CN103952388A - 重组的弹性蛋白酶蛋白质及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备、纯化、配制生物学上有活性的重组弹性蛋白酶蛋白质的方法及所述生物学上有活性的重组弹性蛋白酶蛋白质的用途。描述了制备治疗学有用的弹性蛋白酶蛋白质的重组方法及含所述弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物。还公开了新的重组弹性蛋白酶蛋白质及蛋白质制剂。描述了使用含本发明的弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物治疗和预防生物管道疾病的方法。

Description

重组的弹性蛋白酶蛋白质及其制备方法和用途
本申请是分案申请，母案的申请号为200880124812.X(国际申请号PCT/US2008/085559)，申请日为2008年12月4日，发明名称为“重组的弹性蛋白酶蛋白质及其制备方法和用途”。
本发明要求2007年12月4日提交的美国临时申请No.60/992,319的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
1.技术领域
本发明涉及制备和配制用于治疗和预防生物管道疾病的弹性蛋白酶蛋白质的重组方法。本发明还涉及新的重组的弹性蛋白酶蛋白质和含所述蛋白质的药物组合物。本发明还涉及含重组弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物用于治疗和预防生物管道疾病的用途。
2.背景技术
弹性蛋白是能够伸展后自发重卷的蛋白质。交联的弹性蛋白是弹性纤维的主要结构成分，所述弹性纤维赋予组织弹性。可将拥有溶解成熟的、交联的弹性蛋白的能力的蛋白酶的成为弹性蛋白酶(Bieth,JG“Elastases:catalytic and biological properties,”at pp.217-320(Mecham Edition,Regulation of Matrix Accumulation,New York,Academic Press,1986)。多个出版的专利申请(WO2001/21574；WO2004/073504；和WO2006/036804)表明单独的弹性蛋白酶，或弹性蛋白酶与其他试剂的组合有利于治疗生物管道疾病，所述生物管道包括经受或易于经受阻塞和血管痉挛的生物管道。对于人受试者的弹性蛋白酶治疗，期望使用人弹性蛋白酶来降低针对非人弹性蛋白酶免疫应答的风险。
然而至今无已知的商用有效的制备生物学有效的对于临床应用而言足够纯净形式且充足量的弹性蛋白酶的手段。因为弹性蛋白酶是有力的可水解多种除弹性蛋白酶之外的蛋白质的酶，弹性蛋白酶的蛋白水解活性对于其制备具有潜在的障碍。例如，成熟的弹性蛋白酶活性可破坏表达其的宿主细胞，降解其本身或降解用于辅助制备或表征弹性蛋白酶的试剂。
弹性蛋白长表达为含信号肽、活化肽和成熟的、活性部分的前原蛋白。分泌后切割信号序列产生几乎无或无酶活性的原蛋白，且其氨基酸序列含活化肽和成熟蛋白的氨基酸序列。一般而言，对于重组表达，可表达无活性的前体代替成熟的活性酶，以免破坏表达其的细胞。例如，美国专利No.5,212,068描述了人胰腺弹性蛋白酶cDNA(称之为弹性蛋白酶“IIA”、“IIB”、“IIIA”和“IIIB”)的克隆。各种弹性蛋白酶在哺乳动物COS-1细胞中表达为包括天然信号序列的全长cDNA。此外，含枯草杆菌(B.subtilis)信号序列和β-半乳糖甘酶信号序列的经加工形式的弹性蛋白酶也分别在枯草杆菌和大肠杆菌中表达。美国专利No.5,212,068还提示了酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的弹性蛋白酶。一般而言，美国专利No.5,212,068中的弹性蛋白酶表达的实施例显示回收的弹性蛋白酶的低活性，或需要涉及用胰蛋白酶处理的活化步骤，以产生有活性的弹性蛋白酶。此外，当在大肠杆菌中表达时，弹性蛋白酶大量存在于包含体中，且只要小部分表达的弹性蛋白酶是可溶和有活性的。美国专利No.5,212,068中描述的弹性蛋白酶制剂均未被纯化到药品级。
由此，现有技术需要重组制备方法，所述方法能够产生治疗量的生物学上有活性的的药品级弹性蛋白酶，且优选避免大规模制备中成本高且导致终产物的胰蛋白酶污染的胰蛋白酶活化步骤。给患者施用含胰蛋白酶的弹性蛋白酶可导致蛋白酶活化的受体1和2的活化，其可降低弹性蛋白酶治疗的一些有利效果。
本申请第2部分或任何其他部分中的任何参考文献的引用或指出不能理解为承认所述参考文献可作为相对本发明的现有技术。
3.发明概述
本发明提供制备重组弹性蛋白酶蛋白质的新的有效方法，及重组蛋白在治疗和预防生物管道疾病的组合物(如药物组合物、弹性蛋白酶制剂或单元剂)中的用途。
本发明针对自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质、编码自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的核酸、含所述核酸的宿主细胞、制备自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的方法及自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质用于制备成熟的生物学上有活性的弹性蛋白酶蛋白质(例如在药物制剂中使用的)的用途。本文中的术语“自体活化的(auto-activated)”(或“autoactivated”)可与术语“自体活化的(auto-activating)”、“自体活化的(self-activating)”和“自体活化的(self-activated)”互换使用，且不旨在暗示已发生活化步骤。本文中的术语“活化”可与术语“转变”互换使用，且不旨在暗示由“活化”得到的蛋白必需拥有酶活性。
下文中除非另有规定，术语“弹性蛋白酶”一般指具有弹性蛋白酶活性的成熟的弹性蛋白酶蛋白质及不成熟的弹性蛋白酶蛋白质(包括不成熟的原弹性蛋白酶蛋白质(在本文中也称为弹性蛋白酶原蛋白)和不成熟的前原弹性蛋白酶蛋白质(在本文中也称为弹性蛋白酶前原蛋白))。
本发明优选的弹性蛋白酶是I型胰腺弹性蛋白酶，如人I型胰腺弹性蛋白酶和猪I型胰腺弹性蛋白酶。I型胰腺弹性蛋白酶有时也被称为“弹性蛋白酶-1”、“弹性蛋白酶I”、“1型弹性蛋白酶(elastase type1)”、“1型弹性蛋白酶(type1elastase)”或“ELA-1”。人I型胰腺弹性蛋白酶在本文中也被称为hELA-1或人ELA-1；猪I型胰腺弹性蛋白酶在本文中也被称为pELA-1或猪ELA-1。
本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质一般具有天然弹性蛋白酶基因编码的氨基酸序列或该序列的变体。本文描述了优选的序列变体(包括含氨基酸取代的变体)。原弹性蛋白酶蛋白质是成熟的弹性蛋白酶蛋白质的大多无活性的前体，且前原弹性蛋白酶还含蛋白质分泌的信号序列。本发明的弹性蛋白酶蛋白质的前序列和原序列一般非源于编码本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的弹性蛋白酶基因。因此，某种意义上，本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质是具有其由天然弹性蛋白酶基因编码的成熟部分和其由非弹性蛋白酶基因序列编码的不成熟部分的“嵌合”蛋白。
为易于引用，本发明的弹性蛋白酶蛋白质及其核心序列成分示于图2。如图2所示，原弹性蛋白酶序列中切割键(即被切割而产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的键)N-端侧的氨基酸残基在本文中被标为PX、…P5、P4、P3、P2和P1，其中P1是从切割键数起N-端侧的第一个氨基酸残基，而位于成熟的弹性蛋白酶切割键C-端侧(且向N-端侧)的氨基酸残基被标为P1’、P2’、P3’、…PX’，其中P1’是从切割键数起C-端侧的第一个氨基酸残基，且代表成熟的蛋白质的N-端氨基酸残基。图2还显示下列成分：
(1)信号序列：增加由细胞分泌的表达出的分子的比例的序列。例示序列是SEQ ID NO：50或51的氨基酸1～22。
(2)原肽+间隔子：任选地，优选为非弹性蛋白酶，还任选包括一个或多个间隔子序列(酵母α因子原肽序列与Kex2和STE13间隔子序列示于图1B)的原肽序列(如酵母α因子前原肽)。在特定实施方式中，原肽序列不包括间隔子。
(3)弹性蛋白酶原肽：存在于弹性蛋白酶N-端时使分子无活性或相比相应的成熟的弹性蛋白酶蛋白质少活性的肽。弹性蛋白酶原肽可与活化肽连续，或可相对活化肽含附加的氨基酸。例示弹性蛋白酶原肽序列是SEQ ID NO：64和69的氨基酸1～10。
(4)活化肽：可与“活化序列”互换使用，活化肽是弹性蛋白酶原肽的成分，且可与弹性蛋白酶原肽连续。如图2所示，活化肽含氨基酸残基P10～P1。例示活化肽共有序列是SEQ ID NO：80，其他活化肽序列例是SEQ ID NO：23、72和73。
(5)识别序列：识别序列是弹性蛋白酶原肽的成分。如图2所示，识别序列含氨基酸残基P3～P1。例示识别序列共有序列是SEQ IDNO：11～13和93，且例示识别序列是SEQ ID NO：20。
(6)切割结构域：原弹性蛋白酶蛋白质中跨切割键的区域。如图2所示，切割结构域含氨基酸残基P5～P3’。例示切割结构域序列是SEQ ID NO：42、43、48、49、53、53、54和55。
(7)切割位点：原弹性蛋白酶蛋白质中跨切割键的另一区域。如图2所示，切割位点含氨基酸残基P4～P4’。例示切割位点序列是SEQID NO：27。
(8)前原弹性蛋白酶蛋白质：可含全部组成部分的蛋白质。例示前原弹性蛋白酶蛋白质可含SEQ ID NO：50、51、96或97的肽，随后是可操作连接的SEQ ID NO：64或69的蛋白质。
(9)原弹性蛋白酶蛋白质：含成熟的弹性蛋白酶蛋白质、弹性蛋白酶原肽和任选的原肽和间隔子序列的蛋白质。例示原弹性蛋白酶序列是SEQ ID NO：64和69。
(10)成熟的弹性蛋白酶蛋白质：适当加工时表现出弹性蛋白酶活性的蛋白质。例示成熟的序列是SEQ ID NO：1(人)和SEQ ID NO：39(猪)。
弹性蛋白酶蛋白质成分可被认为是弹性蛋白酶蛋白质、原弹性蛋白酶蛋白质和前原弹性蛋白酶蛋白质的模块构建。例如，本发明提供含弹性蛋白酶原肽和成熟的弹性蛋白酶蛋白质的序列的原弹性蛋白酶蛋白质。弹性蛋白酶原肽可含活化肽。弹性蛋白酶原肽还可含弹性蛋白酶识别序列。本发明还提供含在跨弹性蛋白酶原肽和成熟的弹性蛋白酶蛋白质之间的连接的区域中的切割结构域或切割位点的原弹性蛋白酶蛋白质。原弹性蛋白酶蛋白质还可含分泌用信号序列。所述蛋白质被认为是前原弹性蛋白酶蛋白质。前原弹性蛋白酶蛋白质还可含酵母α因子原肽，及任选的信号序列与弹性蛋白酶原肽之间的间隔序列。本发明的弹性蛋白酶蛋白质还可含图2所示的核心模块成分之外的成分。例如，弹性蛋白酶蛋白质可含用于纯化的表位标签或组氨酸标签。还应知本发明的弹性蛋白酶蛋白质无需含图2所示全部成分，但一般含图2中所示的至少一种成分(包括例如但不限于成熟的弹性蛋白酶或原弹性蛋白酶序列)。本发明的例示弹性蛋白酶蛋白质下文第8部分的实施方式1～12、28～39和68～69所述，包括下文第8部分的实施方式13～27所述的I型原弹性蛋白酶蛋白质。
本文含盖了编码本发明的弹性蛋白酶蛋白质的核酸、制备和纯化所述蛋白质、重组细胞和细胞培养物上清的方法、含弹性蛋白酶蛋白质的组合物(例如药物组合物、单元剂、制剂)、所述蛋白质用于治疗目的的用途和含所述蛋白质、制剂、药物组合物和单元剂的试剂盒。编码本发明的弹性蛋白酶蛋白质的核酸例示于下文第8部分的实施方式40～67，包括载体(见例如实施方式70～72)。例示于下文第8部分的还有重组细胞(见例如实施方式73～84)、含弹性蛋白酶蛋白质的细胞上清(见例如实施方式88)。制备弹性蛋白酶蛋白质的方法例示于下文第8部分的实施方式89～224、261～276和347～373。制备弹性蛋白酶制剂的方法例示于下文第8部分的实施方式225～260。制备药物组合物的方法例示于下文第8部分的实施方式374～385。含弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物例示于下文第8部分的实施方式277～313和386，且单元剂例示于下文第8部分的实施方式415～420。弹性蛋白酶蛋白质制剂例示于下文第8部分的实施方式324～346。弹性蛋白酶蛋白质用于治疗目的的用途例示于下文第8部分的实施方式387～414。含所述蛋白质的试剂盒例示于下文第8部分的实施方式421～424。
本发明的有关药物组合物和/或具有SEQ ID NO：64和69的原弹性蛋白酶蛋白质的方面例示于下文第8部分的实施方式425～472；而所述实施方式可应用于本文公开的其他弹性蛋白酶蛋白质序列和组合物。
本文描述的制备方法长包括活化步骤，其中所述活化肽从原弹性蛋白酶序列除去/从成熟的弹性蛋白酶序列分离出，由此产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质。本文描述的活化步骤可为自体活化步骤(即通过弹性蛋白酶活性进行)或非自体活化步骤(即非弹性蛋白酶介导的，例如通过胰蛋白酶进行)。
在某些方面，本发明提供含编码弹性蛋白酶蛋白质(包括但不限于SEQ ID NO：6～9、64～69、88～91或98～103中任一蛋白质)的核苷酸序列的核酸分子，所述弹性蛋白酶蛋白质包括：(i)含活化肽序列(含弹性蛋白酶识别序列)的弹性蛋白酶原肽，其可操作连接于(ii)具有弹性蛋白酶活性的蛋白质的氨基酸序列。所述蛋白质任选还包括可操作连接于所述弹性蛋白酶原肽的信号序列(如酵母α-因子信号肽，且由SEQ ID NO：34的氨基酸序列所例示)。所述α-因子在本文中有时被称为“α-因子(alpha-因子)”或“α交配因子”或“α-交配因子”。在某些特定实施方式中，所述蛋白质含非弹性蛋白酶原肽，如酵母α-因子原肽。在某些特定实施方式中，所述蛋白质可含一种或多种间隔序列。间隔序列可包括但不限于：Kex2和STE13蛋白酶切割位点。在特定实施方式中，可使用Kex2间隔子。在另一实施方式中，如图1B所示，Kex2间隔子可被可操作连接于STE13间隔子。信号肽序列和非弹性蛋白酶原肽序列以SEQ ID NO：51或97的氨基酸序列例示。含信号肽序列、非弹性蛋白酶原肽序列和间隔序列的肽以SEQ ID NO：50或96的氨基酸序列例示。
在其他特定实施方式中，所述信号序列是哺乳动物分泌信号序列，如猪或人I型弹性蛋白酶(与I型胰腺弹性蛋白酶互换使用)信号序列。
弹性蛋白酶识别序列优选为I型胰腺弹性蛋白酶识别序列。
在特定实施方式中，所述具有I型弹性蛋白酶活性的蛋白质是成熟的人I型弹性蛋白酶，例如SEQ ID NO：1、4、5、84或87的氨基酸序列的蛋白质。
本发明还提供含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质含：(i)在比赤酵母中可操作的信号序列，其可操作连接于(ii)含弹性蛋白酶识别序列(包括但不限于SEQ ID NO：11～23和93的氨基酸序列)活化序列(包括但不限于SEQ ID NO：23、72、73或80的氨基酸序列)，其又连接于(iii)成熟的人I型弹性蛋白酶的氨基酸序列。在优选实施方式中，蛋白酶识别序列是人I型弹性蛋白酶识别序列，最优选为SEQ ID NO：20的弹性蛋白酶识别序列。
还提供了由本发明的核酸编码的原弹性蛋白酶蛋白质(任选含信号序列，由此呈现为前原弹性蛋白酶蛋白质)和成熟的弹性蛋白酶蛋白质，及含所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质的组合物(例如药物组合物、制剂和单元剂)。
在优选实施方式中，所述原弹性蛋白酶蛋白质或成熟的弹性蛋白酶蛋白质不具有N-端甲硫氨酸残基。但在另一实施方式中，所述原弹性蛋白酶蛋白质或成熟的弹性蛋白酶蛋白质具有N-端甲硫氨酸残基。
以下表1总结了本发明中使用的序列标识。本发明的优选蛋白质含以下表1所列SEQ ID NO：1～32、34、37～73、77、78、82～92和98～105中任一个，或由以下表1所列SEQ ID NO：1～32、34、37～73、77、78、82～92和98～105中任一个构成，或部分或全部由SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：81的核苷酸序列编码。
表1：氨基酸和核苷酸SEQ ID NO的总结。
人I型弹性蛋白酶蛋白质有至少5种已证实的多态性，在位置10(Q或H)、44(W或R)、59(M或V)、220(V或L)和243(Q或R)处。全长(前原弹性蛋白酶)蛋白质的长度为258个氨基酸。前8个氨基酸对应于信号序列或“前”肽序列，其被切割下而产生无活性的原蛋白，接着，“原”肽序列(含对应于活化肽的10个氨基酸序列，或由对应于活化肽的10个氨基酸序列构成)被切割下而产生有活性的、成熟的蛋白质。因此，在位置10处的多态性存在于原蛋白中，但不存在于成熟蛋白中。
因此，以下表2显示了人I型弹性蛋白酶的5种多态性的所有可能的组合。本发明提供前原弹性蛋白酶和原弹性蛋白酶蛋白质(包括但不限于本文描述的变体前原弹性蛋白酶和原弹性蛋白酶蛋白质)(如例示于第8部分的实施方式1～39和68～69的蛋白质，或由第8部分的实施方式89～224、261～276和347～373中任一项的方法得到或可得到的蛋白质)含以下表2所示的任意多态性组合。
位置 10 44 59 220 243
实施方式 Q或H W或R M或V V或L Q或R
1. Q W M V Q
2. Q W M V R
3. Q W M L Q
4. Q W V V Q
5. Q R M V Q
6. Q W M L R
7. Q W V L Q
8. Q R V V Q
9. Q W V V R
10. Q R M L Q
11. Q R M V R
12. Q R V L Q
13. Q R V V R
14. Q R M L R
15. Q W V L R
16. Q R V L R
17. H W M V Q
18. H W M V R
19. H W M L Q
20. H W V V Q
21. H R M V Q
22. H W M L R
23. H W V L Q
24. H R V V Q
25. H W V V R
26. H R M L Q
27. H R M V R
28. H R V L Q
29. H R V V R
30. H R M L R
位置 10 44 59 220 243
实施方式 Q或H W或R M或V V或L Q或R
31. H W V L R
32. H R V L R
表2：人I型成熟的弹性蛋白酶(前原)和原弹性蛋白酶蛋白质的变体。所述位置编号指天然人I型弹性蛋白酶的前原蛋白的位置。
此外，以下表3显示了可存在于成熟的弹性蛋白酶蛋白质的人I型弹性蛋白酶的4种多态性的所有可能的组合。本发明提供了含以下表3所示多态性组合中的任一种的成熟的弹性蛋白酶蛋白质(包括但不限于本文所述变体成熟的弹性蛋白酶蛋白质)，如例示于第8部分的实施方式89～224、261～276和347～373中任一项的方法得到或可得到的成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
位置 44 59 220 243
实施方式 W或R M或V V或L Q或R
1. W M V Q
2. W M V R
3. W M L Q
4. W V V Q
5. R M V Q
6. W M L R
7. W V L Q
8. R V V Q
9. W V V R
10. R M L Q
11. R M V R
12. R V L Q
13. R V V R
14. R M L R
15. W V L R
16. R V L R
表3：成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质。所述位置编号指天然人I型弹性蛋白酶的前原蛋白的位置。
本发明的成熟的I型弹性蛋白酶可经纯化，例如用于药物组合物。在特定实施方式中，所述弹性蛋白酶为至少70％、80％、90％、95％、98％或99％纯。
本发明的成熟的I型弹性蛋白酶优选具有大于1、大于5、大于10、大于20、大于25、或大于30U/mg蛋白质的比活性，如通过小肽底物(N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基酰苯胺(SLAP))的水解速率(其通过加入弹性蛋白酶而被催化)来测定。1个活性单位被定义为于30℃每分钟催化1μmol底物水解的弹性蛋白酶量，而比活性被定义为每mg弹性蛋白酶蛋白质的活性(U/mg)。成熟的人I型弹性蛋白酶优选具有在下限为1、2、3、4、5、7、10、15或20U/mg蛋白质而上限独立地为5、10、15、20、25、30、35、40或50U/mg蛋白质的范围内的比活性。例示实施方式中，比活性在1～40U/mg蛋白质、1～5U/mg蛋白质、2～10U/mg蛋白质、4～15U/mg蛋白质、5～30U/mg蛋白质、10～20U/mg蛋白质、20～40U/mg蛋白质的范围内、或下限和上限选自上述任何值的任何范围内。成熟的猪I型弹性蛋白酶优选具有在下限为1、2、3、4、5、7、10、15、20、30、40、50、60或75U/mg蛋白质而上限独立地为5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、90、95或100U/mg蛋白质的范围内的比活性。例示实施方式中，猪弹性蛋白酶的比活性在10～50U/mg蛋白质、20～60U/mg蛋白质、30～75U/mg蛋白质、30～40U/mg蛋白质、20～35U/mg蛋白质、50～95U/mg蛋白质、25～100U/mg蛋白质的范围内、或下限和上限选自上述任何值的任何范围内。
因此，本发明的某些方面涉及组合物(如药物组合物、弹性蛋白酶制剂和单元剂)，如下文第8部分的实施方式277～314、346、386和415～420或通过实施方式261～276和374～385中任一项的方法得到或可得到的那些所例示。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物含胰蛋白酶活化的弹性蛋白酶(如由本文公开的任意方法制备的胰蛋白酶活化的蛋白质)。在其他实施方式中，所述组合物含自体活化的弹性蛋白酶蛋白质，例如由本文公开的任意方法制备的自体活化的弹性蛋白酶。在某些方面，本发明的组合物的特征在于下列特征中的至少1项、至少2项、至少3项、至少4项、至少5项、至少6项或至少7项：
(a)所述组合物中无胰蛋白酶；
(b)所述组合物中基本上无胰蛋白酶；
(c)所述组合物中无由SEQ ID NO：70和71构成的任意蛋白质；
(d)所述组合物中基本上无由SEQ ID NO：2和3构成的任意蛋白质；
(e)所述组合物中无细菌蛋白质；
(f)所述组合物中基本上无细菌蛋白质；
(g)所述组合物中无所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质之外的哺乳动物蛋白质；
(h)所述组合物中基本上无所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质之外的哺乳动物蛋白质；
(i)所述组合物中无或基本上无1种、2种、3种或全部4种由SEQ ID NO：85、86、94和95构成的蛋白质；
(j)所述组合物中无或基本上无1种、2种或全部3种由SEQ IDNO：106、107和108构成的蛋白质；
(k)所述组合物含药学可接受水平的内毒素(如10EU/mg弹性蛋白酶或以下，或者5EU/mg弹性蛋白酶或以下)；
(l)所述组合物中成熟的弹性蛋白酶蛋白质的特征在于1～40U/mg蛋白质的比活性，或本文公开的任意其他范围的比活性；
(m)所述组合物中的胰蛋白酶活性对应于小于4ng/mg成熟的弹性蛋白酶蛋白质或本文公开的任意其他范围的胰蛋白酶活性；
(n)所述组合物含聚山梨酯-80；
(o)所述组合物含右旋糖酐；
(p)所述组合物含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子和聚山梨酯-80；
(q)所述组合物含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子和右旋糖酐；
(r)所述组合物含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子、聚山梨酯-80和右旋糖酐；
(s)所述组合物中的成熟的弹性蛋白酶蛋白质表现出本文公开的稳定量(如在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～100％)；及
(t)所述组合物含0.0033mg～200mg所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质的单元剂，或本文公开的任何其他成熟的弹性蛋白酶蛋白质的单元剂。
在某些方面，所述组合物的特征在于独立选自下列组(i)～(v)的至少3项特征、至少4项特征或5项特征：
(i)(a)、(b)或(m)
(ii)(e)或(f)
(iii)(g)或(h)
(iv)(k)
(v)(l)
在特定实施方式中，所述至少3项或至少所述4项特征中的2项选自组(i)和(iv)或(v)。在其他实施方式中，所述至少4项特征中的3项选自组(i)、(iv)和(v)。
在特定实施方式中，本发明提供组合物(包括但不限于药物组合物、弹性蛋白酶制剂或单元剂)，其含：(i)治疗有效量的无胰蛋白酶的人I型弹性蛋白酶；和(ii)药学可接受载体。另外，本发明提供组合物，其含：(i)治疗有效量的基本上无胰蛋白酶的人I型弹性蛋白酶；和(ii)药学可接受载体。在特定实施方式中，所述人I型弹性蛋白酶和/或组合物含小于5ng/ml的胰蛋白酶活性、小于4ng/ml的胰蛋白酶活性、小于3ng/ml的胰蛋白酶活性、小于2ng/ml的胰蛋白酶活性、或小于1.56ng/ml的胰蛋白酶活性。在上述例子中，所述ng/ml胰蛋白酶活性可在含1mg/ml人I型弹性蛋白酶蛋白质的液体人I型弹性蛋白酶组合物或制剂中测定。因此，所述胰蛋白酶活性还可以mg弹性蛋白酶描述，例如小于3ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶蛋白质，小于1.56ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶蛋白质等。本发明还提供组合物，其含：(i)治疗有效量的人I型弹性蛋白酶；和(ii)药学可接受载体，其中所致组合物含少于5ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于4ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于3ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于2ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、或少于1.56ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶。
本发明还提供提高由胰蛋白酶活化方法(例如下文第8部分的实施方式145的方法)产生的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的质量的方法，包括：用Macro-Prep High S树脂层析柱纯化所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质。本发明的发明人发现，相比用Poros(聚(苯乙烯-二乙烯苯))层析柱的纯化(其产生具有对应于约1000ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶蛋白质的胰蛋白酶活性水平的弹性蛋白酶组合物)，用Macro-Prep High S树脂层析柱纯化的成熟的弹性蛋白酶蛋白质产生具有对应于20～25ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶蛋白质的胰蛋白酶活性水平的弹性蛋白酶组合物。本发明还提供含通过用Macro-PrepHigh S树脂层析柱纯化胰蛋白酶-活化的弹性蛋白酶蛋白质产生的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的弹性蛋白酶组合物。所述Macro-Prep High S树脂层析柱可从Biorad(Hercules,CA)得到，根据其所言，刚性甲基丙烯酸酯支持物的皱缩度和溶胀度小。可使用其他类似的相同类别和/或具有相同珠尺寸(约50μm)的阳离子交换柱，如可适用其他甲基丙烯酸酯层析柱。
本发明的其他方面涉及含猪I型胰腺弹性蛋白酶的组合物(包括但不限于药物组合物、弹性蛋白酶制剂或单元剂)。在特定实施方式中，本发明提供组合物，其含：(i)治疗有效量的无胰蛋白酶的猪I型弹性蛋白酶；和(ii)药学可接受载体。另外，本发明提供组合物，其含：(i)治疗有效量的基本上无胰蛋白酶的猪I型弹性蛋白酶；和(ii)药学可接受载体。在特定实施方式中，所述猪I型弹性蛋白酶和/或组合物含小于100ng/ml的胰蛋白酶活性、含小于75ng/ml的胰蛋白酶活性、含小于50ng/ml的胰蛋白酶活性、含小于25ng/ml的胰蛋白酶活性、含小于15ng/ml的胰蛋白酶活性、含小于10ng/ml的胰蛋白酶活性、小于5ng/ml的胰蛋白酶活性、小于4ng/ml的胰蛋白酶活性、小于3ng/ml的胰蛋白酶活性、小于2ng/ml的胰蛋白酶活性、或小于1.56ng/ml的胰蛋白酶活性。在上述例子中，所述ng/ml胰蛋白酶活性可在含1mg/ml猪I型弹性蛋白酶蛋白质的液体猪I型弹性蛋白酶组合物或制剂中测定。因此，所述胰蛋白酶活性还可以mg弹性蛋白酶描述，例如小于25ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶蛋白质，小于5ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶蛋白质等。本发明还提供组合物，其含：(i)治疗有效量的猪I型弹性蛋白酶；和(ii)药学可接受载体，其中所致组合物含少于100ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于75ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于50ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于25ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于15ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于10ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于5ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于4ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于3ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、少于2ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶、或少于1.56ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶。
其他实施方式中，本发明提供弹性蛋白酶蛋白质(如成熟的弹性蛋白酶蛋白质)的组合物(包括但不限于药物组合物、弹性蛋白酶制剂或单元剂)，其中无对应于SEQ ID NO：70、71、104、105中的1种、2种、3种或全部4种的N-端变体。在某些实施方式中，本发明提供药物组合物，其含：(i)治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶；(ii)药学可接受载体，其中所述药物组合物中无具有SEQ ID NO：70、71、104、105的任意蛋白质。
在其他实施方式中，本发明提供组合物(包括但不限于药物组合物、弹性蛋白酶制剂或单元剂)，其含：(i)治疗有效量的人I型弹性蛋白酶，其无或基本上无成熟的弹性蛋白酶蛋白质N-端上的特定额外氨基酸的变体蛋白质(SEQ ID NO：37、38、70、71、94、95、104、105)；和(ii)药学可接受载体。其他实施方式中，本发明提供组合物，其含：(i)治疗有效量的人I型弹性蛋白酶，其无或基本上无缺少成熟的弹性蛋白酶蛋白质N-端氨基酸的变体蛋白质(SEQ ID NO：2、3、37、38、70、71、85、86、94、95、104、105、106、107、108)；和(ii)药学可接受载体。在特定实施方式中，人I型弹性蛋白酶和/或组合物含少于25％的N-端变体、少于20％的N-端变体、少于15％的N-端变体、少于10％的N-端变体、少于5％的N-端变体、少于4％的N-端变体、少于3％的N-端变体、少于2％的N-端变体、少于1％的N-端变体、少于0.5％的N-端变体、0％的N-端变体，或含上述百分比中的任意2个之间的量的N-端变体(如2％～25％的N-端变体、0.5％～10％的N-端变体、5％～15％的N-端变体、0％～2％的N-端变体等)。如本文所用，术语“少于X％的N-端变体”指N-端变体占总弹性蛋白酶蛋白质的百分量。
在其他实施方式中，本发明提供组合物(包括但不限于药物组合物、弹性蛋白酶制剂或单元剂)，其含：(i)治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶；和(ii)药学可接受载体，其中所述药物组合物中无或基本上无细菌蛋白质和/或者无或基本上无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质。在特定实施方式中，所述人I型弹性蛋白酶和/或组合物含少于25％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、少于20％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、少于15％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、少于10％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、少于5％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、少于4％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、少于3％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、少于2％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、少于1％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、少于0.5％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、0％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质，或者含上述百分比中的任意2个之间的量的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质(例如2％～25％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、0.5％～10％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、5％～15％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质、0％～2％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质等)。如本文所用，术语“少于X％的细菌蛋白质和/或所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质”指所述蛋白质占弹性蛋白酶制剂或所述组合物中总蛋白质的百分量。在某些实施方式中，弹性蛋白酶占所述组合物或制剂中总蛋白的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.8％。
还提供了治疗和预防生物管道疾病的方法，所述方法包括：给有需要的患者施用含经纯化的本发明的成熟的人I型弹性蛋白酶的组合物(如药物组合物、弹性蛋白酶制剂或单元剂)。
还提供了载体，其含编码任意本发明的弹性蛋白酶蛋白质的核酸(“本发明的核酸”)、经改造而表达本发明的核酸的宿主细胞。在特定实施方式中，所述载体还含调控弹性蛋白酶蛋白质表达的核苷酸序列。例如，编码本发明的蛋白质的核苷酸序列可被可操作连接于可被甲醇诱导的启动子。其他适宜启动子例示于下文第5.3部分。
在特定实施方式中，本发明提供载体，其含：编码开放阅读框的核苷酸序列，所述开放阅读框含可操作连接于人I型弹性蛋白酶原蛋白序列的酵母α-因子信号肽或I型弹性蛋白酶信号肽(如猪弹性蛋白酶信号肽)。所述载体还任选含可操作连接于所述开放阅读框的可被甲醇诱导的启动子。
还提供了含本发明的核酸和载体的宿主细胞。在某些实施方式中，所述载体或核酸整合到所述宿主细胞基因组中；在其他实施方式中，所述载体或核酸在染色体外。优选的宿主细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。其他适宜的宿主细胞例示于下文第5.3部分。
在特定实施方式中，本发明提供经基因工程改造而编码含可操作连接于人I型弹性蛋白酶原酶序列的酵母α-因子信号肽或猪弹性蛋白酶信号肽的开放阅读框的巴斯德毕赤酵母宿主细胞。所述开放阅读框任选在可被甲醇诱导的启动子控制下。
本发明还提供产生本发明的未成熟或成熟的弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在原弹性蛋白酶蛋白质产生出的条件下培养经改造而表达本发明的核酸的宿主细胞。在某些实施方式中，也产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
产生本发明的原弹性蛋白酶和成熟蛋白(尤其对于宿主细胞巴斯德毕赤酵母)的优选培养条件包括在低pH下的生长期。一般而言，所述低pH是2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，或上述值的任意对之间的任意范围。在特定实施方式中，所述低pH是2.0～6.0、2.0～5.0、3.0～6.0、3.0～5.0、4.0～6.0或3.0～4.0的pH。在培养期末期，培养物的pH上升，出于从成熟的弹性蛋白酶蛋白质分离或移出活化序列的目的，优选达到pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0或上述任2个之间的pH范围。在特定实施方式中，培养物的pH上升到7.5～10.0或8.0～9.0的pH范围，及最优选达到pH8.0。
当本发明的原弹性蛋白酶蛋白质的表达在可被甲醇诱导的启动子控制下时，产生本发明的未成熟或成熟的弹性蛋白酶蛋白质的条件还可包括甲醇诱导期。
本发明的弹性蛋白酶产生方法还包括回收由宿主细胞表达出的蛋白质的步骤。在某些实施方式中，回收到的蛋白质是含活化序列的原弹性蛋白酶。在其他例子中，回收到的蛋白质是缺少活化序列的成熟的弹性蛋白酶。在某些条件下，兼回收原弹性蛋白酶和成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
优选地，尤其当需要防止自体活化的原弹性蛋白酶的自体活化时，用于原弹性蛋白酶表达的培养条件可包括在低pH下的生长和诱导期。一般而言，所述低pH是2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，或者上述值的任意对之间的任意范围。在特定实施方式中，所述低pH是2.0～3.0、4.0～5.0、5.0～6.0或6.0～7.0的pH。在特定实施方式中，所述pH为4.0～6.0，且最优选为pH5.5。
优选地，尤其当需要防止自体活化的原弹性蛋白酶自体活化时，用于原弹性蛋白酶表达的培养条件可包括在柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠中的生长和诱导期。在特定实施方式中，使用5～50mM、7.5～100mM、10～15mM、50～200mM、75～175mM、100～150mM、75～125mM的浓度，或者下限和上限选自上述任意值的任意范围的浓度(如50～75mM、75～100mM等)。在优选实施方式中，柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠浓度是90～110mM，且最优选为100mM。
此外，尤其当需要防止自体活化的原弹性蛋白酶自体活化或由成熟的弹性蛋白酶的自体降解时，用于未成熟的弹性蛋白酶蛋白质表达的培养条件可包括在适于所述宿主细胞的温度范围下端的生长和诱导期。例如，当宿主细胞是巴斯德毕赤酵母宿主细胞时，优选范围是约22～28℃。在特定实施方式中，所述巴斯德毕赤酵母在28℃下培养。
此外，尤其当需要防止由宿主细胞蛋白酶的蛋白质降解时，用于未成熟的弹性蛋白酶蛋白质表达的培养条件可包括在适于所述宿主细胞的温度范围下端的生长和诱导期。例如，当宿主细胞是巴斯德毕赤酵母宿主细胞时，优选范围是约22～28℃。在特定实施方式中，所述巴斯德毕赤酵母在28℃下培养。
本发明的自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的活化可由加入少(催化)量外源性弹性蛋白酶来起始。在某些实施方式中，内源性弹性蛋白酶的催化量占加入催化性弹性蛋白酶的样品中的弹性蛋白酶的少于10％、少于5％、少于2％、少于1％、少于0.5％或少于0.1％(以摩尔或摩尔质量计)。
另外或同时，自体活化的原弹性蛋白酶可经受pH7～11(最优选为pH8)，其后无需胰蛋白酶地除去自体活化的原弹性蛋白酶活化肽，且产生成熟的有活性的弹性蛋白酶。在特定实施方式中，在活化步骤过程中加入Tris碱至50～200mM、75～175mM、100～150mM、75～125mM的浓度，或者下限和上限选自上述任意值的任意范围的浓度(如50～75mM、75～100mM等)。在优选实施方式中，加入Tris碱至浓度90～110mM，最优选为100mM。Tris碱的pH优选为7～11；在特定实施方式中，Tris碱的pH为7.0～11.0、7～9、7.5～9.5、7.5～10、8～10、8～9，或下限和上限选自上述任意值的任意范围。在优选实施方式中，Tris碱的pH为7.5～8.5，最优选为8.0。
未成熟弹性蛋白酶序列的表达可在某些情形下产生原弹性蛋白酶蛋白质和成熟的弹性蛋白酶蛋白质及N-端变体弹性蛋白酶蛋白质的混合物。因此，本发明提供组合物，其含以下之至少2种：(1)原弹性蛋白酶蛋白质、(2)成熟的弹性蛋白酶蛋白质、和(3)N-端变体弹性蛋白酶蛋白质。
一旦产生成熟的弹性蛋白酶，其可经冻干例如用于药物制剂。在例示实施方式中，本发明提供分离冻干的成熟的I型弹性蛋白酶的方法，包括：
(a)在开放阅读框表达出的条件下培养经改造而表达编码前原弹性蛋白酶开放阅读框的核酸分子的宿主细胞(如巴斯德毕赤酵母宿主细胞)，其中，在特定实施方式中，所述开放阅读框含以5’→3’方向编码下列序列的核苷酸序列：
(i)信号肽(如在巴斯德毕赤酵母中可操作的信号肽)；
(ii)含弹性蛋白酶识别序列的活化序列；和
(iii)成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的序列，
由此产生原弹性蛋白酶蛋白质；
(b)使所述原弹性蛋白酶蛋白质经受自体活化条件，由此产生成熟的I型弹性蛋白酶，其中所述自体活化条件包括下列之一或下列之组合：
(i)改变含原弹性蛋白酶蛋白质的溶液(可为细胞培养物上清)pH至pH6.5～11，优选为8～9；
(ii)纯化原弹性蛋白酶蛋白质(例如通过离子交换层析)，并使所述溶液经受延长的转变，以除去N-端变体，由此产生成熟的人I型弹性蛋白酶；
(iii)浓缩原弹性蛋白酶蛋白质(例如2倍、3倍、5倍、8倍、10倍、12倍，或者下限和上限独立选自上述浓度水平的范围)；
(iv)使所述原弹性蛋白酶蛋白质经受升高的温度(如29℃、30℃、32℃、35℃、40℃、45℃或40℃，或者下限和上限独立选自上述温度的范围)；
(v)从细胞培养物上清纯化原弹性蛋白酶蛋白质(如使用Macro-Prep High S树脂)，并于环境温度(如22℃～26℃)下温育所述含经纯化的原弹性蛋白酶蛋白质的溶液至少1天(如1天、2天、3天、4天、5天或6天，下限和上限独立选自上述值的天范围)的时间(这受溶液中柠檬酸/乙酸的存在、浓度、温度和pH的影响，且可容易被本领域技术人员确定)；
(c)任选地，纯化成熟的人I型弹性蛋白酶，如离子交换层析步骤，用于精制(polish)层析；及
(d)冻干成熟的I型弹性蛋白酶，由此分离冻干的成熟的人I型弹性蛋白酶。所述成熟的I型弹性蛋白酶优选为人I型弹性蛋白酶。在某些方面，所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶优选高于95％纯；在特定实施方式中，所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶优选高于98％纯或高于99％纯。
本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质可配置成药物组合物。因此，在例示实施方式中，本发明提供产生含成熟的人I型弹性蛋白酶的药物组合物的方法，所述方法包括：(i)根据上述方法分离冻干的成熟的人I型弹性蛋白酶；及(ii)在药学可接受载体中复原所述冻干的成熟的人I型弹性蛋白酶。本发明的成熟的人I型弹性蛋白酶优选具有大于1、大于5、大于10、大于20、大于25、或大于30U/mg蛋白质的比活性，如通过小肽底物(N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基酰苯胺(SLAP))的水解速率(其通过加入弹性蛋白酶而被催化)来测定。1个活性单位被定义为于30℃每分钟催化1mmol底物水解的弹性蛋白酶量，而比活性被定义为每mg弹性蛋白酶蛋白质的活性(U/mg)。成熟的人I型弹性蛋白酶优选具有在下限为1、2、3、4、5、7、10、15或20U/mg蛋白质而上限独立地为5、10、15、20、25、30、35、40或50U/mg蛋白质的范围内的比活性。例示实施方式中，比活性在1～40U/mg蛋白质、1～5U/mg蛋白质、2～10U/mg蛋白质、4～15U/mg蛋白质、5～30U/mg蛋白质、10～20U/mg蛋白质、20～40U/mg蛋白质的范围内、或下限和上限选自上述任何值的任何范围内(如1～10U/mg、5～40U/mg等)。
本发明的药物组合物优选为稳定的。在特定实施方式中，药物组合物(如通过上述冻干和复原制备的药物组合物)在4℃保存1周后保持至少50％、更优选至少60％和最优选至少70％其比活性。在特定实施方式中，药物组合物在复原和于4℃保存1周后保持至少75％、至少80％、至少85％或至少95％其比活性。
本发明还提供含I型弹性蛋白酶原蛋白(elastase proprotein)氨基酸序列的蛋白质，所述I型弹性蛋白酶原蛋白氨基酸序列含弹性蛋白酶切割结构域序列。其他也可用于本发明的切割结构域是由共有切割结构域序列(SEQ ID NO：74)Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8描述的任意序列，其中Xaa1＝P5、Xaa2＝P4、Xaa3＝P3、Xaa4＝P2、Xaa5＝P1、Xaa6＝P′1、Xaa7＝P′2、且Xaa8＝P′3，其中：
Xaa1是谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或丙氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa2是苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或组氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa3是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、天冬酰胺或缬氨酸，或者任选为它们的类似物，但优选不是甘氨酸或脯氨酸；
Xaa4是脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸或苏氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa5是丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丝氨酸，但不是甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酸或赖氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa6是丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丝氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa7是甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸，或者任选为它们的类似物；且
Xaa8是缬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸，或者任选为它们的类似物。
