nas SEQ ID NOS: 2 e 3; (e) a composição é livre de proteínas bacterianas; (f) a composição é substancialmente livre de proteínas bacteria- nas; (g) Composição é livre de proteínas de mamíferos outra que não a referida proteína elastase madura; À (h) a composição é substancialmente livre de proteínas de ma- miíferos que não a referida proteína elastase madura; fia (i) a composição é livre ou substancialmente livre de uma, duas, três ou quatro proteínas consistindo da SEQ ID NO: 85, 86, 94 e 95; (]) a composição é livre ou substancialmente livre de uma, duas ou três proteínas consistindo na SEQ ID NO: 106, 107 e 108; (k) a composição contém níveis farmaceuticamente aceitáveis de endotoxinas; (1) a proteína elastase madura na composição é caracterizada por uma atividade específica de 1 a 40 U/mg de proteína; (m) a atividade da tripsina na referida composição corresponde a menosde4 ng por1mg de proteína elastase madura; (n) a composição compreende o polissorbato-80; (0) a composição compreende o dextrano; (p) a composição compreende íons de sódio, íons de potássio, íons de fosfato, íons de cloreto e polissorbato-80; (q) a composição compreende íons de sódio, íons de potássio, fons de fosfato, íons de cloreto e dextrano; (1) a composição compreende íons de sódio, íons de potássio,

íons de fosfato, íons de cloreto, polissorbato-80, e dextrano; (s) da proteína elastase madura na referida composição mantém 60% a 100% da sua atividade específica após pelo menos uma semana de armazenamento a 4ºC, após pelo menos um mês de armazenamento a 4ºC, após pelo menos dois meses de armazenamento a 4ºC, após pelo menos três meses de armazenamento a 4ºC, ou após pelo menos seis meses de armazenamento a 4ºC, e (1) a composição compreende uma dose unitária de 0,0033 mg a 200 mg da referida proteína elastase madura.

461. Composição farmacêutica da Modalidade 460, em que a composição farmacêutica é caracterizada por pelo menos três característi- cas, pelo menos quatro características ou pelo menos cinco características independentemente selecionadas dentre os seguintes grupos de (i) a (v): (6) (a), (b) ou (m) (ii) (e) ou (f) é (oii) (g) ou (h) Gv) (1) (v) 0)

462. Composição farmacêutica da Modalidade 461, em que dois de pelomenos três ou pelo menos, quatro das referidas características são selecionadas dos grupos de (i) e (iv) ou (v).

463. Composição farmacêutica da Modalidade 462, em que três de pelo menos quatro das referidas características são selecionadas dos grupos (1), (iv) e (v).

464. Composição farmacêutica de qualquer uma das Modalida- des 460 a 463 que é produzida pelo método de qualquer uma das modalida- des 453 a 459.

465. Um método para remover uma ou mais proteínas elastases maduras processadas incorretamente de uma mistura de proteínas elasta- ses maduras processada correta e incorretamente, o referido método com- preende: (a) submeter uma composição compreendendo uma mistura das

: 221 proteínas elastases maduras processadas correta e incorretamente a um pH em que a enzima madura processada corretamente é ativa; (b) manter tal pH até o momento em que uma ou mais das prote- inas elastases maduras processadas incorretamente são degradadas, removendo assim uma ou mais das referidas proteínas elastases maduras processadas incorretamente de uma mistura de proteínas elasta- ses maduras processadas correta e incorretamente.

466. Método da Modalidade 465, em que uma ou mais das refe- ridas proteínas elastases maduras processadas incorretamente contêm pelo menos um aminoácido adicional ou menos aminoácido no N-terminal em relação às proteínas elastases maduras processadas corretamente.

467. Método da Modalidade 465 ou 466, em que o referido pH é entre 5 e 12.

é 468. Método de qualquer uma das Modalidades 465 a 467, em É 15 que que uma ou mais das referidas proteínas elastases maduras processa- ! das incorretamente são degradadas por 50% a 100%.

