JPH0472565A

JPH0472565A - 検出試薬

Info

Publication number: JPH0472565A
Application number: JP18407190A
Authority: JP
Inventors: Haruma Kawaguchi; 春馬川口; Takeshi Miyazaki; 健宮崎
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1990-07-13
Publication date: 1992-03-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野コ本発明は、検体中の被検出物質に対して免疫的に活性な
物質を固定した固体微粒子を含み、免疫学的な各種の検
出や測定に用い得る検出試薬に関する。

［従来の技術］抗体等の免疫的に活性な物質を担持したポリスチレンな
どの固体微粒子を水等の液媒体中に分散させた分散液（
ラテックス試薬）に、抗原等の前記免疫的に活性な物質
に対して特異的に反応する物質を作用させることにより
起る凝集を観察することで、抗原等の存在を測定するラ
テックス凝集イムノアッセイ法（ＬＡ　Ｉ　Ａ）がジエ
ー・エム・シンガーら［Ｊ、　Ｍ、　Ｓｉｎｇｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｍｅｄ２１、８８８　（１
９５６）］により見出され、その後、種々の検討がなさ
れている。

凝集の程度を視覚で判断するＬＡＩＡを利用した測定法
は、定量的な測定は困難なものの、簡便でかつ結果が短
時間で得られるという利点があり、実用化されており、
各種の検出に広く普及している。

更に、近年、光学機器を利用した光学的手法によって、
反応に応じた着果の度合を光学的な変化でとらえること
で、ＬＡＩＡによる定量的な測定も可能となり、広く行
われるようになってきた。

ＬＡＩＡに用いるラテックス試薬は、上述のように液媒
体中に抗体等を固定した固体微粒子を分散したものであ
る。

しかしながら、固体微粒子の分散液は、本質的に不安定
な系であるために、例えば長時間の貯蔵を行うと、固体
微粒子の凝集を起こし易く、凝集が生じた場合には測定
感度の低下等の問題が生じる。また、凍結保存した後に
解凍した場合、固体微粒子の良好な分散状態が再現され
ず、試薬として利用できなくなる場合か多い。

従って、ラテックス試薬は、その保存に格別の配慮が必
要であった。

こうした保存安定性における問題を改善する方法として
、分散液としてのラテックス試薬を乾燥して、乾燥品と
して保存安定性を高める方法が検討されている。

例えば、特開昭５８−７３８６６号公報には、ラテック
ス試薬等の凝集性免疫試薬を毛細管に注入して、凍結乾
燥させて保存する方法が開示されている。

「発明が解決しようとする課題］ところが、乾燥状態としたラテックス試薬（才、定性的
な測定には十分適用可能であるが、光学的手法を用いた
定量的な測定に適用するには不十分なものであった。

すなわち、蒸発、スプレートライ、凍結乾燥、真空乾燥
などの方法によってラテックス試薬を乾燥させた場合、
固体微粒子間の固着・凝集が生じ、再懸濁に際して固体
微粒子の均一な分散状態が得られなくなり、再現性良い
定量分析が行えなくなる。

乾燥ラテックス試薬の再分散性を向上させる方法として
は、例えば、特開昭５２−１１７４２０号公報に、ラテ
ックス試薬に乳糖などの水溶性糖類を添加した状態で凍
結乾燥させて、乾燥品とする方法が開示されでいる。

この方法によれば、水溶性糖類の添加によって乾燥ラテ
ックス試薬の再分散性はかなり向上されるものの、光学
的手法を用いる定量分析において要求される十分な再分
散性が得られないという問題がなお残されている。

そこで、糖類のような再分散性を高めるための添加剤の
添加量を増やす方法があるが、多量の添加剤の使用は免
疫学的反応に対して感度低下などの急影響を及ぼすため
、添加量の増加には限界がある。

更に、長時間の攪拌や、高い攪拌強度での攪拌を行うこ
とで、より均一な再分散状態を得る方法もあるが、強い
条件での攪拌処理によって免疫的に活性な物質と固体微
粒子との結合状態が破壊されたり、また免疫的に活性な
物質自体が破壊されたりする場合があり、免疫的に活性
な物質と固体微粒子との結合形態や、免疫的に活性な物
質の種類によっては、これらの方法は適用できない。