本发明还提供分离成熟的人I型弹性蛋白酶的方法，包括：(a)在培养条件下培养含编码含下列序列的原蛋白的核苷酸序列的宿主细胞：(i)含胰蛋白酶识别序列的活化序列，其可操作连接于(ii)在所述培养条件下具有弹性蛋白酶活性的蛋白质的氨基酸序列，其中所述培养条件包括在pH2～6的生长或诱导期；(b)回收表达出的原蛋白；(c)使回收到的蛋白质与催化量的胰蛋白酶在胰蛋白酶有活性的pH条件下接触；及(d)分离成熟的人I型弹性蛋白酶。在此方法中，所述成熟的人I型弹性蛋白酶可基本上由SEQ ID NO：1、4、5、84或87构成。在某些实施方式中，所述条件可包括：(a)在pH4～6下的生长或诱导期；(b)在22℃～28℃下的生长或诱导期；或(c)在所述宿主细胞的培养基中约50mM～约200mM的柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠浓度，或者柠檬酸钠浓度为90mM～约110mM。
应知，本申请所用不定冠词“a”和“an”及定冠词“the”，如在专利申请中常用，指一种或多种/一个或多个，除非文中明显别样规定。此外，本申请好所用术语“或”，如在专利申请中常用，指析取的“或”，或者合取的“和”。
说明书中提及的全部出版物通过引用并入本文。说明书中包括的任何文献讨论、说法、材料、文章等仅旨在提供本发明的上下文。这不是承认任意这些构成如在本申请的优先权日前已存在的现有技术基础的一部分或是本发明相关领域的公知常识。
本发明的特征和优点将通过下列实施方式的详述而更加显见。
4.附图简述
图1A～图1B：图1A示合成的(如重组的)人ELA-1.2A序列。重组的人弹性蛋白酶-1(如人I型胰腺弹性蛋白酶)序列含750个碱基对的编码区。选定的限制酶位点加了下划线。碱基取代以双下划线显示，粗体字母和含所述粗体字母的密码子加了双下划线。终止密码子用方框框住。原肽序列以斜体显示。编码区产生250个氨基酸的蛋白质。切去10个氨基酸原肽后产生的成熟酶是240个氨基酸。图1B示pPROT24翻译融合区。图示了载体与ELA-1编码区的翻译融合体。为并入Kex2和STE13信号切割结构域而提供ELA-1序列的PCR扩增，以产生具有期望的活化序列(以斜体显示)的第一氨基酸(以粗体显示)的N-端分的泌出的产物。
图2：本发明的弹性蛋白酶蛋白质的(重叠的)核心成分的N-端至C-端示意图，其中所述编号的成分指：(1)信号序列(垂直条纹)；(2)任选的原肽/间隔序列(砖纹)；(3)弹性蛋白酶原肽(合并了斜纹、空白条和菱形图案)；(4)活化肽(合并了空白条和菱形图案)；(5)识别序列(菱形图案)；(6)切割结构域(空白条、菱形图案和水平条纹的左部分)；(7)切割位点(空白条、菱形图案和水平条纹的左部分)；(8)前原弹性蛋白酶蛋白质(整个示意图)；(9)原弹性蛋白酶蛋白质(合并了垂直条纹、空白条、菱形图案和水平条纹)；和(10)成熟的弹性蛋白酶蛋白质(水平条纹)。表显示示意图中箭头跨越的区域的氨基酸标识。未按比例画出。命名仅用于参照目的，不旨在意味着特定功能、活性或机理。
图3：pPROT24-V载体的模式图。“α因子分泌”指含酵母α因子信号肽和原肽的盒，其后是Kex2位点和STE13重复子。
图4：自含胰蛋白酶活化的原-PRT-201的201-24-266-VU培养物的捕获层析的级分的SDS-PAGE分析。泳道数对应于级分数。级分6～18主要由糖基化的原酶(上带)和非糖基化的原酶(下带)组成。级分19～35主要由非糖基化的原酶组成。M＝分子量标记物。FT＝柱流通。
图5A～5F：图5A是自体活化的原蛋白数据表。原肽序列列于第一栏。诱导1、2和3天后上清的SDS-PAGE(分别为泳道1、2和3)显示于第二栏。基于SDS-PAGE的相对原蛋白产量列于第三栏。诱导经3天的原蛋白的基于SDS-PAGE的相对稳定性列于第四栏。具有42和48原肽序列的原蛋白经排序具有低稳定性，因为诱导期间存在成熟蛋白(42变体在1、2和3天后观察到；而48变体在2和3天后观察到)。经时测定而达到最大SLAP反应速度的原蛋白的相对转变速率列于第五栏。经转变的含成熟的弹性蛋白酶蛋白质的N-端变体的蛋白质的估计的百分率列于第六栏。图5B～5F分别示原肽序列24、42、48、49和55的转变速率。
图6：pPROT55M3-V克隆方案。pPROT55M3-V通过将两种额外的表达盒体外连接至4.3kb的pPROT55-V载体骨架上，导致共3个串联的表达盒。用BglII和BamHI限制消化从pPROT55-V释放2.3kb的表达盒片段，并纯化，随后将2个拷贝的表达盒连接到用BamHI线性化的pPROT55-V。
图7：克隆201-55M3-006-VU的摇瓶优化。制备标准诱导培养基BKME，并补充柠檬酸钠至0、12.5、25和50mM柠檬酸钠的终浓度，pH5.5。所述培养基用于以1g湿细胞重量/10mL诱导培养基的比例重悬生长期细胞沉淀。将各25mL的细胞悬液置于250mL不带挡板的瓶中，并于22℃或25℃，275rpm摇动下温育3天。每天加入2次甲醇至0.5％(以体积计)的终浓度。在3天培养期间取上清等份，并用SDS-PAGE和考马斯染色分析蛋白质的表达。图7A显示于22℃诱导的样品；而图7B显示于25℃诱导的样品。在2幅图中，泳道1～3分别是诱导1、2和3天后的上清，含0％柠檬酸钠；泳道4～6类似，除含12.5％柠檬酸钠之外；泳道7～9类似，除含25％柠檬酸钠之外；且泳道10～12类似，除含50mM柠檬酸钠之外。
图8：201-55-001-VU和201-55M3-003-VU发酵上清的SDS-PAGE分析。泳道1、2：201-55-001-VU上清；泳道3、4：201-55M3-003-VU上清；泳道5：空；泳道6：分子量标记物。
图9：自pPROT55M3-V原蛋白捕获层析的级分的SDS-PAGE分析。将自各洗脱级分的共30μl与10μl补充β-巯基乙醇的4×Laemmli样品加样缓冲液混合。将蛋白质在8～16％线性梯度凝胶上电泳，然后经考马斯染色。观察到2种主要形式的PRT-201：原蛋白(级分15～43)和自发转变的成熟的PRT-201(级分15～44)。泳道数对应于级分数。M，分子量标记物。BC，柱前(加样前)样品。
图10：纯化的原蛋白转变的HIC-HPLC分析。使纯化的原-PRT-201-55M3-003-VU经受于26℃下的转变。坐标图示成熟(全长)PRT-201和转变过程中产生的N-端变体的相对量。
图11：经正切流动过滤作用的发酵上清中原蛋白转变的HIC-HPLC分析。将澄清的201-55M3-003-VU发酵上清在环境温度下用再生的纤维素膜以恒定速度透析过滤经100mM Tris，pH8.0的正切流动过滤作用。坐标图显示转变期间各时间点存在的原蛋白、成熟(全长)PRT-201和N-端变体的相对量。
图12：自pPROT55M3-V转变捕获层析的级分的SDS-PAGE分析。将自各洗脱级分的共30μl与10μl补充β-巯基乙醇的4×Laemmli样品加样缓冲液混合。将蛋白质在8～16％线性梯度凝胶上电泳，然后经考马斯染色。观察到2种主要形式的PRT-201：糖基化的成熟形式(级分35～70)和非糖基化的的成熟形式(级分75～160)。泳道数对应于级分数。M，分子量标记物。BC，柱前(加样前)样品。
图13：原转变的浓度依赖性。使自201-55M3-003-VU克隆(原-PRT-201-55M3-003-VU)纯化的原-PRT-201在0.2、1.0、1.6和1.8mg/mL的浓度下经历转变。转变反应通过HIC-HPLC实时监控至原蛋白占总蛋白的≤1％。坐标图显示转变期间产生的成熟(全长)PRT-201(空白柱)和N-端变体(垂直实心柱)的相对量。
图14：合成的(即重组的)猪I型胰腺弹性蛋白酶的DNA序列。重组序列含750个碱基对的编码区。并入所示SacII和Xbal限制位点，以辅助克隆。终止密码子用方框框住。原肽序列以粗体显示。
图15：合成的(即重组的)猪I型胰腺弹性蛋白酶的氨基酸序列。原肽区以粗体显示，而胰蛋白酶切割位点以方框框住。在切割10个氨基酸原肽后，得到的成熟酶是240个氨基酸。
图16：猪I型胰腺弹性蛋白酶至PV-1载体的克隆方案。在合成猪I型胰腺弹性蛋白酶原蛋白编码区后，将其克隆至蓝HeronpUC载体。除扩增猪I型胰腺弹性蛋白酶的编码序列后，用PCR将克隆用XhoI和SacII限制位点并入PV-1载体。PCR产物经消化，经凝胶纯化及与经XhoI和SacII消化的PV-1载体连接，由此产生编码胰蛋白酶活化的猪I型胰腺弹性蛋白酶原蛋白的pPROT101-24-V表达载体。
图17：甲醇诱导期间自体活化pPROT101-42-V和胰蛋白酶活化的pPROT101-24-V克隆的通过SDS-PAGE的表达分析。诱导1天后，将摇瓶上清在8～16％梯度凝胶上分析，其后用考马斯染色。泳道1～10含自经pPROT101-42-V转化的10个不同克隆的上清。泳道11～12含自经pPROT101-24-V转化的2个不同克隆的上清。M，分子量标记物。
图18：甲醇诱导期间自体活化的pPROT101-49-V和pPROT101-55L-V克隆的通过SDS-PAGE的表达分析。诱导1天和2天后，将摇瓶上清在8～16％梯度凝胶上分析，其后用考马斯染色。泳道1～2含分别诱导1和2天后自pPROT101-49-V克隆的上清。泳道3～4含分别诱导1和2天后自pPROT101-55L-V克隆的上清。M，分子量标记物。
图19：通过小规模转变试验的pPROT101-49-V和pPROT101-55L-V蛋白质的时程活化(如通过SLAP弹性蛋白酶活性所测定)。误差条表示平均值的±SD(n＝4)。
图20：小规模转变试验前后pPROT101-49-V和pPROT101-55L-V上清的SDS-PAGE分析。电泳前，将上清与柠檬酸、还原剂TCEP和LDS样品缓冲液(Invitrogen,CA)混合。将样品于70℃加热10分钟。泳道1～2：分别转变试验前后pPROT101-49-V上清；泳道3～4：分别转变试验前后pPROT101-55L-V上清。M，分子量标记物。
图21：TrypZean标准曲线。
图22：第5.9部分描述的医疗装置的一种实施方式的局部侧视剖视图。
图23：显示医疗装置的传动装置的运动的类似于图22的视图。
图24：图22中线2-2的平面中的末端剖视图。
图25：图22中线3-3的平面中的末端剖视图。
图26：图22的医疗装置的流道的模式图，从Luer毂贯通流体递送管道至储存器，及再至组织穿透器。
图27：显示其限定构型的传动装置的本发明的医疗装置的第二实施方式的局部侧视剖视图。
图28：类似于图27，但显示其非限定构型的传动装置的剖视图。
图29：图27沿线3’-3’的组件的末端透视图。
图30：图29中沿线4’-4’的组件的末端透视图，其显示组织穿透器。
图31：显示装置近端细节的侧视图，显示到图27和28的右侧。
图32：以限定位置的图22的医疗装置外部的局部视图。
5.发明详述
本发明涉及重组表达和产生成熟的、生物学有活性的弹性蛋白酶蛋白质的方法。本发明提供新的、有效的通过培养含编码原弹性蛋白酶蛋白质和前原弹性蛋白酶蛋白质的核酸宿主细胞(包括优选的宿主细胞巴斯德毕赤酵母)来制备重组弹性蛋白酶的方法。还提供了重组蛋白用于制备治疗和预防生物管道(包括动脉或静脉)疾病的药物组合物的用途。
在某些方面，本发明涉及重组的自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质和相关核酸、宿主细胞、及制备方法。所述自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质经改造而含位于成熟的弹性蛋白酶蛋白质N-端侧第一个残基的弹性蛋白酶识别位点。在特定培养条件下，所述下文第6部分所述，可减少自体活化直到需要活化。也可减少自体活化直到已从细胞培养物中除去原弹性蛋白酶。
本发明提供产生药品级弹性蛋白酶蛋白质的有效的表达和纯化方法。本发明还提供用本发明的弹性蛋白酶蛋白质治疗或预防生物管道疾病的方法。
本文第5部分的描述可应用于第8部分的实施方式。因此，例如，本发明的弹性蛋白酶蛋白质包括但不限于实施方式1～39和68～69的弹性蛋白酶蛋白质，或者由实施方式89～224、261～276和347～373中任一项的方法得到或可得到的弹性蛋白酶蛋白质，同样，本发明的核酸尤其是指第8部分实施方式40～67中任一项的核酸；载体尤其是指第8部分实施方式70～72的载体；细胞尤其是指第8部分实施方式73～87中任一项的细胞；细胞培养物上清尤其是指第8部分实施方式88的细胞培养物上清；组合物(如药物组合物、弹性蛋白酶制剂和单元剂)例如第8部分实施方式277～314、346、386和415～420中例示的那些组合物，或者由第8部分实施方式261～276和374～385中任一项的方法得到或可得到的组合物；治疗方法还包括第8部分实施方式387～414的治疗方法；试剂盒尤其包括第8部分实施方式421～425的试剂盒。
5.1弹性蛋白酶蛋白质
本发明尤其涉及重组表达和产生成熟的、生物学有活性的弹性蛋白酶蛋白质的方法。弹性蛋白酶蛋白质一般表达为前原蛋白，其尤其含信号肽序列、活化肽序列和具有生物学活性的成熟部分序列。合适的成熟弹性蛋白酶蛋白质序列描述于下文第5.1.1部分。合适的活化肽序列描述于下文第5.1.2部分。合适的信号序列描述于下文第5.1.3部分。
因此，在某些方面，本发明的弹性蛋白酶蛋白质是前原弹性蛋白酶蛋白质。在分泌后从前原蛋白除去信号序列一般产生含活化肽和成熟蛋白的无活性的原蛋白。表述“活化序列”与“活化肽”在本文中互换使用。因此，在其他方面，本发明的弹性蛋白酶蛋白质是含可操作连接于成熟的弹性蛋白酶蛋白质的活化肽的原弹性蛋白酶蛋白质。在例示实施方式中，野生型人I型胰腺弹性蛋白酶的活化肽或序列含人I型弹性蛋白酶原蛋白前10个N-端氨基酸(SEQ ID NO：22)。在某些实施方式中，活化肽是SEQ ID NO：80的肽。用于本发明的实施的活化肽或序列还包括但不限于SEQ ID NO：23、72和73。其他可用于本发明的实施的活化序列可由SEQ ID NO：64～69和98～103的N-端残基1～10得到。
从原弹性蛋白酶序列除去活化肽产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质。从原弹性蛋白酶序列除去活化肽/从成熟的弹性蛋白酶序列分离而产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的步骤在本文被称为活化步骤。因此，在其他方面，本发明的弹性蛋白酶蛋白质是成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
包围切割键的含活化肽C-端(即羧基端)和成熟蛋白N-端(即氨基端)的氨基酸残基示于图2，及如下定义。第一，位于活化肽C-端的残基被标为PX、…P5、P4、P3、P2和P1，其中P1是活化肽的C-端残基。位于成熟蛋白N-端的残基被标为P1’、P2’、P3’、…PX’，其中P1’是成熟蛋白的N-端氨基酸残基。被蛋白水解酶切开的切开键(在图2中被称为“切开键”)是介于活化肽的P1残基和成熟蛋白的P1’残基之间的肽键。
跨活化肽C-端的4个氨基酸(残基P4～P1)至成熟蛋白N-端的前4个氨基酸(残基P1’～P4’)的区域在本文中被称为“切割位点”。
跨活化肽C-端的约5个氨基酸(即残基P5～P1)至成熟蛋白N-端的约前3个氨基酸(即残基P1’～P3’)的区域在本文中被称为“切割结构域”。可用于本发明的切割结构域的例子包括但不限于SEQ IDNO：42、43、48、49、52、53、54或55。其他也可用于本发明的切割结构域是由共有切割结构域序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8描述的任意序列，其中Xaa1＝P5、Xaa2＝P4、Xaa3＝P3、Xaa4＝P2、Xaa5＝P1、Xaa6＝P′1、Xaa7＝P′2、且Xaa8＝P′3，其中：
Xaa1是谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或丙氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa2是苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或组氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa3是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、天冬酰胺或缬氨酸，或者任选为它们的类似物，但优选不是甘氨酸或脯氨酸；
Xaa4是脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸或苏氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa5是丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丝氨酸，但不是甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酸或赖氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa6是丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丝氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa7是甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸，或者任选为它们的类似物；且
Xaa8是缬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸，或者任选为它们的类似物。
跨活化肽的残基P3、P2和P1的三氨基酸区域在本文中被称为“弹性蛋白酶识别位点”。可用于本发明的识别位点的例子包括但不限于SEQ ID NO：14～16和18～21。其他本发明考虑的识别位点包括由SEQ ID NO：11、12、13或93的共有识别位点所示的任意识别位点。SEQ ID NO：11共有弹性蛋白酶识别序列1表示为肽序列Xaa1Xaa2Xaa3，其中Xaa1＝P3、Xaa2＝P2、Xaa3＝P1，其中：
Xaa1是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、天冬酰胺或缬氨酸，或者任选为它们的类似物，但优选不是甘氨酸或脯氨酸；
Xaa2是脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸或苏氨酸，或者任选为它们的类似物；
Xaa3是丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丝氨酸，或者任选为它们的类似物，但优选不是甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酸或赖氨酸。
SEQ ID NO：12共有弹性蛋白酶识别序列2表示为序列Xaa1ProXaa2，其中：
Xaa1是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、天冬酰胺或缬氨酸，或者任选为它们的类似物，但优选不是甘氨酸或脯氨酸；
Pro是脯氨酸，或者任选为其类似物；
Xaa2是丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丝氨酸，或者任选为它们的类似物，但优选不是甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酸或赖氨酸。
SEQ ID NO：13共有弹性蛋白酶识别序列3表示为肽序列Xaa1Xaa2Xaa3，其中Xaa1＝P3、Xaa2＝P2、Xaa3＝P1，其中：Xaa1是天冬酰胺或丙氨酸，或者任选为其类似物；其中Xaa2是脯氨酸或丙氨酸，或者任选为其类似物；且其中Xaa3是丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸，或者任选为其类似物。
SEQ ID NO：93共有弹性蛋白酶识别序列4表示为序列Xaa1ProXaa2，其中：
Xaa1是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、天冬酰胺或缬氨酸，或者任选为它们的类似物，但优选不是甘氨酸或脯氨酸；
Pro是脯氨酸，或者任选为其类似物；
Xaa2是丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或丝氨酸，或者任选为它们的类似物，但优选不是甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酸或赖氨酸。
称序列为“切割序列”、“切割结构域”、“活化序列”“弹性蛋白酶识别序列”等仅为称呼而已，不旨在暗示任何序列功能或者所述序列可被识别或加工的机理。
本发明的蛋白质一般由氨基酸构成，且可额外包括一个或多个(例如至2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15个)氨基酸类似物。一般而言，在本文中，氨基酸是指天然L立体异构体。氨基酸类似物指D-立体异构体、经化学修饰的氨基酸或其他非天然氨基酸。例如非天然氨基酸包括但不限于：铃兰氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2’-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、naphthalanine、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、哌可酸和硫脯氨酸。经化学修饰的氨基酸包括经化学可逆或不可逆封闭和/或修饰了一个或多个其侧链基团、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸基的氨基酸。化学修饰包括加入化学部分，产生新键，和除去化学部分。经化学修饰的氨基酸例子包括例如：甲硫氨酸亚砜、磺甲硫氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亚砜和磺S-(羧甲基)-半胱氨酸。在氨基酸侧链基团的修饰包括赖氨酸ε-氨基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基的修饰包括：脱氨基、N-低级烷基、N-二低级烷基和N-酰基修饰。末端羧基的修饰包括酰胺、低级烷基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1～C4烷基。此外，一个或多个侧链或末端集团可用本领域技术人员已知的保护基保护。氨基酸的α-碳可被单甲基化或二甲基化。
本发明的蛋白质可经修饰或衍生，如被磷酸化或糖基化修饰，或者通过缀合于例如脂质或其他蛋白质(例如用于靶向或稳定)等衍生。
本发明常涉及“分离出的”或“经纯化的”弹性蛋白酶蛋白质。分离出的弹性蛋白酶蛋白质是从其细胞环境中移出的弹性蛋白酶蛋白质。经纯化的弹性蛋白酶蛋白质是基本上无细胞物质或其他自细胞或组织源(弹性蛋白酶蛋白质源于此)污染蛋白，或者基本上无化学前体或其他化学合成时的化学物质。表述“基本上无细胞物质”包括蛋白质从其重组产生的细胞的细胞成分中分离出的弹性蛋白酶蛋白质制剂。因此，基本上无细胞物质的弹性蛋白酶蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)异源蛋白(在本文中也被称为“污染蛋白”)弹性蛋白酶蛋白质制剂。当弹性蛋白酶蛋白质由其分泌到培养基中的过程产生时，其还优选基本上无培养基，即培养基占少于约20％、10％或5％弹性蛋白酶蛋白质制剂的体积。
在某些实施方式中，分离出的或经纯化的弹性蛋白酶还无或基本上无细胞DNA。在特定实施方式中，宿主细胞基因组DNA以少于10pg、少于5pg、少于3pg、少于2pg或少于1pg DNA/mg弹性蛋白酶蛋白质的量存在于分离出的或经纯化的弹性蛋白酶蛋白质制剂中，或者喊分离出的或经纯化的弹性蛋白酶蛋白质的组合物中。一个实施方式中，所述宿主细胞DNA是巴斯德毕赤酵母DNA。
有用的弹性蛋白酶蛋白质序列示于表1。在特定实施方式中，本发明提供含下列序列的弹性蛋白酶蛋白质(包括但不限于SEQ IDNO：6～9、64～69、88～91和98～103中任一蛋白)：(i)含弹性蛋白酶识别序列的活化序列，其可操作连接于(ii)具有I型弹性蛋白酶活性的蛋白质的氨基酸序列。已知人I型弹性蛋白酶的数个多态性。本发明的原弹性蛋白酶蛋白质序列考虑多态性的任意组合，包括但不限于表2所示多态性的组合。所述蛋白质还任选含可操作连接于所述活化序列的信号序列。在某些特定实施方式中，所述信号序列在巴斯德毕赤酵母中可操作，如SEQ ID NO：34的氨基酸序列例示的酵母α-因子信号肽。替代性的信号肽含SEQ ID NO：50和96(含信号肽、非弹性蛋白酶原肽和间隔序列)及SEQ ID NO：51和97(含信号肽和非弹性蛋白酶原肽)例示的序列。在其他特定实施方式中，所述信号序列是哺乳动物分泌信号序列，如猪弹性蛋白酶信号序列。所述弹性蛋白酶识别序列优选为I型弹性蛋白酶识别序列，最优选为人I型弹性蛋白酶识别序列。
本发明还包括本发明的弹性蛋白酶蛋白质的变体。变体可含在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处的氨基酸取代。相对于天然成熟的弹性蛋白酶，变体优选包括不超过15个、不超过12个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个保守氨基酸取代；和/或相对于天然成熟的弹性蛋白酶，包括不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个非保守氨基酸取代。
在特定实施方式中，相对于本发明的成熟的弹性蛋白酶、原弹性蛋白酶或前原弹性蛋白酶(如对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：84的成熟的弹性蛋白酶；或者SEQ ID NO：6～9、64～69、88～91和98～103的原弹性蛋白酶蛋白质)，变体具有不超过10个或更优选不超过5个保守氨基酸取代。SEQ ID NO：1和84的氨基酸序列在成熟的弹性蛋白酶序列中含一个或多个对应于潜在的多态性的位置，在位置44(W或R)、59(M或V)、220(V或L)和243(Q或R)处(位置是前原蛋白的位置)。本发明因此包括具有SEQ ID NO：84所示4种多态性的任意组合的成熟的弹性蛋白酶蛋白质。各该组合列于上表3。SEQ ID NO：88～91和98～103的序列还在原肽序列中含潜在的多态性，在位置10(Q或H)处。本发明因此包括含SEQ ID NO：88～91和98～103所示5种多态性的任意组合的前原弹性蛋白酶和原弹性蛋白酶序列。各该组合列于上表2。
“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已由本领域定义。这些家族包括具有碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)的氨基酸。
本发明的变体弹性蛋白酶蛋白质可包括用本文所述的氨基酸类似物及氨基酸的氨基酸取代。
在特定实施方式中，本发明的蛋白质含成熟的人I型弹性蛋白酶的变体，或基本上由成熟的人I型弹性蛋白酶的变体构成，如与列于表1的弹性蛋白酶原蛋白或成熟的弹性蛋白酶蛋白质(如但不限于SEQ ID NO：6～9、64～69、88～91和98～103的弹性蛋白酶原蛋白)具有至少约75％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的变体，且在表达而产生SEQ ID NO：1、4、5、84或87的成熟的弹性蛋白酶蛋白质时保持弹性蛋白酶活性。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，将序列以最佳比较目的(如可将空位引入第一氨基酸序列或核酸序列，以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)进行比对。比较对应氨基酸位置处或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中的相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置同一。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一位置数的函数(％同一性＝(#同一性位置/总#重叠位置)×100)。一个实施方式中，两个序列是相同长度。在其他实施方式中，两个序列长度不同，差异不多于两个序列中较长者长度的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
可用数学算法完成两个序列之间同一性百分比的确定。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性例子是Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268的算法，被在Karlinand Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中改良。所述算法被并入Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序、分值＝100、字长＝12进行，以得到本发明的核酸分子的核苷酸序列同源性。BLAST蛋白质搜索可用XBLAST程序、分值＝50、字长＝3进行，以得到本发明的蛋白质分子的氨基酸序列同源性。为得到比较目的的加空位的比对，可如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述利用Gapped BLAST。另外，可用PSI-BLAST进行检测分子之间远关系的迭代搜索(Id.)。当利用BLAST、GappedBLAST和PSI-BLAST程序时，可使用相应程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于比较序列的数学算法的另一优选的非限制性例子是Myersand Miller,CABIOS(1989)的算法。如并入作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)的算法。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。本领域已知的用于序列分析的其他算法包括Torellis andRobotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中描述的ADVANCE和ADAM，及Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-8中描述的FASTA。FASTA中，ktup是设定灵敏度和搜索速度的控制选项。如果ktup＝2，比较的两个序列中的相近区域通过查看比对的残基对发现；如果ktup＝1，则检查了单个比对的氨基酸。对于蛋白质序列，ktup可被设为2或1，或者对于DNA序列，其可被设为1～6。若ktup未被特殊指定，默认情况下，对于蛋白质其是2，而对于DNA其是6。对于FASTA参数的进一步描述，见http://bioweb.pasteur.fr/docs/man/man/fasta.1.html#sect2，其内容通过引用并入本文。
两个序列之间的同一性可用与上述类似的技术(允许或不允许空位)确定。在计算同一性百分比时，一般技术精确匹配。
本发明的弹性蛋白酶蛋白质可表现出翻译后修饰，包括但不限于：糖基化(如N-连或O-连糖基化)、十四烷基化、十六烷基化、乙酰化和磷酸化(如丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸)。一个实施方式中，相对于内源性表达的弹性蛋白酶蛋白质，本发明的弹性蛋白酶蛋白质表现出降低水平的O-连糖基化和/或N-连糖基化。另一实施方式中，本发明的弹性蛋白酶蛋白质不表现出O-连糖基化或N-连糖基化。
5.1.1成熟的弹性蛋白酶序列
本发明的成熟的弹性蛋白酶序列优选为哺乳动物弹性蛋白酶序列，最优选为人弹性蛋白酶序列。其他实施方式中，成熟的哺乳动物弹性蛋白酶序列来自其他哺乳动物，如小鼠、大鼠、猪、牛或马。
本发明的方法和组合物中，所用成熟的弹性蛋白酶序列优选为I型胰腺弹性蛋白酶的成熟的弹性蛋白酶序列，其优先切割疏水性蛋白质序列，优选在小疏水性残基(如丙氨酸)的羧基侧。I型胰腺弹性蛋白酶的例子包括在皮肤中表达的人弹性蛋白酶I酶(NCBI登录号NP_001962)和在胰腺中表达的猪胰腺弹性蛋白酶I酶(NCBI登录号CAA27670)。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：84是成熟的人I型弹性蛋白酶序列的例子。
另外，可使用可优选在中到大疏水性氨基酸残基的羧基侧切割疏水性蛋白质序列的II型弹性蛋白酶。II型弹性蛋白酶的例子包括均在胰腺中表达的人弹性蛋白酶IIA酶(NCBI登录号NP254275)和猪弹性蛋白酶II酶(NCBI登录号A26823)。
也包括本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的变体。变体包括含与本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的氨基酸序列足够同一或源自本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列，且表现出弹性蛋白酶生物学活性的蛋白质。本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的生物学有活性的部分可为长度例如至少150、160、175、180、185、190、200、210、220、230、231、232、233、234、235、236、237、238或239氨基酸的蛋白质。此外，其他蛋白质的其他区域删除的生物学有活性的部分可通过重组技术制备，且评价一种或多种本发明的天然形式的成熟的弹性蛋白酶的功能活性。
此外，含4种人I型弹性蛋白酶多态性的任意组合的成熟的弹性蛋白酶蛋白质示于SEQ ID NO：84。可能的组合示于上表3。
5.1.2原弹性蛋白酶活化序列
弹性蛋白酶活化序列是从原弹性蛋白酶蛋白质除去则产生生物学有活性的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的任意序列。
活化序列一般含与切割原蛋白而产生成熟的生物学有活性的蛋白质处邻接的蛋白酶识别位点。活化序列可经改造而添加蛋白酶或弹性蛋白酶识别位点，或者其可经改造而用另外的蛋白酶识别位点取代现有的弹性蛋白酶识别位点。用于实施本发明的活化肽或序列包括但不限于SEQ ID NO：23、72和73。其他可用于实施本发明的活化序列可从SEQ ID NO：64～68的N-端残基1～10得到。在优选方面，原弹性蛋白酶活化序列经改造而含I型或II型弹性蛋白酶的识别序列。弹性蛋白酶识别序列最优选被成熟的弹性蛋白酶(弹性蛋白酶识别序列与其可操作连接)识别。因此，在涉及II型弹性蛋白酶的实施方式中，识别序列最优选为II型弹性蛋白酶识别序列。反之，涉及I型弹性蛋白酶的实施方式中，识别序列最优选为I型弹性蛋白酶识别序列。在优选实施方式中，识别序列是人I型弹性蛋白酶识别序列。例示I型识别序列包括SEQ ID NO：14～16和18～21的氨基酸序列。本发明考虑的其他识别位点包括SEQ ID NO：11、12或13的共有识别位点所示的任何识别位点。
5.1.3信号序列
本发明的原弹性蛋白酶蛋白质还可含增加原弹性蛋白酶分泌到其表达出的宿主细胞的培养基中的信号序列。
可使用弹性蛋白酶蛋白质的天然信号序列，尤其是用于在哺乳动物宿主细胞中表达的。其他实施方式中，本发明的弹性蛋白酶蛋白质的天然信号序列可被除去及用自另外的蛋白质的信号序列(如猪I型弹性蛋白酶信号序列、人I型弹性蛋白酶信号序列或酵母α-因子信号序列)取代。在某些特定实施方式中，所述酵母α-因子信号肽可还含：(1)酵母α-因子原肽或(2)酵母α-因子原肽和间隔序列，各分别以SEQ ID NO：50和96或SEQ ID NO：51和97的氨基酸序列所例示。另外，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可用作异源信号序列(Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,JohnWiley&Sons,1992))。真核异源信号序列的其他例子包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla,California)。在其他例子中，有用的原核异源信号序列包括phoA信号序列(Sambrook et al.,supra)和蛋白A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway,New Jersey)。
5.2弹性蛋白酶核酸
本发明的一个方面涉及编码本发明的重组弹性蛋白酶蛋白质的重组核酸分子。如本文所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)和用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可为单链或双链，但优选为双链DNA。
本发明涉及编码本发明的弹性蛋白酶蛋白质的核酸。因此，在某些方面，本发明提供含编码原弹性蛋白酶蛋白质(包括但不限于SEQID NO：6～9、64～69、88～91和98～103中任一蛋白)的核苷酸序列的核酸分子，所述原弹性蛋白酶蛋白质含：(i)含弹性蛋白酶识别序列的活化序列，其可操作连接于(ii)具有I型弹性蛋白酶活性的蛋白质的氨基酸序列。其他实施方式中，本发明还提供含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质含：(i)在巴斯德毕赤酵母中可操作的信号序列，其可操作连接于(ii)含弹性蛋白酶识别序列的活化序列(包括但不限于SEQ ID NO：23、72或73的氨基酸序列)，其又可操作连接于(iii)成熟的人I型弹性蛋白酶的氨基酸序列。
本发明的核酸经纯化。“经纯化”的核酸分子(如cDNA分子)在通过重组技术产生时可基本上无其他细胞物质或培养基；或者当化学合成时基本上无化学前体或其他化学物质。
在核酸分子是cDNA或RNA(如mRNA)分子的例子中，该分子可包括多聚A“尾”，或替代性地可缺少该3’尾。
本发明的核酸分子可用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术扩增。如此扩增的核酸可克隆到合适的载体，并用DNA序列分析表征。此外，对应于本发明的全部或部分核酸分子的寡核苷酸可通过标准合成技术(例如使用自动DNA合成仪)制备。
5.3重组体表达载体和宿主细胞
还提供含本发明的任意核酸的载体，或者经改造而表达本发明的核酸的宿主细胞。在特定实施方式中，载体含调控由本发明的核酸编码的蛋白质的表达的核苷酸序列。例如，编码本发明的蛋白质的核苷酸序列可操作连接于可被甲醇诱导的启动子。
还提供了含本发明的核酸和载体的宿主细胞。在某些实施方式中，载体或核酸被整合到宿主细胞基因组中；在其他实施方式中，载体或核酸在染色体外。优选的宿主细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。
如本文所用，术语“载体”指能够运输连接到其的另外的核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，这指可连接额外的DNA区段的环形双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可连接到病毒基因组中。某些载体能够在导入载体(如具有细菌复制起点和附加刑哺乳动物载体的细菌载体)的宿主细胞中自我复制。其他载体(如非附加刑哺乳动物载体)在导入宿主细胞中后被整合到宿主细胞基因组中，并因此随着宿主基因组复制。此外，某些载体，表达载体能够指导连接到其的编码序列的表达。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体常以质粒(载体)形式。
本发明的重组表达载体含适合于在宿主细胞中表达的形式的编码本发明的成熟的弹性蛋白酶、原弹性蛋白酶或前原弹性蛋白酶的核苷酸序列。这指重组表达载体含基于待用于表达的宿主细胞选择的可操作连接于待表达的核酸序列的一个或多个调控序列。在重组表达载体中，“可操作连接”旨在指目的核苷酸序列以允许表达核苷酸序列的形式连接于调控序列(如在体外转录/翻译系统中或当载体被导入宿主细胞中时在宿主细胞中)。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子及其他表达控制元件(如多聚腺苷酸化信号)。该调控序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185(Academic Press,San Diego,CA,1990)中。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的调控序列和指导核苷酸序列仅在特定宿主细胞中表达的调控序列(如组织特异性调控序列)。本领域技术人员会同意，表达载体的设计可取决于以下因素，如：待转化宿主细胞的选择、期望的弹性蛋白酶蛋白质的表达水平等。可将本发明的表达载体导入宿主细胞，由此产生由本文所述的核酸编码的弹性蛋白酶蛋白质。
本发明的重组表达载体可设计用于本发明的弹性蛋白酶蛋白质在原核细胞(如大肠杆菌)或真核细胞(如昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞)中的表达。合适的宿主细胞在Goeddel,supra中进一步讨论。另外，重组表达载体还颗粒如用T7启动子调控序列和T7聚合酶体外转录和翻译。
蛋白质在原核生物中的表达最常在大肠杆菌(其载体含指导融合子或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子)中进行。融合载体将许多氨基酸添加到其编码蛋白质，通常到重组蛋白的氨基末端。该融合载体一般用于3个目的：(1)为增加重组弹性蛋白酶蛋白质的表达；(2)为增加重组弹性蛋白酶蛋白质的溶解度；及(3)为作为亲和纯化中的配体辅助重组弹性蛋白酶蛋白质的纯化。常常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的连接处导入蛋白水解切割结构域，以使在融合蛋白纯化后，重组蛋白从融合部分分离出。因此，融合部分和蛋白水解切割结构域一起可作为包括蛋白酶识别位点的用于弹性蛋白酶蛋白质的重组表达的活化序列。能够活化该融合蛋白及其识别序列的酶包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc.；Smith and Johnson,1988,Gene67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，它们分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A，以靶向重组蛋白。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amannet al.,1988,Gene69:301-315)和pET-11d(Studier et al.,1990,GeneExpression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,California,185:60-89)。由pTrc载体的靶基因表达取决于宿主RNA聚合酶从杂交trp-lac融合启动子的转录。由pET-11d载体的靶基因表达取决于从T7gn10-lac融合启动子的共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的转录。此病毒聚合酶由收获T7gn1基因的自常住λ原噬菌体的宿主株BL21(DE3)或HMS174(DE3)在lacUV5启动子的转录控制下供应。
最大化重组弹性蛋白酶蛋白质在大肠杆菌中的表达的一种策略是在蛋白水解切割重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达蛋白质(Gottesman,1990,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology185,Academic Press,San Diego,California185:119-129)。另一策略是改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列，从而使各氨基酸的个别密码子是大肠杆菌中优先使用的密码子(Wadaet al.,1992,Nucleic Acids Res.20:2111-2118)。本发明的核酸序列的该改变可用标准DNA合成技术进行。
在其他实施方式中，表达载体是酵母表达载体。在酵母酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari et al.,1987,EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz,1982,Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz et al.,1987,Gene54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)和pPicZ(Invitrogen Corp,San Diego,CA)。对于在酵母中的表达，优选使用可被甲醇诱导的启动子。本文还考虑了改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列，从而使各氨基酸的个别密码子是巴斯德毕赤酵母中优先使用的密码子。更特别地，SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：81的密码子可被巴斯德毕赤酵母中优先使用的密码子取代。
另外，表达载体是杆状病毒表达载体。可用于在培养中的昆虫细胞(如Sf9细胞)的蛋白表达的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith etal.,1983,Mol.Cell Biol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow andSummers,1989,Virology170:31-39)。另一策略是改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列，从而使各氨基酸的个别密码子是昆虫细胞中优先使用的密码子。
另一实施方式中，摔坏哺乳动物表达载体将弹性蛋白酶蛋白质在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed,1987,Nature329(6142):840-2)和pMT2PC(Kaufman et al.,1987,EMBO J.6:187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能常由病毒调控元件提供。例如，常用的启动子源于多瘤腺病毒2、巨细胞病毒和猴肾病毒40。其他适合于原核细胞和真核细胞的表达载体参见Sambrook et al.,supra的第16章和第17章。
另一实施方式中，重组哺乳动物表达载体能够指导优先在特定细胞类型的核酸的表达(如组织特异性调控元件用于表达所述核酸)。本领域已知组织特异性调控元件。合适的组织特异性启动子的非限制性例子包括：白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert et al.,1987,Genes Dev.1:268-277)、淋巴样特异性启动子(Calame and Eaton,1988,Adv.Immunol.43:235-275)、T细胞受体(Winoto and Baltimore,1989,EMBO J.8:729-733)和免疫球蛋白(Banerji et al.,1983,Cell33:729-740；Queen and Baltimore,1983,Cell33:741-748)的特别启动子、神经元特异性启动子(如神经丝启动子；Byrne and Ruddle,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlundet al.,1985,Science230:912-916)、和乳腺特异性启动子(如乳清蛋白启动子；美国专利No.4,873,316和欧洲申请公开No.EP264166)。也包括了发育调控的启动子，例如小鼠hox启动子(Kessel and Gruss,1990,Science249:374-379)和β-胎蛋白启动子(Campes and Tilghman,1989,Genes Dev.3:537-546)。
在本发明的某些方面，本发明的蛋白质的表达可通过增加相应基因的剂量来增加，例如通过使用高拷贝表达载体或基因扩增。基因扩增可通过在二氢叶酸还原酶-(“dhfr-”)缺陷性CHO细胞中共转染目的基因与dhfr基因，并暴露于含递增浓度的甲氨蝶呤的选择培养基来实现。见例如Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular BiologyUnit16.14,(John Wiley&Sons,New York,1996)。增加基因拷贝数的替代性方法是将载体导入宿主细胞前使编码目的弹性蛋白酶蛋白质的表达盒(如启动子带编码序列)在载体中多聚化。用于实现表达盒多聚化的方法和载体在酵母和哺乳动物宿主细胞系统中已知(见例如Monaco,Methods in Biotechnology8:Animal Cell Biotechnology,atpp.39-348(Humana press,1999)；Vassileva et al.,2001,ProteinExpression and Purification21:71-80；Mansur et al.,2005,Biotechnology Letter27(5):339-45)。此外，用于多拷贝基因表达的试剂盒可商购。例如，可从Invitrogen(Carlsbad,California)得到多拷贝比赤酵母表达试剂盒。表达盒的多聚化例示于下文实施例6。