469. Um método para aumentar terapeuticamente o diâmetro de uma artéria ou veia de um sujeito humano que necessite do mesmo, o méto- do compreendendo: administrar localmente na parede da artéria ou veia do sujeito humano a composição farmacêutica de qualquer uma das Modalida- des 460 a 464 em uma dose suficiente para aumentar o diâmetro da artéria Ou veia.

470. Método da Modalidade 469, em que o diâmetro do vaso, o diâmetro lumenal do vaso, ou ambos, são aumentados.

471. Um método para prevenir ou tratar o vasoespasmo de uma artéria ou veia de um sujeito humano que necessite dele, o método compre- endendo: administrar localmente na parede da artéria ou veia do ser humano a composição farmacêutica de qualquer uma das Modalidades 460 a 464 em uma dose suficiente para prevenir ou tratar o vasoespasmo da artéria ou veia

472. Um método para o tratamento de uma artéria ou veia obs- truída em um sujeito humano que necessite de tal tratamento, o método í 222 compreendendo: administrar localmente na parede da artéria ou veia do su- jeito humano a composição farmacêutica de qualquer uma das Modalidades 460 a 464, em que os referidos resultados de administração resultam em proteólise da elastina na parede da artéria ou veia, levando ao alargamento dodiâmetro da artéria ou veia.

473. Um método para o tratamento de uma artéria ou veia co- nectada a um enxerto de hemodiálise arteriovenosa ou fístula arteriovenosa em um sujeito humano com necessidade de tal tratamento, o método com- preendendo: administrar localmente na parede da artéria ou veia do ser hu- mano a composição farmacêutica de qualquer uma das Modalidades 460 a 464, em que os referidos resultados da administração na proteólise de elas- tina na parede da artéria ou veia, levam ao alargamento do diâmetro da arté- ' ria ou veia.

: 474. Um método para tratar uma veia de um sujeito humano pa- FF 15 ra uso em hemodiálise, o método compreendendo: administrar localmente fita na parede da veia no ser humano a composição farmacêutica de qualquer uma das Modalidades 460 a 464, em que os referidos resultados da adminis- tração na proteólise de elastina na parede da veia, levam ao alargamento do diâmetro da veia.

475. O kit compreendendo a composição farmacêutica de qual- quer uma das Modalidades 460 a 464.

476. O kit da Modalidade 475 em que a composição farmacêuti- ca está em um recipiente, embalagem, distribuidor, ou cateter.

As reivindicações do pedido provisório US nº 60/992 319, depo- sitado em 04 de dezembro de 2007 estão incorporadas por referência aqui em sua totalidade, e cada modalidade estabelecida em tais reivindicações são incorporadas por referência como uma modalidade específica aqui.

A presente invenção não deve ser limitada no espaço pelas mo- dalidades específicas descritas neste documento. Na verdade, várias modifi- cações da invenção, além das descritas aqui se tornarão aparentes para aqueles especialistas na técnica da descrição acima e das figuras anexadas. Tais alterações destinam-se a cair no escopo das reivindicações anexadas.