本発明の目的は、光学的手法を用いた定量分析にも好適
に適用できるＬＡＩＡ用の検出試薬を提供することにあ
る。

本発明の他の目的は、乾燥状態で安定保存可能なＬＡＩ
Ａ用の検出試薬を提供することにある。

本発明の他の目的は、乾燥状態からの液媒体への再分散
性に優れ、得られた再分散液は光学的手法を用いた定量
分析にも好適に適用できるＬＡＩＡ用の検出試薬を提供
することにある。

［課題を解決するための手段〕本発明の検出試薬は、検体中の被検出物質に対して免疫
的に活性な物質を固定した固体微粒子を含む検出試薬に
おいて、前記固体微粒子がアミド基とカルボキシル基を
有する変性ポリスチレンであることを特徴とする。

本発明における担体として機能する変性ポリスチレン微
粒子は、少なくともアミノ基とカルボキシル基を有し、
水性液媒体（水を主体とする液媒体）への分散性に優れ
、本発明の試薬を水性液媒体に分散させてＬＡＩＡ用の
検出試薬として用いることで、定性分析のみならず、光
学的手法を用いた定量分析を行うことができる。

また、本発明の試薬は、乾燥品とした際の保存安定性に
優れ、乾燥品の再分散においても良好な分散性が維持で
きる。

従って、乾燥品の再分散液をＬＡＩＡ用の検出試薬とし
て用いることで、定性分析及び光学的手法を用いた定量
分析を行うことができる。

また、本発明の検出試薬は水性液媒体への分散性に優れ
ているので、その分散液の調製に当たっては、分散性を
高めるための糖類などの添加剤が不要、あるいはその使
用量を更に減少させることができ、また、特別に強度な
攪拌条件による攪拌を行う必要もなく、これらを採用す
ることによる弊害を回避できる。

なお、本発明の試薬の分散液に調製に用いる水性液媒体
としては、水又は水およびアルコール類、ケトン類など
の水と相溶性のある有機溶媒との混合溶媒が使用される
。また分散媒には適宜ｐＨ緩衝剤、蛋白質、界面活性剤
、水溶性高分子化合物などが添加される６ｐＨＭ衝剤は、抗原−抗体反応は一般に溶媒のｐＨの影
響を受けやすいため、最適のｐＨに調節するために添加
され、例えば、リン酸塩やＴｒｉｓＨＣβ緩衝剤などが
使用される。蛋白質は、非特異反応を防止する目的で添
加され、例えば、牛血清アルブミン、セラチンなどが使
用される。また、検出感度の調整か目的で界面活性剤や
ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子化合物か添
加される。

本発明の検出試薬における変性ポリスチレンからなる固
体微粒子は、アミド基及び／又はカルボキシル基を有す
る部位とスチレンを有する部位からなる共重合体、又は
、アミド基及び／又はカルホキシル基で置換したスチレ
ンを有する部位の重合体、又はアミド基及び／又はカル
ホキシル基で置換したスチレンを有する部位とアミド基
及び／又はカルボキシル基を有する部位からなる共重合
体をいう。例えば、アミド基を有するモノマーと、カル
ボキシル基を有するモノマーと、スチレン及びスチレン
誘導体から選択した一種以上とを３元共重合させて得る
ことができる。また、アミド基を有するスチレンとカル
ボキシル基を有するスチレンを２元共重合させて得るこ
ともできる。

また、スチレン及びスチレン誘導体から選択した一種以
上からなる成分Ａと、アミド基を有する千ツマ−からな
る成分Ｂとを共重合させ、得られた共重合体微粒子の有
するアミド基の一部を加水分解しで、カルボキシル基に
変換する方法により得ることができる。

これらの方法の中では、均一粒径の微粒子が得られると
いう点から後者のアミド基の加水分解を利用する方法が
好適である。

この方法では、アミド基の加水分解によってカルボキシ
ル基が生成され、その条件を適宜設定することで、アミ
ド基とカルボキシル基の比率を変化させることができる
という利点もある。

固体微粒子を構成する変性ポリスチレンにおけるアミド
基とカルボキシル基の比率は、アミド基１に対し、カル
ボキシル基は０．０１〜１０００の範囲、より好ましく
は０５〜１００である。