因此，本发明的其他方面涉及导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组的宿主细胞”在本文中可互换使用。已知该术语不仅指特定受试细胞，还指该细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在下一代中发生，该后代细胞实际上可不同于亲本细胞，但仍包括在本文所用术语的范围内。
宿主细胞可为任意原核细胞(如大肠杆菌)或真核细胞(如昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞)。
可通过常规的转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞。如本文所用，术语“转化”和“转染”旨在指多种本领域已知用于将外源核酸导入宿主细胞的技术，包括：磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可见于Sambrook等人(上文)及其他实验室手册。
就哺乳动物细胞的稳定转染而言，已知，取决于所用表达载体和转染技术，仅小部分细胞可在其基因组整合外源DNA。为鉴定和筛选这些整合体，一般讲选择标记物(如用于抗抗生素)的编码序列随目的开放阅读框导入宿主细胞。优选的筛选标记物包括赋予对药物(如G418、潮霉素、zeocin和甲氨蝶呤)的抗性的筛选标记物。用导入的核酸稳定转染的细胞可用药物筛选来鉴定(如，整合了筛选标记物编码序列的细胞会存活，但其他细胞将死亡)。
另一实施方式中，细胞、细胞系或微生物内内源性弹性蛋白酶编码序列的表达特征可通过将异源于弹性蛋白酶编码序列的DNA调控元件插入细胞、稳定的细胞系或克隆的微生物的基因组中来修饰，以便插入的调控元件可操作连接于内源性基因。
可使用技术(如打靶同源重组)将含调控元件的异源序列插入到稳定的细胞系或克隆的微生物中，以便其与内源性弹性蛋白酶基因可操作连接，及活化所述内源性弹性蛋白酶基因的表达，所述打靶同源重组为本领域技术人员所熟知，且被描述于例如Chappel，美国专利No.5,272,071；PCT公开No.WO91/06667，公开于1991年5月16日。所述异源序列还可包括：本发明的信号肽、切割序列和/或活化序列。
5.4成熟的弹性蛋白酶蛋白质的制备方法
可将本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)用于产生的本发明的弹性蛋白酶蛋白质。因此，本发明还提供使用本发明的宿主细胞产生本发明的弹性蛋白酶蛋白质的方法。一个实施方式中，所述方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已导入编码本发明的弹性蛋白酶蛋白质的重组表达载体)，以便产生弹性蛋白酶蛋白质的方法。另一实施方式中，所述方法还包括从培养基或宿主细胞中分离弹性蛋白酶蛋白质。
本发明还提供产生本发明的未成熟的弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在原弹性蛋白酶蛋白质产生的条件下培养经改造而表达本发明的核酸的宿主细胞。在某些实施方式中，还产生前原弹性蛋白酶蛋白质。本发明还提供产生本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在原弹性蛋白酶蛋白质产生的条件下培养经改造而表达本发明的核酸的宿主细胞，及使原弹性蛋白酶蛋白质经受活化条件以便产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
产生本发明的未成熟和成熟的蛋白质(尤其对于宿主细胞巴斯德毕赤酵母)的优选条件包括在低pH下的生长期。特定实施方式中，所述低pH是pH2～6、pH2～5、pH3～6、pH3～5、pH4～6、pH3～4、或者下限和上限选自上述任意值的任何范围。在培养期末期，培养物的pH可上升，优选至pH7～11，最优选至pH8。
当本发明的原弹性蛋白酶蛋白质的表达在可被甲醇诱导的启动子控制下时，产生本发明的未成熟或成熟的弹性蛋白酶蛋白质的条件还可包括甲醇诱导期。
本发明的弹性蛋白酶产生方法还可包括回收由宿主细胞表达的蛋白质的步骤。在某些例子中，回收到的蛋白质是含活化序列的原弹性蛋白酶。其他例子中，回收到的蛋白质是缺少活化序列的成熟的弹性蛋白酶。在某些条件下，兼产生原弹性蛋白酶和成熟的弹性蛋白酶蛋白质。其他例子中，产生出前原弹性蛋白酶。
优选地，尤其当需要防止自体活化的原弹性蛋白酶的自体活化时，用于原弹性蛋白酶表达的培养条件包括在柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠中的生长期。在特定实施方式中，使用5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、75～175mM、100～150mM、75～125mM的浓度，或者下限和上限选自上述任意值的任意范围的浓度。在优选实施方式中，柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠浓度是90～110mM，且最优选为100mM。
此外，尤其当需要防止蛋白质降解时，用于原弹性蛋白酶表达的培养条件包括在适于所述宿主细胞的温度范围下端的生长和诱导期。例如，当宿主细胞是巴斯德毕赤酵母宿主细胞时，优选范围是约22～28℃。在特定实施方式中，所述巴斯德毕赤酵母在约28℃下培养。生长和诱导无需在相同温度下进行；例如，在用巴斯德毕赤酵母作为宿主细胞的一个实施方式中，生长可在28℃下进行，而诱导可在22℃下进行。
本发明的自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的活化可由加入少(催化)量外源性弹性蛋白酶来起始。另外或同时，本发明的自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的活化可由升高含自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的溶液的pH来起始。pH优选为7～11；在特定实施方式中，溶液的pH为7～10、7～9、8～10、8～9，或下限和上限选自上述任意值的任意范围。在优选实施方式中，溶液的pH为7～9，最优选为8。
在特定实施方式中，可使自体活化的原弹性蛋白酶在活化步骤中经受Tris碱。在特定实施方式中，加入Tris碱至5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、75～175mM、100～150mM、75～125mM的浓度，或者下限和上限选自上述任意值的任意范围的浓度。在优选实施方式中，加入Tris碱至浓度90～110mM，最优选为100mM。Tris碱的pH优选为7～11；在特定实施方式中，Tris碱的pH为7～10、7～9、8～10、8～9，或下限和上限选自上述任意值的任意范围。在优选实施方式中，Tris碱的pH为7～9，最优选为8。
在本发明的某些方面，用于弹性蛋白酶自体活化的温度是环境温度(如22℃～26℃范围的温度)。在某些实施方式中，就最佳切割精度和最少N-端变体的形成而言，弹性蛋白酶活化步骤优选用低初始浓度(0.1～0.3mg/ml)的原弹性蛋白酶进行。
本发明的某些实施方式中，由于原弹性蛋白酶可经历自体蛋白水解，无需加入催化量的弹性蛋白酶，以将自体活化的原弹性蛋白酶转变为成熟的弹性蛋白酶。在某些实施方式中，自体蛋白水解速度是浓度无关的。无意受任何理论束缚，认为某些自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的浓度无关的自体蛋白水解经由分子内加工(其中原弹性蛋白酶分子经由分子内反应切割其自身)介导。但在其他实施方式中，自体活化的原弹性蛋白酶的活化是浓度依赖的。无意受任何理论束缚，认为某些自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的浓度依赖的自体蛋白水解经由分子间反应(其中原弹性蛋白酶被另一原弹性蛋白酶和/或被成熟的弹性蛋白酶切割)介导。再一实施方式中，某些自体活化的弹性蛋白酶原蛋白表现出浓度依赖的活化和浓度无关的活化的组合。在那些例子中，当自体活化是浓度依赖的时，如果需要，可以更稀释的形式维持原蛋白，以降低活化。含SEQ ID NO：55的弹性蛋白酶原蛋白切割结构域弹性蛋白酶原蛋白(包括但不限于SEQ ID NO：69的原蛋白)的活化可通过将该原蛋白维持在稀释形式来控制。
还认识到某些成熟的弹性蛋白酶的不希望的N-端序列变体可在产生本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的过程中积累。更具体而言，含SEQ ID NO：42的弹性蛋白酶原肽切割结构域的原弹性蛋白酶蛋白质(包括SEQ ID NO：6的原蛋白)可产生N-端序列变体(其中切割发生在位置P3或P2处残基之任一的C-端侧的肽键)。但该不希望的N-端变体的出现可通过将某些氨基酸安置在活化序列中的某些位置来降低。例如，当脯氨酸存在于P2位置时，具有一个或两个额外的N-端氨基酸的N-端变体的产生就降低或消除。需要胰蛋白酶用于活化的消除降低或消除缺少9个N-端残基的变体的产生。此外，不希望的N-端变体的出现可通过在某些条件下进行活化反应来降低或消除。
更具体而言，在某些实施方式中，活化条件包括“延长的转变(extended conversion)”步骤，此过程中，在转变反应的初始部分期间产生N-端变体，随后被选择性地降解。“延长的转变”期间蛋白种类的相对量可通过HIC-HPLC实时监控。不希望的N-端变体的选择性降解升高了转变反应中全长、成熟的PRT-201的比例，且降低了N-端变体的比例。就含SEQ ID NO：55弹性蛋白酶原蛋白切割结构域的原弹性蛋白酶蛋白质而言，进行延长的转变步骤4～8小时，且优选约6小时。就其他原弹性蛋白酶蛋白质而言，可增加或减少所述延长的转变步骤，取决于全部原弹性蛋白酶已转变后随即的N-端变体相对成熟的(全长)弹性蛋白酶的比例。当转变在复合培养基(如发酵肉汤)中发生时，由于溶液中其他蛋白质和肽对成熟的弹性蛋白酶的活性位点的竞争，可增加延长的转变期。另外，在延长的转变步骤前，可从复合培养基中回收成熟的弹性蛋白酶和N-端变体弹性蛋白酶的混合物，由此减少活性位点竞争和除去N-端变体种类所需的时间。
如上所述，在就原PRT-201-55M3-003-VU的转变反应期间，有导致N-端变体产生的副反应。在原PRT-201-55M3-003-VU的特定情况下，这些N-端变体缺失前两个缬氨酸，且有很少或无弹性蛋白酶活性。就其他突变的原蛋白而言，有其他N-端变体产生，一些具有添加，而其他具有不同的删除。已开发出减少N-端变体至0～2％范围的N-端除去步骤。此除去步骤的开发源于多种实验和观察。如上所述，在优化用原PRT-201-42的转变条件实验的过程中发现，更久的转变反应常导致非常低的N-端变体百分比。随后确定，更久的转变反应允许成熟的PRT-201选择性降解N-端变体。PRT-201在某些条件下的选择性降解N-端变体的能力的发现通过辅助产生含更少N-端变体的更纯化的PRT-201产物而具有了巨大益处。通过建立允许原PRT-201转变为成熟的PRT-201，且允许PRT-201降解N-端变体的条件来进行此N-端变体除去步骤至大规模生产过程。
所述步骤的代表例示于图10，如可通过HIC-HPLC实时监控。在约50分钟时，100％的原PRT-201-55M3完全转变为约86％的成熟的PRT-201和14％的N-端变体。延长所述转变反应，其允许成熟的PRT-201选择性降解N-端变体至变体降为14％～2％。随更久温育，N-端变体可选择性降解至不可检测的水平。当N-端变体水平足够低时，用柠檬酸钠及调反应pH至5.0来抑制PRT-201活性。
一旦得到纯化的成熟的弹性蛋白酶，可将有活性的酶放入溶液中，在其中弹性蛋白酶蛋白质相对无活性，且放入缓冲液中用于进一步柱层析(如阳离子交换层析)纯化步骤。一般而言，可将弹性蛋白酶蛋白质放入浓度约5～25mM，且pH约2～5的柠檬酸钠中。在特定实施方式中，将弹性蛋白酶放入pH5、20mM柠檬酸钠中。然后任选通过下列方法中的一种、多于一种或全部来分析洗脱级分：(1)在A280处的分光光度法来测定浓度；(2)SDS-PAGE来评价纯度；(3)活性测定(如SLAP测定)来评价弹性蛋白酶比活性；及(4)HIC-HPLC来检测成熟的弹性蛋白酶和N-端变体，并且合并具有适当特征(如可接受的比活性、可检测糖型的可接受的低水平(优选无)及可检测N-端变体的可接受的低水平(优选无))的级分。
一旦得到纯化的成熟的弹性蛋白酶，则可将有活性的酶放入合适的冻干用溶液中。一般而言，可将弹性蛋白酶蛋白质在冻干前放入1×磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)(137mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM磷酸钾，pH7.4)的缓冲液中。在某些实施方式中，可将弹性蛋白酶蛋白质在冻干前放入0.1×PBS(13.7mM氯化钠、1.0mM磷酸钠、0.27mM磷酸钾，pH7.4)的缓冲液中。
原弹性蛋白酶序列的表达在一些情况下产生原弹性蛋白酶和成熟的弹性蛋白酶蛋白质的混合物。因此，本发明提供兼含原弹性蛋白酶蛋白质和成熟的弹性蛋白酶蛋白质的组合物。
5.5药物组合物
可将本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质掺入适于施用的药物组合物中。所述药物组合物一般含弹性蛋白酶蛋白质和药学惰性成分，例如药学可接受的载体。本文所用表述“药学可接受载体”旨在包括任意和所有与药物施用匹配的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。还考虑为药物惰性成分的为常规的赋形剂、媒质、填充剂、结合剂、崩解剂、溶剂、增溶剂和着色剂。所述介质和知己用于药学活性物质的用途为本领域技术人员所知。除不与成熟的弹性蛋白酶蛋白质匹配的任何介质或制剂外，考虑它们在组合物中的用途。也可将补充性活性化合物掺入所述组合物。
因此，本发明的某些方面涉及药物组合物。在特定实施方式中，本发明提供含下列物质的组合物：(i)治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶，和(ii)药学可接受载体。可用于所述组合物的成熟的人I型弹性蛋白酶包括但不限于SEQ ID NO：1、4、5、84、87的蛋白质。所述成熟的人I型弹性蛋白酶可含上表3所示的多态性的任意组合。
其他实施方式中，本发明提供药物组合物，其含：(i)治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶，(ii)药学可接受载体，所述药物组合物中无胰蛋白酶或胰蛋白酶的片段。其他实施方式中，药物组合物基本上无胰蛋白酶或胰蛋白酶的片段。如本文所用，短语“无胰蛋白酶”指不以生产过程的任何部分中在组合物中使用胰蛋白酶。如本文所用，短语“基本上无胰蛋白酶”指胰蛋白酶以不多于约0.0025％(以重量/重量计)或更优选少于约0.001％的最终百分比(如重量胰蛋白酶/总组合物重量)存在。如本文所用，短语“无”胰蛋白酶指组合物中检测(如通过酶测定或ELISA的方法)不到变体。
在某些方面，本发明的组合物具有小于3ng/ml胰蛋白酶当量的胰蛋白酶活性(如通过BENZ测定测量)、优选小于2.5ng/ml胰蛋白酶当量的胰蛋白酶活性(如通过BENZ测定测量)、且甚至更优选小于2ng/ml胰蛋白酶当量的胰蛋白酶活性(如通过BENZ测定测量)。在特定实施方式中，本发明提供含治疗有效量的弹性蛋白酶蛋白质的组合物，其中所述胰蛋白酶活性小于1.6ng/ml胰蛋白酶当量(如通过BENZ测定测量)。具有小于1.6ng/ml胰蛋白酶当量的胰蛋白酶活性(如通过BENZ测定测量)的弹性蛋白酶组合物的例子提供于下文实施例8。在某些实施方式中，可在液体人I型弹性蛋白酶组合物或含1mg/ml人I型弹性蛋白酶蛋白质的制剂中测定ng/ml胰蛋白酶活性。因此，胰蛋白酶活性可以mg弹性蛋白酶蛋白质来描述，例如小于3ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶蛋白质、小于1.56ng胰蛋白酶活性/mg弹性蛋白酶蛋白质等。
本发明还提供无或基本上无成熟的弹性蛋白酶的不希望的N-端变体的药物组合物。不希望的N-端变体包括但不限于通过在P5、P4、P3、P2、P’1、P’2、P’3、P’4、P’6和/或P’9位置的任意残基C-端的肽键出切割而产生的变体。某些不希望的N-端变体由胰蛋白酶活性产生；其他由不含优化的活化序列的原弹性蛋白酶序列的自体活化产生。
在某些实施方式中，药物组合物中无或基本上无成熟的弹性蛋白酶的一种、多于一种或全部N-端变体，其包括但不限于SEQ ID NO：2、3、37、38、70、71、85、86、94、95、104、105、106、107、108。在某些实施方式中，本发明提供药物组合物，其含：(i)治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶、(ii)药学可接受载体，所述药物组合物无或基本上无具有SEQ ID NO：2、3、37、38、70、71、85、86、94、95、104、105、106、107或108的任意蛋白。其他实施方式中，药物组合物基本上无成熟的弹性蛋白酶的N-端变体，其包括但不限于SEQID NO：2、3、37、38、70、71、85、86、94、95、104、105、106、107或108。如本文所用，短语“无”特定变体指组合物中变体检测不到(例如通过阳离子交换HPLC测定、疏水相互作用HPLC测定或质谱与液相色谱的组合的方法。如本文所用，短语“基本上无”指组合物中N-端变体以至少少于约0.5％的终百分比(即重量N-端变体/总组合物重量)存在。某些优选实施方式中，基本上无N-端变体的组合物是N-端变体浓度以重量/重量计少于约0.1％或少于约0.01％，或更优选甚至少于约0.001％的组合物。在某些方面，N-端变体的存在通过阳离子交换HPLC测定、疏水相互作用HPLC测定或质谱与液相色谱的组合的方法检测。
某些特定实施方式中，无SEQ ID NO：70、71、104和105的N-端变体的药物组合物通过原弹性蛋白酶的活化来产生，所述原弹性蛋白酶在P1位置不含精氨酸，和/或在P2位置不含丙氨酸。
其他实施方式中，本发明提供药物组合物，其含：(i)治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶、(ii)药学可接受载体，所述药物组合物中基本上无细菌蛋白质和/或基本上无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质。如本文所用，短语“基本上无哺乳动物蛋白质”或“基本上无细菌蛋白质”指组合物中所述蛋白质以至少少于约0.5％的终百分比(即重量哺乳动物蛋白质(非弹性蛋白质，且任选为载体蛋白(如白蛋白))或细菌蛋白质/总组合物重量)存在。某些优选实施方式中，基本上无所述蛋白质的组合物是不希望的蛋白质浓度以重量/重量计少于约0.1％或少于约0.01％，或更优选甚至少于约0.001％的组合物。
在某些方面，“无哺乳动物蛋白质”(非弹性蛋白酶)的药物组合物含由不是哺乳动物细胞的重组细胞系产生的弹性蛋白酶，且在产生过程的任意部分无具有哺乳动物序列或基本上哺乳动物序列的蛋白质存在。在某些方面，“无细菌蛋白质”的药物组合物含由不是细菌细胞的重组细胞产生的弹性蛋白酶，且在产生过程的任意部分无具有细菌序列或基本上细菌序列的蛋白质存在。
本发明的成熟的人I型弹性蛋白酶(包括变体)最优选纯化用于药物组合物。在特定实施方式中，所述弹性蛋白酶至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％纯。其他特定实施方式中，所述弹性蛋白酶至98％、98.5％、99％、99.2％、99.5％或99.8％纯。
就配入药物组合物而言，本发明的成熟的人I型弹性蛋白酶优选具有大于1、大于5、大于10、大于20、大于25或大于30U/mg蛋白质的比活性，如通过测量小肽底物N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺(SLAP)的水解速率(其通过加入弹性蛋白酶而被催化)来测定。1个活性单位被定义为在30℃每分钟催化1μmol底物水解的弹性蛋白酶量，而比活性被定义为每mg弹性蛋白酶蛋白质的活性(U/mg)。成熟的人I型弹性蛋白酶优选具有在下限为1、2、3、4、5、7、10、15或20U/mg蛋白质而上限各自为5、10、15、20、25、30、35、40或50U/mg蛋白质的范围内的比活性。例示实施方式中，比活性在1～40U/mg蛋白质、1～5U/mg蛋白质、2～10U/mg蛋白质、4～15U/mg蛋白质、5～30U/mg蛋白质、10～20U/mg蛋白质、20～40U/mg蛋白质的范围内、或上限和下限选自上述任何值的任何范围内。
本发明的药物组合物优选的稳定的。在特定实施方式中，药物组合物(如通过上述冻干制备的药物组合物)在4℃保存1周后，更优选1个月后，再优选3个月后，最优选6个月后，保持至少50％、更优选至少60％和最优选至少70％其比活性。在特定实施方式中，药物组合物在4℃保存1周后，更优选1个月后，再优选3个月后，最优选6个月后，保持至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％其比活性。
本发明的药物组合物配制成与预期的施用途径匹配。施用弹性蛋白酶以治疗或预防生物管道疾病的方法描述于WO2001/21574、WO2004/073504和WO2006/036804。最优选的施用途径是肠胃外施用，如直接施用于血管壁，包括局部施用于手术暴露的血管的外膜外表面，及用药物递送导管局部施用于血管壁。用于肠胃外施用的溶液或悬液可包括下列成分：无菌稀释液(如注射用水、盐溶液、磷酸盐缓冲溶液)、糖(如蔗糖或右旋糖酐)、固定油聚乙二醇、甘油、丙二醇、聚山梨酯-80(也称为吐温-80)、或其他合成溶剂；抗菌剂(如对羟基苯甲酸甲酯)、抗氧化剂(如抗坏血酸或亚磷酸氢钠)、螯合剂(乙烯二胺四乙酸)、缓冲剂(如磷酸盐)、及调张度用剂(如氯化钠或右旋糖)。可用酸和碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。肠胃外制剂也可装入玻璃制或塑料制的安瓿、一次性注射器或者一个或多个剂量小瓶中。肠胃外制剂也可装入药物递送导管中。所有情况中，所述组合物必需是无菌的。
特定实施方式中，本发明的药物组合物是含一种或多种下列赋形剂的液体制剂：右旋糖(如2～10％w/v)、乳糖(如2～10％w/v)、甘露醇(如2～10％w/v)、蔗糖(如2～10％w/v)、海藻糖(如2～10％w/v)、抗坏血酸(如2～10mM)、氯化钙(如4～20mM)、右旋糖酐70(如2～10％w/v)、泊洛沙姆188(如0.2～1％w/v)、聚山梨酯-80(如0.001～5％w/v，更优选0.1～5％)、甘油(如0.2～5％w/v)、精氨酸(如2～10％w/v)、甘油酸(如2～10％w/v)、右旋糖酐-44(如2～10％w/v)和右旋糖酐-18(如2～10％w/v)。某些实施方式中，右旋糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐-70、甘油、精氨酸、甘氨酸、右旋糖酐-44或右旋糖酐-18的单独或以聚集体的浓度在下限为2.5、4、5或7％w/v，且上限独立地为4、5、6、8或10％w/v的范围内。
可通过将水加入到含成熟的弹性蛋白酶蛋白质的干制剂、一种或多种缓冲剂和/或一种或多种赋形剂来制备液体制剂。可通过冻干含成熟的弹性蛋白酶蛋白质、一种或多种缓冲剂和/或一种或多种赋形剂的溶液来制备干制剂。
可例如通过用无菌水或缓冲溶液复原冻干的本发明的弹性蛋白酶蛋白质来制备液体制剂。缓冲溶液的例子包括盐的无菌溶液或磷酸盐缓冲液。在特定实施方式中，在将含成熟的弹性蛋白酶蛋白质的干制剂复原至期望蛋白质浓度后，溶液含约137mM氯化钠、2.7mM磷酸钾、10mM磷酸钠(被认为是1×磷酸盐缓冲液浓度)，且溶液的pH约为7.4。在某些方面，含成熟的弹性蛋白酶蛋白质的干制剂还含仅需水来复原的量的钠离子、氯离子和磷酸根离子。
还可例如通过用含一种或多种赋形剂的缓冲溶液复原冻干的弹性蛋白酶蛋白质来制备液体制剂。赋形剂的例子包括聚山梨酯-80和右旋糖酐。某些实施方式中，将含成熟的弹性蛋白酶蛋白质的干制剂复原至期望蛋白质浓度后，得到的溶液含约137mM氯化钠、2.7mM磷酸钾、10mM磷酸钠、0.01％聚山梨酯-80，且溶液的pH约为7.4。可在冻干前或冻干后(但复原前)，将一种或多种赋形剂与成熟的弹性蛋白酶蛋白质混合。因此，在某些方面，含成熟的弹性蛋白酶蛋白质的干制剂还含赋形剂(如聚山梨酯-80和右旋糖酐)。
在某些方面，本发明提供液体制剂，其在137mM氯化钠、2.7mM磷酸钾、10mM磷酸钠的溶液中含0.001～50mg/ml成熟的弹性蛋白酶蛋白质，且含5～10％、更优选6～9％选自下列的赋形剂：右旋糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐-70、甘油、精氨酸、甘氨酸、右旋糖酐-44或右旋糖酐-18。
在特定实施方式中，本发明提供液体制剂，其在137mM氯化钠、2.7mM磷酸钾、10mM磷酸钠的溶液中含0.001～50mg/ml成熟的弹性蛋白酶蛋白质，所述溶液的pH为7.4。
另一特定实施方式中，本发明提供液体制剂，其在137mM氯化钠、2.7mM磷酸钾、10mM磷酸钠的溶液中含0.001～50mg/ml成熟的弹性蛋白酶蛋白质，且含0.01％聚山梨酯-80，所述溶液的pH为7.4。
另一特定实施方式中，本发明提供液体制剂，其在137mM氯化钠、2.7mM磷酸钾、10mM磷酸钠的溶液中含0.001～50mg/ml成熟的弹性蛋白酶蛋白质，且含0.01％聚山梨酯-80和8％右旋糖酐-18，所述溶液的pH为7.4。
另一特定实施方式中，本发明提供液体制剂，其在137mM氯化钠、2.7mM磷酸钾、10mM磷酸钠的溶液中含0.001～50mg/ml成熟的弹性蛋白酶蛋白质，且含8％右旋糖酐-18，所述溶液的pH为7.4。
本发明的液体制剂优选含终浓度在如下范围内的成熟的弹性蛋白酶蛋白质，所述范围的下限为：0.1、0.5、1、2.5、5、10、15或20mg/ml，而上限独立地为0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1000或1500mg/ml。
在某些方面，本发明的提供液体制剂，其在0.5×PBS～1.5×PBS(更优选1×PBS)的溶液中含0.0001～500mg/ml(更优选1～100mg/ml、再更优选0.5～20mg/ml)成熟的弹性蛋白酶蛋白质，所述溶液含5～10％(更优选6～9％)选自下列的赋形剂：右旋糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐-70、甘油、精氨酸、甘氨酸、右旋糖酐-44或右旋糖酐-18，且具有6.5～8.5的pH。在特定实施方式中，所述液体制剂在1×PBS中含0.5mg/ml成熟的弹性蛋白酶蛋白质和8％右旋糖酐-18，pH为7.4。在特定实施方式中，所述液体制剂在1×PBS中含5mg/ml成熟的弹性蛋白酶蛋白质和8％右旋糖酐-18，pH为7.4。
本发明的液体制剂优选具有在以下范围内的渗透压，所述范围的下限为100、125、150、175、200、250或275mOsm/kg，而上限独立地为500、450、400、350、325、300、275或250mOsm/kg。特定实施方式中，本发明的液体制剂的渗透压优选具有约125～500mOsm/kg，更优选约275～325mOsm/kg的渗透压，例如通过冰点降低法测量。
特别有利制备易于施用且剂量均匀的剂量单元形式和的肠胃外组合物(如可制备入本发明的液体制剂的组合物)。本文所述的单元剂形式是指适合作为用于待治疗受试者的单元剂的物理分泌单元；各单元含计算为产生期望治疗效果的预定量的成熟的弹性蛋白酶蛋白质及所需药学载体。
如本文定义，弹性蛋白酶蛋白质的治疗有效量(即有效剂量)为约0.0033mg～200mg。具有更小直径和更薄壁的血管(如桡头动静脉瘘中的血管)优选更小剂量(如0.0033mg～2.0mg)。具有更大直径和更厚壁的血管(如股动脉)优选更大剂量(如2.05～100mg)。
在某些实施方式中，药物组合物可包括于容器、容器、包装、分注器或导管内。又一实施方式中，药物组合物可与施用说明一起包括于容器、包装、分注器或导管内。施用说明可以打印形式包括于容器、包装、分注器或导管内或上。另外，施用说明可以所引另一打印的或可在互联网看到的提供说明的文件形式包括于容器、包装、分注器或导管内或上。
某些实施方式中，药物组合物可包括于容器、包装或分注器内。又一实施方式中，药物组合物可与施用说明一起包括于容器、包装或分注器内。施用说明可以打印形式包括于容器、包装或分注器内或上。另外，施用说明可以所引另一打印的或可在互联网看到的提供说明的文件形式包括于容器、包装或分注器内或上。
本发明包括制备药物组合物的方法。一旦根据本发明产生了成熟的弹性蛋白酶，可将其冻干和保存至将其复原入适于施用的药物制剂。在例示实施方式中，本发明提供分离冻干的成熟的人I型弹性蛋白酶的方法，包括：
(a)在开放阅读框表达出的条件下培养经改造而表达编码前原弹性蛋白酶开放阅读框的核酸分子的宿主细胞(如巴斯德毕赤酵母宿主细胞)，其中，所述开放阅读框含以5’→3’方向编码下列序列的核苷酸序列：
(i)在巴斯德毕赤酵母中可操作的信号肽；
(ii)含弹性蛋白酶识别序列的活化序列；和
(iii)成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的序列，
由此产生原弹性蛋白酶蛋白质；
(b)使所述原弹性蛋白酶蛋白质经受自体活化条件，由此产生成熟的I型弹性蛋白酶，其中所述自体活化条件包括：
(i)改变含原弹性蛋白酶蛋白质的溶液pH例如至pH6.5～11，优选为8～9；
(ii)纯化原弹性蛋白酶蛋白质(例如通过离子交换层析)，并使所述溶液经受延长的转变，以除去N-端变体，由此产生成熟的人I型弹性蛋白酶；
(c)任选地，纯化成熟的人I型弹性蛋白酶，如离子交换层析步骤，用于精制层析；及
(d)冻干成熟的I型弹性蛋白酶，由此分离冻干的成熟的人I型弹性蛋白酶。所述成熟的I型弹性蛋白酶优选为人I型弹性蛋白酶。在某些方面，所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶优选高于95％纯；在特定实施方式中，所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶优选高于98％纯或高于99％纯。
本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质可配制入药物组合物。因此在例示实施方式中，本发明提供产生含成熟的人I型弹性蛋白酶的药物组合物的方法，所述方法包括：(i)根据上述(如第5.4部分中的)方法分离冻干的成熟的人I型弹性蛋白酶；及(ii)在药学可接受载体中复原所述冻干的成熟的人I型弹性蛋白酶。
5.6有效剂量
本发明一般提供肠胃外(优选局部)单独或与其他制剂组合施用用于治疗或预防生物管道疾病的重组的弹性蛋白酶蛋白质的益处。
某些实施方式中，除肠胃外施用外，也可使用用于治疗或预防生物管道疾病的制剂的经口施用。
可通过标准药学方法测定细胞培养物中或实验动物中用于本发明的方法的实施的弹性蛋白酶蛋白质的毒性和治疗有效性，例如通过测定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)。毒性效果和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，且可将其表示为比例LD50/ED50。该信息可用于更精确确定在人中的有用剂量。
5.7施用方法
本发明涉及含新弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物及其用于预防或治疗生物管道疾病的方法。所述药物组合物可以上述第5.5部分所述的常规方法配制。
可将本发明的弹性蛋白酶组合物施用于生物管道的期望区段，通过本领域技术人员已知可接受用于将溶液递送到动脉或静脉壁的设备(如注射器、药物递送导管、药物递送针、植入的药物递送聚合物(片或微球制剂)、可植入的导管或聚合物包被的血管支架(优选为自展式支架))处理。
某些实施方式中，施用于期望区段可通过直接可视化、超声波、CT、荧光导向、MRI或内窥镜导向导向。
在本发明的某些方面，弹性蛋白酶至生物管道的施用包括将弹性蛋白酶液体制剂直接应用于手术暴露的动脉或静脉的外膜外表面。在本发明的特定方面，施用用注射器进行。
在本发明的某些方面，弹性蛋白酶至生物管道的施用包括将递送设备放置于待治疗生物管道区段附近。在一些实施方式中，通过递送设备递送弹性蛋白酶蛋白质期间，可将递送设备的一部分插入到生物管道壁。一些实施方式中，可对生物管道腔加压，同时将弹性蛋白酶蛋白质递送到加压的生物管道区段。在一些实施方式中，通过机械作用给生物管道腔加压。在一些实施方式中，用气囊导管给生物管道腔加压。在一些实施方式中，通过自展式膜(其为导管或装置的一部分)给生物管道内壁加压。在一些实施方式中，用同一装置施用弹性蛋白酶蛋白质及进行加压。在一些实施方式中，手术暴露生物管道，并将弹性蛋白酶蛋白质体内递送到生物管道腔内，或应用到生物管道外表面。在涉及腔内递送的实施方式中，可用夹子止住流过血管的血流，或使弹性蛋白酶与血管壁接触更长时间，及防止弹性蛋白酶被血清抑制。在一些实施方式中，手术移出生物管道，并将弹性蛋白酶体外递送到导管的腔内表面和/或外表面。然后在某些实施方式中，可将经处理的导管返回至身体。
在本发明的其他方面，弹性蛋白酶至生物管道的施用涉及聚合物制剂的使用，所述聚合物制剂作为支架放置于待治疗血管内，作为夹子或带应用于生物管道外表面，或作为卷放置在待治疗血管上或周围，或其他围绕或接近待治疗血管的装置。
本发明的又一方面，以扩张组织区内的动脉和/或静脉(包括副动脉)的目的将弹性蛋白酶经皮注射到所述组织区。在其他方面，以扩张血管特定区段的目的将弹性蛋白酶经皮直接注射到动脉或静脉壁中，或直接注射到周围组织中。在旨在治疗心脏血管的实施方式中，可将弹性蛋白酶蛋白质经皮递送到心包腔或直接应用于手术暴露的冠状血管。
可用于将本发明的弹性蛋白酶蛋白质施用于血管的医疗装置描述于下文第5.9部分。
5.8试剂盒
本发明提供实施本发明的方法的试剂盒。本发明的“治疗性”试剂盒含一个或多个容器、本文所述用于治疗或预防生物管道疾病的一种或多种制剂，任选与辅助所述制剂递送的任何制剂一起。作为本发明的替代试剂盒，“生产性”试剂盒含一个或多个容器、本文所述用于制备重组弹性蛋白酶蛋白质的一种或多种制剂。
本发明的治疗性制剂任选含有用于实施本发明的方法的其他成分。例如，治疗性制剂可含有用于配制本发明的制剂的药学载体。治疗性试剂盒还可含用于实施本发明的治疗性方法的装置或装置的部件，例如注射器或针。还涉及治疗性试剂盒中包括装置(如壁内或血管周注射导管，或者腔内注射导管)。在某些实施方式中，本发明的制剂可以单元剂形式提供。另外且替代性地，本发明的试剂盒可提供描述一种或多种本发明的方法的实施的说明材料，或政府部门规定药物或生物产品的制造、使用或销售的规定形式的注意事项，所述注意事项反应所述部分对用于人施用的制造、使用或销售的批准。说明材料可以打印的形式包括于一个或多个容器内或上。另外，说明材料以所引另一打印的或可在互联网看到的提供所述说明材料的文件形式包括于一个或多个容器内或上。
在特定实施方式中，本发明的试剂盒含如第5.9部分所述的医疗装置。
本发明的生产性试剂盒任选含有用于进行本发明的方法的其他成分。
5.9用于施用弹性蛋白酶蛋白质的医疗装置
本文提供可用于将本发明的弹性蛋白酶蛋白质施用于生物管道(如动脉或静脉)的医疗装置。所述装置在下文中描述，及描述于2008年1月31日提交的暂时申请No.61/025,084，2008年2月1日提交的暂时申请No.61/025,463，和2008年6月25日提交的暂时申请No.61/075,710，各通过引用整体并入本文。本发明的弹性蛋白酶蛋白质还可通过常规导管施用于生物管道。
一个实施方式中，用于施用弹性蛋白酶蛋白质的医疗装置具有中央纵轴，且包括一个或多个执行器，其中所述一个或多个执行器可以约束构型存在，其中所述一个或多个执行器的长度取向为基本上与所述医疗装置的纵轴平行，及以不约束的构型存在，其中所述一个或多个执行器长度的至少一部分取向为基本上与所述装置中央纵轴不平行。在所述装置位于临近生物管道壁的靶位点后，一个或多个执行器(且如果希望，全部执行器)可从约束构型中解放出，并允许采用不约束构型，由此使与生物管道壁相接触。一个或多个执行器可为任何形状，且在优选实施方式中，一个或多个执行器从约束构型至不约束构型的移动发生在由装置操作器的约束力释放之后，但无需通过操作器将任何变形力输入到装置或靶组织。
在图22中所示的第一特定实施方式中，装置是流体递送导管10，其包括：形成为一对长形花键12、14的一个或多个执行器，可在约束构型(其取向为基本上与导管组件的中央纵轴15平行)和不约束构型(其中花键对的至少一部分取向为基本上与所述中央纵轴不平行)之间移动中间区(见图23的中花键长度的左L和右R部分)。一个或多个花键12、14可由各具有相对的近端和远端的长形带或线构成。优选实施方式中，所述花键具有平的、相对的内表面24、26和平的相背的外表面28、30。本实施方式中，如图22和23所示，花键12、14可在约束位置和不约束位置之间转移。一个实施方式中，如图22所示，花键对在其约束构型中背对背放置。
导管10还包括：安置于一个或多个花键12、14的一个或多个表面的一个或多个组织渗透器16、18，具有长形长度的导管部件20，和可在导管于生物管道中移动期间罩住组织穿透器的外部导管部件22。
组织穿透器16、18可由任意合适的材料构成。所述材料的优选例包括但不限于：镍、铝、钢及它们的合金。特定实施方式中，组织穿透器由镍钛合金构成。
中央导管部件20和外部导管部件22可由一般用于构成导管的材料构成。所述材料的例子包括但不限于：硅酮、聚氨酯、尼龙、涤纶和PEBAXTM。
执行器优选由柔韧的、弹性材料构成。优选实施方式中，柔韧的、弹性材料能在应用约束力后(例如，当执行器在约束构型时)被约束，且当去除约束力时(例如当执行器在不约束构型时)采取七原来的不约束形状。可使用任意所述柔韧的、弹性材料，包括但不限于：手术用钢、铝、聚丙烯、烯材料、聚氨酯及其他合成橡胶或塑料材料。一个或多个执行器最优选由形状记忆材料构成。所述形状记忆材料的例子包括但不限于：铜-锌-铝-镍合金、铜-铝-镍合金和镍-钛(NiTi)合金。优选实施方式中，形状记忆材料是镍钛合金。优选实施方式中，当花键对采取不约束构型时，材料(各花键由此形成)的形状记忆特性导致花键，无需应用任何外部约束力而如图23所示在单个平面内以辐射状彼此弯离。
如图24所示，一个或多个花键(且优选花键中的每个)具有沿花键长度延伸的或在花键内的柔韧的流体递送管道32、34。当花键12、14从它们的直形约束构型移动到它们的弯曲的不约束构型时，流体递送管道32、34也从直形构型移动到弯曲构型。一个实施方式中，流体递送管道32、34是沿花键对12、14安置的分开的管状管道。另一实施方式中，流体递送管道是形成于花键材料中，或在花键材料内的管道。
一个或多个花键(且优选为花键12、14的每个)还形成有沿花键长度延伸的啮合轨道36、38(图24)。啮合轨道36、38由与花键12、14相同的材料或用花键12、14弯曲的材料形成。
一个或多个组织穿透器16、18安置于花键对12、14的外表面28、30(图24)。组织穿透器16、18与沿花键12、14长度延伸的流体递送管道32、34连接且连通。组织穿透器16、18从花键12、14的外表面28、30基本上垂直伸出。组织穿透器16、18具有与花键的流体递送管道32、34连通的空内孔。组织穿透器的远端具有与组织穿透器内孔连通的流体递送口。
装置允许将流体递送到或递送经一个或多个生物管道壁(例如血管壁)的不同层。血管壁包括多个结构和层，包括：内皮层和基底膜层(总称为内膜层)、内弹性膜、中间层及外膜层。这些层排列如下，内皮层暴露于血管腔，且基底膜、内弹性膜、中间层和外膜层依次叠在内皮层上，如美国专利申请No.2006/0189941A1所述。通过本发明的医疗装置，组织穿透器16、18可穿透的深度由各组织穿透器16、18的长度确定。例如，如果靶层是外膜层，使用具有装置发动后足以穿透外膜层深度的确定长度的组织穿透器16、18。同样，如果靶层是中间层使用具有装置发动后足以穿透中间层深度的确定长度的组织穿透器16、18。
特定实施方式中，组织穿透器16、18的长度为，对于血管应用而言为约0.3mm～约5mm；对于涉及其他生物空间或管道的应用(例如结肠应用)而言为至约20mm或甚至30mm。组织穿透器16、18优选具有约0.2mm(33口径)～约3.4mm(10口径)，更优选0.2mm～1.3mm(约33～21口径)的直径。组织穿透器的远端可具有标准斜面，短斜面或标准短斜面。替代实施方式中，与任一花键连接的组织穿透器不是相同长度，但可配置为它们的远端对齐，从而当医疗装置在不约束位置时(例如使用期间)距生物管道壁相同距离。
中央导管部件20具有相对的近端和远端的长形长度，在图22中分别显示为左和右。一个实施方式中，中央导管部件20具有沿其长形长度延伸的圆筒形外表面。花键12、14的近端与中央导管部件20的远端连接(如焊接或胶接)，而花键12、14的的远端与导管导端40连接(如焊接或胶接)。端40具有设计为易于在生物管道内移动的平滑的外表面。导丝孔48贯通中央导管20和端40的长度。导丝孔的尺寸设为以滑动啮合方式通过孔接受导丝。
一对流体递送腔44、46贯通中央导管部件20的内部经导管部件的整个长度(图25)。在中央导管部件20的远端，一对流体递送腔44、46与沿所述花键12、14的长度延伸至组织穿透器16、18的一对流体递送管道32、34连通。导丝孔48也从中央导管部件的近端贯通中央导管部件20的内部至远端(图25)。中央导管部件20的近端提供有Luer毂50、52(图22)。一个实施方式中，各Luer毂50、52与贯通中央导管长度的流体递送腔44、46连通。各Luer毂50、52设计为与流体递送源连接，以通过各Luer毂50、52，然后通过贯通中央导管部件20的各流体递送腔44、46，然后通过沿花键对12、14的长度延伸的各流体递送管道32、34，及然后通过安置于花键对中的每个的组织穿透器16、18连通流体。另一实施方式中，各Luer毂50、52与贯通中央导管部件长度的两个流体递送腔44、46独立连通。此构型中，可通过第一Luer毂将第一流体递送至两个组织穿透器16、18；且可通过第二Luer毂将第二流体递送至两个组织穿透器16、18。如图32所示，可通过从各Luer毂延伸至远端公用存储槽61的独立管道实现流体从各Luer毂至两个组织穿透器的递送。此存储槽与两个组织穿透器16、18连通。另外，另一实施方式中，本发明的医疗装置仅包括与贯通中央导管的一个流体递送腔连接的一个Luer毂，所述一个Luer毂然后与远端公用存储槽连接，允许单股流递送至两个组织穿透器16、18。
外部导管部件22具有围绕花键对12、14和大部分中央导管20的管状构型(图22)。导管部件22具有在导管部件的相对的近端和远端(在图22中分别显示为左和右)之间延伸的长形长度。导管部件远端的尺寸设为以紧固啮合方式与导端40啮合，其中当导管部件远端与所述端啮合时，端40的外表面与导管部件22的外表面融合。导管部件22的管状构型的尺寸设为导管部件22的内表面，花键对的约束位置中花键对12、14上多个组织穿透器16、18。当导管部件远端与导管导端40啮合时，中央导管20的近端延伸超过导管部件22的近端。
在外部导管部件22近端和中央导管部件20近端之间提供机械连接件54，其能使外部导管部件沿花键对12、14和中央导管部件20的长度向后移动，导致外部导管部件22远端从导端40分离并穿过花键对12、14；及沿中央导管部件20的长度和花键对12、14的长度向前移动，以将外部导管部件22远端与端40啮合(图22)。机械连接件54可由手动滑动外部导管部件22过中央导管部件20的手柄或按钮提供。连接件54还可由压轮或触发机制提供。此外，连接件54可提供有相对中央导管部件20外部导管部件22的移动增加的声响或触觉指示(如弹响)。
一个实施方式中，外部导管部件22提供有沿外部导管部件的内表面上的外部导管部件22一侧的整个长度延伸的单啮合轨道56(图24)。外部导管部件22内部的啮合轨道56以滑动啮合方式在各花键12、14的一侧与啮合轨道36、38啮合。使外部导管部件22沿中央导管部件20和朝向导管组件的导端40的花键对12、14的整个长度前进导致外部导管部件的啮合轨道56沿花键对12、14的轨道36、38滑动。这使花键对12、14从它们弯曲的、不约束的构型(如图23所示)向他们背靠背的、约束构型(如图22所示)移动。外部导管部件22的啮合轨道56中花键轨道36、38的啮合将花键对12、14保持在其如图22所示的背靠背相对位置。外部导管部件22向前推动中央导管部件20和花键对12、14至外部导管部件22的远端与导端40啮合，组织穿透器16、18被盖住，本发明的导管组件可安全地在生物管道中前后移动。外部导管部件22盖住从花键对12、14伸出的组织穿透器16、18，且外部导管部件22与远导端40的啮合给导管组件提供平滑外表面，这有助于将导管组件插入或插通生物管道(如血管)。另一实施方式中，外部导管部件22提供有彼此为180°的沿外表面上外部导管部件22的整个长度延伸的2个啮合轨道，且花键在两侧都有轨道。
导丝58用于导管组件(图22)。导丝58贯通中央导管部件导丝孔48，沿花键12、14延伸，且贯通导端出口42。某些实施方式中，导丝58具有固体核(如不锈钢或超弹力镍钛合金)。导丝(整体或其远部(如最远侧1mm～25mm或最远侧3mm～10mm))可由不透射线材料构成。导丝58任选包被了医疗惰性的涂层(如)。
此装置使用中，通过本领域技术人员熟知的方法将导丝58置于生物管道内。导丝58从生物管道贯通组件的端40中的导丝出口42，贯通组织穿透器16、18后的外部屏蔽导管22，并贯通中央导管20的导丝孔48。其他实施方式中，导管组件是快速交换导管组件，其中所述导丝腔存在于导管的导端40的远端，但不贯通医疗装置的整个长度延伸。
放置导丝后，将装置沿之前放置的导丝58推入生物管道。一种或多种不透射线标记物任选提供在装置上，以监控装置在生物管道中的位置。任何阻止电子辐射穿过的材料被认为是不透射线的，且可使用。优选的不透射线材料包括但不限于铂、金或银。不透射线材料可包被在端40的全部或一部分表面上，花键12、14或其他执行器的全部或部分上，导丝58上，或者上述结构的一些组合上。另外，不透射线材料环可与端40连接。装置任选提供有机载成像(如血管内超声或光学相干的断层成像术)。装置端任选提供有用于测定装置位置或生物管道周围特征的光学器件。
当装置在生物管道中的期望位置，操作器使用机械连接件54，以远离导端40向后撤回外部导管部件22。优选实施方式中，随着外部导管部件22从组织穿透器16、18撤过，外部导管部件22的啮合轨道56撤过花键对12、14的轨道36、38。此移动将花键对12、14从其约束的、背靠背构型(如图22所示)中解放出来，且允许花键12、14的形状记忆材料采取其不约束的、弯曲构型(如图23所示)。随着花键12、14移动到其不约束的、弯曲构型，花键与生物管道壁的内表面接触，且将花键12、14的外表面28、30上的组织穿透器16、18压入装置位置处的生物管道的内表面。
在组织穿透器16、18进入生物管道壁的期望层中后，可通过中央导管部件20的流体递送腔44、46，通过花键对12、14上的流体递送管道32、34，及通过组织穿透器16、18递送流体。当流体递送完成时，操作器使用机械连接件54，以使外部导管部件22(其还可被称为屏蔽部件)向前移动过中央导管部件20，且过花键对12、14向导端40。随着外部导管部件22向前移动过花键对12、14，外部导管部件22内部的啮合轨道56经过花键对12、14上的轨道36、38，导致花键12、14从它们不约束的、弯曲构型动回到它们的约束构型。当外部导管部件22已整体前进超过花键12、14，且再次与导端40啮合时，外部导管部件22内的啮合轨道56保持花键12、14在它们的约束构型。然后可将装置复位，用于在生物管道内的另一位置或另一生物管道释放，或从身体抽出。
花键12、14的形状和长度选择为装置的各种实施方式可用于各种尺寸或直径的生物空间或管道。某些实施方式中，花键可为平的或圆的。平花键优选具有约0.2mm～约20mm范围的宽度、约0.2mm～约5mm范围的高度、及约10mm～约200mm范围的长度，取决于具体应用。圆花键优选具有约0.2mm～约20mm范围的直径，和约10mm～约200nm范围的长度，取决于具体应用。特定实施方式中，平花键宽度为3.5mm～5mm,5mm～10mm、10mm～15mm、15mm～20mm，或它们中的任意范围(如3.5mm～10mm)；高度为3.5mm～5mm、5mm～10mm、10mm～15mm、15mm～20mm，或它们中的任意范围(如3.5mm～10mm)；及长度为10mm～20mm、20mm～40mm、40mm～80mm、80mm～120mm、120mm～150mm或150～200mm，或它们中的任意范围(如10mm～40mm)，或上述之任意置换(如5mm～10mm的宽度、3.5～5mm的高度、及20～40mm的长度)。其他实施方式中，园花键直径为3.5mm～5mm、5mm～10mm、10mm～15mm、15mm～20mm,或它们中的任意范围(如3.5mm～10mm)且长度为10mm～20mm、20mm～40mm、40mm～80mm、80mm～120mm、120mm～150mm或150～200mm,或它们中的任意范围(如10mm～40mm)，或上述之任意置换(如5mm～10mm的直径和20～40mm的长度)。