Várias referências, incluindo pedidos de patentes, patentes e publicações científicas, são citadas aqui; a divulgação de cada referência é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES . 1. Proteína elastase pancreática tipo |, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ativação de elastase que compreende uma sequência de reconhecimento de elastase, em que a sequência de ati- vação de elastase é operavelmente ligada a uma sequência de aminoácidos de uma elastase pancreática tipo | madura.
2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um resíduo de prolina localizado na posição 2 da sequência de reconhecimento de elastase.
3. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de reconhecimento da elastase é selecionada a par- tir do grupo compreendendo SEQ ID NO: 11, 13, 15, 20 e 93.
4. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de ativação da elastase é selecionada a partir do —grupocompreendendo SEQ ID NO: 80,72 e 73.
5. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de clivagem compreendendo uma se- quência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NO: 42, 48, 49,53 e 55.
6. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de elastase madura compreende uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de a- minoácidos a partir da posição 6 até o final da SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 1.
7. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo com- preendendo SEQ ID NO: 64, 65, 67 e 69. |
8. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência sinal.
9. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína, como definida em qualquer uma das reivindicações de1laB8.
i 10. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma mo- . lécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 8.
11. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser genetica- mente modificada para expressar uma molécula de ácido nucleico, como definidana reivindicação 9.
12. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compre- ende um vetor, como definido na reivindicação 10.
13. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12, carac- terizada pelo fato de que pelo menos uma cópia do vetor é integrada no ge- —noma da célula hospedeira.
14. Método para produzir uma proteína elastase pancreática tipo |, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira, como definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, sobre condições que resultam na produção de uma proteína elastase pancreática tipo | com- preendendo uma sequência propetídeo.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe- lo fato de que ainda compreende submeter a proteína elastase pancreática tipo | a condições de ativação, de tal modo que a proteína elastase pancreá- tica tipo | é produzida.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe- lo fato de que não compreende o uso de tripsina em qualquer etapa.
17. Método de acordo com uma das reivindicações 14 a 16, ca- racterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira na pre- sença de um composto de citrato, succinato ou acetato.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que um composto de citrato, succinato ou acetato está presente na cultura a uma concentração de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50-200 MM, 100-150 mM, 75-125 mM ou 90-110 mM.
19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lofatode que o composto de citrato, succinato ou acetato é o citrato de só- dio, succinato de acetato de sódio, respectivamente.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 RENA Eterna, Le aaa DA E AA A EEE ; | i a 19, caracterizado pelo fato de que compreende o crescimento ou indução | ' da célula hospedeira em um pH de 2 a 6 por um período de tempo e elevar o PH da solução contendo a proteína a um pH de 6 a 12.
21. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe- lofatode que ainda compreende a etapa de isolar a proteína elastase pan- | creática tipo |. |
22. Método para produzir uma composição farmacêutica com- preendendo uma proteína elastase pancreática tipo | madura, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) submeter uma proteína elastase pancreática tipo | autoativa- da a condições de autoativação para produzir uma proteína elastase pan- creática tipo | madura; e (b) formular a proteína elastase pancreática tipo | madura, pro- duzindo assim uma composição farmacêutica compreendendo proteína elas- tase pancreática tipo | madura.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe- lo fato de que a etapa (b) compreende liofilizar a proteína elastase pancreá- tica tipo | madura.
| 24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe- lofatode que a etapa (b) ainda compreende misturar a proteína elastase | madura com um ou mais ingredientes tampões após a liofilização.
25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe- lo fato de que a etapa (b) ainda compreende misturar a proteína elastase madura com um ou mais ingredientes tampões antes da liofilização.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizado pelo fato de que a ativação da proteína elastase é inicia- da pela adição de uma quantidade catalítica de elastase.
27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de ser ob- tenível por um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 22a26.
28. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína elastase pancreática tipo | humana madura com-

preendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identi- ' dade de sequência com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, em que O limite superior de tripsina é inferior a 5 ng de tripsina por 1 mg de proteina elastase madura.
29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o limite superior de tripsina corresponde a | menos do que 4 ng de tripsina por 1 mg de proteína elastase madura.
30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que é isenta de tripsina.
31. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizada pelo fato de que é isenta de qualquer proteína consistindo em SEQ ID NO: 70 e 71.
32. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizada pelo fato de que o limite superior de tripsina é quantificado usando um ensaio colorimétrico de atividade de com N-benzoil-Phe-Val-Arg-pNitroanilida (BENZ).
33. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizada pelo fato de que o limite superior de atividade de tripsina na composição corresponde a menos do que 1,56 por 1 mgde proteína elastase madura.
34. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizada pelo fato de que o limite superior de atividade de tripsina na composição corresponde a menos do que 1,56 por 1 mg de proteína elastase madura quando quantificado usando ensaio colori- —métricode atividade de tripsina com BENZ.
35. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34, caracterizada pelo fato de que a proteína elastase pancreática tipo | humana madura tem uma atividade de 1 a 40 U/mg de pro- teina, quando quantificada usando um ensaio de hidrólise colorimétrico com —N-succinil-Ala-Ala-Ala-pNitroanilida (SLAP).
36. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 35, caracterizada pelo fato de que a proteína elastase pancreática tipo | humana madura compreende uma sequência de aminoá- . cidos com pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1.
37. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das 5 reivindicações 28 a 36, caracterizada pelo fato de que é livre de proteínas bacterianas.
38. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, caracterizada pelo fato de que é livre de proteínas de mamíferos exceto a referida elastase humana madura.
39. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, caracterizada pelo fato de que a quantidade de endo- toxina não excede uma quantidade farmaceuticamente aceitável.
40. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, caracterizada pelo fato de que está na forma de uma dosagem unitária compreendendo 0,0033 mg a 200 mg da proteína elastase madura.
41. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, caracterizada pelo fato de que compreende íons fos- fato.
42. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, caracterizada pelo fato de que compreende íons po- tássio.
43. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, caracterizada pelo fato de que compreende polisor- bato-80.
44. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, caracterizada pelo fato de que compreende íons de sódio e cloro.
45. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 44, caracterizada pelo fato de que compreende menos do que 0,5% em peso de uma proteina consistindo de SEQ ID NO:2 e me- nos do que 0,5% em peso de uma proteína consistindo de SEQ ID NO:3.

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46. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das D reivindicações 28 a 45, caracterizada pelo fato de que a proteína elastase madura mantém de 60% a 100% de sua atividade específica após pelo me- nos um mês de armazenamento a 4ºC.

47. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a proteína elastase madura mantém de 60% a 100% de sua atividade específica após pelo menos três meses de arma- zenamento a 4ºC.

48. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que a proteína elastase madura mantém de 60% a 100% de sua atividade específica após pelo menos seis meses de arma- zenamento a 4ºC.

49. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 48, caracterizada pelo fato de ser uma composição far- — macêutica líquida.

50. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 48, caracterizada pelo fato de ser uma composição far- macêutica liofilizada.

51. Uso de uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 27 a 49, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma artéria ou veia em um paciente humano em necessidade de tal tratamento.

52. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 50, caracterizada pelo fato de ser usada no tratamento de uma artéria ou veja em um paciente humano em necessidade de tal tra- tamento. NRCC— O st õ. Õ nodos

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XY 168 Fig 31 / o 58 42 40 : Fig 32 í RESUMO ' Patente de Invenção: "PROTEÍNA ELASTASE PANCREÁTICA TIPO |, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, SUA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUZIR A REFERIDA COMPOSIÇÃO, E USO DA REFE- RIDA COMPOSIÇÃO".

A presente invenção refere-se a métodos para a produção, puri- ficação, formulação e utilização de proteínas elastases recombinantes biolo- gicamente ativas. Métodos recombinantes para produzir proteínas elastases —terapeuticamente úteis, assim como composições farmacêuticas compreen- dendo as referidas proteínas elastases são descritos. As proteínas elastases recombinantes novas e as preparações de proteína também são descritas. Os métodos são descritos para tratar e prevenir as doenças de tubos bioló- gicos usando composições farmacêuticas contendo as proteínas elastases dainvenção.

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências - biológicas de que trata a Resolução INPI! 228 de 11/11/2009: Código de Controle Campo 1

OO Campo 2 Innnnonenooononan . Outras Informações: - Nome do Arquivo: p167725.bxt - Data de Geração do Código: 03-08-2010 - Hora de Geração do Código: 14:29:59 - Código de Controle: - Campo 1: 5D117A66532ECE4F - Campo 2: AAOAF6314B3DF60B Gerado pelo Sistema de Listagem de Sequências Biológicas (SisBioList)