以下、アミド基の加水分解を利用する方法による場合に
ついて説明する。

成分Ａに用いるスチレン誘導体としては、例えば、ａ−
メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ａ−エチ
ルスチレン、ｐ−ビニルスチレン、ｐ−イソプロピルス
チレン、ｍ−フェニルスチレン、ａ−クロルスチレン、
ｐ−クロルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｍ−アミ
ノスチレン、ｐ−シアンスチレンなどを挙げることがで
きる。

成分Ｂしては、例えば、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−
メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−フェニル（メタ）
アクリルアミド、Ｎ−（ジエチルアミンエチル）（メタ
）アクリルアミド、ＮＮ−ジメチル（メタ）アクリルア
ミドなどの（メタ）アクリルアミド誘導体、メチレンビ
ス（メタ）アクリルアミドなどを、単独で、またはこれ
らの二種以上を組合せて用いることができる。

成分Ａと成分Ｂとの共重合には、種々の公知の方法が利
用できる。

例えば、アニオン性界面活性剤、非イオン系界面活性剤
などの存在下に水性液媒体中で水溶性ラジカル開始剤を
用いた乳化重合、界面活性剤を使用せずに、水性液媒体
中で水溶性ラジカル開始剤を用いたソープフリー乳化重
合９部分鹸化ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドン、などの保護コロイドの存在下での懸濁重合、ビニ
ル系千ツマ−は溶解するが重合体は溶解しない液媒体中
で重合させる沈殿重合等の各種の重合法が利用できる。

共重合体中での成分Ａと成分Ｂのモル比は、例えば、１
０５〜１０，００１の範囲とすることができる。

重合における反応条件は、得られる共重合体固体微粒子
の粒径などに応じて適宜設定すれば良い。

固体微粒子の粒径は、特に限定されないが、検出試薬の
液媒体中での分散性、特に乾燥試薬の再分散性等を考慮
すれば、例えば、０，０５μｍ〜５μｍの範囲内である
ことが好ましく、０．１μｍ〜２μｍの範囲内であるこ
とが特に好ましい。すなわち、０．０５μｍ未満の粒径
の場合は、乾燥試薬の再分散が困難になり、また、５μ
ｍを越えると分散液中での固体微粒子の沈殿等か生じ易
くなり、分散液としての試薬の安定性が得られなくなる
。

得られた固体微粒子は、次に加水分解により、アミド基
の一部かカルボキシル基に変換される。

この加水分解は、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水
酸化カリウム水溶液などのアルカリ性水溶液中で行うこ
とができる。

加水分解におけるアルカリ濃度、反応時間、反応温度な
どの反応条件は、所望とするアミド基のカルボキシル基
への変換率や固体微粒子自体の安定性等に応じて適宜選
択される。

例えば、後述の参考例で採用した条件では、第１図に示
すように、加水分解時間を変化させることで、アミド基
のカルホキシル基への変換率を変化させることができ、
この結果を基礎として、加水分解時間を設定すれば、所
望のアミド基のカルボキシル基への変換率を得ることか
できる。

固体微粒子の表面に固定させる免疫的に活性な物質とし
ては、被検出物質の免疫測定に必要な各種物質が用いら
れる。

例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥなどの免疫グロブリン
、補体、ＣＲＰ、フェリチン、α１マイクログロブリン
、β２マイクログロブリンなどの血漿タンパク質や、こ
れらに対する抗体、ａフェトプロティン、癌胎児性抗原
（ＣＥＡ）、前立腺性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）
、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５などの腫瘍マーカー及び
これらに対する抗体、黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵細胞
刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（
ｈＣＧ）、エストロゲン、インスリンなどのホルモン類
及びこれらに対する抗体。

ＨＢＶ関連抗原（ＨＢｓ、ＨＢｅ、ＨＢｃ）、ＨＩＶ、
ＡＬＴなどのウィルス感染関連物質およびこれらに対す
る抗体、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズマ
、梅毒トレボネーマなどのハタテリア類及びこれらに対
する抗体、トキソプラズマ、ｌ−１／コモナス、ワージ
ュマニア、トリバノゾーマ、マラリア原虫などの原虫類
及びこれらに対する抗体、フェニトイン、フエノバルビ
タールなどの抗てんかん薬、キニジン、ジゴキシニンな
どの心血管渠、テオフィリンなどの抗喘息薬、クロラム
フェニコール、ゲンタマイシンなどの抗生物質等の薬物
類及びこれらに対する抗体酵素、菌体外毒素（ストレリ
ジンＯなど）及びこれらに対する抗体などが用いられる
。