图27所示的特定实施方式中，本发明的装置本发明的装置是流体递送导管110，其包括具有沿纵轴113的长形长度的中央导管部件112、一个或多个(且优选为2个)柔韧的、弹性执行器(其在此特定实施方式中形成为从中央导管部件112远部延伸而来的组织穿透器呈递管114、116)。组织呈递管114、116的至少一部分可在约束构型(其取向为基本上平行于导管组件的中央纵轴113)和不约束构型(其取向为基本上不平行于导管的中央纵轴113)之间移动。
所述导管还包括一个或多个(且优选为2个)柔韧的、长形组织穿透器118、120，其贯通2个组织穿透器呈递管114、116，外部配置(deployment)管122(其遍布中央导管部件112、组织穿透器呈递管114、116，和中间轨道132的部分)。
中央导管部件112和外部配置管122可由任何适于构成导管的材料的构成。所述材料的例子包括但不限于：硅酮、聚氨酯、尼龙、涤纶和PEBAXTM。
组织穿透器118、120与各自的毂166、168(图31)。一个或多个组织穿透器对118、120优选具有约0.2mm(33口径)～约3.4mm(10口径)，更优选0.8mm～1.3mm(约18～21口径)的直径。一个或多个组织穿透器对可具有标准斜面，短斜面或标准短斜面。组织穿透器对118、120优选由允许组织穿透器沿其长度伸缩的材料构成。所述材料的例子包括但不限于：镍、铝、钢和它们的合金。在特定实施方式中，所述组织穿透器由镍钛合金构成。组织穿透器对118、120的全长可由单一材料构成，或者组织穿透器对118、120的远端(如远侧1mm～远侧20mm)(包括端156、158)可由一种材料构成，且经由不同材料(如塑料)构成的管道与各自的毂166、168连接。
一个或多个组织穿透器呈递管对114、116优选由柔韧的、弹性材料构成。所述柔韧的、弹性材料例如当组织穿透器呈递管114、116是图27的直的、约束构型时可变形，但当变形力被除去时(如当组织穿透器呈递管114、116是图28的弯曲的、不约束构型时)回到其原形状。可使用任意所述柔韧的、弹性材料，包括但不限于手术用钢、铝、聚丙烯、烯材料、聚氨酯及其他合成橡胶或塑料材料。组织穿透器呈递管对114、116最优选由形状记忆材料构成。所述形状记忆材料的例子包括但不限于：铜-锌-铝-镍合金、铜-铝-镍合金和镍-钛(NiTi)合金。优选实施方式中，形状记忆材料是镍钛合金。
中央导管部件112具有柔韧的伸长长度(具有相对的近端124和远端126)(图27)。中央导管部件的远端126形成为具有外部形状构型的指导远端126通过生物管道的导端。中间轨道132内的导丝孔128从近端124贯通中央导管112的中央到远端126。导丝孔128接受用于所述孔128过丝滑动的柔韧的、长形导丝130(图29)。导丝130用于指导导管组件通过生物管道。某些实施方式中，导丝130具有固体核，如不锈钢或超弹力镍钛合金。导丝任选其整体或其远部(例如最远侧1mm～25mm，或最远侧1mm～3mm)由不透射线材料构成。导丝130可选包被医疗惰性涂层(例如)。其他实施方式中，导管组件是快速交换导管组件，其中导丝位于导端126远端，且从该处延伸。
围绕导丝孔128的狭窄中间轨道132从导管远端126的导端向导管近端124延伸。中间轨道132将导端126与中央导管部件基部138连接。
中央导管部件基部138具有沿基部整个长度延伸的圆筒形外表面。基部138沿中央导管部件112的整个长度的大部分延伸。如图29所示，导丝孔128通过中央导管部件基部138中央延伸。此外，一对组织穿透器腔140、142也贯通沿靠导丝孔128的中央导管部件基部138的长度。在中央导管部件的近端124，一对口144、146将腔对140、142与中央导管部件112外部连接(图27)。
替代性实施方式中，图27的医疗装置还含一个形成为组织穿透器呈递管的柔韧的、弹性执行器，一个贯通组织穿透器呈递管及连接毂的柔韧的、长形组织穿透器，及遍布中央导管部件、组织穿透器呈递管，和中间轨道的长度的外部配置管。
所述一对第一和第二组织穿透器呈递管114、116从导管中央部件基部138伸向导管远端126。各组织穿透器呈递管形成为具有紧固至中央导管部件基部138的近端的狭窄的、长形管，和相对的远端148、150。各第一和第二组织穿透器呈递管114、116具有与中央导管部件基部138内各自的第一组织穿透器腔140和第二组织穿透器腔142连通的内孔152、154。
如图29和30所示，组织穿透器呈递管114、116的外部构型与中间轨道132匹配，以便组织穿透器呈递管114、116的长度可并排于中间轨道132相对侧。组织穿透器管远端148、150可形成为液辅助导管经过血管系统的导端表面。组织穿透器管远端148、150优选直径大于组织穿透器呈递管114、116。特定实施方式中，组织穿透器管远端148、150是圆形且球形端。所述端是无创的，且管不会意外刺破生物管道壁。端148、150是露出的，且向外延伸不超过导端126的直径。
各组织穿透器管114、116优选由形状记忆材料(如镍钛合金)构成。如图28所示，管114、116形成为弯曲的、不约束构型。当无约束力施加到管上时，管114、116移动到如图28所示的弯曲的、不约束构型。为使呈递管114、116沿中间轨道132取平直的、约束构型，必需对管施加约束力，以将它们保持在图27所示的其平直的约束位置。当各管114、116从图28所示的其平直的、约束构型移动到图28所示的其弯曲的不约束构型时，贯通所述管的组织穿透器孔152、154也从平直构型移动到弯曲构型。
当组织穿透器对118、120(从它们的远端到毂166、168)具有略长于贯通中央导管基部138的组织穿透器腔140、142和贯通组织穿透器呈递管114、116的组织穿透器孔152、154的组合长度的长度。组织穿透器118、120的端156、158位于组织穿透器呈递管114、116的远端148、150附近，且位于图27的所述约束构型的管的孔152、154内。组织穿透器118、120的相对的近端伸出通过中央导管112的侧口144、146。组织穿透器对118、120具有合适的尺寸以易于滑动通过中央导管部件112的组织穿透器腔140、142和组织穿透器呈递管114、116的组织穿透器孔152、154。中央导管部件112的侧口144、146优选与中央导管近端124成20°～90°角，最有选与中央导管近端124成30°～60°角。
一对手动操作器移动至线性移动控制器162、164可与组织穿透器118、120的近端连接，且可紧固至中央导管口144、146(图31)。控制器162、164可构成为通过中央导管组织穿透器腔140、142及通过组织穿透器呈递管孔152、154将组织穿透器118、120的操作器移动转换为受控的线性移动。一个实施方式中，有可手动以一个方向移动的旋转控制器162、164，以便在组织穿透器远端的所述组织穿透器注射端156、158可调节地取位，以从组织穿透器管远端148、150处的组织穿透器管口152、154延伸出期望长度。通过以反方向旋转控制器，组织穿透器118、120可缩回入组织穿透器管口152、154。各操作器移动至线性移动控制器162、164可提供有与贯通组织穿透器118、120的内孔连通的毂166、168，且可用于连接含诊断剂或治疗剂的溶液的注射器或管。
外部配置管122具有围绕中央导管112、组织穿透器呈递管114、116和中央轨道132的管状长度。配置管122可安装在中央导管部件112和组织穿透器呈递管114、116上，用于当如图27所示，配置管的开放远端172位于组织穿透器呈递管114、116的远端148、150附近时，向配置管122的向前位置滑动；而当如图28所示，所述管远端172位于组织穿透器呈递管114、116与中央导管部件112的连接件附近时，向配置管122的向后位置滑动。配置管122的相对的远端174可提供有至中央导管112的机械连接件176。机械连接件176能使配置管122在其相对于中央导管112和组织穿透器呈递管114、116的向前位置和向后位置之间移动(图27和28)。所述连接件可由压轮、滑动连接件、触发器或按钮或一些其他可手动操作的连接件提供，以使配置管122相对中央导管112和呈递管114、116移动。当配置管122移动到图27中所示的其向前位置时，管远端172经过组织穿透器呈递管114、116的长度，且将所述呈递管移动到其沿中央导管中间轨道132的相对侧的约束位置。当配置管122移动到图28中所示的其向后位置时，配置管的远端172从超过组织穿透器呈递管114、116的长度缩回，且逐渐允许呈递管114、116释放其约束能，且移动到图28中所示的其弯曲的、不约束构型。
导管110的使用中、配置管122在图27中所示的正向位置。导丝130以已知方式置于生物管道(例如动脉或静脉)内。然后使所述导管经过所述导丝进入生物管道内。导丝130从生物管道延伸，并进入中央导管部件远端126通过导丝腔128。所述丝130经过中央导管112的长度，并在邻近导管口144、146的中央导管部件近端处出现，在该处导丝130可手动操作。
可使导管110在生物管道中前进，且可由导丝130指导。任选在组件上提供不透射线标记物，以监控组件在生物管道中的位置。任何阻止电磁辐射穿过的材料被人为是不透射线的，且可使用。可用的不透射线材料包括但不限于：铂、金或银。可将不透射线材料包被在端126的全部或部分表面上，呈递管114、116的全部或部分上，组织穿透器118、120的全部或部分上，导丝130的全部或部分上，或上述结构的任意组合上。另外，不透射线材料环可与端126连接。组件任选提供有机载成像(如血管内超声或光学相干的断层成像术)。组件端任选提供有用于测定组件位置或生物管道周围特征的光学器件。当组件在期望位置时，可通过手动操作机械连接件176来使外部配置管122从图27中所示其向前位置移动到图28中所示其向后位置。
当配置管122从超过组织穿透器呈递管对114、116撤回时，组织穿透器呈递管114、116的约束能释放，且所述管向图28中所示的其不约束的、弯曲构型移动。此移动使组织穿透器管远端148、150处的组织穿透器孔152、154处于靠在已插入组件110的生物管道内表面的位置。
然后可手动操作操作器移动至线性移动控制器162、164，以从组织穿透器呈递管远端148、150处的组织穿透器孔152、154延伸组织穿透器远端156、158。可在各操作器移动至线性移动控制器162、164上提供计量仪，其提供随着控制器162、164旋转，组织穿透器端156、158从组织穿透器管端148、150伸出程度的视觉指示。控制器还可提供声响或触觉(如弹响)，以指示组织穿透器移动的递增步长。此给组织穿透器端156、158配置了进入生物管道壁内的期望距离。
第三特定实施方式中，本发明的医疗装置是含一个或多个由柔韧的、弹性材料构成的组织穿透器的流体递送导管。在某些方面，本发明的医疗装置具有中央纵轴，且含一个或多个组织穿透器，其中所述一个或多个组织穿透器可以约束构型(其中所述一个或多个组织穿透器的长度取向为基本上平行于所述医疗装置的纵轴)和不约束构型(其中所述一个或多个组织穿透器的长度的至少一部分取向为基本上不平行于所述装置的中央纵轴)存在。当所述装置位于邻近生物管道壁的靶位点后，一个或多个组织穿透器(且如果需要，全部组织穿透器)可从约束构型释放，并允许采取不约束构型，由此与生物管道壁接触。一个或多个组织穿透器可为任何形状，且在优选实施方式中，在装置操作器释放约束力(但无需由操作器向装置或靶位点输入任何变形力)后，发生一个或多个组织穿透器的从约束构型向不约束构型的移动。
优选实施方式中，组织穿透器由柔韧的、弹性材料构成，所述材料能够在应用约束力后(例如当组织穿透器在约束构型时)被约束，及当除去约束力时(例如当组织穿透器在不约束构型时)采取其原不约束形状。可使用任何所述柔韧的、弹性材料，包括但不限于：手术用钢、铝、聚丙烯、烯材料、聚氨酯或其他合成橡胶或塑料材料。一个或多个组织穿透器最优选由形状记忆材料构成。所述形状记忆材料的例子包括但不限于：铜-锌-铝-镍合金、铜-铝-镍合金和镍-钛(NiTi)合金。优选实施方式中，形状记忆材料是镍钛合金。优选实施方式中，当组织穿透器采取不约束构型时，材料(各组织穿透器由此形成)的形状记忆特性导致组织穿透器，无需应用任何外部约束力而从基本上平行于医疗装置纵轴的位置移动到基本上垂直于医疗装置的位置。
优选实施方式中，组织穿透器通过具有围绕组织穿透器的管状构型的外部导管部件保持在约束构型。在外部导管部件和中央导管部件(组织穿透器连接于此)之间提供机械连接。机械连接能使外部导管部件沿中央导管部件长度向后移动，由此掀开约束的一个或多个组织穿透器，且允许一个或多个组织穿透器采取不约束构型，其中它们与靶递送位点相接触。本领域技术人员会知道，此特定实施方式可易于适于掺入不透涉嫌标记物，以辅助装置定位，或者并入快速交换特征，以辅助装置的使用。
本发明的医疗装置，在其各种实施方式中，允许将流体递送入血管壁的不同层。血管壁由多种结构和层构成，结构和层包括内皮层和基底膜层(总称为内膜层)、内弹性膜、中间层及外膜层。这些层排列如下，内皮层暴露于血管腔，且基底膜、内膜、内弹性膜、中间层和外膜层依次叠在内皮层上，如美国专利申请No.2006/0189941A1所述。通过本发明的医疗装置，组织穿透器端156、158可穿透入靶组织的厚度可通过旋转控制器162、164来控制。例如，如果靶层是外膜层，所述管114、116的约束能释放，所述管采取图28中所示的其不约束的、弯曲构型；且组织穿透器端156、158用控制器前进足以穿透外膜层厚度的长度。同样，如果靶层是中间层，管114、116的约束能释放，管采取图28中所示的其不约束的、弯曲构型，且组织穿透器端156、158用控制器前进足以穿透中间层厚度的长度。
随着组织穿透器植入生物管道壁的期望层，然后流体可通过组织穿透器118、120递送。当流体递送完成时，可操作控制器162、164以将组织穿透器端156、158撤回入组织穿透器呈递管114、116的外部孔152、154。然后可将配置管122移动到其向前位置，在该处配置管远端172移动组织穿透器呈递管114、116回到图27中所示的其约束位置。当配置管122已移动到图27中所示的其完全向前位置时，则可复位组件，或从身体中撤出。
本发明的医疗装置还允许将流体递送到生物管道壁内侧上的或生物管道壁内的血小板沉淀。
本发明的医疗装置还允许将流体递送到位于生物管道外壁外侧的细胞外空间或组织(如到血管外表面，或到靠着血管外表面取位的肌肉(如心肌))。
本发明的装置的一个有利特征是，执行器依靠其设计根据它们在生物管道内的配置与少于完全圆周的生物管道内壁接触。优选实施方式中，执行器与少于100％圆周的生物管道(执行器配置于其中)内壁接触。执行器更优选与少于75％、50％或25％圆周的生物管道(执行器配置于其中)内壁接触。执行器最优选与少于10％、5％、2.5％、1％、0.5％或0.1％圆周的生物管道(执行器配置于其中)内壁接触。
装置可用于将含各种治疗剂和/或诊断剂的流体递送到生物管道壁。治疗剂包括但不限于蛋白质、化学物质、小分子、细胞和核酸。由装置递送的治疗剂可含与微颗粒或纳米颗粒复合，或者与微颗粒或纳米颗粒结合的微颗粒或纳米颗粒。蛋白剂包括：弹性蛋白酶、抗增殖剂和血管痉挛抑制剂。尤其考虑用于递送弹性蛋白酶的装置的使用。几个公开的专利申请(WO2001/21574；WO2004/073504和WO2006/036804)教导，单独及与其他剂组合的弹性蛋白酶有利于治疗生物管道疾病，包括：生物管道阻塞和血管痉挛。诊断剂包括但不限于：造影剂、微颗粒、纳米颗粒或其他成像剂。
可用装置实施各种不同的流体递送方法。某些应用中，可通过装置的各组织穿透器同时或依次递送不同流体。其他应用中，可通过两个组织穿透器同时或依次递送同一流体。也考虑如下实施方式和/或方法，通过两个组织穿透器递送第一流体，随后通过两个组织穿透器递送第二流体。
尤其考虑使用装置将流体递送到或递送通过生物管道壁的方法。这些方法包括下列步骤：将装置导入生物管道；使所述装置在所述管道内前进到靶位点；从其约束位置释放执行器，任选推进组织穿透器通过执行器腔，以穿透到生物管道壁的期望厚度；将至少一种流体递送到或递送通过所述壁，任选将组织穿透器撤回到执行期腔内，收缩执行器到其约束位置；在同一或不同递送其他流体(如果需要)用管道内复原装置；及从管道内除去装置。
6.实施例
本部分描述产生临床用重组I型弹性蛋白酶(例如作为增大血管直径及由此血管腔的剂)的方法。人I型胰腺弹性蛋白酶与猪I型胰腺弹性蛋白酶的整个长度表现出89％的氨基酸同一性，具有“催化三联体”和底物特异性决定残基的完全保守。猪I型弹性蛋白酶初始合成为酶学无活性的原酶，其由胰蛋白酶活化而产生含4个内部二硫键且无糖基化的成熟酶(见Shotton,1970,Methods Enzymol19:113-140,Elastase；及Hartley and Shotton,1971,Biochem.J.124(2):289-299,Pancreatic Elastase.The Enzymes3:323-373及其中的参考文献)。
以下实施例说明有效且可量的重组猪和人I型弹性蛋白酶表达和适于这些酶(用于非临床和临床研究)的cGMP制造的纯化方案，及商业药学用途。成熟的猪弹性蛋白酶被称为PRT-102。成熟的人I型弹性蛋白酶被称为PRT-201。
6.1术语和缩写
如本文所用，术语PRT-101、PRT-102、PRT-201和原-PRT-201应意在下列：
PRT-101：猪胰腺弹性蛋白酶。除非另有说明，用于实施例中的猪胰腺弹性蛋白酶是购自Elastin Products Company,Inc,Owensville,MO,catalog#EC134的高度纯化的猪胰腺弹性蛋白酶。
PRT-102：成熟的重组I型猪胰腺弹性蛋白酶。需知，具有名称“pPROT101-XXX”的载体编码PRT-102。
PRT-201：成熟的重组I型人胰腺弹性蛋白酶。
原PRT-201：含原肽序列的重组的人I型胰腺弹性蛋白酶的原酶形式。
下列缩写用于本申请的第6部分：
BKGY：缓冲的甘油复合培养基
BKME：缓冲的甲醇复合培养基
CHO：中国仓鼠卵巢
E.coli：大肠杆菌(Escherichia coli)
ELA-1：I型胰腺弹性蛋白酶
HEK：人胚胎肾
hELA-1：人ELA-1
HIC：疏水性相互作用层析
MBP：麦芽糖结合蛋白
pELA-1：猪ELA-1
P.pastoris：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
PCR：聚合酶链式反应
PMSF：苯甲基磺酰基氟化物
RP：逆相
S.cerevisiae：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SEC：尺寸排阻层析
USP：美国药典
YPDS：酵母提取物蛋白胨右旋糖山梨醇培养基
6.2实施例1：弹性蛋白酶DNA合成
人弹性蛋白酶-I编码序列获自美国专利No.5,162,205(Takiguichiet al.,1992)。制作多个序列变化以辅助克隆进表达载体(图1A)。碱基变化落入遗传密码的简并性，由此无氨基酸残基变化。在天然终止密码子后随即加入第二终止密码子，以最小化潜在的核糖体连读。
通过Blue Heron Biotechnology(Bothell,WA)使用非-PCR“长寡”技术，在Amgen(Thousand Oaks,CA)的授权下合成经修饰的编码序列。将命名为ELA-1.2A(SEQ ID NO：81)的重组DNA克隆进Blue Heron pUC，pUC119的衍生物，且得到的质粒命名为pPROT1。对pPROT1的两条链测序，以确认正确的序列。在两条链上有大量重叠的高质量测序数据允许了跨整个序列的明确的碱基分配(其由最少4次测序反应覆盖，各链至少一次反应)。
6.3实施例2：PRT-201在大肠杆菌中的表达
尝试了各种表达策略，以获得可溶且在大肠杆菌中有酶活性的人弹性蛋白酶。
一组大肠杆菌表达载体包含人I型胰腺弹性蛋白酶(ELA-1)与麦芽糖结合蛋白(MBP)的羧基端的框内融合物，所述麦芽糖结合蛋白再与N-端分泌肽融合。将人ELA-1成熟酶编码序列和原酶编码序列作为框内C-端融合物克隆到质粒pMAL-p2G(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)的MBP编码序列，以产生pPROT3(成熟的ELA-1)或pPROT5(ELA-1原酶)。如下构建pPROT3：首先通过PCR诱变获得6.6kb成熟的人ELA-1编码片段，在成熟的人ELA-1的N-端缬氨酸密码子处有SnaBI位点，且HindIII位点位于成熟的ELA-1终止密码子3’端。此PCR诱变使用含ELA-1.2A编码序列(SEQ ID NO：81)的pPROT1模板和2个寡核苷酸引物(5’ATC TAC GTA GTCGGA GGG ACT GAG GCC，SEQ ID NO：75；和5’gtc gac aag ctt atcagt tgg agg cga t，SEQ ID NO：76)。分离出所得到的6.6kb的PCR片段，用SnaBI和HindIII消化，随即克隆到经XmaI/HindIII消化的pMAL-p2G载体中，以产生pPROT3。如下构建pPROT5：从pPROT1克隆ScaI/HindIII片段，并连接到已经用SnaBI和HindIII消化的pMAL-p2G载体中。所得融合物将人ELA-1原酶编码区的N端可操作连接到pPROT5中pMAL-p2G的MBP的C-端。将人ELA-1原蛋白的胰蛋白酶切割结构域保存于pPROT5中。
用pPROT3和pPROT5转化大肠杆菌TB1株，并随后用IPTG诱导，以确定是否可产生融合蛋白或酶学有活性的人ELA-1。在pPROT3的情况中，产生的全部MBP-ELA-1融合蛋白是不可溶的。在通过被诱导的含pPROT3的大肠杆菌的渗透冲击得到的周质材料中检测不到可溶的或酶学有活性的MBP-ELA-1融合蛋白。在pPROT5的情况中，可在通过被诱导的含pPROT5的大肠杆菌的渗透冲击得到的周质材料中通过使用SDS-PAGE和考马斯染色或者在蛋白印迹中使用抗-MBP抗体来检测到低水平的可溶性重组MBP-原ELA-1蛋白(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)。可用胰蛋白酶消化所述可溶的重组MBP-原ELA-1蛋白，以产生MBP和成熟的人ELA-1。随后用SLAP肽底物测定通过pPROT5诱导得到的成熟的人ELA-1的弹性蛋白酶活性。观察pPROT5周质提取物中的弹性蛋白酶活性。弹性蛋白酶酶活性依赖于胰蛋白酶活化(即，缺乏胰蛋白酶时观察不到活性，活性量随着胰蛋白酶活化时期的增大而增大)。此外，弹性蛋白酶活性依赖于pPROT5至用胰蛋白酶平行处理的pMAL-p2G载体对照提取物中观察不到活性。最后，pPROT5弹性蛋白酶活性被PMSF(已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂)抑制。
随后纯化重组MBP-原ELA-1融合蛋白，并用胰蛋白酶切割，以产生酶学有活性的源于pPROT5的成熟的人ELA-1。首先用直链淀粉亲和层析纯化融合蛋白，然后用麦芽糖洗脱。然后用固定的胰蛋白酶处理经纯化的MBP-原ELA-1。胰蛋白酶活化步骤后，通过阳离子SP琼脂糖层析纯化经切割的MBP-原ELA-1。但是，使用经亲和力纯化的源于pPROT5的成熟的人ELA-1的随后实验显示，仅可从含pPROT5的大肠杆菌中获得非常有限量的可溶的酶学有活性的弹性蛋白酶。此外，经亲和力纯化的、源于pPROT5的成熟的人ELA-1的比活性非常低，在0.27～0.38U/mg的范围内(U＝每分钟水解的SLAP底物的微摩尔)。
还研究了在大肠杆菌中获得可溶且酶学有活性的ELA-1的替代性策略。简言之，构建了编码含大肠杆菌lacZα亚基前8个氨基酸残基+5个氨基酸的多聚接头编码的残基、及人ELA-1N-端原酶的蛋白融合物的pPROT8载体。此载体通过将含自pPROT1的人ELA-1编码序列的BamHI/NcoI片段(即含ELA-1.2A序列的载体，SEQ ID NO：81)连接入经BamHI/NcoI消化的pBlueHeron pUC(Blue HeronBiotechnology,Bothell,WA,USA)来构建。
用pPROT8转化大肠杆菌株EC100(EPICENTREBiotechnologies,Madison,WI)，随后用IPTG诱导，以确定是否可产生融合蛋白或酶学有活性的人ELA-1。在EC100转化细胞的情况中，产生的全部源于pPROT8的lacZ-原ELA-1融合蛋白是不可溶的(即见于包含体)。随后用pPROT8转化在trxB和gor基因中含突变的大肠杆菌株(OrigamiTM株,Takara Mirus Bio,Inc.,Madison,WI)，因为在这些编码序列中有突变的大肠杆菌株已知促进可溶且酶学有活性的重组蛋白的回收。尽管在用IPTG诱导后回收到trxB/gor大肠杆菌株中一些可溶的源于pPROT8的lacZ-原ELA-1融合蛋白，但其不能用胰蛋白酶转变为酶学有活性的人ELA-1。
6.4实施例3：PRT-201在哺乳动物细胞系中的表达
尝试了多个表达策略，以在哺乳动物细胞系中获得可溶且酶学有活性的人I型胰腺弹性蛋白酶(ELA-1)。将含CMV启动子的高拷贝哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)用作2种人ELA-1弹性蛋白酶表达载体(pPROT30和pPROT31)的骨架。通过PCR扩增构建体pPROT30、人ELA-1原酶序列，并融合到并入正向PCR引物中的猪胰腺弹性蛋白酶信号序列。使用并入PCR引物中的限制性位点，消化PCR产物，并用相应的限制性位点连接入pcDNA3.1载体中。除使用人ELA-1成熟的编码序列代替原酶编码序列(旨在直接表达成熟的酶)之外，以类似方式构建pPROT31。用连接反应转化大肠杆菌，并筛选克隆用于小量制备。基于期望的正确插入用限制消化模式，就各表达载体选择1种克隆。就各克隆制备质粒DNA，并通过DNA测序确定表达载体编码序列。
用pPROT30和pPROT31分别短暂转染哺乳动物细胞系CHO、COS、HEK293和HEK293T。几天后，收获细胞培养物上清，并通过蛋白印迹分析人ELA-1原蛋白(pPROT30)或成熟蛋白(pPROT31)的表达。抗-猪胰腺弹性蛋白酶多克隆抗体与期望分子量带(在pPROT30上清中为人ELA-1原蛋白，而在pPROT31上清中为成熟的人ELA-1蛋白)交叉反应。
通过SLAP测定分析pPROT30和pPROT31上清的弹性蛋白酶活性。就pPROT30而言，首先用胰蛋白酶处理上清，以将原酶转变为成熟的PRT-201。使用SLAP测定法在对于各载体的任何上清中检测不到弹性蛋白酶活性。
6.5实施例4：巴斯德毕赤酵母中胰蛋白酶活化的PRT-201的表 达
通过Blue Heron合成巴斯德毕赤酵母分泌的表达载体，PV-1，并首先用于克隆野生型人ELA-1编码序列。PV-1载体设计用于重组蛋白的简单克隆、分泌和高水平表达。载体含用于直接筛选多拷贝整合体的ZeocinTM抗性基因。将弹性蛋白酶原肽的N-端融合到如图1B所示的含酵母分泌信号、原肽和间隔子序列的酵母α杂交型序列允许在培养基中分泌表达出的蛋白。可易于从细胞沉淀中分离分泌的弹性蛋白酶原蛋白，向纯化的实质性第一步骤。此外，选择含胰蛋白酶切割位点的原酶形式的人ELA-1用于表达，以避免直接表达成熟的、活化的酶，其可导致蛋白错误折叠，或对表达重组酶的细胞的毒性。
如下完成用于指导ELA-1原酶表达的表达构建体pPROT24-V的克隆。通过PCR(扩展的高保真PCR系统，Roche,Indianapolis,IN)从Blue Heron pUC ELA-1扩增人ELA-1编码序列(SEQ ID NO：81)。20F正向引物并有XhoI位点(5'-ggctcgagaaaagagaggctgaagctactcaggaccttccggaaaccaatgcccgg-3；SEQ ID NO：35)。24R引物并有SacII位点(5'-gggccgcggcttatcagttggaggcgatgacat-3'；SEQ ID NO：36)。得到的PCR产物经凝胶纯化，并克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)。用XhoI和SacII分离ELA-1编码序列，经凝胶纯化，并在所述位点克隆入PV-1载体，以产生pPROT24-V(图3)。
在大肠杆菌株TOP10中扩增pPROT24-V连接的产物。将细胞混合物平铺于补充25μg/mL Zeocin的低盐LB平板上。制备DNA质粒(Qiagen,Valencia,CA)，并通过限制性消化鉴定人ELA-1插入子。通过用多重叠反应测序纯化的最大制剂DNA的两条链来确认pPROT24编码序列。高质量测序数据允许了明白的碱基排列，并证实了正确的编码序列。制备pPROT24-V/TOP10的甘油储液，并保存于-80℃。
将获自美国农业部(USDA,Peoria,IL,USA)的野生型NRRLY-11430巴斯德毕赤酵母株用于转化。用SacI将自pPROT24-V的质粒DNA线性化，且通过在琼脂糖凝胶上运行小量反应来确认完全消化。用pPROT24-V质粒DNA使用电穿孔转化巴斯德毕赤酵母。将细胞混合物平铺于含100μg/mL Zeocin的YPDS平板上。3天后，集落开始形成，并筛选更多天，用于在新鲜平板上重划线。
总之，筛选药物抗性转化体，用于在1L带挡板的瓶中表达。使用1个集落接种200mL BKGY培养基。BKGY溶液的组成如下：含10g/L甘油、13.4g/L含硫酸铵而不含氨基酸的酵母氮源(Invitrogen)、20g/L大豆蛋白胨、10g/L酵母提取物、0.4mg/L生物素的0.1M磷酸钾缓冲液(pH5.0)。于28℃，275rpm摇动下生长培养物2天。通过于室温下以650×g离心10分钟来沉淀培养物。通过以1g湿细胞对5mL诱导培养基的比例重悬沉淀来将细胞沉淀重悬于BKME诱导培养基(pH5.0)中。将50mL细胞悬液放置于500mL不带挡板的瓶中，以获得细胞悬液对瓶溶剂的1:10的比例。于22℃用275rpm摇动1～3天来温育细胞。在诱导过程中每天补充2次诱导培养基中的甲醇，至0.5％的终浓度。
为筛选用于表达，取1mL等份，转移到1.5mL微型离心管，并在离心机中以20,000×g离心5分钟。将上清转移到新管中，并保存于-80℃。就SDS-PAGE分析而言，解冻上清等份，并与用还原剂β-巯基乙醇补充至5％体积的4×Laemmli缓冲液混合。煮沸样品5分钟，轻缓离心，并装载在标准电泳系统(Bio-Rad)中的8～16％梯度Tris-HCl预制凝胶上。电泳后，用考马斯染色凝胶，并分析人ELA-1原酶表达。克隆201-24-266-VU筛选为高产量克隆，用于进一步评价。制备由201-24-266-VU甘油储液构成的发展的细胞库，并保存于-80℃。
就用克隆201-24-266-VU扩大人ELA-1原酶产量而言，一般根据以下描述的方法进行多次产生运行。如果可应用，标出方法中的运行间变化。
就细胞培养而言，用250μl解冻的201-24-266-VU甘油储液接种一系列含500mLBKGY生长培养基的2L带挡板的摇瓶(一般在20～40瓶的范围)。在摇动温育器中于28℃、以250～300rpm生长培养物2天。2天后，通过离心沉淀细胞，并除去上清。将细胞以1g重量细胞对5mL培养基的比例重悬于BKME诱导培养基(pH5.0)中。将200～400mL体积的细胞悬液放置在2L不带挡板的瓶中，并在摇动温育器(250～300rpm)中，于22℃培养3天。诱导过程中，每天向培养基中补充2次甲醇至0.5％体积。诱导末，离心摇瓶培养物以沉淀细胞。除去上清，随即于室温下用1L真空过滤单元过滤通过0.22μm聚醚砜膜，以除去任何残留的细胞碎片。将过滤物保存于2～8℃至1.5个月。基于HIC-HPLC分析，在澄清的上清中自克隆原-PRT-201-24-266-VU的人ELA-1原酶的产量一般为200～250mg/L。
如下实现自上清中的原-PRT-201-24-266-VU的捕获。首先，合并自多轮摇瓶培养(一般4～10轮)的上清(一般共8～25L)，用水稀释8倍，并用1M HCl调至pH5.0。然后将稀释的上清于2～8℃，以100mL/分钟的速度(线性流速76cm/小时)装载于经平衡的2L柱床体积Macro-Prep High S离子交换捕获柱上。层析程序包括下列步骤：
1.用10L(5柱体积[CV])缓冲液A(20mM柠檬酸钠，pH5.0)以100mL/分钟(76cm/小时)洗柱；
2.用4L(2CV)90％缓冲液A和10％缓冲液B(500mM氯化钠；20mM柠檬酸钠，pH5.0)的混合物(终缓冲液组成为：50mM氯化钠；20mM柠檬酸钠，pH5.0)以100mL/分钟(76cm/小时)洗柱；
3.用6L(3CV)80％缓冲液A和20％缓冲液B的混合物(终缓冲液组成为：100mM氯化钠；20mM柠檬酸钠，pH5.0)以100mL/分钟(76cm/小时)洗柱；
4.用6L(3CV)始于75％缓冲液A和25％缓冲液B至68％缓冲液A和32％缓冲液B的线性梯度以100mL/分钟(153cm/小时)洗柱；
5.用30L(15CV)始于68％缓冲液A和32％缓冲液B至0％缓冲液A和100％缓冲液B的线性梯度以100mL/分钟(76cm/小时)洗柱。
洗脱物收集于各500～1000mL的级分中。
一般而言，通过SDS-PAGE及考马斯染色观察到2种主要的蛋白类：糖基化的人ELA-1原酶和非糖基化的人ELA-1原酶，如通过随后的LC/MS分析测定，一般以约320mM氯化钠洗脱(见图4)。一些产生运行中，观察到一小类略小于人ELA-1原酶的蛋白质。这些级分的随后的LC/MS分析显示，大部分蛋白不是全长原酶，而是在N-端缺少几个氨基酸。纯化这些N-端变体，并进行弹性蛋白酶活性分析，其显示，它们具有低于全长PRT-201的弹性蛋白酶活性。N-端变体可产生自细胞培养和捕获层析操作期间表现出低水平弹性蛋白酶活性，及通过分子内反应切割其自身或通过分子间反应切割另一人ELA-1原酶分子的人ELA-1原酶。这些操作过程中最适度以下切割条件可导致高水平的不准确原酶切割(有时也称为自发的或不受控的转变)，主要产生N-端变体，而非完整的全长PRT-201。
查看SDS-PAGE结果后，合并一组级分，以获得纯化的非糖基化的原-PRT-201，用于进一步加工。一般从合并物中排除含糖基化原酶或全长PRT-201和/或N-端变体的级分(在SDS-PAGE中共迁移)。在从原酶转变成成熟酶前，一般在5L塑料杯中于2～8℃下保存合并的原-PRT-201几小时至过夜。
如下进行通过固定的胰蛋白酶的从原-PRT-201至成熟的PRT-201的转变。在20mM磷酸钠(pH5.0)中于2～8℃透析合并的原-PRT-201级分过夜。此步骤提供用于除去抑制胰蛋白酶的柠檬酸盐。透析后，原-PRT-201经过固定于经20mM磷酸钠(pH5.0)预平衡的琼脂糖珠的重组的胰蛋白酶(TrypZean)的柱。一般而言，原-PRT-201与固定的TrypZean之间的接触时间在3.5～5分钟之间。通过SDS-PAGE分析得到的转变后材料，以证实转变，并随后装载在Macro-Prep High S精制柱上。随后用5CV20mM柠檬酸钠(pH5.0)洗柱；用2CV20mM柠檬酸钠、50mM氯化钠(pH5.0)洗柱；及用3CV20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠(pH5.0)洗柱。还可用含125mM氯化钠～160mM氯化钠线性梯度的20mM柠檬酸钠(pH5.0)洗柱。在含165mM～500mM氯化钠线性梯度的20mM柠檬酸钠(pH5.0)中洗脱PRT-201，并收集于级分中。通过SDS-PAGE及考马斯染色分析级分中的蛋白质，并通过SLAP测定法分析级分中的弹性蛋白酶活性。一般而言，合并具有90％的级分或大于具有最高比活性的级分的级分。随后的LC/MS分析中，发现具有较低比活性的后期洗脱级分富集了PRT-201N-端变体。
将合并的具有高比活性的级分透析过滤到由pH5.0的0.1×PBS(13.7mM氯化钠、1mM磷酸钠、0.27mM磷酸钾)制剂缓冲液。将PRT-201浓缩到1mg/mL后，将pH调至7.4。然后将溶液等份加入具有橡胶塞的玻璃血清瓶中，并冷冻干燥。一般用-30～-50℃的第一干燥循环和-15℃的第二干燥循环进行冷冻干燥。冷冻干燥后，将瓶塞住，并用铝封束缚。然后一般在2～8℃或-80℃保存瓶。
为评价瓶中冻干的PRT-201的稳定性，制备入2批无菌GMP药品放置在稳定性程序上。稳定性程序由在-15℃保存药品，并周期性移出瓶一组瓶，用于通过如下稳定性指示分析方法测试(规格以括号括住)：冻干材料的形状(白色至灰白色粉末)，复原后形状(无颗粒的清澈、无色溶液)，通过SLAP测定的比活性(25～45U/mg)，RP-HPLC的纯度(总纯度：不小于93％；个别杂质：不多于2％)，通过还原的SDS-PAGE的纯度(不小于93％)，通过非还原的SDS-PAGE的纯度(不小于93％)，颗粒物注射(复合USP)，通过SEC-HPLC的聚集物(不多于3％)，每瓶中内容物(4.5～5.5mg)，pH(6.5～8.5)，湿度(不超过5％)及无菌(复合USP)。至今，2批在所有测试的时间点符合规定的规格(批C0807117经12个月，批C1007132经9个月)。这些结果显示，当冻干保存于-15℃瓶中时，PRT-201稳定至少12个月。
基于数据在原-PRT-201的捕获层析和转变的PRT-201的精制层析期间使用柠檬酸钠(pH5.0)，所述数据显示柠檬酸钠抑制纯化的PRT-201的弹性蛋白酶活性，及因此还可抑制加工操作期间原-PRT-201和PRT-201的弹性蛋白酶活性。所述抑制可最小化原-PRT-201至N-端变体的自发转变，及最小化PRT-201的自我降解。在SLAP测定缓冲液含115mM柠檬酸钠(pH5.0)的实验中，PRT-201的比活性被抑制91％。
有时，自原-PRT-201捕获柱的洗脱物质不如上所述经历由胰蛋白酶的转变，而用于获得富含各类蛋白制剂。例如，从捕获柱洗脱物制备主要含糖基化的原-PRT-201、非糖基化的原-PRT-201或产自自发转变的蛋白质的级分合并物。一般而言，将这些级分合并物透析过滤至10mM磷酸钠(pH5.0)中，冷冻干燥，并于-80℃保存。
进行研究以测定pH和温度对经纯化的原-PRT-201的经时稳定性的影响。将冻干的原-PRT-201复原于10mM磷酸钠溶液中(pH在3.0～8.4的范围内)，随后于4℃或25℃温育7天。7天后，原-PRT-201样品在pH4.0～8.0及25℃条件下显示出成熟的PRT-201富集，如通过SDS-PAGE和考马斯染色显示，所述成熟的PRT-201随着pH增大而增多。在pH8.4和25℃条件下，观察到原-PRT-201至成熟的PRT-201的完全转变。样品在4℃，pH4.0～8.4下显示少或无转变。于pH3.0，4℃和25℃下均观察不到转变。有文章(Hartley and Shotton,1971,Pancreatic Elastase.Enzymes3:323-373)报道，猪胰腺弹性蛋白酶在长时间保存于低于3.0的pH后不可逆地灭活。因此，基于本研究的这些结果，且为避免PRT-201的不可逆灭活，有用于最小化纯化的原-PRT-201的转变的条件是于4℃在pH3.0～4.0之间保存。
6.6实施例5：巴斯德毕赤酵母中自体活化的PRT-201的表达
为得到能够自体活化的变体原酶，由此消除胰蛋白酶活化的需要，构建了多种弹性蛋白酶切割结构域变体载体，并在小规模培养物和转变实验中分析。通过pPROT24-V载体及随后衍生载体的定点PCR诱变来产生变体载体。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)进行定点诱变。用得到的质粒转化大肠杆菌XL10-GOLD株。将转化的细胞混合物平铺于补充了25μg/mL Zeocin的低盐LB平板中。挑选药物抗性克隆，并制备质粒DNA(Qiagen,Valencia,CA)。用多重叠反应，通过多肽区中质粒DNA的两条链的测序来证实克隆中期望密码子变化。用变体载体转化巴斯德毕赤酵母，并如之前实施例所述筛选克隆。
所产生的弹性蛋白酶切割结构域变体的总结提供于下表4：
表4：弹性蛋白酶切割结构域变体
就上表4而言，第一栏“原-肽序列名”列对应于指定弹性蛋白酶切割结构域的SEQ ID NO。因此，24对应于SEQ ID NO：24的野生型胰蛋白酶切割结构域。号40～49、52～63分别对应于SEQ ID NO：40～49和52～63的变体弹性蛋白酶切割结构域。
为培养变体克隆，建立用于之前实施例中描述的胰蛋白酶活化的201-24-266-VU克隆的摇瓶培养条件一般如下。测试了将分泌到摇瓶上清中的变体原肽转变成成熟的PRT-201的几种方法。第一转变策略构成如下：首先层析纯化变体原酶，随后在特定转变缓冲液中受控切割。因为相比野生型原酶，变体原蛋白中的氨基酸变化导致仅理论等电点的小变化，一般如之前实施例中所述进行阳离子交换层析。一般如之前实施例中所述通过用水稀释或者通过浓缩接着通过使用正切流动过滤将上清透析过滤到柱装载缓冲液中来制备用于层析的自变体克隆培养物的上清。在层析纯化后，通过SDS-PAGE及考马斯染色分析洗脱级分。凝胶分析证实，相比初始上清，级分中更大量的转变的成熟蛋白至原蛋白指示，发生显著量的自发原蛋白转变。随后的纯化后，通过LC/MS测定自发转变的蛋白，主要由在SLAP测定中显示少或无弹性蛋白酶活性的N-端变体组成。
第二转变策略构成如下：在从培养物上清纯化前转变变体原蛋白，接着成熟酶的层析纯化。此转变策略先以小规模测定测试，随后扩大适于更大转变体积。就小规模转变而言，一般将经澄清的自变体克隆培养物的上清通过在超离心过滤装置中于2～8℃离心来浓缩5倍。浓缩后，用Tris缓冲液将渗余物稀释5倍至终浓度100mM的Tris-HCl(一般在8.0～9.0的pH范围内)。于室温下在摇摆台上温育样品。一般通过SLAP测定监控弹性蛋白酶活性至活性反应速度达到平台。一些情况中，反应速度缓慢增大，在达到平衡前SLAP监控停止。通过SDS-PAGE分析转变的样品中的蛋白种类(例如原蛋白和PRT-201/N-端变体)。为扩大此转变策略，使用正切流动过滤及用100mM Tris-HCl(pH6.0～9.0的范围)透析过滤来将含变体原蛋白的上清浓缩10倍。通过HIC-HPLC分析(其中定量了原蛋白、PRT-201和N-端变体种类)经时监控转变反应的进展。当透析过滤缓冲液的pH在8.0和9.0之间时，一般有更高速度的转变。
列于表5中的弹性蛋白酶原蛋白如述表达于巴斯德毕赤酵母中，且测试了它们在如上第二转变策略中所述小规模转变测定中经历自体转变的能力。这些研究的结果总结与如下表5：
原肽序列名 摇瓶产量 摇瓶稳定性 转变速度 ％N-端变体 胰蛋白酶用于加工
24 高 高 快 20％ 是
40 无 不可应用 不可应用 不可应用 否
41 中 高 慢 未检测 否
42 低 低 中 25％ 否
43 中 高 慢 未检测 否
44 中-高 高 未检测到转变 不可应用 否
45 中 高 未检测到转变 不可应用 否
46 中 高 未检测到转变 不可应用 否
47 中 高 未检测到转变 不可应用 否
48 中 低 快 15％ 否
49 高 高 慢 35％ 否
52 中 低 快 未检测 否
53 中 中 快 25％ 否
54 中 低 快 未检测 否
55 中–高 中 快 15％ 否
56 低 低 未检测 未检测 否
57 低 低 未检测 未检测 否
58 中–高 中 慢 未检测 否
59 中–高 中 慢 未检测 否
60 中–高 高 慢 未检测 否
61 无 不可应用 不可应用 不可应用 否
62 高 高 未检测到转变 不可应用 否
63 无 不可应用 不可应用 不可应用 否
表5：巴斯德毕赤酵母中弹性蛋白酶原蛋白的表达结果。
在上表5中，第一栏“原-肽序列名”列对应于指定弹性蛋白酶切割结构域的SEQ ID NO。因此，24对应于SEQ ID NO：24的野生型胰蛋白酶活化的弹性蛋白酶切割结构域。号40～49和52～63分别对应于SEQ ID NO：40～49和52～63的变体弹性蛋白酶切割结构域。标为“摇瓶产量”的栏对应于诱导过3天后培养物上清中相应原蛋白量(如通过SDS-PAGE分析测定)。标为“摇瓶稳定性”的栏对应于诱导过3天后摇瓶培养基上清中相应原蛋白量(如通过见于SDS-PAGE分析上的PRT-201/N-端变体的量来测定)。标为“转变速度”的栏对应于原蛋白至PRT-201的转变的相对速度，如通过达到最大SLAP反应速度的时间指示(快：短于60分钟；中：60～120分钟；满：久于120分钟)。使用上述小规模转变测定法测定变体原蛋白的转变时程，并与使用固定的胰蛋白酶活化测定的24种原蛋白的转变时程相比较。标为“％N-端变体”的栏是指包括成熟的弹性蛋白酶蛋白质的N-端变体的转变的蛋白质的百分比(即在任意非P1位点键C-端处含切割的变体)。为阐述用于表5的相对排序系统，用于一组自体活化的变体的SDS-PAGE，转变速度和N-端变体分析的例子示于图5。
分析各种变体表明，含SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：55变体弹性蛋白酶切割结构域的弹性蛋白酶原蛋白提供了高质量(包括：中～高摇瓶产量，和转变后低百分比的变体)的自体活化的弹性蛋白酶。进一步分析含SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：55变体弹性蛋白酶切割结构域的弹性蛋白酶原蛋白表明，相应原蛋白(即分别SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：69的弹性蛋白酶原酶)的自体活化的产生了仅一类在P’2残基肽键C-端处具有切割的N-端变体。弹性蛋白酶原蛋白的进一步分析表明，含SEQ ID NO：55变体弹性蛋白酶切割结构域的原蛋白相比含SEQ ID NO：48变体弹性蛋白酶切割结构域的弹性蛋白酶原蛋白更稳定。
使用具有42种原肽序列(SEQ ID NO：6)的原蛋白进行了初始实验，以优化用于经纯化的原-PRT-201受控切割的条件。使经纯化的原蛋白在一组条件(包括：pH(7.7～8.9)、缓冲液组成(0.4～10mM柠檬酸钠)、蛋白质浓度(0.14～0.23mg/mL)、和反应时间(5～24小时))中经历转变。在转变期末，通过加入甲酸而降低pH至3.0来抑制反应。通过质谱法测定各反应中蛋白种类的相对量。基于这些结果，导致最低N-端变体百分比的转变条件包括：pH8.3、100mMTris和小于1mM柠檬酸钠的缓冲液组成、0.2mg/mL的蛋白质浓度、和5～24小时的反应时间。此研究中，仅分析了反应终点。未获得转变质量的实时数据，最终结果可反映N-端变体的初始产生，及用于那些变体降解的时间的基本量。随后，建立HIC-HPLC测定，以使能够实时监控反应浓度。包括使用实时HIC-HPLC监控的进一步转变优化研究描述于实施例6。
6.7实施例6：巴斯德毕赤酵母中用多拷贝变体载体的自体活化 的PRT-201的表达
利用巴斯德毕赤酵母中重组基因的多拷贝整合提高期望蛋白的表达(见例如Sreekrishna et al.,1989,Biochemistry28:4117-4125；Clareet al.,1991,Bio/Technology9:455-460；Romanos et al.,1991,Vaccine9:901-906)。但在某些例子中，获自单拷贝载体整合体的表达水平有效，且不由多拷贝载体整合体提高(Cregg et al.,1987,Bio/Technology5:479-485)。巴斯德毕赤酵母中自发多拷贝质粒整合事件以低频率体内发生。为得到多拷贝基因的基因组整合，且可能提高蛋白表达，可使用体外连接方法产生表达载体内基因的串联插入子，随后转化巴斯德毕赤酵母。
未获得pPROT55-V变体的多拷贝整合体，使用体外连接方法构建了含多拷贝的pPROT55-V的载体，所述载体随后用于转化巴斯德毕赤酵母。为制备多拷贝载体，用BglII和BamHI消化pPROT55-V载体，以释放编码原-PRT-201基因、AOX1启动子和AOX1转录终止序列的2.3kb表达盒。然后将表达盒与已用BamHI线性化的pPROT55-V载体制剂连接，且用牛小肠碱性磷酸酶(New EnglandBiolabs,MA,USA)处理，以阻止自连接。于16℃过夜温育连接混合物。用连接反应物转化大肠杆菌TOP10株(Invitrogen,CA,USA)。在25μg/mL Zeocin存在下将转化混合物平铺于低盐LB上。挑选药物抗性转化体，并制备质粒DNA。
为测定所得克隆中表达盒数，用BglII和BamHI消化质粒DNA，并通过使用DNA大小标准标记物的琼脂糖凝胶电泳分析。鉴定了含一个具有与3种2.3kb表达盒一致的定义的插入子带的克隆，并命名为pPROT55M3-V。用限制酶图谱确定用于pPROT55M3-V载体的线性头尾多聚体制剂的方向。图6显示pPROT55M3-V克隆方案。
除转化前用BglII(而非SacI)线性化pPROT55M3-V载体之外，如实施例4中所述用野生型巴斯德毕赤酵母株NRRL Y-11430进行转化。如实施例4中所述培养药物抗性转化体，并就pPROT55M3原蛋白的表达进行筛选。
进行摇瓶培养条件的优化，以最小化诱导期间的自发切割。摇瓶优化着眼于2个变量，诱导温度和和诱导培养基组成。首先发现，在22℃进行诱导相比在25℃进行诱导，导致在全部所测试的培养基组成的培养物上清中更高比例的原酶至成熟酶。其次，添加柠檬酸钠，以增加诱导培养基的缓冲强度，导致在全部所测试的柠檬酸钠浓度(12.5～50mM)下，培养物上清中无自发转变的成熟酶。这些变量对经时摇瓶上清中原蛋白表达产量及稳定性的影响示于图7。
选择高表达的3拷贝克隆201-55M3-003-VU用于使用如下所述针对201-55-001-VU克隆的发酵程序进行扩大发酵分析。通过解冻1种细胞库瓶，并用其接种含500ml BKGY生长培养基(pH5.7)的摇瓶中来进行201-55-001-VU克隆的发酵。将接种培养物于28℃摇动下生长24小时至湿细胞重量约40g/L。在高压灭菌器中灭菌含BKGY生长培养基(pH5.7)的发酵罐。在培养基冷却至28℃后，添加包括酵母氮源和生物素的补充物。以1:33比例的接种培养物与BKGY生长培养基接种发酵罐。
发酵程序始于甘油流加培养，且于pH5.7、28℃下补加甘油。通过10％磷酸和30％硫酸铵溶液控制pH。换气以控制40％溶氧下以300～1000rpm搅拌培养物。在初始批甘油耗尽且溶氧达到峰值(spiked)后，表明系统中甘油耗尽，以131g/小时补加额外的50％甘油至湿细胞重量优选达到200g/L～300g/L之间。湿细胞重量达到200g/L～300g/L之后，随即用0.025mL甲醇团/g湿生物质起始诱导。在甲醇耗尽及溶氧升高后，通过以0.0034g甲醇/g湿细胞重量/小时的恒定补加速度加入有限量的甲醇来继续诱导。恒定甲醇补加开始时，发酵肉汤的pH从5.7变到5.5，温度从28℃变到22℃。诱导70小时后收获发酵物。
为测定单拷贝克隆和3拷贝克隆相对产量，将含一个单拷贝pPROT55-V载体的基因组整合体的克隆201-55-001-VU与含一个3拷贝pPROT55M3-V载体的基因组整合体的克隆201-55M3-003-VU平行发酵。除培养物pH始终维持在5.7之外，如上所述进行发酵。通过梯度SDS-PAGE及随后的胶体蓝染色分析收获自201-55-001-VU和201-55M3-003-VU发酵物的上清(图8)，其显示，相比单拷贝201-55-001-VU克隆，从多拷贝201-55M3-003-VU克隆得到更高原蛋白表达。用发酵物上清中的原蛋白浓度的HIC-HPLC分析来证实SDS-PAGE结果，显示201-55M3-003-VU克隆产生约600mg/L分泌出的原蛋白，而201-55-001-VU克隆产生约400mg/L。因此，相比含1个表达盒的201-55-001-VU克隆，含3个表达盒的多拷贝201-55M3-003-VU克隆产生多出约50％的原蛋白。
用产生自发酵物的201-55M3-003-VU上清测试了2个转变策略。除以更大规模进行外，这些策略一般遵从实施例5中描述用于其它原蛋白变体的策略。在第一此略中，通过阳离子交换层析从上清中捕获原蛋白，随后将其转变成成熟蛋白，并经精制层析。在第二策略中，纯化前将原蛋白转变成成熟蛋白，之后用阳离子交换层析捕获，延长转变，以除去N-端变体，并进一步经精制层析。2种策略也包括转变后于pH8.0的缓冲液中延长的温育步骤，以实现N-端变体的选择性降解。
使用第一策略，如下实现捕获原蛋白之后转变和PRT-201精制纯化。从发酵培养物中收获201-55M3-003-VU上清，并于-80℃冷冻。将约7L冷冻澄清的上清(自上述201-55M3-003-VU发酵物的3.5L和自一般如实施例4和5中所述制备的201-55M3-003-VU摇瓶培养物的3.5L)解冻，并于2～8℃用去离子水和1M柠檬酸钠(pH4.3)稀释8倍，以获得25mM柠檬酸钠的终浓度。将溶液pH调至4.7。将溶液于2～8℃以76cm/小时装载于2.3L床Macroprep High S阳离子交换柱上。用5CV的25mM柠檬酸钠(pH4.7)、之后5CV的160mM氯化钠、25mM柠檬酸钠(pH4.7)洗柱。用15CV的线性梯度(在25mM柠檬酸钠(pH4.7)中始于160mM氯化钠到500mM氯化钠)以87ml/分钟(67cm/小时)洗脱原蛋白。洗脱物收集于级分中。通过SDS-PAGE分析级分中的蛋白质含量(图9)。通过SDS-PAGE观察了少量自发转变的蛋白质。合并含原蛋白的级分，用于进一步加工。使合并的物质经历HIC-HPLC分析，所述分析显示，所述合并的物质由92％原蛋白和8％成熟的PRT-201组成。
为起始转变，合并的物质用在10～12℃恒定体积透析过滤而正切流动过滤入100mM氯化钠、20mM Tris(pH4.0)而经缓冲液交换。用纤维素膜、15psi的转膜压、20L/分钟的交叉流速度及800mL/分钟的流量再生正切流动过滤。将3个透析体积的2～8℃的缓冲液以与流量相同的速度加入。随后，将3个额外体积的环境温度的缓冲液以与流量相同的速度加入，以升高转变溶液温度至目标26℃。使用正切流动过滤浓缩转变溶液至目标1.5mg/mL，所使用的条件是：15psi转膜压、1.2L/分钟交叉流速度和76ml/分钟流量。但在开始浓缩过程约2分钟后，观察到不希望的沉淀，停止了浓缩过程。通过280nm处的UV吸光度测定570mL体积中转变溶液的蛋白质浓度为1.1mg/mL。为最小化进一步沉淀，将转变溶液用100mM氯化钠、20mM Tris(pH4.0)透析至1mg/mL，并过滤通过0.22μm膜。将16mL3M Tris(pH9.0)加入转变溶液。将转变溶液放入26℃水浴中。通过HIC-HPLC分析监控转变反应。30分钟后，HIC-HPLC显示，大部分原蛋白已转变成PRT-201及一些N-端变体(图10)。1小时后，转变反应由0％原蛋白、86％全长PRT-201和14％N-端变体组成。将转变物质再温育4个小时，届时HIC-HPLC分析显示，转变物质由98％全长PRT-201和2％N-端变体组成。
用去离子水和1M柠檬酸钠(pH4.3)将转变物质稀释4倍至25mM柠檬酸钠的终浓度。在用于装载于精制层析柱上的制剂中将溶液pH调至5.0。将溶液以27mL/分钟(83cm/小时)装载于600mL床Macroprep High S阳离子交换柱上。用5CV的20mM柠檬酸钠(pH5.0)、之后5CV的160mM氯化钠、20mM柠檬酸钠(pH5.0)洗柱。用15CV的线性梯度(在25mM柠檬酸钠(pH5.0)中始于160mM氯化钠到500mM氯化钠)以87ml/分钟(67cm/小时)洗脱PRT-201。洗脱物收集于级分中。通过SDS-PAGE分析级分中的蛋白质含量，并通过SLAP测定分析了比活性。合并含比活性≥30U/mg的PRT-201的级分。通过正切流动过滤将合并的PRT-201级分透析过滤入制剂缓冲液(0.1×PBS，pH5.0)。将透析过滤的PRT-201的pH调至pH7.4，并通过正切流动过滤将蛋白质浓度调至1mg/mL。将瓶填充，并如实施例4中从201-24-266-VU克隆产生PRT-201所述进行冻干。
使用第二策略，如下实现原蛋白转变之后PRT-201纯化。将约7L冷冻澄清的自上述201-55M3-003-VU发酵物的上清解冻，且通过正切流动过滤用含100mM Tris(pH8.0)，使用于环境温度下的用再生的纤维素膜的恒定体积透析过滤起始转变反应。2个透析体积的100mM Tris-HCl(pH8.0)足以将渗余物的pH从pH5.0改变至pH8.0，并实现转变。还通过直接将澄清的上清的pH通过加入Tris碱至100mM的终浓度，及用1N氢氧化钠将pH调至8.0来调至8.0来进行实验。这导致沉淀形成及浑浊的上清，可能由于两种成分的沉淀，这是不希望的。使用正切流动过滤的优选转变方法不导致沉淀。
通过实时HIC-HPLC分析监控转变反应。在起始转变后，经头2个小时，原-PRT-201缓慢转变成成熟的PRT-201，之后转变加速(图11)。4.5小时时，转变反应由约4％原-PRT-201、75％成熟的PRT-201和21％N-端变体组成。6.5小时时，转变反应由约1％原-PRT-201、83％成熟的PRT-201和16％N-端变体组成。N-端变体从4.5小时时至6.5小时时从21％减少至16％，或许是由于N-端变体被全长、有活性的PRT-201降解，但这不完全，且不如在经纯化的原-PRT-201转变期间观察到的N-端变体减少快。在此第二策略中，延长转变反应可能由于上清中的竞争蛋白(其竞争弹性蛋白酶的活性位点)而不能完全除去N-端变体。为改善转变反应，捕获转变后物质，并随后透析过滤入合适的缓冲液中，以如下所述在pH8.0起始延长的转变用于N-端变体的选择性降解。
如下实现从转变物质的PRT-201捕获。转变物质经缓冲液更换至20mM柠檬酸钠(pH5.0)，并装载于Macro-prep High S阳离子交换层析柱上。用5CV的20mM柠檬酸钠(pH5.0)、之后5CV的20mM柠檬酸钠、160mM氯化钠(pH5.0)洗柱。用线性梯度(在20mM柠檬酸钠(pH5.0)中始于160mM到500mM氯化钠)洗脱PRT-201。通过SDS-PAGE分析级分中的蛋白质含量，通过HIC-HPLC分析N-端变体，通过280nm处的UV吸光度分析蛋白质浓度，及通过SLAP测定分析了弹性蛋白酶活性。如图12所示，通过SDS-PAGE检测到2个主要的蛋白条带，对应于PRT-201和PRT-201糖型。从合并物中排除含如通过SDS-PAGE测定的PRT-201糖型或如通过HIC-HPLC测定的N-端变体的级分。如通过SLAP测定的表现出相对低的比活性(小于30U/mg)的级分也从合并物中排除。合并剩下的含PRT-201的级分，用于进一步加工。合并的级分的HIC-HPLC分析显示，此物质由约98％全长PRT-201和1～2％N-端变体组成。将合并的物质于2～8℃保存12～16小时。
目前观察已知，N-端变体经如上所述的延长的转变期表现出降低，使合并的PRT-201物质于pH8.0经历延长的温育步骤。通过透析过滤及于环境温度下用100mM Tris、300mM氯化钠(pH8.0)正切流动过滤2.5小时来进行延长的温育。2.5小时后，如HIC-HPLC分析显示，转变物质由100％成熟的PRT-201组成。使转变物质经历透析过滤及正切流动过滤入20mM柠檬酸钠(pH5.0)中，以抑制弹性蛋白酶活性，及制备用于柱层析。将经透析过滤的PRT-201物质于2～8℃保存约64小时。
如下实现PRT-201的精制层析纯化。将经透析过滤的PRT-201物质装载于Macro-prep High S阳离子交换柱上，并用5CV的缓冲液C(20mM柠檬酸钠，pH5.0)、之后5CV的160mM氯化钠、20mM柠檬酸钠(pH5.0)洗柱。用15CV的线性梯度(始于68％缓冲液C和32％缓冲液D(160mM氯化钠、25mM柠檬酸钠，pH5.0)至0％缓冲液C和100％缓冲液D(500mM氯化钠、25mM柠檬酸钠，pH5.0))以50ml/分钟(153cm/小时)进行PRT-201的洗脱。将洗脱物收集于级分中。PRT-201在37mS/cm(330mM氯化钠)洗脱为对称峰。通过SDS-PAGE分析级分中的蛋白质含量，通过280nm处的UV吸光度分析蛋白质浓度，及通过SLAP测定分析了比活性。合并了含具有30.1～38.8U/mg的比活性的PRT-201的级分。将合并的PRT-201级分通过正切流动过滤透析过滤入制剂缓冲液(0.1×PBS，pH5.0)中。将经透析过滤的PRT-201的pH调至pH7.4，并通过正切流动过滤将蛋白质浓度调至1mg/mL。将瓶填充，并如实施例4中从201-24-266-VU克隆产生PRT-201所述进行冻干。
基于检查蛋白质浓度、温度、缓冲液组成、透析体积和pH变量的转变优化研究选择上述转变过程的条件。第一研究中，分析了转变期间原蛋白浓度对N-端变体产生的影响。将20mM磷酸钠(pH5.0)中初始浓度0.2mg/mL的纯化自201-55M3-003-VU克隆(原-PRT-201-55M3-003-VU)的原-PRT-201等分，并用离心浓缩装置浓缩至1.0、1.6和1.8mg/mL(如通过280nm处的UV吸光度测定)。通过加入Tris和氯化钠至4种浓度样品各100mM，将pH从5.0调至8.0，及于环境温度下温育样品来实现原蛋白转变。通过HIC-HPLC实时监控转变反应至原蛋白占总蛋白的≤1％(图13)。在此终点，0.2mg/mL样品由约8％N-端变体组成，而1.0mg/mL、1.6mg/mL和2.0mg/mL样品分别由约14％、19％和29％N-端变体组成。各样品中剩下的蛋白质由全长PRT-201组成。这些结果证实，转变期间升高浓度的原-PRT-201-55-003-VU导致更多N-端变体和更少全长PRT-201的形成。其他研究提示，原-PRT-201-55M3-003-VU转变通过分子内和分子间反应发生。因此，就此变体原蛋白而言，分子内反应(更稀释的原蛋白溶液中偏好)产生更准确的转变，而分子间反应(更浓缩的原蛋白溶液中偏好)导致更少的准确转变(即相对于全长PRT-201，形成更高百分比的N-端变体)是可能的。
在第二研究中，分析了转变期间温度对N-端变体产生的影响。使以1.6mg/mL的浓度产生的纯化自201-55M3-VU克隆的原-PRT-201(称为原-PRT-201-55M3-003-VU)于15℃或26℃如上所述经历转变。通过HIC-HPLC实时监控转变反应，且使所述转变反应进行至原蛋白占总蛋白的<1％。达到此原蛋白减少所需时间在26℃为约30分钟，在15℃为约90分钟。在这些时间中，两种温度下均观察到相近的N-端变体百分比(总蛋白的约20％)因此，当产生基本一致的反应产物特征谱时，相比更低温度15℃，更高温度26℃导致更快速的转变反应。
第三研究检查了转变期间缓冲液组成对原蛋白可溶性的影响。使经纯化的浓度1.0mg/mL的原-PRT-201(原-PRT-201-55M3-003-VU)在表6列出的条件下经历转变。除一例(缓冲液组成：20mM Tris-HCl，100mM氯化钠，pH4.0)中于2～8℃进行外，转变反应在环境温度下进行。肉眼观察转变反应中的沉淀。如表6所示，不导致沉淀的缓冲液组成包括：100mM Tris-HCl，pH8.0；100mM Tris-HCl，100mM氯化钠，pH5.0；和100mM Tris-HCl，300mM氯化钠，pH8.0。于较低pH(如pH5.0)下含较低浓度Tris或无氯化钠的缓冲液组成显示出沉淀。
缓冲液组成 温度 观察的沉淀 可溶性(未观察到沉淀)
1mM Tris-HCl，pH5.0 环境温度 +
25mM Tris-HCl，pH5.0 环境温度 +
100mM Tris-HCl，pH5.0 环境温度 +
100mM Tris-HCl，pH8.0 环境温度 +
20mM Tris-HCl，100mM氯化钠，pH4.0 2～8℃ +
100mM Tris-HCl，100mM氯化钠，pH5.0 环境温度 +
100mM Tris-HCl，300mM氯化钠，pH8.0 环境温度 +
表6：转变期间缓冲液组成对沉淀的影响
在第四研究中，分析了含原蛋白(原-PRT-201-55M3-003-VU)的上清转变期间正切流动过滤透析体积数对沉淀的影响。用于缓冲液更换的溶液是100mM Tris-HCl、100mM氯化钠(pH8.0)。此外，测试了不正切流动过滤而直接将上清pH从pH5.0调至pH8.0。如表7所示，上清的直接pH调节导致大量沉淀。1个透析体积的更换观察到一些沉淀。当使用2～5个透析体积时未观察到沉淀。
透析体积 观察的沉淀
0 大部分沉淀
1 小部分沉淀
2 无沉淀
3 无沉淀
5 无沉淀
表7：缓冲液交换期间透析体积数对沉淀的影响
第五研究中，分析了pH对成熟的PRT-201的弹性蛋白酶活性的影响。此研究设计为鉴定对转变有用的pH范围，所述pH范围不会导致成熟的PRT-201转变产物的弹性蛋白酶活性的不可逆损失。制备了20mM Tris-HCl、20mM磷酸钠中的1mg/mL PRT-201溶液(pH1～14)。将溶液保持在环境温度0.5、2、24和48小时。在指定的时间点，在SLAP测定中测试了溶液的弹性蛋白酶活性。弹性蛋白酶活性在全部时间点、pH3～8普遍稳定。在pH小于3和大于8时，在全部时间点，弹性蛋白酶活性降低，更长的时间点和更低的弹性蛋白酶活性相关联。这些结果表明，在3～8的pH范围外进行的转变反应可对PRT-201转变产物的弹性蛋白酶活性有负面影响。
6.8实施例7：自体活化的重组猪I型胰腺弹性蛋白酶的产生
将编码自体活化的猪ELA-1原酶的载体在巴斯德毕赤酵母中表达。将产生的自体活化的猪ELA-1与表达为胰蛋白酶活化的野生型原蛋白的猪ELA-1蛋白质相比较。
为构建胰蛋白酶活化的猪ELA-1载体，通过Blue HeronBiotechnology(Bothell,WA)用获Amgen(Thousand Oaks,CA)授权的非PCR“长寡”技术合成猪ELA-1编码区。将重组基因克隆入BlueHeron pUC载体，其为pUC119的衍生物。对猪ELA-1基因的两条链测序，以确认正确的序列。如图14所示，将SacII和Xbal限制性位点并入作为潜在的克隆位点，其位于猪ELA-1基因侧翼。在天然终止密码子后随即加入第二终止密码子，以最小化潜在的核糖体连读。图15显示猪ELA-1原酶的天然一致的氨基酸序列，其含胰蛋白酶活化位点。
通过PCR使用一对含XhoI和SacII位点(以辅助克隆)的寡核苷酸扩增猪ELA-1的编码区。用XhoI和SacII消化PCR产物，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将猪ELA-1片段在XhoI和SacII限制性位点克隆入PV-1载体。用连接混合物转化大肠杆菌TOP10株。将细胞混合物平铺于补充了25mg/mL Zeocin的低盐LB平板上。挑选药物抗性克隆，并制备质粒DNA(Qiagen,CA)。基于限制性分析，鉴定含猪ELA-1基因插入物的克隆，并将载体命名为pPROT101-24-V。通过DNA测序确认此载体的编码序列。pPROT101-24-V的克隆方案描绘于图16。
使用胰蛋白酶活化的pPROT101-24-V载体，通过将猪ELA-1的原肽区中的胰蛋白酶切割位点改变为弹性蛋白酶切割位点来工程改造3种不同的自体活化的克隆。一般如实施例4中所述使用合成的含表8所述的期望突变的寡核苷酸引物来进行定点诱变。通过双链DNA测序确认原肽区中的全部突变。
表8：胰蛋白酶活化的和自体活化的猪ELA-1载体的切割结构域序列。突变的密码子添加底部阴影。切割键在P1和P’1之间。
转化野生型NRRL Y-11430巴斯德毕赤酵母株，培养药物抗性转化体，并如实施例3中所述就猪ELA-1原蛋白的表达进行筛选。基于通过SDS-PAGE及考马斯染色分析(见图17和图18)，相比自体活化的克隆，野生型胰蛋白酶活化的pPROT101-24-V克隆具有最高水平的表达。自体活化的克隆中，pPROT101-49-V克隆具有最高水平的表达，之后是pPROT101-55L-V克隆及pPROT101-49-V克隆。自体活化的pPROT101-42-V和pPROT101-55L-V原蛋白在诱导期间表现出基本上自发的转变，而胰蛋白酶活化的pPROT101-24-V和自体活化的pPROT101-49-V原蛋白在诱导培养基中显示出更高的稳定性。
对通过由表达自pPROT101-24-V的原弹性蛋白酶蛋白质的胰蛋白酶活化产生的PRT-102的弹性蛋白酶活性研究显示如表9所示的比PRT-201更高的比活性：
表9：相比成熟的人I型胰腺弹性蛋白酶，成熟的猪I型胰腺弹性蛋白酶(胰蛋白酶活化的)的3种不同样品的弹性蛋白酶活性。
用小规模转变实验确定pPROT101-55L-V和pPROT101-49-V原蛋白是否可转变为表现出弹性蛋白酶活性的成熟酶。用离心过滤单元将pPROT101-55L-V和pPROT101-49-V摇瓶上清浓缩10倍，并用100mM Tris-HCl(pH9.0)稀释5倍。使于室温下进行转变，并通过SLAP测定经时监控弹性蛋白酶活性。由各时间点测定每分钟吸光度的平均变化，并以非标准化反应速度报告(图19)。pPROT101-49-V和pPROT101-55L-V上清二者的转变导致弹性蛋白酶活性升高。将自各克隆的末时间点样品通过SDS-PAGE及考马斯染色分析，并与转变前样品比较(图20)。SDS-PAGE结果证实，到转变测定末，几乎全部pPROT101-49-V原蛋白转变成成熟蛋白。SDS-PAGE结果还显示，转变测定前，几乎全部pPROT101-55L-V已自发转变为成熟蛋白。
将pPROT101-24-V和pPROT101-49-V原蛋白与成熟酶的经纯化制剂交付于Danforth Plant Science Center,MO，分析完整分子量。通过阳离子交换层析(Macroprep High S,Bio-Rad)纯化原蛋白。就成熟酶分析而言，将自两种克隆的原蛋白首先处理至产生成熟酶，再通过阳离子交换层析纯化。用胰蛋白酶处理胰蛋白酶活化的原蛋白，同时在100mM Tris-HCl(pH9.0)存在下进行转变，之后进行阳离子交换层析。获自质谱分析的主峰值列于表10。
蛋白质 期望的MW 观察到的MW
胰蛋白酶活化的pPROT101-24-V原蛋白 27068 27064
胰蛋白酶活化的pPROT101-24-V成熟酶 25908 25898
自体活化的pPROT101-49-V原蛋白 27049 27047
自体活化的pPROT101-49-V成熟酶 25908 25910
表10：猪ELA-1蛋白的期望的和观察到的分子量。
SDS-PAGE、弹性蛋白酶活性和质谱结果证实，可通过工程改造原蛋白序列(用弹性蛋白酶切割位点置换胰蛋白酶切割位点)来产生自体活化形式的I型猪胰腺弹性蛋白酶。这些自体活化形式的I型猪胰腺弹性蛋白酶的表达水平低于野生型胰蛋白酶活化形式。在测试的自体活化的克隆中，具有pPROT101-49-V原肽序列的那些现实最高水平表达及最少的自发转变。pPROT101-49-V和pPROT101-55L-V克隆的转变导致具有实质弹性蛋白酶活性的成熟蛋白。质谱分析显示，pPROT101-49-V原蛋白和成熟的猪I型的分子量对应于期望质量。
6.9实施例8：通过benz比色肽底物测定对成熟的重组人弹性蛋 白酶-1的胰蛋白酶活性分析
进行使用小肽底物N-苯甲酰基-Phe-Val-Arg-对硝基苯胺(BENZ)的比色水解测定，以确定产生自自体活化的克隆201-55M3-003-VU的成熟的弹性蛋白酶蛋白质是否具有胰蛋白酶活性。将这些冻干的纯化自克隆201-55M3-003-VU的PRT-201的瓶从-80℃保存中回收，并用水复原，以得到0.1×PBS(pH7.4)中的1mg/mL PRT-201。通过测量280nm处的UV吸光度来确定蛋白质浓度。使用TrypZean储存溶液(10mg/mL)制得胰蛋白酶活性的标准曲线。包括之前测试的胰蛋白酶活化的PRT-201样品作为阳性对照。此外，向一些实验和对照样品外加(spike)TrypZean，以测定PRT-201存在下胰蛋白酶活性的恢复。用大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)处理经外加的(spiked)和未经外加的(unspiked)样品，以测定SBTI抑制任何固有的或外加的(spiked)胰蛋白酶活性的能力。还用SBTI处理TrypZean标准物，以确认抑制剂的有效性。见下表11，其中总结了包括于本研究中的样品。
表11：用测定缓冲液(0.1M Tris，pH8.3)制备用于标准曲线的TrypZean稀释液。TrypZean溶液的标准曲线适于图21。
制备底物溶液(0.1M Tris中的0.4mg/mL N-苯甲酰基-Phe-Val-Arg-对硝基苯胺Lot7733，pH8.3)，并于水浴中预加温至30℃。将100μl各样品一式三份移液于96孔微平板中。用多道移液器将200μl底物溶液移液于各孔中，并将微平板随即放置于预热至30℃的微平板读取仪中。微平板读取仪每分钟记录一次各孔的405nm处的吸光度，持续60分钟。
还在SLAP测定中测试PRT-201样品的弹性蛋白酶活性。制备SLAP底物溶液(0.1M Tris中的4.5mg/mL SLAP，pH8.3)，并于水浴中预加温至30℃。用水将1mg/mL PRT-201样品稀释20倍至0.05mg/mL。将10各样品稀释液一式三份移液于96孔微平板中。用多道移液器将300μl SLAP底物溶液移液于各孔中，并将微平板随即放置于预热至30℃的微平板读取仪中。微平板读取仪每分钟记录一次各孔的405nm处的吸光度，持续5分钟。
BENZ和SLAP活性测定结果分别显示于下表12和13。
表12：平均胰蛋白酶活性报告为等效TrypZean浓度(ng/mL)。[a]回归系数<0.8。
描述 未添加
自克隆55M3Vial#1的PRT-201 34.9
自克隆55M3Vial#2的PRT-201 36.6
自克隆55M3Vial#3的PRT-201 35.7
自胰蛋白酶活化的克隆的PRT-201 32.1
表13：平均SLAP活性，报告为U/mg。
自克隆201-55M3-003-VU的PRT-201的胰蛋白酶活性水平在胰蛋白酶活性测定中在标准曲线范围下(<1.56ng/mL)。此外，三次重复的水解反应的回归系数差(<0.8)还支持在此自体活化的成熟的弹性蛋白酶蛋白质中胰蛋白酶活性的缺乏。相反，对照胰蛋白酶活化样品的胰蛋白酶活性水平被测定为8.7ng/mL。
7.序列表
8.具体实施方式，参考文献的引用
本发明由以下特定实施方式所例示。
1.蛋白质，其含：
(i)含弹性蛋白酶识别序列的弹性蛋白酶活化序列，其可操作连接于
(ii)成熟的弹性蛋白酶的氨基酸序列。
2.实施方式1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：11。
3.实施方式1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：12。
4.实施方式1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：13。
5.实施方式1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：93。
6.实施方式1、实施方式2或实施方式4的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含下列中的任一个：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21。
7.实施方式1的蛋白质，其中所述活化序列含SEQ ID NO：80。
8.实施方式1或实施方式7的蛋白质，其中所述活化序列含SEQID NO：23、SEQ ID NO：72、或SEQ ID NO：73。
9.实施方式1的蛋白质，其中所述蛋白质含切割结构域，所述切割结构域含SEQ ID NO：74。
10.实施方式1或实施方式9的蛋白质，其中所述切割结构域含下列中的任一个：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。
11.实施方式1～5和7中任一项的蛋白质，其含SEQ ID NO：64。
12.实施方式1～5和7中任一项的蛋白质，其含SEQ ID NO：69。
13.I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含SEQ ID NO：74的切割结构域序列。
14.实施方式13的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述切割结构域含下列中的任一个：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：55。
15.实施方式13或实施方式14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述成熟的弹性蛋白酶序列含与SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位(例如根据本文中的弹性蛋白酶氨基酸标识的P5’残基的C-端)至末端的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的序列。
16.实施方式13或实施方式14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含与SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位(例如根据本文中的弹性蛋白酶氨基酸标识的P5’残基的C-端)至末端的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。
17.实施方式13或实施方式14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含与SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位至末端的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的序列。
18.实施方式13或实施方式14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述成熟的弹性蛋白酶含相对SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位至末端的氨基酸序列具有至10个连续氨基酸变化的序列。
19.实施方式13或实施方式14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含相对SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位至末端的氨基酸序列具有至7个连续氨基酸变化的序列。
20.实施方式13或实施方式14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含相对SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位至末端的氨基酸序列具有至5个连续氨基酸变化的序列。
21.实施方式13～20中任一项的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述SEQ ID NO：74中被记为“Xaa1”的氨基酸残基是谷氨酸或组氨酸。
22.实施方式13～21中任一项的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述SEQ ID NO：74中被记为“Xaa4”的氨基酸残基是脯氨酸。
23.实施方式13～22中任一项的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述SEQ ID NO：74中被记为“Xaa5”的氨基酸残基是丙氨酸。
24.实施方式13～23中任一项的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述SEQ ID NO：74中被记为“Xaa1”的氨基酸残基是组氨酸，SEQ IDNO：74中被记为“Xaa4”的氨基酸残基是脯氨酸，SEQ ID NO：74中被记为“Xaa5”的氨基酸残基是丙氨酸。
25.实施方式13～24中任一项的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含SEQ ID NO：103的氨基酸序列。
26.实施方式25的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。
27.实施方式25的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含SEQ ID NO：69的氨基酸序列。
28.实施方式1～27中任一项的蛋白质，其是分离出的。
29.实施方式1～27中任一项的蛋白质，其含信号序列。
30.蛋白质，其含：
(i)信号序列；
(ii)含弹性蛋白酶识别序列的弹性蛋白酶活化序列；和
(iii)成熟的弹性蛋白酶的氨基酸序列。
31.实施方式30的蛋白质，其中所述信号序列在巴斯德比赤酵母中可操作。
32.实施方式30的蛋白质，其中所述信号序列是酵母α-因子信号肽。
33.实施方式32的蛋白质，其中所述酵母α-因子信号肽含SEQ IDNO：34的氨基酸序列。
34.实施方式30的蛋白质，其中所述信号序列是哺乳动物分泌信号序列。
35.实施方式34的蛋白质，其中所述哺乳动物分泌信号序列是猪I型弹性蛋白酶信号序列。
36.实施方式34的蛋白质，其中所述哺乳动物分泌信号序列是人I型弹性蛋白酶信号序列。
37.实施方式1或实施方式30的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列是I型人弹性蛋白酶识别序列。
38.实施方式1或实施方式30的蛋白质，其中所述成熟的弹性蛋白酶是人I型弹性蛋白酶。
39.实施方式1或实施方式30的蛋白质，其中所述成熟的弹性蛋白酶是猪I型弹性蛋白酶。
40.核酸，其编码实施方式1～39中任一项的蛋白质。
41.核酸分子，其含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质含：
(i)含弹性蛋白酶识别序列的活化序列，其可操作连接于
(ii)弹性蛋白酶的氨基酸序列。
42.实施方式41的核酸分子，其中所述蛋白质还含可操作连接到所述活化序列的信号序列。
43.实施方式41或实施方式42的核酸分子，其中所述信号序列在巴斯德毕赤酵母中可操作。
44.实施方式41～43中任一项的核酸，其中所述弹性蛋白酶识别序列是I型弹性蛋白酶识别序列。
45.实施方式41～44中任一项的核酸，其中所述弹性蛋白酶识别序列是I型人弹性蛋白酶识别序列。
46.实施方式41～45中任一项的核酸分子，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ ID NO：11。
47.实施方式41～45中任一项的核酸分子，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ ID NO：12。
48.实施方式41～45中任一项的核酸分子，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ ID NO：13。
49.实施方式41～45中任一项的核酸分子，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ ID NO：93。
50.实施方式41～46和48中任一项的核酸分子，其中所述弹性蛋白酶识别序列含下列中的任一个：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21。
51.实施方式41～50中任一项的核酸分子，其中所述活化序列含SEQ ID NO：80。
52.实施方式41～45和51中任一项的核酸分子，其中所述活化序列含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：72、或SEQ ID NO：73。
53.实施方式41～46中任一项的核酸分子，其中所述蛋白质含切割结构域，所述切割结构域含SEQ ID NO：74。
54.实施方式41～46和53中任一项的核酸分子，其中所述切割结构域含下列中的任一个：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。
55.实施方式41～54中任一项的核酸，其中所述弹性蛋白酶是成熟的人I型弹性蛋白酶。
56.实施方式41～54中任一项的核酸，其中所述弹性蛋白酶是成熟的猪I型弹性蛋白酶。
57.实施方式41～54中任一项的核酸，其中所述弹性蛋白酶含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：87、和SEQ ID NO：39中任一氨基酸序列。
58.实施方式57的核酸，其中所述弹性蛋白酶含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
59.实施方式42～58中任一项的核酸分子，其中所述信号序列是酵母α-因子信号肽。
60.实施方式59的核酸分子，其中所述蛋白质含SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97中任一氨基酸序列。
61.实施方式42和44～58中任一项的核酸分子，其中所述信号序列是哺乳动物分泌信号序列。
62.实施方式61的核酸分子，其中所述哺乳动物分泌信号序列是猪I型弹性蛋白酶信号序列。
63.实施方式61的核酸分子，其中所述哺乳动物分泌信号序列是人I型弹性蛋白酶信号序列。
64.实施方式41～63中任一项的核酸分子，其中所述蛋白质含SEQ ID NO：88～91和98～103中任一氨基酸序列。
65.实施方式64的核酸分子，其中所述蛋白质含SEQ ID NO：6～9和64～69中任一氨基酸序列。
66.实施方式64的核酸分子，其中所述蛋白质含表2所示弹性蛋白酶多态性的组合中的任一个。
67.实施方式64的核酸分子，其中所述蛋白质含表3所示弹性蛋白酶多态性的组合中的任一个。
68.蛋白质，其由实施方式41～67中任一项的核酸分子编码。
69.实施方式68的蛋白质，其是分离出的。
70.载体，其含实施方式41～67中任一项的核酸分子。
71.实施方式70的载体，其还含控制基因表达的核苷酸序列，其被可操作连接到编码所述蛋白质的核苷酸序列。
72.实施方式70或实施方式71的载体，其中编码所述蛋白质的所述核苷酸序列经多聚化。
73.宿主细胞，其含实施方式70～72中任一项的载体。
74.实施方式73的宿主细胞，其中至少1个拷贝的所述载体被整合入所述宿主细胞基因组。
75.实施方式74的宿主细胞，其中1个拷贝的所述载体被整合入所述宿主细胞基因组。
76.实施方式74的宿主细胞，其中2～5个拷贝的所述载体被整合入所述宿主细胞基因组。
77.实施方式74或76的宿主细胞，其中2个拷贝的所述载体被整合入所述宿主细胞基因组。
78.实施方式74或76的宿主细胞，其中3个拷贝的所述载体被整合入所述宿主细胞基因组。
79.宿主细胞，其含至少1个拷贝的被整合入其基因组的实施方式41～67中任一项的核酸分子。
80.实施方式79的宿主细胞，其中1个拷贝的所述核酸分子被整合入其基因组。
81.实施方式79的宿主细胞，其中2～5个拷贝的所述核酸分子被整合入其基因组。
82.实施方式79的宿主细胞，其中2个拷贝的所述核酸分子被整合入其基因组。
83.实施方式79的宿主细胞，其中3个拷贝的所述核酸分子被整合入其基因组。
84.细胞，其经基因工程改造而表达实施方式41～67中任一项的核酸分子。
85.实施方式84的细胞，其中所述核苷酸序列被可操作连接于可被甲醇诱导的启动子。
86.巴斯德毕赤酵母细胞，其经基因工程改造而表达实施方式41～67中任一项的核苷酸序列。
87.实施方式87的巴斯德毕赤酵母，其中所述核苷酸序列被可操作连接于可被甲醇诱导的启动子。
88.细胞培养物上清，其含实施方式1～27中任一项或实施方式68的蛋白质。
89.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在蛋白产生的条件下培养实施方式84的宿主细胞。
90.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在蛋白产生的条件下培养实施方式85的宿主细胞。
91.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在蛋白产生的条件下培养实施方式86的宿主细胞。
92.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在蛋白产生的条件下培养实施方式87的宿主细胞。
93.实施方式91或实施方式92的方法，其中所述条件包括在pH2～6下生长或诱导的时期。
94.实施方式91或实施方式92的方法，其中所述条件包括在22℃～28℃的温度下生长或诱导的时期。
95.实施方式89～92中任一项的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
96.实施方式95的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
97.实施方式89～96中任一项的方法，其中所述宿主细胞在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
98.实施方式97的方法，其中所述柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
99.实施方式97或实施方式98的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
100.实施方式97或实施方式98的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
101.实施方式89～100中任一项的方法，还包括回收所述蛋白质。
102.实施方式95的方法，其中所述蛋白质通过回收所述上清来回收。
103.实施方式95的方法，其中所述蛋白质从所述上清中回收。
104.实施方式95～104中任一项的方法，其中所述回收的蛋白质缺少信号序列。
105.实施方式95～104中任一项的方法，其中所述回收的蛋白质缺少信号序列和活化序列。
106.实施方式89～92和93～105中任一项的方法，还包括：将含所述蛋白质的溶液的pH升高至6～12。
107.实施方式89～92和93～106中任一项的方法，其还包括：使所述蛋白与催化量的弹性蛋白酶接触。
108.实施方式89～92和93～106中任一项的方法，其还包括：
使所述蛋白质经受自体活化条件；
使所述蛋白质与催化量的弹性蛋白酶接触，
或两者兼有。
109.实施方式108的方法，其中所述蛋白质经受自体活化条件。
110.实施方式109的方法，其中所述蛋白质在经受自体活化条件时在所述上清中。
111.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：
(a)在第一柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养能够表达重组原弹性蛋白酶蛋白质的宿主细胞。
(b)从所述宿主细胞培养物中回收所述重组原弹性蛋白酶蛋白质；及
(c)任选地，使所述重组原弹性蛋白酶蛋白质暴露于活化条件，以产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质，
由此产生弹性蛋白酶蛋白质。
112.实施方式111的方法，其中所述方法包括使所述重组原弹性蛋白酶蛋白质暴露于活化条件，以产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的步骤。
113.实施方式112的方法，其中所述重组原弹性蛋白酶蛋白质在所述暴露于活化条件前经纯化。
114.实施方式113的方法，其中所述重组原弹性蛋白酶蛋白质在第二柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下经纯化，以便产生含所述经纯化的原弹性蛋白酶蛋白质和第二柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的溶液。
115.实施方式111～114中任一项的方法，其中所述第一柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
116.实施方式114或实施方式115的方法，其中所述第二柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
117.实施方式114～116中任一项的方法，其中所述第一和第二柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物相同。
118.实施方式114～116中任一项的方法，其中所述第一和第二柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物不同。
119.实施方式114～118中任一项的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
120.实施方式114～118中任一项的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述培养物中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
121.实施方式111～120中任一项的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述溶液中。
122.实施方式111～120中任一项的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述溶液中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
123.实施方式111～122中任一项的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
124.实施方式123的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
125.实施方式111～124中任一项的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质从所述宿主细胞的上清中回收。
126.实施方式111～125中任一项的方法，其中所述活化条件包括暴露于胰蛋白酶。
127.实施方式111～125中任一项的方法，其中所述活化条件是自体活化条件。
128.实施方式111～127中任一项的方法，其还包括分离所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质的步骤。
129.实施方式111～128中任一项的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质是成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质。
130.实施方式129的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
131.实施方式129的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
132.产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：
(a)冻干原弹性蛋白酶蛋白质；
(b)保存冻干的原弹性蛋白酶蛋白质；
(c)复原所述冻干的原弹性蛋白酶蛋白质；及
(d)活化所述复原的原弹性蛋白酶蛋白质，
由此产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
133.实施方式132的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质是重组的。
134.实施方式133的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质由包括下列步骤的方法制备或可由包括下列步骤的方法得到：
(i)在原弹性蛋白酶蛋白质表达的条件下培养能够表达所述原弹性蛋白酶蛋白质的宿主细胞；及
(ii)回收所述原弹性蛋白酶蛋白质。
135.实施方式134的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
136.实施方式135的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
137.实施方式132～136中任一项的方法，其中所述宿主细胞在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
138.实施方式137的方法，其中所述柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
139.实施方式137或实施方式138的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
140.实施方式137或实施方式138的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
141.实施方式132～140中任一项的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质从所述宿主细胞的上清中回收。
142.实施方式132～141中任一项的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质在冻干前经纯化。
143.实施方式132～142中任一项的方法，其中所述冻干的原弹性蛋白酶蛋白质被保存至少1天、至少1周、至少1个月或至少3个月。
144.实施方式132～143中任一项的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质在-80℃～+4℃的温度下保存。
145.实施方式132～144中任一项的方法，其中所述活化步骤包括胰蛋白酶活化。
146.实施方式132～144中任一项的方法，其中所述活化步骤包括自体活化。
147.实施方式132～146中任一项的方法，其还包括分离所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质的步骤。
148.实施方式132～147中任一项的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质是成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质。
149.实施方式148的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
150.实施方式148的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
151.产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：
使重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶蛋白质经受自体活化条件；
使重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶蛋白质与催化量的弹性蛋白酶接触，
或两者兼有，
由此产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质
152.实施方式151的方法，其中所述重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶蛋白质通过包括下列步骤的方法得到或可得到：
(a)在所述蛋白质表达的条件下培养实施方式84或86的宿主细胞；及
(b)回收所述表达出的蛋白质，
由此产生重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶蛋白质。
153.实施方式152的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
154.实施方式153的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
155.实施方式152～154中任一项的方法，其中所述宿主细胞在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