免疫的に活性な物質の固体微粒子への固定方法としては
、例えば、固定化酵素（講談社、１９７５、千畑一部編
）などに開示されている酵素等の固定化に用いられてい
る各種の化学的及び／または物理的結合方法が利用でき
る。

例えば、固体微粒子にグルクルアルデヒドなどのポリア
ルデヒドを用いて共有結合によって免疫的に活性な物質
を結合させる方法、特公昭５３−１２９６６号公報、特
開昭５３−５２６２０号公報に開示されている縮合剤と
してカルボジイミドやウッドワード試薬になどを使用し
て免疫的に活性な物質を固体微粒子に結合させる方法な
どを利用することができる。

なお、固体微粒子や免疫的に活性な物質に、免疫測定時
における凝集の検出をより容易とするための着色染料や
、蛍光色素などの標識剤を結合させてもよい。

免疫的に活性な物質の固体微粒子への固定は、水性液媒
体中で行うのが好ましい。この水性液媒体としては、水
、水と有機溶媒との混合物等が利用できる。なお、有機
溶媒としては水と相溶性のあるアルコール類やケトン類
が利用できる。

固定化反応は、反応系中に固体微粒子の安定化、非特異
凝集の生起を防止するなどの目的で、リン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）、１’リス−塩酸緩衝液などの緩衝液中
で、必要に応じて牛血清アルブミンなどの不活性タンパ
ク質、界面活性剤等の存在下に行っても良い。

固定化反応における反応液のｐｈは、通常、６〜１０、
好ましく（よ７〜９とすることかできる。

また、反応液中での固体微粒子の濃度は通常０．０１〜
５．０重量％とすることができる。

免疫的に活性な物質が固定化された固体微粒子を測定用
の水性液媒体に分散させて、分散液としての試薬を得る
ことができる。

この分散液試薬を調製するための液媒体としては、リン
酸緩衝生理食塩水やトリス−塩酸緩衝液などの緩衝液に
、必要に応じて牛血清アルブミンなどの不活性タンパク
質、界面活性剤等を添加したものが利用できる。

更に、免疫的に活性な物質が固定化された固体微粒子の
適当な分散液を調製し、該分散液から液媒体を除去して
、乾燥させることによって乾燥試薬を得ることができる
。

乾燥方法としては、蒸発、スプレートライ、凍結乾燥、
真空乾燥などの方法が利用できるが、６０℃以下、好ま
しくは３０’Ｃ以下の温度で行うのが望ましい。これら
の方法の中では、試薬の感度を定常的に維持できるとい
う点から凍結乾燥が好ましい。

乾燥試薬は、免疫測定用の液媒体に再分散させて、分散
液試薬として測定に用いることができる。

［実施例］以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

参考例１［固体微粒子の合成］還流冷却器、攪拌機及び温度計を備太る３００ｍβ容量
の重合容器中に、水１６０ｍｊ２、四ホウ酸ナトリウム
（Ｎａ、Ｂ２Ｏ，−１０８２０）　０　、　５０　ｇ、
アクノルアミド２０ｇを加え７０℃に加温し、溶解させ
た。

重合容器内に３０分間Ｎ２ガスを導入して、容器内の空
気をＮ２に置換した後、重合開始剤として過硫酸カリウ
ム１．７ｇを添加し、攪拌機で３００ｒｐｍで攪拌しな
がら７０℃で一時間重合反応を行った。

次に、スチレン４０ｇを重合容器内に加えて４時間開条
件で攪拌し、更に、アクリルアミド２ｇを加えて５時間
開条件で攪拌を続け、凝集していないスチレン／アクリ
ルアミド共重合体微粒子のの分散液が得られた。

分散液を室温にもどし、その一部を取り出して合成され
たスチレン／アクリルアミド共重合体微粒子を回収、乾
燥させて、透過型電子顕微鏡で観察したところ粒径０．
７６μｍの均一な大きさの球形粒子が観察できた。

スチレン／アクリルアミド共重合体微粒子を上記の分散
液から遠心分離により回収し、さらに蒸留水で三回洗浄
した後、蒸留水中に固形分２ｏ重量％で共重合体微粒子
が含まれる分散液を得た。