156.实施方式155的方法，其中所述柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
157.实施方式155或实施方式156的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
158.实施方式155或实施方式156的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
159.实施方式152～158中任一项的方法，其中回收所述表达出的蛋白质包括回收所述上清。
160.实施方式159的方法，其中所述自体活化步骤在所述上清中进行。
161.实施方式152～154中任一项的方法，其中所述表达出的蛋白质从所述上清中回收。
162.实施方式161的方法，其中所述自体活化步骤在所述上清中进行。
163.实施方式161的方法，其还包括纯化所述表达出的蛋白质的步骤。
164.实施方式151～163中任一项的方法，其中使所述重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶蛋白质经受自体活化条件包括升高含所述回收到的蛋白质的溶液的pH。
165.实施方式164的方法，其中所述溶液的pH被升高到碱性pH。
166.实施方式165的方法，其中所述碱性pH在7～9的范围内。
167.实施方式166的方法，其中所述碱性pH是8。
168.实施方式164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为10mg/ml或以下。
169.实施方式164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为5mg/ml或以下。
170.实施方式164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为2mg/ml或以下。
171.实施方式164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为1mg/ml或以下。
172.实施方式164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为0.5mg/ml或以下。
173.实施方式164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为0.25mg/ml或以下。
174.实施方式165～173中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为至少0.1mg/ml。
175.实施方式165～173中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为至少0.2mg/ml。
176.实施方式165～175中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经0.5～8小时。
177.实施方式174的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经2～7小时。
178.实施方式177的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经6小时。
179.实施方式165～178中任一项的方法，其中所述暴露于碱性pH在22℃～28℃的温度下进行。
180.实施方式179的方法，其中所述暴露于碱性pH在26℃的温度下进行。
181.实施方式152～180的方法，其中所述回收到的蛋白质在自体活化前被保存。
182.实施方式181的方法，其中所述回收到的蛋白质在保存前被冻干。
183.实施方式182的方法，其中所述回收到的蛋白质在冻干前经纯化。
184.实施方式181～183中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质被保存至少1天、至少1周、至少1个月或至少3个月。
185.实施方式184的方法，其中所述回收到的蛋白质在-80℃～+4℃的温度下保存。
186.实施方式150～185中不从属于实施方式160或162的实施方式中任一项的方法，其中所述重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶在经受自体活化条件前经纯化。
187.实施方式150～186中任一项的方法，其还包括分离所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的步骤。
188.实施方式150～187中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
189.实施方式150～187中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
190.产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：
(a)在所述蛋白质表达的条件下培养实施方式84或86的宿主细胞；
(b)回收所述表达出的蛋白质；
(c)纯化所述回收到的蛋白质；
(d)升高含所述蛋白质的溶液的pH，或使所述回收到的蛋白质与催化量的弹性蛋白酶接触以产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质，
由此产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质。
191.实施方式190的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
192.实施方式191的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
193.实施方式190～192中任一项的方法，其中所述宿主细胞在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
194.实施方式193的方法，其中所述柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
195.实施方式193或实施方式194的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
196.实施方式193或实施方式194的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
197.实施方式190～196中任一项的方法，其还包括纯化所述成熟的I型弹性蛋白酶的步骤(e)。
198.实施方式190～197中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
199.实施方式190～197中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
200.产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：
(a)在所述蛋白质表达的条件下培养实施方式84或86的宿主细胞；
(b)回收所述表达出的蛋白质；及
(c)使所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH至成熟的蛋白质产生；
由此产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质。
201.实施方式200的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
202.实施方式201的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
203.实施方式200～202中任一项的方法，其中所述宿主细胞在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
204.实施方式203的方法，其中所述柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
205.实施方式203或实施方式204的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
206.实施方式203或实施方式204的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
207.实施方式200～206中任一项的方法，其中所述碱性pH是7～9。
208.实施方式207的方法，其中所述碱性pH是8。
209.实施方式200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为10mg/ml或以下。
210.实施方式200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为5mg/ml或以下。
211.实施方式200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为2mg/ml或以下。
212.实施方式200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为1mg/ml或以下。
213.实施方式200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为0.5mg/ml或以下。
214.实施方式200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为0.25mg/ml或以下。
215.实施方式209～214中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为至少0.1mg/ml。
216.实施方式209～214中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为至少0.2mg/ml。
217.实施方式200～214中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经0.5～8小时。
218.实施方式217的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经2～7小时。
219.实施方式218的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经6小时。
220.实施方式200～219中任一项的方法，其中所述暴露于碱性pH在22℃～28℃的温度下进行。
221.实施方式220的方法，其中所述暴露于碱性pH在26℃的温度下进行。
222.实施方式200～221中任一项的方法，还包括分离所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的步骤(d)。
223.实施方式150～222中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶是成熟的猪I型弹性蛋白酶。
224.实施方式150～222中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶是成熟的人I型弹性蛋白酶。
225.产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的制剂的方法，包括：
(a)使自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质经受自体活化条件，以产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质；及
(b)将所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质制成制剂，
由此产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的制剂。
226.实施方式225的方法，其中所述自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质是重组的。
227.实施方式226的方法，还在步骤(a)之前包括：从在原弹性蛋白酶蛋白质表达的条件下生长的能够表达所述自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的宿主细胞的培养物中回收所述原弹性蛋白酶蛋白质。
228.实施方式225或实施方式226的方法，还在步骤(b)前包括：纯化所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
229.实施方式225～228中任一项的方法，其中所述制成制剂的步骤包括冻干所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
230.实施方式229的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质在冻干前不与缓冲液或缓冲液成分混合。
231.实施方式230的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质在冻干后与一种或多种缓冲液成分混合。
232.实施方式229的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质在冻干前与缓冲液或者一种或多种缓冲液成分混合。
233.实施方式231或232的方法，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲液(“PBS”)或所述缓冲液成分是PBS缓冲液成分。
234.实施方式231～233中任一项的方法，其中所述缓冲液含右旋糖酐或其中所述缓冲液成分含右旋糖酐。
235.实施方式234的方法，其中所述右旋糖酐是右旋糖酐-18。
236.实施方式230～235中任一项的方法，其中所述缓冲液含聚山梨酯80。
237.实施方式229～236中任一项的方法，其中所述制成制剂的步骤还包括：用液体复原冻干的成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
238.实施方式237的方法，其中所述液体是水。
239.实施方式237的方法，其中所述液体是缓冲液。
240.实施方式239的方法，其中所述缓冲液是全强度缓冲液、大于全强度缓冲液或小于全强度缓冲液。
241.实施方式237～240中任一项的方法，其中在复原后产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的全强度缓冲液的溶液、大于全强度缓冲液的溶液或小于全强度缓冲液的溶液。
242.实施方式241的方法，其中缓冲液成分
存在于冻干物中，
在复原后即加入，
或二者兼。
243.实施方式240～242中任一项的方法，其中全强度缓冲液含1×PBS。
244.实施方式240或241的方法，其中所述小于全强度缓冲液含0.1×PBS或0.5×PBS。
245.实施方式244的方法，其中所述小于全强度缓冲液含0.1×PBS。
246.实施方式244的方法，其中所述小于全强度缓冲液含0.5×PBS。
247.实施方式240或241的方法，其中所述大于全强度缓冲液含1.1×PBS～3×PBS。
248.实施方式247的方法，其中所述大于全强度缓冲液含1.5×PBS～2×PBS。
249.实施方式241～248中任一项的方法，其中所述缓冲液含右旋糖酐。
250.实施方式249的方法，其中所述右旋糖酐是右旋糖酐18。
251.实施方式241～250中任一项的方法，其中所述缓冲液含聚山梨酯80。
252.实施方式241～251中任一项的方法，其中所述缓冲液的pH为7～8。
253.实施方式252的方法，其中所述缓冲液的pH为7.4。
254.实施方式237～253中任一项的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质复原至0.001mg/ml～50mg/ml的浓度。
255.实施方式254的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质复原至0.1mg/ml～40mg/ml的浓度。
256.实施方式255的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质复原至5mg/ml～30mg/ml的浓度。
257.实施方式256的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质复原至10mg/ml～20mg/ml的浓度。
258.实施方式225～257中任一项的方法，其中所述制剂是含所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物。
259.实施方式225～258中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
260.实施方式225～258中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
261.产生冻干的成熟的I型弹性蛋白酶的方法，包括：
(a)根据实施方式151～181中任一项的方法产生成熟的I型弹性蛋白酶；
(b)分离成熟的I型弹性蛋白酶；及
(c)冻干所述分离出的成熟的I型弹性蛋白酶，
由此产生冻干的成熟的I型弹性蛋白酶。
262.实施方式261的方法，其中所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶为95％～100％纯。
263.实施方式261或实施方式262的方法，其中所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶为至少95％纯。
264.实施方式261或实施方式262的方法，其中所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶为至少98％纯。
265.实施方式261～264中任一项的方法，其中所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶被纯化至均一。
266.实施方式261～265中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
267.实施方式261～265中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
268.实施方式130、149、188、198、223、259和267中任一项的方法，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87构成。
269.实施方式268的方法，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4构成。
270.实施方式131、150、189、199、224、260和268中任一项的方法，其中所述成熟的猪I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ IDNO：39构成。
271.实施方式111～128、132～148、151～197和225～257中任一项的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质是实施方式13～27中任一项的蛋白质。
272.实施方式200～222中任一项的方法，其中所述表达出的蛋白质是实施方式13～27中任一项的蛋白质。
273.成熟的人I型弹性蛋白酶，其由实施方式149、188、198和223中任一项的方法产生或可由实施方式149、188、198和223中任一项的方法得到。
274.实施方式273的成熟的人I型弹性蛋白酶，其具有1～40U/mg蛋白质的比活性。
275.成熟的猪I型弹性蛋白酶，其由实施方式150、189、199和224中任一项的方法产生或可由实施方式150、189、199和224中任一项的方法得到。
276.实施方式275的成熟的猪I型弹性蛋白酶，其具有10～100U/mg蛋白质的比活性。
277.药物组合物，其含治疗有效量的：
(a)实施方式273或实施方式274的成熟的人I型弹性蛋白酶，或
(b)由实施方式259的方法产生或可由实施方式259的方法得到的成熟的人I型弹性蛋白酶制剂。
278.实施方式277的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87构成。
279.实施方式278的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4构成。
280.药物组合物，其含治疗有效量的：
(a)实施方式275或实施方式276的成熟的猪I型弹性蛋白酶，或
(b)由实施方式260的方法产生或可由实施方式260的方法得到的成熟的猪I型弹性蛋白酶制剂。
281.实施方式280的药物组合物，其中所述成熟的猪I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：39构成。
282.药物组合物，其含：
(i)治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶，和
(ii)药学可接受载体，
所述药物组合物的特征在于具有下列特征中的至少1项：
(a)所述组合物中无胰蛋白酶；
(b)所述组合物中基本上无胰蛋白酶；
(c)所述组合物中无由SEQ ID NO：2、3、37、38、70和/或71构成的任意蛋白质；
(d)所述组合物中基本上无由SEQ ID NO：2、3、37、38、70和/或71构成的任意蛋白质；
(e)所述组合物中无细菌蛋白质；
(f)所述组合物中基本上无细菌蛋白质；
(g)所述组合物中无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质；
(h)所述组合物中基本上无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质。
283.药物组合物，其含：
(i)治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶，和
(ii)药学可接受载体，
所述药物组合物的特征在于具有下列特征中的至少1项：
(a)所述组合物中无胰蛋白酶；
(b)所述组合物中基本上无胰蛋白酶；
(c)所述组合物中无由SEQ ID NO：70和71构成的任意蛋白质；
(d)所述组合物中基本上无由SEQ ID NO：2和3构成的任意蛋白质；
(e)所述组合物中无细菌蛋白质；
(f)所述组合物中基本上无细菌蛋白质；
(g)所述组合物中无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质；
(h)所述组合物中基本上无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质。
284.实施方式282或实施方式283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少2项。
285.实施方式284的药物组合物，其中所述至少2项特征包括(a)和(c)。
286.实施方式284的药物组合物，其中所述至少2项特征包括(b)和(d)。
287.实施方式282或实施方式283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少3项。
288.实施方式284的药物组合物，其中所述至少3项特征包括(a)、(c)和(e)。
289.实施方式284的药物组合物，其中所述至少3项特征包括(b)、(d)和(f)。
290.实施方式282或实施方式283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少4项。
291.实施方式284的药物组合物，其中所述至少4项特征包括(a)、(c)、(e)和(g)。
292.实施方式284的药物组合物，其中所述至少4项特征包括(b)、(d)、(f)和(h)。
293.实施方式282或实施方式283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少5项。
294.实施方式282或实施方式283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少6项。
295.实施方式282或实施方式283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少7项。
296.实施方式282或实施方式283的药物组合物，其特征在于全部特征(a)～(h)。
297.实施方式282～296中任一项的药物组合物，其无或基本上无1种、2种、3种或全部4种由SEQ ID NO：85、86、94和95构成的蛋白质。
298.实施方式282～297中任一项的药物组合物，其无或基本上无由SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：86构成的蛋白质。
299.实施方式282～297中任一项的药物组合物，其无或基本上无由SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95构成的蛋白质。
300.实施方式282～297中任一项的药物组合物，其无或基本上无1种、2种或全部3种由SEQ ID NO：106、107和108构成的蛋白质。
301.实施方式282～300中任一项的药物组合物，其含药学可接受水平的内毒素。
302.实施方式301的药物组合物，其中所述药物组合物是液体组合物，且其中内毒素的所述药学可接受水平是8EU/ml或以下。
303.实施方式302的药物组合物，其中内毒素的所述药学可接受水平是5EU/ml或以下。
304.实施方式301的药物组合物，其中所述药物组合物是固体组合物，且其中内毒素的所述药学可接受水平是10EU/g成熟的人I型弹性蛋白酶或以下。
305.实施方式304的药物组合物，其中内毒素的所述药学可接受水平是5EU/g成熟的人I型弹性蛋白酶或以下。
306.实施方式282～305中任一项的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶的特征在于1～40U/mg蛋白质的比活性。
307.实施方式306的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶的特征在于25～35U/mg蛋白质的比活性。
308.实施方式306的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶的特征在于大于10U/mg蛋白质的比活性。
309.实施方式306的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶的特征在于大于20U/mg蛋白质的比活性。
310.实施方式282～309中任一项的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶基本上由SEQ ID NO：5、84或87构成。
311.实施方式310的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4构成。
312.实施方式282～311中任一项的药物组合物，其中所述胰蛋白酶活性对应于小于4ng/mg成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质。
313.实施方式312的药物组合物，其中所述胰蛋白酶活性对应于小于2ng/mg成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质。
314.冻干的蛋白质制剂，其基本上由SEQ ID NO：5、84或87构成，其在复原至1mg/ml的所述蛋白质浓度后，所述胰蛋白酶活性对应于小于2ng/ml胰蛋白酶。
315.实施方式314的冻干制剂，其中水分含量小于5％。
316.实施方式315的冻干制剂，其含钠离子、钾离子、磷酸离子和氯离子。
317.实施方式315的冻干制剂，其含聚山梨酯-80。
318.实施方式315的冻干制剂，其含右旋糖酐。
319.实施方式318的冻干制剂，其中所述右旋糖酐是右旋糖酐-18。
320.实施方式311的冻干制剂，其含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子和聚山梨酯-80。
321.实施方式314的冻干制剂，其含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子和右旋糖酐。
322.实施方式321的冻干制剂，其中所述右旋糖酐是右旋糖酐-18。
323.实施方式314的冻干制剂，其含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子、聚山梨酯-80和右旋糖酐。
324.实施方式323的冻干制剂，其中所述右旋糖酐是右旋糖酐-18。
325.液体制剂，其含至少0.1mg/ml蛋白质溶液，所述蛋白质基本上由SEQ ID NO：5、84或87构成，其中所述胰蛋白酶活性对应于小于2ng/ml胰蛋白酶。
326.实施方式325的液体制剂，其中所述溶液是缓冲溶液。
327.实施方式326的液体制剂，其中所述溶液缓冲至pH7～8。
328.实施方式326的液体制剂，其中所述溶液是PBS。
329.实施方式328的液体制剂，其中所述溶液含137mM氯化钠、2.7mM磷酸钾和10mM磷酸钠。
330.实施方式325～329中任一项的液体制剂，其还含一种或多种赋形剂。
331.实施方式330的液体制剂，其中所述一种或多种赋形剂含右旋糖酐-18。
332.实施方式331的液体制剂，其中所述右旋糖酐-18的量为所述溶液的8％重量/体积。
333.实施方式330的液体制剂，其中所述一种或多种赋形剂含聚山梨酯-80。
334.实施方式333的液体制剂，其中所述聚山梨酯-80的量为所述溶液的0.01％重量/体积。
335.实施方式325～334中任一项的液体制剂，其中所述蛋白质在所述溶液中的浓度在0.001mg/ml～40mg/ml的范围内。
336.实施方式335的液体制剂，其中所述蛋白质在所述溶液中的浓度在0.1mg/ml～20mg/ml的范围内。
337.实施方式325～336中任一项的液体制剂，其还含一种或多种防腐剂、稳定剂和着色剂。
338.实施方式325～337中任一项的液体制剂，其基本上无所述SEQ ID NO：5、84或87的蛋白质之外的哺乳动物蛋白质。
339.实施方式325～338中任一项的液体制剂，其基本上无细菌蛋白质。
340.制剂，其由实施方式225～258中任一项的方法制备或可由实施方式225～258中任一项的方法得到。
341.实施方式340的制剂，其是液体制剂。
342.实施方式340或341的制剂，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
343.实施方式342的制剂，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：5、84或87构成。
344.实施方式342的制剂，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4构成。
345.实施方式340或341的制剂，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
346.实施方式345的制剂，其中所述成熟的猪I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：39构成。
347.从正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质和未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的混合物中除去所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)使含正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质和未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的混合物的组合物经受正确加工的成熟的酶有活性的pH；
(b)保持该pH至一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质降解的时间，
由此从正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质和未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的混合物中除去所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
348.实施方式347的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质相比正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质于N-端含至少一个额外的氨基酸或含更少的氨基酸。
349.实施方式347或348的方法，其中所述pH在5和12之间。
350.实施方式347～349中任一项的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～100％。
351.实施方式348的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～99％。
352.实施方式348的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～98％。
353.实施方式348的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～95％。
354.实施方式348的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～90％。
355.实施方式350～354中任一项的方法，其中多于一种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少50％。
356.实施方式355的方法，其中所述混合物中全部未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少50％。
357.实施方式350～354中任一项的方法，其中至少一种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少75％。
358.实施方式357的方法，其中多于一种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少75％。
359.实施方式357的方法，其中所述混合物中全部未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少75％。
360.实施方式350～354中任一项的方法，其中至少一种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少90％。
361.实施方式360的方法，其中多于一种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少90％。
362.实施方式360的方法，其中所述混合物中全部未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少90％。
363.实施方式347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为10mg/ml或以下。
364.实施方式347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为5mg/ml或以下。
365.实施方式347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为2mg/ml或以下。
366.实施方式347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为1mg/ml或以下。
367.实施方式347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为0.5mg/ml或以下。
368.实施方式347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为0.25mg/ml或以下。
369.实施方式363～368中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为至少0.1mg/ml。
370.实施方式363～368中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为至少0.2mg/ml。
371.实施方式347～370中任一项的方法，其中所述组合物中的胰蛋白酶活性小于4ng/ml胰蛋白酶/mg总弹性蛋白酶蛋白质。
372.实施方式347～370中任一项的方法，其中所述组合物中的胰蛋白酶活性小于2ng/ml胰蛋白酶/mg总弹性蛋白酶蛋白质。
373.实施方式347～372中任一项的方法，其中所述组合物
无或基本上无由SEQ ID NO：104构成的蛋白质，和/或
无或基本上无由SEQ ID NO：105构成的蛋白质。
374.产生含成熟的I型弹性蛋白酶的药物组合物的方法，所述方法包括：
(i)根据实施方式261～265中任一项的方法产生冻干的成熟的I型弹性蛋白酶；及
(ii)在水或药学可接受的载体中复原冻干的成熟的I型弹性蛋白酶，由此产生含成熟的人I型弹性蛋白酶的药物组合物。
375.产生含成熟的I型弹性蛋白酶的药物组合物的方法，所述方法包括：在水或药学可接受的载体中复原实施方式314～324中任一项的冻干制剂，由此产生含成熟的I型弹性蛋白酶的药物组合物。
376.实施方式374或实施方式375的方法，其中所述药物组合物含磷酸盐。
377.实施方式374～376中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶是成熟的人I型弹性蛋白酶
378.实施方式377的方法，其特征在于1～40U/mg蛋白质的比活性。
379.实施方式377的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶的特征在于25～35U/mg蛋白质的比活性。
380.实施方式377～379中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～100％。
381.实施方式377～379中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～98％。
382.实施方式377～379中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～95％。
383.实施方式377～379中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～90％。
384.实施方式377～379中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～80％。
385.实施方式377～384中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存1周后保持其比活性的至少70％。
386.药物组合物，其由实施方式374～385中任一项的方法产生或可由实施方式374～385中任一项的方法得到。
387.治疗性地增大有需要的人受试者的动脉或静脉直径的方法，所述方法包括：将下列以足以增大动脉或静脉直径的剂量局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁：
(a)实施方式277～313和386中任一项的药物组合物；
(b)实施方式325～339中任一项的液体制剂；或
(c)实施方式341的制剂。
388.实施方式387的方法，其中血管直径增大、血管腔径增大，或两者均增大。
389.预防或治疗有需要的人受试者的动脉或静脉血管痉挛的方法，所述方法包括：将下列以足以治疗或预防动脉或静脉血管痉挛的剂量局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁：
(a)实施方式277～313和386中任一项的药物组合物；
(b)实施方式325～339中任一项的液体制剂；或
(c)实施方式341的制剂。
390.治疗需要所述治疗的人受试者的阻塞的动脉或静脉的方法，所述方法包括：将下列局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁：
(a)实施方式277～313和386中任一项的药物组合物；
(b)实施方式325～339中任一项的液体制剂；或
(c)实施方式341的制剂，
其中所述施用导致所述动脉或静脉壁中的弹性蛋白的蛋白水解，所述蛋白水解导致所述动脉或静脉直径增大。
391.治疗需要所述治疗的人受试者的连接到动静脉血液透析移植物或动静脉瘘的动脉或静脉的方法，所述方法包括：将下列局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁：
(a)实施方式277～313和386中任一项的药物组合物；
(b)实施方式325～339中任一项的液体制剂；或
(c)实施方式341的制剂，
其中所述施用导致所述动脉或静脉壁中的弹性蛋白的蛋白水解，所述蛋白水解导致所述动脉或静脉直径增大。
392.处理用于血液透析的人受试者静脉的方法，所述方法包括：将下列局部施用于所述人受试者的静脉壁：
(a)实施方式277～313和386中任一项的药物组合物；
(b)实施方式325～339中任一项的液体制剂；或
(c)实施方式341的制剂，
其中所述施用导致所述静脉壁中的弹性蛋白的蛋白水解，所述蛋白水解导致所述静脉直径增大。
393.实施方式387～392中任一项的方法，其还包括：将一部分递送设备插入动脉或静脉壁中，以将弹性蛋白酶递送至所述动脉或静脉壁。
394.实施方式387～393中任一项的方法，其中所述药物组合物或液体制剂通过导管施用。
395.实施方式387～394中任一项的方法，其中所述药物组合物或液体制剂直接施用到所述动脉或静脉壁中。
396.实施方式387～395中任一项的方法，其中所述动脉或静脉被阻塞。
397.实施方式396的方法，其中所述动脉或静脉被狭窄阻塞。
398.实施方式397的方法，其中所述阻塞在治疗前允许通过不足体积的血。
399.实施方式398的方法，其中所述阻塞是狭窄。
400.实施方式399的方法，其中所述动脉或静脉被内膜增生阻塞。
401.实施方式387～400中任一项的方法，其中所述药物组合物或液体制剂被施用于阻塞的冠状动脉或外周动脉。
402.实施方式387～395中任一项的方法，其中所述动脉或静脉易于被内膜增生阻塞。
403.实施方式387～400和402中任一项的方法，其中所述组合物被施用于静脉壁。
404.实施方式403的方法，其中所述静脉连接到动静脉血液透析移植物或动静脉瘘。
405.实施方式404的方法，其中所述静脉用于血液透析。
406.实施方式405的方法，还包括：将所述静脉直接与动脉连接或将所述静脉通过移植物与动脉连接。
407.实施方式387～394中任一项的方法，其中所述组合物被施用于手术暴露的动脉或静脉的外膜表面。
408.实施方式387～407中任一项的方法，其中所述药物组合物、液体制剂或制剂中的成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
409.实施方式408的方法，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87构成。
410.实施方式408的方法，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4构成。
411.实施方式387～407中任一项的方法，其中所述药物组合物、液体制剂或制剂中的成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
412.实施方式411的方法，其中所述成熟的猪I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：39构成。
413.单元剂，其含0.0033mg～200mg的：
(a)实施方式273或实施方式274的成熟的人I型弹性蛋白酶，或
(b)由实施方式259的方法产生或可由实施方式259的方法得到的成熟的人I型弹性蛋白酶制剂。
414.实施方式413的单元剂，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87构成。
415.单元剂，其含0.0033mg～200mg的：
(a)实施方式275或实施方式276的成熟的猪I型弹性蛋白酶，或
(b)由实施方式260的方法产生或可由实施方式260的方法得到的成熟的猪I型弹性蛋白酶制剂。
416.实施方式415的单元剂，其中所述成熟的猪I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：39构成。
417.实施方式413～416中任一项的单元剂，其含0.5mg～50mg所述成熟的I型弹性蛋白酶。
418.实施方式417的单元剂，其含1mg～20mg所述成熟的I型弹性蛋白酶。
419.实施方式418的单元剂，其含5mg～10mg所述成熟的I型弹性蛋白酶。
420.实施方式413～419中任一项的单元剂，其在容器、包装、分注器或导管内。
421.试剂盒，其含：
实施方式1～39和68～69中任一项的弹性蛋白酶蛋白质，或者由或可由实施方式89～224、261～276和347～373中任一项的方法得到的弹性蛋白酶蛋白质；
实施方式40～67中任一项的核酸；
实施方式70～72中任一项的载体；
实施方式73～87中任一项的细胞；
实施方式88的细胞培养物上清；
实施方式314～346中任一项的弹性蛋白酶制剂，或者由或可由实施方式261～276中任一项的方法得到的弹性蛋白酶制剂；
实施方式277～313和386中任一项的药物组合物，或者由或可由实施方式374～385中任一项的方法得到的药物组合物；或
实施方式415～420中任一项的单元剂。
422.实施方式421的试剂盒，其为治疗性试剂盒。
423.实施方式422的试剂盒，其含容器、包装、分注器或导管。
424.实施方式423的试剂盒，其为制造性试剂盒。
本发明还被下列集中于但不限定于SEQ ID NO：64和SEQ IDNO：69的原弹性蛋白酶蛋白质的特定实施方式所例示：
425.蛋白质，其含SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69的氨基酸序列。
426.实施方式425的蛋白质，其是分离出的。
427.核酸分子，其含编码实施方式425的蛋白质的核苷酸序列。
428.实施方式427的核酸分子，其中所述蛋白质含可操作连接于所述SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69的氨基酸序列的信号序列。
429.实施方式428的核酸分子，其中所述信号序列在巴斯德比赤酵母中可操作。
430.实施方式429的核酸分子，其中所述信号序列是酵母α-因子信号肽。
431.载体，其含实施方式427～430中任一项的核酸分子。
432.实施方式431的载体，其中所述核苷酸序列经多聚化。
433.宿主细胞，其含实施方式431的载体。
434.实施方式433的宿主细胞，其中至少1个拷贝的所述载体被整合到所述宿主细胞基因组中。
435.实施方式434的宿主细胞，其中2～5个拷贝的所述载体被整合到所述宿主细胞基因组中。
436.实施方式433的宿主细胞，其中所述核苷酸序列经多聚化。
437.实施方式436的宿主细胞，其中所述载体含2～5个拷贝的所述核苷酸序列。
438.细胞，其经基因工程改造而表达实施方式427～430中任一项的核酸分子。
439.实施方式438的细胞，其为巴斯德毕赤酵母细胞。
440.实施方式439的细胞，其中所述核苷酸序列可操作连接于可被甲醇诱导的启动子。
441.细胞培养物上清，其含实施方式425的蛋白质。
442.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69的蛋白质表达的条件下培养实施方式429的细胞。
443.实施方式442的方法，其中所述条件包括下列1项、2项、3项或全部4项：
(i)在pH2～6下生长或诱导期；
(ii)在22℃～28℃的温度下生长或诱导期；
(iii)在复合培养基中培养；或
(iv)在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
444.实施方式442或实施方式443的方法，其还包括回收所述蛋白质。
445.实施方式442～444中任一项的方法，其还包括使所述SEQID NO：64或SEQ ID NO：69的蛋白质暴露于活化条件以产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
446.实施方式445的方法，其中所述蛋白质在所述暴露于活化条件前经纯化。
447.实施方式446的方法，其中所述蛋白质在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下经纯化。
448.实施方式445～447中任一项的方法，还包括纯化所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
449.实施方式448的方法，还包括冻干所述经纯化的成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
450.制备成熟的弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：使实施方式441的细胞培养物上清经受自体活化条件，由此产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
451.实施方式450的方法，还包括纯化所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
452.实施方式451的方法，还包括冻干所述经纯化的成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
453.制备含成熟的弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物的方法，复原含通过实施方式449或实施方式452的方法产生的冻干的原弹性蛋白酶蛋白质的冻干物。
454.实施方式453的方法，其中所述冻干物：(a)含一种或多种缓冲液成分，或者(b)不含缓冲液成分。
455.实施方式454的方法，其中所述冻干物用水或缓冲液复原。
456.实施方式455的方法，其中在复原后产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的全强度缓冲液的溶液、大于全强度缓冲液的溶液或小于全强度缓冲液的溶液。
457.实施方式456的方法，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲液。
458.实施方式453～457中任一项的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质复原至0.001mg/ml～50mg/ml的浓度。
459.实施方式453～458中任一项的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质具有1～40U/mg蛋白质的比活性。
460.含成熟的弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物，其特征在于下列特征中的至少1项、至少2项、至少3项、至少4项、至少5项、至少6项或至少7项：
(a)所述组合物中无胰蛋白酶；
(b)所述组合物中基本上无胰蛋白酶；
(c)所述组合物中无由SEQ ID NO：70和71构成的任意蛋白质；
(d)所述组合物中基本上无由SEQ ID NO：2和3构成的任意蛋白质；
(e)所述组合物中无细菌蛋白质；
(f)所述组合物中基本上无细菌蛋白质；
(g)所述组合物中无所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质之外的哺乳动物蛋白质；
(h)所述组合物中基本上无所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质之外的哺乳动物蛋白质；
(i)所述组合物中无或基本上无1种、2种、3种或全部4种由SEQ ID NO：85、86、94和95构成的蛋白质；
(j)所述组合物中无或基本上无1种、2种或全部3种由SEQ IDNO：106、107和108构成的蛋白质；
(k)所述组合物含药学可接受水平的内毒素；
(l)所述组合物中成熟的弹性蛋白酶蛋白质的特征在于1～40U/mg蛋白质的比活性；
(m)所述组合物中的胰蛋白酶活性对应于小于4ng/mg成熟的弹性蛋白酶蛋白质；
(n)所述组合物含聚山梨酯-80；
(o)所述组合物含右旋糖酐；
(p)所述组合物含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子和聚山梨酯-80；
(q)所述组合物含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子和右旋糖酐；
(r)所述组合物含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子、聚山梨酯-80和右旋糖酐；
(s)所述组合物中的成熟的弹性蛋白酶蛋白质在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～100％；及
(t)所述组合物含0.0033mg～200mg所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质的单元剂。
461.实施方式460的药物组合物，其中所述药物组合物的特征在于独立选自下列组(i)～(v)的至少3项特征、至少4项特征或5项特征：
(i)(a)、(b)或(m)
(ii)(e)或(f)
(iii)(g)或(h)
(iv)(k)
(v)(l)。
462.实施方式461的药物组合物，其中所述至少3项或至少所述4项特征中的2项选自组(i)和(iv)或(v)。
463.实施方式462的药物组合物，其中至少所述4项特征中的3项选自组(i)、(iv)和(v)。
464.实施方式460～463中任一项的药物组合物，其由实施方式453～459中任一项的方法产生。
465.从正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质和未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的混合物中除去所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)使含正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质和未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的混合物的组合物经受正确加工的成熟的酶有活性的pH；
(b)保持该pH至一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质降解的时间，
由此从正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质和未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的混合物中除去所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
466.实施方式465的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质相比正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质于N-端含至少一个额外的氨基酸或含更少的氨基酸。
467.实施方式465或实施方式466的方法，其中所述pH在5和12之间。
468.实施方式465～467中任一项的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～100％。
469.治疗性地增大有需要的人受试者的动脉或静脉直径的方法，所述方法包括：将实施方式460～464中任一项的药物组合物以足以增大动脉或静脉直径的剂量局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁。
470.实施方式469的方法，其中血管直径增大、血管腔径增大，或两者均增大。
471.预防或治疗有需要的人受试者的动脉或静脉血管痉挛的方法，所述方法包括：将实施方式460～464中任一项的药物组合物以足以预防或治疗动脉或静脉血管痉挛的剂量局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁。
472.治疗需要所述治疗的人受试者的阻塞的动脉或静脉的方法，所述方法包括：将实施方式460～464中任一项的药物组合物局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁，其中所述施用导致所述动脉或静脉壁中的弹性蛋白的蛋白水解，所述蛋白水解导致所述动脉或静脉直径增大。
473.治疗需要所述治疗的人受试者的连接到动静脉血液透析移植物或动静脉瘘的动脉或静脉的方法，所述方法包括：将实施方式460～464中任一项的药物组合物局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁，其中所述施用导致所述动脉或静脉壁中的弹性蛋白的蛋白水解，所述蛋白水解导致所述动脉或静脉直径增大。
474.处理血液透析中使用的人受试者静脉的方法，所述方法包括：将实施方式460～464中任一项的药物组合物局部施用于所述人受试者的静脉壁，其中所述施用导致所述静脉壁中的弹性蛋白的蛋白水解，所述蛋白水解导致所述静脉直径增大。
475.试剂盒，其含实施方式460～464中任一项的药物组合物。
476.实施方式475的药物组合物，其中所述药物组合物在容器、包装、分注器或导管中。
本申请还涉及下列实施方案：
1.蛋白质，其含：
(i)含弹性蛋白酶识别序列的弹性蛋白酶活化序列，其可操作连接于
(ii)成熟的弹性蛋白酶的氨基酸序列。
2.实施方案1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：11。
3.实施方案1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：12。
4.实施方案1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：13。
5.实施方案1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：93。
6.实施方案1、实施方案2或实施方案4的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含下列中的任一个：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21。
7.实施方案1的蛋白质，其中所述活化序列含SEQ ID NO：80。
8.实施方案1或实施方案7的蛋白质，其中所述活化序列含SEQID NO：23、SEQ ID NO：72、或SEQ ID NO：73。
9.实施方案1的蛋白质，其中所述蛋白质含切割结构域，所述切割结构域含SEQ ID NO：74。
10.实施方案1或实施方案9的蛋白质，其中所述切割结构域含下列中的任一个：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。
11.实施方案1～5和7中任一项的蛋白质，其含SEQ ID NO：64。
12.实施方案1～5和7中任一项的蛋白质，其含SEQ ID NO：69。
13.I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含SEQ ID NO：74的切割结构域序列。
14.实施方案13的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述切割结构域含下列中的任一个：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：55。
15.实施方案13或实施方案14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述成熟的弹性蛋白酶序列含与SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位至末端的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的序列。
16.实施方案13或实施方案14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含与SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位至末端的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。
17.实施方案13或实施方案14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含与SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位至末端的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的序列。
18.实施方案13或实施方案14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述成熟的弹性蛋白酶含相对SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位至末端的氨基酸序列具有至10个连续氨基酸变化的序列。
19.实施方案13或实施方案14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含相对SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位至末端的氨基酸序列具有至7个连续氨基酸变化的序列。
20.实施方案13或实施方案14的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含相对SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：1的6位至末端的氨基酸序列具有至5个连续氨基酸变化的序列。
21.实施方案13～20中任一项的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述SEQ ID NO：74中被记为“Xaa1”的氨基酸残基是谷氨酸或组氨酸。
22.实施方案13～21中任一项的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述SEQ ID NO：74中被记为“Xaa4”的氨基酸残基是脯氨酸。
23.实施方案13～22中任一项的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述SEQ ID NO：74中被记为“Xaa5”的氨基酸残基是丙氨酸。
24.实施方案13～23中任一项的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其中所述SEQ ID NO：74中被记为“Xaa1”的氨基酸残基是组氨酸，SEQ IDNO：74中被记为“Xaa4”的氨基酸残基是脯氨酸，SEQ ID NO：74中被记为“Xaa5”的氨基酸残基是丙氨酸。
25.实施方案13～24中任一项的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含SEQ ID NO：103的氨基酸序列。
26.实施方案25的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。
27.实施方案25的I型原弹性蛋白酶蛋白质，其含SEQ ID NO：69的氨基酸序列。
28.实施方案1～27中任一项的蛋白质，其是分离出的。
29.实施方案1～27中任一项的蛋白质，其含信号序列。
30.蛋白质，其含：
(i)信号序列；
(ii)含弹性蛋白酶识别序列的弹性蛋白酶活化序列；和
(iii)成熟的弹性蛋白酶的氨基酸序列。
31.实施方案30的蛋白质，其中所述信号序列在巴斯德比赤酵母中可操作。
32.实施方案30的蛋白质，其中所述信号序列是酵母α-因子信号肽。
33.实施方案32的蛋白质，其中所述酵母α-因子信号肽含SEQ IDNO：34的氨基酸序列。
34.实施方案30的蛋白质，其中所述信号序列是哺乳动物分泌信号序列。
35.实施方案34的蛋白质，其中所述哺乳动物分泌信号序列是猪I型弹性蛋白酶信号序列。
36.实施方案34的蛋白质，其中所述哺乳动物分泌信号序列是人I型弹性蛋白酶信号序列。
37.实施方案1或实施方案30的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列是I型人弹性蛋白酶识别序列。
38.实施方案1或实施方案30的蛋白质，其中所述成熟的弹性蛋白酶是人I型弹性蛋白酶。
39.实施方案1或实施方案30的蛋白质，其中所述成熟的弹性蛋白酶是猪I型弹性蛋白酶。
40.核酸，其编码实施方案1～39中任一项的蛋白质。
41.核酸分子，其含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质含：
(i)含弹性蛋白酶识别序列的活化序列，其可操作连接于
(ii)弹性蛋白酶的氨基酸序列。
42.实施方案41的核酸分子，其中所述蛋白质还含可操作连接到所述活化序列的信号序列。
43.实施方案41或实施方案42的核酸分子，其中所述信号序列在巴斯德毕赤酵母中可操作。
44.实施方案41～43中任一项的核酸，其中所述弹性蛋白酶识别序列是I型弹性蛋白酶识别序列。
45.实施方案41～44中任一项的核酸，其中所述弹性蛋白酶识别序列是I型人弹性蛋白酶识别序列。
46.实施方案41～45中任一项的核酸分子，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ ID NO：11。
47.实施方案41～45中任一项的核酸分子，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ ID NO：12。
48.实施方案41～45中任一项的核酸分子，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ ID NO：13。
49.实施方案41～45中任一项的核酸分子，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ ID NO：93。
50.实施方案41～46和48中任一项的核酸分子，其中所述弹性蛋白酶识别序列含下列中的任一个：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21。
51.实施方案41～50中任一项的核酸分子，其中所述活化序列含SEQ ID NO：80。
52.实施方案41～45和51中任一项的核酸分子，其中所述活化序列含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：72、或SEQ ID NO：73。
53.实施方案41～46中任一项的核酸分子，其中所述蛋白质含切割结构域，所述切割结构域含SEQ ID NO：74。
54.实施方案41～46和53中任一项的核酸分子，其中所述切割结构域含下列中的任一个：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。
55.实施方案41～54中任一项的核酸，其中所述弹性蛋白酶是成熟的人I型弹性蛋白酶。
56.实施方案41～54中任一项的核酸，其中所述弹性蛋白酶是成熟的猪I型弹性蛋白酶。
57.实施方案41～54中任一项的核酸，其中所述弹性蛋白酶含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：87、和SEQ ID NO：39中任一氨基酸序列。
58.实施方案57的核酸，其中所述弹性蛋白酶含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
59.实施方案42～58中任一项的核酸分子，其中所述信号序列是酵母α-因子信号肽。
60.实施方案59的核酸分子，其中所述蛋白质含SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97中任一氨基酸序列。
61.实施方案42和44～58中任一项的核酸分子，其中所述信号序列是哺乳动物分泌信号序列。
62.实施方案61的核酸分子，其中所述哺乳动物分泌信号序列是猪I型弹性蛋白酶信号序列。
63.实施方案61的核酸分子，其中所述哺乳动物分泌信号序列是人I型弹性蛋白酶信号序列。
64.实施方案41～63中任一项的核酸分子，其中所述蛋白质含SEQ ID NO：88～91和98～103中任一氨基酸序列。
65.实施方案64的核酸分子，其中所述蛋白质含SEQ ID NO：6～9和64～69中任一氨基酸序列。
66.实施方案64的核酸分子，其中所述蛋白质含表2所示弹性蛋白酶多态性的组合中的任一个。
67.实施方案64的核酸分子，其中所述蛋白质含表3所示弹性蛋白酶多态性的组合中的任一个。
68.蛋白质，其由实施方案41～67中任一项的核酸分子编码。
69.实施方案68的蛋白质，其是分离出的。
70.载体，其含实施方案41～67中任一项的核酸分子。
71.实施方案70的载体，其还含控制基因表达的核苷酸序列，其被可操作连接到编码所述蛋白质的核苷酸序列。
72.实施方案70或实施方案71的载体，其中编码所述蛋白质的所述核苷酸序列经多聚化。
73.宿主细胞，其含实施方案70～72中任一项的载体。
74.实施方案73的宿主细胞，其中至少1个拷贝的所述载体被整合入所述宿主细胞基因组。
75.实施方案74的宿主细胞，其中1个拷贝的所述载体被整合入所述宿主细胞基因组。
76.实施方案74的宿主细胞，其中2～5个拷贝的所述载体被整合入所述宿主细胞基因组。
77.实施方案74或76的宿主细胞，其中2个拷贝的所述载体被整合入所述宿主细胞基因组。
78.实施方案74或76的宿主细胞，其中3个拷贝的所述载体被整合入所述宿主细胞基因组。
79.宿主细胞，其含至少1个拷贝的被整合入其基因组的实施方案41～67中任一项的核酸分子。
80.实施方案79的宿主细胞，其中1个拷贝的所述核酸分子被整合入其基因组。
81.实施方案79的宿主细胞，其中2～5个拷贝的所述核酸分子被整合入其基因组。
82.实施方案79的宿主细胞，其中2个拷贝的所述核酸分子被整合入其基因组。
83.实施方案79的宿主细胞，其中3个拷贝的所述核酸分子被整合入其基因组。
84.细胞，其经基因工程改造而表达实施方案41～67中任一项的核酸分子。
85.实施方案84的细胞，其中所述核苷酸序列被可操作连接于可被甲醇诱导的启动子。
86.巴斯德毕赤酵母细胞，其经基因工程改造而表达实施方案41～67中任一项的核苷酸序列。
87.实施方案87的巴斯德毕赤酵母，其中所述核苷酸序列被可操作连接于可被甲醇诱导的启动子。
88.细胞培养物上清，其含实施方案1～27中任一项或实施方案68的蛋白质。
89.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在蛋白产生的条件下培养实施方案84的宿主细胞。
90.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在蛋白产生的条件下培养实施方案85的宿主细胞。
91.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在蛋白产生的条件下培养实施方案86的宿主细胞。
92.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：在蛋白产生的条件下培养实施方案87的宿主细胞。
93.实施方案91或实施方案92的方法，其中所述条件包括在pH2～6下生长或诱导的时期。
94.实施方案91或实施方案92的方法，其中所述条件包括在22℃～28℃的温度下生长或诱导的时期。
95.实施方案89～92中任一项的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
96.实施方案95的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
97.实施方案89～96中任一项的方法，其中所述宿主细胞在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
98.实施方案97的方法，其中所述柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
99.实施方案97或实施方案98的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
100.实施方案97或实施方案98的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
101.实施方案89～100中任一项的方法，还包括回收所述蛋白质。
102.实施方案95的方法，其中所述蛋白质通过回收所述上清来回收。
103.实施方案95的方法，其中所述蛋白质从所述上清中回收。
104.实施方案95～104中任一项的方法，其中所述回收的蛋白质缺少信号序列。
105.实施方案95～104中任一项的方法，其中所述回收的蛋白质缺少信号序列和活化序列。
106.实施方案89～92和93～105中任一项的方法，还包括：将含所述蛋白质的溶液的pH升高至6～12。
107.实施方案89～92和93～106中任一项的方法，其还包括：使所述蛋白与催化量的弹性蛋白酶接触。
108.实施方案89～92和93～106中任一项的方法，其还包括：
使所述蛋白质经受自体活化条件；
使所述蛋白质与催化量的弹性蛋白酶接触，
或两者兼有。
109.实施方案108的方法，其中所述蛋白质经受自体活化条件。
110.实施方案109的方法，其中所述蛋白质在经受自体活化条件时在所述上清中。
111.产生弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：
(a)在第一柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养能够表达重组原弹性蛋白酶蛋白质的宿主细胞。
(b)从所述宿主细胞培养物中回收所述重组原弹性蛋白酶蛋白质；及
(c)任选地，使所述重组原弹性蛋白酶蛋白质暴露于活化条件，以产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质，
由此产生弹性蛋白酶蛋白质。
112.实施方案111的方法，其中所述方法包括使所述重组原弹性蛋白酶蛋白质暴露于活化条件，以产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的步骤。
113.实施方案112的方法，其中所述重组原弹性蛋白酶蛋白质在所述暴露于活化条件前经纯化。
114.实施方案113的方法，其中所述重组原弹性蛋白酶蛋白质在第二柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下经纯化，以便产生含所述经纯化的原弹性蛋白酶蛋白质和第二柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的溶液。
115.实施方案111～114中任一项的方法，其中所述第一柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
116.实施方案114或实施方案115的方法，其中所述第二柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
117.实施方案114～116中任一项的方法，其中所述第一和第二柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物相同。
118.实施方案114～116中任一项的方法，其中所述第一和第二柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物不同。
119.实施方案114～118中任一项的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
120.实施方案114～118中任一项的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述培养物中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
121.实施方案111～120中任一项的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述溶液中。
122.实施方案111～120中任一项的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述溶液中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
123.实施方案111～122中任一项的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
124.实施方案123的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
125.实施方案111～124中任一项的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质从所述宿主细胞的上清中回收。
126.实施方案111～125中任一项的方法，其中所述活化条件包括暴露于胰蛋白酶。
127.实施方案111～125中任一项的方法，其中所述活化条件是自体活化条件。
128.实施方案111～127中任一项的方法，其还包括分离所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质的步骤。
129.实施方案111～128中任一项的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质是成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质。
130.实施方案129的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
131.实施方案129的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
132.产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：
(a)冻干原弹性蛋白酶蛋白质；
(b)保存冻干的原弹性蛋白酶蛋白质；
(c)复原所述冻干的原弹性蛋白酶蛋白质；及
(d)活化所述复原的原弹性蛋白酶蛋白质，
由此产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
133.实施方案132的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质是重组的。
134.实施方案133的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质由包括下列步骤的方法制备或可由包括下列步骤的方法得到：
(i)在原弹性蛋白酶蛋白质表达的条件下培养能够表达所述原弹性蛋白酶蛋白质的宿主细胞；及
(ii)回收所述原弹性蛋白酶蛋白质。
135.实施方案134的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
136.实施方案135的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
137.实施方案132～136中任一项的方法，其中所述宿主细胞在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
138.实施方案137的方法，其中所述柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
139.实施方案137或实施方案138的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
140.实施方案137或实施方案138的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
141.实施方案132～140中任一项的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质从所述宿主细胞的上清中回收。
142.实施方案132～141中任一项的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质在冻干前经纯化。
143.实施方案132～142中任一项的方法，其中所述冻干的原弹性蛋白酶蛋白质被保存至少1天、至少1周、至少1个月或至少3个月。
144.实施方案132～143中任一项的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质在-80℃～+4℃的温度下保存。
145.实施方案132～144中任一项的方法，其中所述活化步骤包括胰蛋白酶活化。
146.实施方案132～144中任一项的方法，其中所述活化步骤包括自体活化。
147.实施方案132～146中任一项的方法，其还包括分离所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质的步骤。
148.实施方案132～147中任一项的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质是成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质。
149.实施方案148的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
150.实施方案148的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
151.产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：
使重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶蛋白质经受自体活化条件；
使重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶蛋白质与催化量的弹性蛋白酶接触，
或两者兼有，
由此产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质
152.实施方案151的方法，其中所述重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶蛋白质通过包括下列步骤的方法得到或可得到：
(a)在所述蛋白质表达的条件下培养实施方案84或86的宿主细胞；及
(b)回收所述表达出的蛋白质，
由此产生重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶蛋白质。
153.实施方案152的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
154.实施方案153的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
155.实施方案152～154中任一项的方法，其中所述宿主细胞在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
156.实施方案155的方法，其中所述柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
157.实施方案155或实施方案156的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
158.实施方案155或实施方案156的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
159.实施方案152～158中任一项的方法，其中回收所述表达出的蛋白质包括回收所述上清。
160.实施方案159的方法，其中所述自体活化步骤在所述上清中进行。
161.实施方案152～154中任一项的方法，其中所述表达出的蛋白质从所述上清中回收。
162.实施方案161的方法，其中所述自体活化步骤在所述上清中进行。
163.实施方案161的方法，其还包括纯化所述表达出的蛋白质的步骤。
164.实施方案151～163中任一项的方法，其中使所述重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶蛋白质经受自体活化条件包括升高含所述回收到的蛋白质的溶液的pH。
165.实施方案164的方法，其中所述溶液的pH被升高到碱性pH。
166.实施方案165的方法，其中所述碱性pH在7～9的范围内。
167.实施方案166的方法，其中所述碱性pH是8。
168.实施方案164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为10mg/ml或以下。
169.实施方案164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为5mg/ml或以下。
170.实施方案164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为2mg/ml或以下。
171.实施方案164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为1mg/ml或以下。
172.实施方案164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为0.5mg/ml或以下。
173.实施方案164～167中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为0.25mg/ml或以下。
174.实施方案165～173中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为至少0.1mg/ml。
175.实施方案165～173中任一项的方法，其中所述溶液中所述回收到的蛋白质的浓度为至少0.2mg/ml。
176.实施方案165～175中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经0.5～8小时。
177.实施方案174的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经2～7小时。
178.实施方案177的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经6小时。
179.实施方案165～178中任一项的方法，其中所述暴露于碱性pH在22℃～28℃的温度下进行。
180.实施方案179的方法，其中所述暴露于碱性pH在26℃的温度下进行。
181.实施方案152～180的方法，其中所述回收到的蛋白质在自体活化前被保存。
182.实施方案181的方法，其中所述回收到的蛋白质在保存前被冻干。
183.实施方案182的方法，其中所述回收到的蛋白质在冻干前经纯化。
184.实施方案181～183中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质被保存至少1天、至少1周、至少1个月或至少3个月。
185.实施方案184的方法，其中所述回收到的蛋白质在-80℃～+4℃的温度下保存。
186.实施方案150～185中不从属于实施方案160或162的实施方案中任一项的方法，其中所述重组的自体活化的I型原弹性蛋白酶在经受自体活化条件前经纯化。
187.实施方案150～186中任一项的方法，其还包括分离所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的步骤。
188.实施方案150～187中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
189.实施方案150～187中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
190.产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：
(a)在所述蛋白质表达的条件下培养实施方案84或86的宿主细胞；
(b)回收所述表达出的蛋白质；
(c)纯化所述回收到的蛋白质；
(d)升高含所述蛋白质的溶液的pH，或使所述回收到的蛋白质与催化量的弹性蛋白酶接触以产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质，
由此产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质。
191.实施方案190的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
192.实施方案191的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
193.实施方案190～192中任一项的方法，其中所述宿主细胞在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
194.实施方案193的方法，其中所述柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
195.实施方案193或实施方案194的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
196.实施方案193或实施方案194的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
197.实施方案190～196中任一项的方法，其还包括纯化所述成熟的I型弹性蛋白酶的步骤(e)。
198.实施方案190～197中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
199.实施方案190～197中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
200.产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的方法，包括：
(a)在所述蛋白质表达的条件下培养实施方案84或86的宿主细胞；
(b)回收所述表达出的蛋白质；及
(c)使所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH至成熟的蛋白质产生；
由此产生成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质。
201.实施方案200的方法，其中所述宿主细胞在复合培养基中培养。
202.实施方案201的方法，其中所述复合培养基是缓冲的甲醇-复合培养基或缓冲的甘油-复合培养基。
203.实施方案200～202中任一项的方法，其中所述宿主细胞在柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的存在下培养。
204.实施方案203的方法，其中所述柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物分别是柠檬酸钠、琥珀酸钠或乙酸钠。
205.实施方案203或实施方案204的方法，其中一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物以5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM的浓度存在于所述培养物中。
206.实施方案203或实施方案204的方法，其中多于一种柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物存在于所述培养物中，且其中所述溶液中柠檬酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐化合物的总浓度为5～50mM、7.5～100mM、10～150mM、50～200mM、100～150mM、75～125mM或90～110mM。
207.实施方案200～206中任一项的方法，其中所述碱性pH是7～9。
208.实施方案207的方法，其中所述碱性pH是8。
209.实施方案200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为10mg/ml或以下。
210.实施方案200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为5mg/ml或以下。
211.实施方案200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为2mg/ml或以下。
212.实施方案200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为1mg/ml或以下。
213.实施方案200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为0.5mg/ml或以下。
214.实施方案200～208中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为0.25mg/ml或以下。
215.实施方案209～214中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为至少0.1mg/ml。
216.实施方案209～214中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质当暴露于碱性pH时浓度为至少0.2mg/ml。
217.实施方案200～214中任一项的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经0.5～8小时。
218.实施方案217的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经2～7小时。
219.实施方案218的方法，其中所述回收到的蛋白质暴露于碱性pH经6小时。
220.实施方案200～219中任一项的方法，其中所述暴露于碱性pH在22℃～28℃的温度下进行。
221.实施方案220的方法，其中所述暴露于碱性pH在26℃的温度下进行。
222.实施方案200～221中任一项的方法，还包括分离所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质的步骤(d)。
223.实施方案150～222中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶是成熟的猪I型弹性蛋白酶。
224.实施方案150～222中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶是成熟的人I型弹性蛋白酶。
225.产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的制剂的方法，包括：
(a)使自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质经受自体活化条件，以产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质；及
(b)将所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质制成制剂，
由此产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的制剂。
226.实施方案225的方法，其中所述自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质是重组的。
227.实施方案226的方法，还在步骤(a)之前包括：从在原弹性蛋白酶蛋白质表达的条件下生长的能够表达所述自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的宿主细胞的培养物中回收所述原弹性蛋白酶蛋白质。
228.实施方案225或实施方案226的方法，还在步骤(b)前包括：纯化所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
229.实施方案225～228中任一项的方法，其中所述制成制剂的步骤包括冻干所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
230.实施方案229的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质在冻干前不与缓冲液或缓冲液成分混合。
231.实施方案230的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质在冻干后与一种或多种缓冲液成分混合。
232.实施方案229的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质在冻干前与缓冲液或者一种或多种缓冲液成分混合。
233.实施方案231或232的方法，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲液(“PBS”)或所述缓冲液成分是PBS缓冲液成分。
234.实施方案231～233中任一项的方法，其中所述缓冲液含右旋糖酐或其中所述缓冲液成分含右旋糖酐。