この分散液の２５ｍ℃に、１００ｍｆｆの２０％水酸化
ナトリウム水溶液を加え３０℃で処理し、アミド基をカ
ルボキシル基に変換するための加水分解処理を行った。

反応時間０〜２４時間までの適当な時期に反応液のサン
プリングを行い、生成してくるカルボキシル基の量を電
導度滴定曲線から算出することによりアミド基のカルボ
キシル基への変換率を求めた。

その結果を第１図に示す。

第１図の結果から、２４時間の加水分解時間でほぼ９９
％のアミド基がカルホキシル基に変換された。従って、
加水分解時間を適宜設定することにより、アミド基とカ
ルホキシル基の比率を調整することができる。

実施例１１−１．変性ポリスチレン微粒子の調製参考例１で得た
スチレン／アクリルアミド共重合体微粒子の蒸留水分散
液（固形分２０重量％）の２５ｍｎに、１００ｍｆｆの
２０％水酸化ナトリウム水溶液を加え、３０℃で２４時
間加水分解処理を行い、変性ボリスチし・ン微粒子を得
た。

反応終了後、反応液を塩酸で中和し、変性ポリスチレン
からなる固体微粒子を遠心分離により回収し、蒸留水で
４回洗浄し、固形分１０％の分散液を調製した。

得られた分散液中の固体微粒子におけるアミド基のカル
ホキシル基への変換率を電導度滴定曲線より算出したと
ころ、９９％であった。また、カルボキシル基の表面密
度は５　、０　ｕｎｉｔ／ｎｍ”であった。

１−２　抗体の固定化上記１−１項の操作で得た変性ポリスチレン微粒子の分
散液の０．５ｍｆｆにＮ／１５リン酸塩緩衝液（ｐＨ８
，０）の５ｍｊ２．１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルホジイミトハイトロクロライト（
ＷＳＣ）の０．１２ｇを加え、室温で三時間振盪した。

次に、Ｎ／１５リン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）で遠心分
離により変性ポリスチレンからなる固体微粒子の洗浄を
三回行い、固体微粒子を回収した。

回収された固体微粒子に、ＣＲＰ抗体溶液（Ｃｏｏｐｅ
ｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　　Ｉｎｃ社製の抗ヒトＣＲ
Ｐヒツジ血清ＩｇＧ画分をＩｇＧが１ｍｇ／ｍｆｆとな
るようにＰＢＳで希釈して調製）の５ｒ＋１２を加え、
室温で三時間振盪し、抗体感作固体微粒子を得た。

抗体感作固体微粒子を、遠心分離により回収し、Ｎ／１
５リン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）で洗浄し、１％濃度で
牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７，２）に分散さ
せて抗体感作固体微粒子の分散液を得た。

１−３　乾燥試薬の調製上述の１−２項の操作で得た抗体感作固体微粒子の分散
液を液体窒素中で凍結減圧乾燥して、乾燥試薬を得た。

１−４．再分散性の評価上述の１−３項の操作で得た乾燥試薬の２０ｍｇをガラ
スセル内に入れ、これにＰＢＳを１ｍ！加え、出力２５
Ｗ（２０ｋＨｚ）で３０秒間超音波攪拌を行い、ＰＢＳ
中に抗体感作固体微粒子を再分散させて、測定用試薬（
分散液）を調製した。

得られた測定用試薬中の抗体感作固体微粒子の再分散性
をフローサイトメーターで測定し、単分散度（Ｍ％）を
算出した。

なお、単分散度（Ｍ％）は次式より算出した。

その結果を表１に示す。

１−５　抗原の定量標準ＣＲＰ血清（医学生物学研究所）の所定の濃度シリ
ーズを調製し、各濃度サンプル（０，５ｍで）と上述の
操作で乾燥試薬を再分散させで得た測定用試薬（０，５
ｍｆｆ）とを個々に３７℃で反応させ、抗原−抗体反応
による凝集状態を６３３ｎｍの光の照射における吸光度
として測定した。その結果、８μｇ　／　ｍ　１２以上
のＣＲＰ濃度において、ＣＲＰの定量を行なった。

実施例２参考例１で得たスチレン／アクリルアミド共重合体微粒
子の蒸留水分散液（固形分２０重量％）（７）　２５　
ｍ　１２に、１００ｒｎＪ２の２０％水酸化ナトリウム
水溶液を加え、３０℃で７時間加水分解処理を行い、変
性ポリスチレンを得た。