235.实施方案234的方法，其中所述右旋糖酐是右旋糖酐-18。
236.实施方案230～235中任一项的方法，其中所述缓冲液含聚山梨酯80。
237.实施方案229～236中任一项的方法，其中所述制成制剂的步骤还包括：用液体复原冻干的成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
238.实施方案237的方法，其中所述液体是水。
239.实施方案237的方法，其中所述液体是缓冲液。
240.实施方案239的方法，其中所述缓冲液是全强度缓冲液、大于全强度缓冲液或小于全强度缓冲液。
241.实施方案237～240中任一项的方法，其中在复原后产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的全强度缓冲液的溶液、大于全强度缓冲液的溶液或小于全强度缓冲液的溶液。
242.实施方案241的方法，其中缓冲液成分
存在于冻干物中，
在复原后即加入，
或二者兼。
243.实施方案240～242中任一项的方法，其中全强度缓冲液含1×PBS。
244.实施方案240或241的方法，其中所述小于全强度缓冲液含0.1×PBS或0.5×PBS。
245.实施方案244的方法，其中所述小于全强度缓冲液含0.1×PBS。
246.实施方案244的方法，其中所述小于全强度缓冲液含0.5×PBS。
247.实施方案240或241的方法，其中所述大于全强度缓冲液含1.1×PBS～3×PBS。
248.实施方案247的方法，其中所述大于全强度缓冲液含1.5×PBS～2×PBS。
249.实施方案241～248中任一项的方法，其中所述缓冲液含右旋糖酐。
250.实施方案249的方法，其中所述右旋糖酐是右旋糖酐18。
251.实施方案241～250中任一项的方法，其中所述缓冲液含聚山梨酯80。
252.实施方案241～251中任一项的方法，其中所述缓冲液的pH为7～8。
253.实施方案252的方法，其中所述缓冲液的pH为7.4。
254.实施方案237～253中任一项的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质复原至0.001mg/ml～50mg/ml的浓度。
255.实施方案254的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质复原至0.1mg/ml～40mg/ml的浓度。
256.实施方案255的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质复原至5mg/ml～30mg/ml的浓度。
257.实施方案256的方法，其中所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质复原至10mg/ml～20mg/ml的浓度。
258.实施方案225～257中任一项的方法，其中所述制剂是含所述成熟的弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物。
259.实施方案225～258中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
260.实施方案225～258中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
261.产生冻干的成熟的I型弹性蛋白酶的方法，包括：
(a)根据实施方案151～181中任一项的方法产生成熟的I型弹性蛋白酶；
(b)分离成熟的I型弹性蛋白酶；及
(c)冻干所述分离出的成熟的I型弹性蛋白酶，
由此产生冻干的成熟的I型弹性蛋白酶。
262.实施方案261的方法，其中所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶为95％～100％纯。
263.实施方案261或实施方案262的方法，其中所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶为至少95％纯。
264.实施方案261或实施方案262的方法，其中所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶为至少98％纯。
265.实施方案261～264中任一项的方法，其中所述冻干的成熟的I型弹性蛋白酶被纯化至均一。
266.实施方案261～265中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
267.实施方案261～265中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
268.实施方案130、149、188、198、223、259和267中任一项的方法，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87构成。
269.实施方案268的方法，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4构成。
270.实施方案131、150、189、199、224、260和268中任一项的方法，其中所述成熟的猪I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ IDNO：39构成。
271.实施方案111～128、132～148、151～197和225～257中任一项的方法，其中所述原弹性蛋白酶蛋白质是实施方案13～27中任一项的蛋白质。
272.实施方案200～222中任一项的方法，其中所述表达出的蛋白质是实施方案13～27中任一项的蛋白质。
273.成熟的人I型弹性蛋白酶，其由实施方案149、188、198和223中任一项的方法产生或可由实施方案149、188、198和223中任一项的方法得到。
274.实施方案273的成熟的人I型弹性蛋白酶，其具有1～40U/mg蛋白质的比活性。
275.成熟的猪I型弹性蛋白酶，其由实施方案150、189、199和224中任一项的方法产生或可由实施方案150、189、199和224中任一项的方法得到。
276.实施方案275的成熟的猪I型弹性蛋白酶，其具有10～100U/mg蛋白质的比活性。
277.药物组合物，其含治疗有效量的：
(a)实施方案273或实施方案274的成熟的人I型弹性蛋白酶，或
(b)由实施方案259的方法产生或可由实施方案259的方法得到的成熟的人I型弹性蛋白酶制剂。
278.实施方案277的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87构成。
279.实施方案278的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4构成。
280.药物组合物，其含治疗有效量的：
(a)实施方案275或实施方案276的成熟的猪I型弹性蛋白酶，或
(b)由实施方案260的方法产生或可由实施方案260的方法得到的成熟的猪I型弹性蛋白酶制剂。
281.实施方案280的药物组合物，其中所述成熟的猪I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：39构成。
282.药物组合物，其含：
(i)治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶，和
(ii)药学可接受载体，
所述药物组合物的特征在于具有下列特征中的至少1项：
(a)所述组合物中无胰蛋白酶；
(b)所述组合物基本上无胰蛋白酶；
(c)所述组合物无由SEQ ID NO：2、3、37、38、70和/或71构成的任意蛋白质；
(d)所述组合物基本上无由SEQ ID NO：2、3、37、38、70和/或71构成的任意蛋白质；
(e)所述组合物无细菌蛋白质；
(f)所述组合物基本上无细菌蛋白质；
(g)所述组合物无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质；
(h)所述组合物基本上无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质。
283.药物组合物，其含：
(i)治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶，和
(ii)药学可接受载体，
所述药物组合物的特征在于具有下列特征中的至少1项：
(a)所述组合物中无胰蛋白酶；
(b)所述组合物基本上无胰蛋白酶；
(c)所述组合物无由SEQ ID NO：70和71构成的任意蛋白质；
(d)所述组合物基本上无由SEQ ID NO：2和3构成的任意蛋白质；
(e)所述组合物无细菌蛋白质；
(f)所述组合物基本上无细菌蛋白质；
(g)所述组合物无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质；
(h)所述组合物基本上无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质。
284.实施方案282或实施方案283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少2项。
285.实施方案284的药物组合物，其中所述至少2项特征包括(a)和(c)。
286.实施方案284的药物组合物，其中所述至少2项特征包括(b)和(d)。
287.实施方案282或实施方案283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少3项。
288.实施方案284的药物组合物，其中所述至少3项特征包括(a)、(c)和(e)。
289.实施方案284的药物组合物，其中所述至少3项特征包括(b)、(d)和(f)。
290.实施方案282或实施方案283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少4项。
291.实施方案284的药物组合物，其中所述至少4项特征包括(a)、(c)、(e)和(g)。
292.实施方案284的药物组合物，其中所述至少4项特征包括(b)、(d)、(f)和(h)。
293.实施方案282或实施方案283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少5项。
294.实施方案282或实施方案283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少6项。
295.实施方案282或实施方案283的药物组合物，其特征在于特征(a)～(h)中的至少7项。
296.实施方案282或实施方案283的药物组合物，其特征在于全部特征(a)～(h)。
297.实施方案282～296中任一项的药物组合物，其无或基本上无1种、2种、3种或全部4种由SEQ ID NO：85、86、94和95构成的蛋白质。
298.实施方案282～297中任一项的药物组合物，其无或基本上无由SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：86构成的蛋白质。
299.实施方案282～297中任一项的药物组合物，其无或基本上无由SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95构成的蛋白质。
300.实施方案282～297中任一项的药物组合物，其无或基本上无1种、2种或全部3种由SEQ ID NO：106、107和108构成的蛋白质。
301.实施方案282～300中任一项的药物组合物，其含药学可接受水平的内毒素。
302.实施方案301的药物组合物，其中所述药物组合物是液体组合物，且其中内毒素的所述药学可接受水平是8EU/ml或以下。
303.实施方案302的药物组合物，其中内毒素的所述药学可接受水平是5EU/ml或以下。
304.实施方案301的药物组合物，其中所述药物组合物是固体组合物，且其中内毒素的所述药学可接受水平是10EU/g成熟的人I型弹性蛋白酶或以下。
305.实施方案304的药物组合物，其中内毒素的所述药学可接受水平是5EU/g成熟的人I型弹性蛋白酶或以下。
306.实施方案282～305中任一项的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶的特征在于1～40U/mg蛋白质的比活性。
307.实施方案306的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶的特征在于25～35U/mg蛋白质的比活性。
308.实施方案306的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶的特征在于大于10U/mg蛋白质的比活性。
309.实施方案306的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶的特征在于大于20U/mg蛋白质的比活性。
310.实施方案282～309中任一项的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶基本上由SEQ ID NO：5、84或87构成。
311.实施方案310的药物组合物，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4构成。
312.实施方案282～311中任一项的药物组合物，其中所述胰蛋白酶活性对应于小于4ng/mg成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质。
313.实施方案312的药物组合物，其中所述胰蛋白酶活性对应于小于2ng/mg成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质。
314.冻干的蛋白质制剂，其基本上由SEQ ID NO：5、84或87构成，其在复原至1mg/ml的所述蛋白质浓度后，所述胰蛋白酶活性对应于小于2ng/ml胰蛋白酶。
315.实施方案314的冻干制剂，其中水分含量小于5％。
316.实施方案315的冻干制剂，其含钠离子、钾离子、磷酸离子和氯离子。
317.实施方案315的冻干制剂，其含聚山梨酯-80。
318.实施方案315的冻干制剂，其含右旋糖酐。
319.实施方案318的冻干制剂，其中所述右旋糖酐是右旋糖酐-18。
320.实施方案311的冻干制剂，其含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子和聚山梨酯-80。
321.实施方案314的冻干制剂，其含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子和右旋糖酐。
322.实施方案321的冻干制剂，其中所述右旋糖酐是右旋糖酐-18。
323.实施方案314的冻干制剂，其含钠离子、钾离子、磷酸离子、氯离子、聚山梨酯-80和右旋糖酐。
324.实施方案323的冻干制剂，其中所述右旋糖酐是右旋糖酐-18。
325.液体制剂，其含至少0.1mg/ml蛋白质溶液，所述蛋白质基本上由SEQ ID NO：5、84或87构成，其中所述胰蛋白酶活性对应于小于2ng/ml胰蛋白酶。
326.实施方案325的液体制剂，其中所述溶液是缓冲溶液。
327.实施方案326的液体制剂，其中所述溶液缓冲至pH7～8。
328.实施方案326的液体制剂，其中所述溶液是PBS。
329.实施方案328的液体制剂，其中所述溶液含137mM氯化钠、2.7mM磷酸钾和10mM磷酸钠。
330.实施方案325～329中任一项的液体制剂，其还含一种或多种赋形剂。
331.实施方案330的液体制剂，其中所述一种或多种赋形剂含右旋糖酐-18。
332.实施方案331的液体制剂，其中所述右旋糖酐-18的量为所述溶液的8％重量/体积。
333.实施方案330的液体制剂，其中所述一种或多种赋形剂含聚山梨酯-80。
334.实施方案333的液体制剂，其中所述聚山梨酯-80的量为所述溶液的0.01％重量/体积。
335.实施方案325～334中任一项的液体制剂，其中所述蛋白质在所述溶液中的浓度在0.001mg/ml～40mg/ml的范围内。
336.实施方案335的液体制剂，其中所述蛋白质在所述溶液中的浓度在0.1mg/ml～20mg/ml的范围内。
337.实施方案325～336中任一项的液体制剂，其还含一种或多种防腐剂、稳定剂和着色剂。
338.实施方案325～337中任一项的液体制剂，其基本上无所述SEQ ID NO：5、84或87的蛋白质之外的哺乳动物蛋白质。
339.实施方案325～338中任一项的液体制剂，其基本上无细菌蛋白质。
340.制剂，其由实施方案225～258中任一项的方法制备或可由实施方案225～258中任一项的方法得到。
341.实施方案340的制剂，其是液体制剂。
342.实施方案340或341的制剂，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
343.实施方案342的制剂，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：5、84或87构成。
344.实施方案342的制剂，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4构成。
345.实施方案340或341的制剂，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
346.实施方案345的制剂，其中所述成熟的猪I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：39构成。
347.从正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质和未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的混合物中除去所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)使含正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质和未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的混合物的组合物经受正确加工的成熟的酶有活性的pH；
(b)保持该pH至一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质降解的时间，
由此从正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质和未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的混合物中除去所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
348.实施方案347的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质相比正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质于N-端含至少一个额外的氨基酸或含更少的氨基酸。
349.实施方案347或348的方法，其中所述pH在5和12之间。
350.实施方案347～349中任一项的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～100％。
351.实施方案348的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～99％。
352.实施方案348的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～98％。
353.实施方案348的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～95％。
354.实施方案348的方法，其中所述一种或多种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解50％～90％。
355.实施方案350～354中任一项的方法，其中多于一种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少50％。
356.实施方案355的方法，其中所述混合物中全部未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少50％。
357.实施方案350～354中任一项的方法，其中至少一种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少75％。
358.实施方案357的方法，其中多于一种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少75％。
359.实施方案357的方法，其中所述混合物中全部未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少75％。
360.实施方案350～354中任一项的方法，其中至少一种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少90％。
361.实施方案360的方法，其中多于一种未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少90％。
362.实施方案360的方法，其中所述混合物中全部未正确加工的成熟的弹性蛋白酶蛋白质被降解至少90％。
363.实施方案347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为10mg/ml或以下。
364.实施方案347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为5mg/ml或以下。
365.实施方案347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为2mg/ml或以下。
366.实施方案347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为1mg/ml或以下。
367.实施方案347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为0.5mg/ml或以下。
368.实施方案347～362中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为0.25mg/ml或以下。
369.实施方案363～368中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为至少0.1mg/ml。
370.实施方案363～368中任一项的方法，其中所述组合物是液体组合物，其中总弹性蛋白酶蛋白质浓度为至少0.2mg/ml。
371.实施方案347～370中任一项的方法，其中所述组合物中的胰蛋白酶活性小于4ng/ml胰蛋白酶/mg总弹性蛋白酶蛋白质。
372.实施方案347～370中任一项的方法，其中所述组合物中的胰蛋白酶活性小于2ng/ml胰蛋白酶/mg总弹性蛋白酶蛋白质。
373.实施方案347～372中任一项的方法，其中所述组合物
无或基本上无由SEQ ID NO：104构成的蛋白质，和/或
无或基本上无由SEQ ID NO：105构成的蛋白质。
374.产生含成熟的I型弹性蛋白酶的药物组合物的方法，所述方法包括：
(i)根据实施方案261～265中任一项的方法产生冻干的成熟的I型弹性蛋白酶；及
(ii)在水或药学可接受的载体中复原冻干的成熟的I型弹性蛋白酶，由此产生含成熟的人I型弹性蛋白酶的药物组合物。
375.产生含成熟的I型弹性蛋白酶的药物组合物的方法，所述方法包括：在水或药学可接受的载体中复原实施方案314～324中任一项的冻干制剂，由此产生含成熟的I型弹性蛋白酶的药物组合物。
376.实施方案374或实施方案375的方法，其中所述药物组合物含磷酸盐。
377.实施方案374～376中任一项的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶是成熟的人I型弹性蛋白酶
378.实施方案377的方法，其特征在于1～40U/mg蛋白质的比活性。
379.实施方案377的方法，其中所述成熟的I型弹性蛋白酶的特征在于25～35U/mg蛋白质的比活性。
380.实施方案377～379中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～100％。
381.实施方案377～379中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～98％。
382.实施方案377～379中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～95％。
383.实施方案377～379中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～90％。
384.实施方案377～379中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存至少1周后、在4℃保存至少1个月后、在4℃保存至少2个月后、在4℃保存至少3个月后、或在4℃保存至少6个月后保持其比活性的60％～80％。
385.实施方案377～384中任一项的方法，其中所述药物组合物中的成熟的人I型弹性蛋白酶在4℃保存1周后保持其比活性的至少70％。
386.药物组合物，其由实施方案374～385中任一项的方法产生或可由实施方案374～385中任一项的方法得到。
387.治疗性地增大有需要的人受试者的动脉或静脉直径的方法，所述方法包括：将下列以足以增大动脉或静脉直径的剂量局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁：
(a)实施方案277～313和386中任一项的药物组合物；
(b)实施方案325～339中任一项的液体制剂；或
(c)实施方案341的制剂。
388.实施方案387的方法，其中血管直径增大、血管腔径增大，或两者均增大。
389.预防或治疗有需要的人受试者的动脉或静脉血管痉挛的方法，所述方法包括：将下列以足以治疗或预防动脉或静脉血管痉挛的剂量局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁：
(a)实施方案277～313和386中任一项的药物组合物；
(b)实施方案325～339中任一项的液体制剂；或
(c)实施方案341的制剂。
390.治疗需要所述治疗的人受试者的阻塞的动脉或静脉的方法，所述方法包括：将下列局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁：
(a)实施方案277～313和386中任一项的药物组合物；
(b)实施方案325～339中任一项的液体制剂；或
(c)实施方案341的制剂，
其中所述施用导致所述动脉或静脉壁中的弹性蛋白的蛋白水解，所述蛋白水解导致所述动脉或静脉直径增大。
391.治疗需要所述治疗的人受试者的连接到动静脉血液透析移植物或动静脉瘘的动脉或静脉的方法，所述方法包括：将下列局部施用于所述人受试者的动脉或静脉壁：
(a)实施方案277～313和386中任一项的药物组合物；
(b)实施方案325～339中任一项的液体制剂；或
(c)实施方案341的制剂，
其中所述施用导致所述动脉或静脉壁中的弹性蛋白的蛋白水解，所述蛋白水解导致所述动脉或静脉直径增大。
392.处理用于血液透析的人受试者静脉的方法，所述方法包括：将下列局部施用于所述人受试者的静脉壁：
(a)实施方案277～313和386中任一项的药物组合物；
(b)实施方案325～339中任一项的液体制剂；或
(c)实施方案341的制剂，
其中所述施用导致所述静脉壁中的弹性蛋白的蛋白水解，所述蛋白水解导致所述静脉直径增大。
393.实施方案387～392中任一项的方法，其还包括：将一部分递送设备插入动脉或静脉壁中，以将弹性蛋白酶递送至所述动脉或静脉壁。
394.实施方案387～393中任一项的方法，其中所述药物组合物或液体制剂通过导管施用。
395.实施方案387～394中任一项的方法，其中所述药物组合物或液体制剂直接施用到所述动脉或静脉壁中。
396.实施方案387～395中任一项的方法，其中所述动脉或静脉被阻塞。
397.实施方案396的方法，其中所述动脉或静脉被狭窄阻塞。
398.实施方案397的方法，其中所述阻塞在治疗前允许通过不足体积的血。
399.实施方案398的方法，其中所述阻塞是狭窄。
400.实施方案399的方法，其中所述动脉或静脉被内膜增生阻塞。
401.实施方案387～400中任一项的方法，其中所述药物组合物或液体制剂被施用于阻塞的冠状动脉或外周动脉。
402.实施方案387～395中任一项的方法，其中所述动脉或静脉易于被内膜增生阻塞。
403.实施方案387～400和402中任一项的方法，其中所述组合物被施用于静脉壁。
404.实施方案403的方法，其中所述静脉连接到动静脉血液透析移植物或动静脉瘘。
405.实施方案404的方法，其中所述静脉用于血液透析。
406.实施方案405的方法，还包括：将所述静脉直接与动脉连接或将所述静脉通过移植物与动脉连接。
407.实施方案387～394中任一项的方法，其中所述组合物被施用于手术暴露的动脉或静脉的外膜表面。
408.实施方案387～407中任一项的方法，其中所述药物组合物、液体制剂或制剂中的成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是人I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
409.实施方案408的方法，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87构成。
410.实施方案408的方法，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4构成。
411.实施方案387～407中任一项的方法，其中所述药物组合物、液体制剂或制剂中的成熟的I型弹性蛋白酶蛋白质是猪I型成熟的弹性蛋白酶蛋白质。
412.实施方案411的方法，其中所述成熟的猪I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：39构成。
413.单元剂，其含0.0033mg～200mg的：
(a)实施方案273或实施方案274的成熟的人I型弹性蛋白酶，或
(b)由实施方案259的方法产生或可由实施方案259的方法得到的成熟的人I型弹性蛋白酶制剂。
414.实施方案413的单元剂，其中所述成熟的人I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：87构成。
415.单元剂，其含0.0033mg～200mg的：
(a)实施方案275或实施方案276的成熟的猪I型弹性蛋白酶，或
(b)由实施方案260的方法产生或可由实施方案260的方法得到的成熟的猪I型弹性蛋白酶制剂。
416.实施方案415的单元剂，其中所述成熟的猪I型弹性蛋白酶蛋白质基本上由SEQ ID NO：39构成。
417.实施方案413～416中任一项的单元剂，其含0.5mg～50mg所述成熟的I型弹性蛋白酶。
418.实施方案417的单元剂，其含1mg～20mg所述成熟的I型弹性蛋白酶。
419.实施方案418的单元剂，其含5mg～10mg所述成熟的I型弹性蛋白酶。
420.实施方案413～419中任一项的单元剂，其在容器、包装、分注器或导管内。
421.试剂盒，其含：
实施方案1～39和68～69中任一项的弹性蛋白酶蛋白质，或者由或可由实施方案89～224、261～276和347～373中任一项的方法得到的弹性蛋白酶蛋白质；
实施方案40～67中任一项的核酸；
实施方案70～72中任一项的载体；
实施方案73～87中任一项的细胞；
实施方案88的细胞培养物上清；
实施方案314～346中任一项的弹性蛋白酶制剂，或者由或可由实施方案261～276中任一项的方法得到的弹性蛋白酶制剂；
实施方案277～313和386中任一项的药物组合物，或者由或可由实施方案374～385中任一项的方法得到的药物组合物；或
实施方案415～420中任一项的单元剂。
422.实施方案421的试剂盒，其为治疗性试剂盒。
423.实施方案422的试剂盒，其含容器、包装、分注器或导管。
424.实施方案423的试剂盒，其为制造性试剂盒。
将提交于2007年12月4日的美国临时申请NO.60/992,319的实施方案书通过引用整体并入本文，且将该实施方案书所示的各实施方式作为特定实施方式并入本文。
本发明不限于本文所述的特定实施方式的范围。实际上，根据之前的描述及附图，对本文所述的本发明之外的各种改变对本领域技术人员而言也是显而易见的。所述改变旨在落入随附实施方案的范围内。
本文引用了各参考文献(包括专利申请、专利和科学出版物)；各所述参考文献的公开内容通过引用整体并入本文。

Claims (10)

1.蛋白质，其含：
(i)含弹性蛋白酶识别序列的弹性蛋白酶活化序列，其可操作连接于
(ii)成熟的弹性蛋白酶的氨基酸序列。
2.权利要求1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：11。
3.权利要求1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：12。
4.权利要求1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：13。
5.权利要求1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQ IDNO：93。
6.权利要求1、权利要求2或权利要求4的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含下列中的任一个：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21。
7.权利要求1的蛋白质，其中所述活化序列含SEQ ID NO：80。
8.权利要求1或权利要求7的蛋白质，其中所述活化序列含SEQID NO：23、SEQ ID NO：72、或SEQ ID NO：73。
9.权利要求1的蛋白质，其中所述蛋白质含切割结构域，所述切割结构域含SEQ ID NO：74。
10.权利要求1或权利要求9的蛋白质，其中所述切割结构域含下列中的任一个：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8501449B2 (en) 2007-12-04 2013-08-06 Proteon Therapeutics, Inc. Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
CN102250863B (zh) * 2011-04-29 2012-12-05 天津金斯坦生物科技有限公司 基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途
SG11201506034TA (en) 2013-03-15 2015-09-29 Alder Biopharmaceuticals Inc Temperature shift for high yield expression of polypeptides in yeast and other transformed cells
US10202630B2 (en) * 2013-03-15 2019-02-12 Alderbio Holdings Llc Temperature shift for high yield expression of polypeptides in yeast and other transformed cells
KR102486713B1 (ko) * 2017-03-10 2023-01-10 볼트 쓰레즈, 인크. 재조합 단백질을 고분비 수율로 생산하기 위한 조성물 및 방법
EP4065167A4 (en) * 2019-11-26 2024-03-27 Children's Hospital Medical Center INHIBITION OF CELA-1 FOR THE TREATMENT OF PULMONARY DISEASE
WO2021146233A1 (en) * 2020-01-14 2021-07-22 Basf Se Method for producing recombinant protein in yeast cells
US20230348881A1 (en) * 2020-08-18 2023-11-02 Onchilles Pharma, Inc. Modified serine protease proproteins
AU2021328359A1 (en) * 2020-08-18 2023-02-02 Onchilles Pharma, Inc. Modified porcine pancreatic elastase proteins

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2508408A (en) 1943-10-11 1950-05-23 Sidney H Liebson Averaging indicator
US2546308A (en) 1948-12-29 1951-03-27 Kahler John Floor marking device
US5212068A (en) * 1985-04-05 1993-05-18 Sankyo Company Limited Human pancreatic elastase
JP2874751B2 (ja) 1986-04-09 1999-03-24 ジェンザイム・コーポレーション 希望する蛋白質をミルク中へ分泌する遺伝子移植動物
US5162205A (en) 1986-04-26 1992-11-10 Sankyo Company, Limited Human pancreatic elastase I
JPH0673456B2 (ja) 1986-04-26 1994-09-21 三共株式会社 ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉ▼
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5543302A (en) 1988-05-27 1996-08-06 Solvay Enzymes, Inc. Proteases of altered stability to autolytic degradation
DK105489D0 (da) 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid
ATE174058T1 (de) 1989-11-06 1998-12-15 Cell Genesys Inc Herstellung von proteinen mittels homologer rekombination
GB8927722D0 (en) 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
NZ236819A (en) 1990-02-03 1993-07-27 Max Planck Gesellschaft Enzymatic cleavage of fusion proteins; fusion proteins; recombinant dna and pharmaceutical compositions
US5503333A (en) 1993-06-23 1996-04-02 Laventure; David Duster extension tube system with dust collecting region and tube cleaner and method of using the same
ATE226642T1 (de) 1994-07-07 2002-11-15 Tno Modifizierte proenzyme als substrate für proteolische enzyme
US5955072A (en) 1994-07-13 1999-09-21 Sankyo Company, Limited Expression systems utilizing autolyzing fusion proteins and a reducing polypeptide
US7531325B2 (en) 1997-04-25 2009-05-12 Sembiosys Genetics Inc. Method for cleavage of fusion proteins
US20030207402A1 (en) 1997-08-22 2003-11-06 Erhard Kopetzki Autocatalytically activatable zymogenic precursors of proteases and their use
GB9817909D0 (en) 1998-08-17 1998-10-14 Zeneca Ltd DNA constructs
GB9908458D0 (en) 1999-04-13 1999-06-09 Queen Mary & Westfield College Enzyme
AU4970900A (en) 1999-05-05 2000-11-21 Genentech Inc. Elastase variants and substrates
US7001892B1 (en) * 1999-06-11 2006-02-21 Purdue Research Foundation Pharmaceutical materials and methods for their preparation and use
US7063838B1 (en) 1999-09-24 2006-06-20 Proteon Therapeutics Llc Methods for treating an artery or vein in a human subject
ES2364191T3 (es) * 1999-09-24 2011-08-26 Proteon Therapeutics, Inc. Sistemas y métodos para abrir conductos biológicos obstruidos.
US7351549B2 (en) 2000-01-24 2008-04-01 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Method for the manufacture of recombinant trypsin
JP2003523756A (ja) 2000-02-24 2003-08-12 フィロス インク． 触媒蛋白質の生成のための改良された方法
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20060189941A1 (en) 2002-01-22 2006-08-24 Mercator Medsystems, Inc. Methods and kits for volumetric distribution of pharmaceutical agents via the vascular adventitia and microcirculation
JP2007525423A (ja) 2003-02-20 2007-09-06 プロテオン セラピューティクス，インコーポレーテッド 生体導管の疾患を治療および予防するための方法
US7571008B2 (en) 2003-08-18 2009-08-04 Medtronic, Inc. System and apparatus for remote activation of implantable medical devices
EP2360474B1 (en) * 2004-06-21 2013-07-24 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
US20090196865A1 (en) 2004-09-22 2009-08-06 Proteon Therapeutics, Inc. Methods for the treatment and prevention of diseases of biological conduits
RU2299070C2 (ru) * 2005-02-08 2007-05-20 Открытое акционерное общество "Химико-фармацевтический комбинат "АКРИХИН" (ОАО "АКРИХИН") Фармацевтическая композиция для лечения заболевания вен и способ ее получения
US20060193824A1 (en) 2005-02-28 2006-08-31 Rubin Bruce K Methods for the treatment of infectious and inflammatory airway diseases
CN1769424A (zh) * 2005-09-20 2006-05-10 浙江大学 一种芽孢杆菌菌株及其用途
KR20170014023A (ko) * 2006-07-05 2017-02-07 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제
US8501449B2 (en) * 2007-12-04 2013-08-06 Proteon Therapeutics, Inc. Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
US7999092B2 (en) * 2008-04-03 2011-08-16 Hudsonalpha Institute For Biotechnology Amplicon rescue multiplex polymerase chain reaction for amplification of multiple targets

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Publication number Publication date
KR101732190B1 (ko) 2017-05-04
HUE032739T2 (en) 2017-10-30
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WO2009079220A3 (en) 2009-08-06
US9057060B2 (en) 2015-06-16
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DK2229440T3 (da) 2013-12-09
CA2707051C (en) 2019-05-21
US20150329846A1 (en) 2015-11-19
JP6084653B2 (ja) 2017-02-22
EP2229440A2 (en) 2010-09-22
US20090162343A1 (en) 2009-06-25
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JP5829808B2 (ja) 2015-12-09
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TWI577385B (zh) 2017-04-11
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NZ601592A (en) 2014-02-28
JP2015172056A (ja) 2015-10-01
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AU2008338743A1 (en) 2009-06-25
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SI2666854T1 (sl) 2017-06-30
US20110008315A1 (en) 2011-01-13
HK1148772A1 (en) 2011-09-16
CY1114724T1 (el) 2016-10-05
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IL206157A (en) 2013-07-31
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TWI619726B (zh) 2018-04-01
PT2229440E (pt) 2013-11-11
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AU2008338743B2 (en) 2015-02-19
MX341317B (es) 2016-08-15
US10308924B2 (en) 2019-06-04
US20190010476A1 (en) 2019-01-10

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