得られた分散液中の固体微粒子におけるアミド基のカル
ボキシル基への変換率を電導度滴定曲線より算出したと
ころ、６７％であった。また、カルボキシル基の表面密
度は３　、４　ｕｎｉｔ／ｎｍ２であった。

得られた変性ポリスチレン微粒子の分散液を用い、実施
例１の１−２〜１−５項と同様にして、抗体（ＣＲＰ）
の固定化、乾燥試薬の調製、ＰＢＳへの再分散及びＣＲ
Ｐの定量を行った。

再分散の際に実施例１の１−４項と同様にして算出した
単分散度（Ｍ％）の結果を表１に示す。

なお、本実施例の測定用試薬（分散液）では、８μｇ　
／　ｍ　１２の濃度においてＣＲＰの定量を行なった。

実施例３参考例１で得たスチレン／アクリルアミド共重合体微粒
子の蒸留水分散液（固形分２０重量％）の２５ｍでに、
１００ｍｊ２の２０％水酸化ナトリウム水溶液を加え、
３０℃で１０分間加水分解処理を行い、変性ポリスチレ
ン微粒子を得た。

得られた分散液中の固体微粒子におけるアミド基のカル
ホキシル基への変換率を電導度摘定曲線より算出したと
ころ、２％であった。また、カルボキシル基の表面密度
は０１　ｕｎｉｔ／ｎｍ２であった。

得られた変性ポリスチレン微粒子分散液を用い、実施例
１の１−２〜１−５項と同様にして、抗体（ＣＲＰ）の
固定化、乾燥試薬の調製、ＰＢＳへの再分散及びＣＲＰ
濃度の定量を行った。

なお、本実施例の測定用試薬（分散液）液では、８μｇ
／ｍ℃の濃度においてＣＲＰの定量を行なった。

実施例４抗ヒトミーフェトプロティン（ウマ）（ＡＦＰ）血清（
ミドリ十字製）からプロティンＡを固定したセファロー
ス（ファルマシア製）を用いたカラムクロマトグラフィ
ーによりＩｇＧ画分を分画し、これをＯ，１Ｍリン酸塩
緩衝液（ｐＨ７２）で１０ｍｇ／ｍｎの濃度に希釈し、
ＩｇＧ画分抗体溶液を調製した。

実施例１の１−１項で得た変性ポリスチレン微粒子の分
散液（固形分１０重量％）の０．５ｍＸに、Ｎ／１５リ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）の５ｍ２、ＷＳＣの０．１
２ｇを加え、室温で三時間振盪した。

振盪終了後、反応液中に先に調製した抗体溶液の１ｍＪ
２及びＮ／１５リン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）の４ｍ！
２を加え、室温で３時間振盪し、抗体感作固体微粒子を
得た。

得られた抗体感作固体微粒子を遠心分離で回収し、Ｎ／
１５リン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）で洗浄した後、ＰＢ
Ｓに分散させて分散液を得た。

この分散液を用い、実施例１の１−３〜１−４項と同様
にして、乾燥試薬の調製、ＰＢＳへの再分散を行った。

更に、標ｐｃＲｐ血清の代わりに、標準△ＦＰ血清（協
和油化化学製）を用いて、実施例１の１−５項と同様に
して、ＡＦＰ濃度の定量を行った。

なお、本実施例の測定用試薬（分散液）液では、１μｇ
　／　ｍ　Ａ以上の濃度においてＡＦＰの定量を行なっ
た。

実施例５実施例２で得た変性ポリスチレン微粒子の分散液０．５
ｍ℃にＮ／＋５ワン酸塩緩衝液（ｐＨ８０）の５ｒｒ１
２、ＣＲＰ抗体溶液（１０ｍｇ／ｍβ）の０．５ｍ℃を
加え、室温で３時間振盪し、抗体感作固体微粒子を得た
。

得られた抗体感作固体微粒子を遠心分離で回収し、更に
Ｎ／１５リン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）で洗浄後、１％
濃度で牛血清アルブミンを含むＰＢＳ　（ｐＨ７，２）
に分散させて抗体感作固体微粒子の分散液を得た。

この分散液を用い実施例１の１−３〜１−５項と同様に
して、乾燥試薬の調製、ＰＢＳへの再分散及び抗原濃度
の定量を行った。

なお、本実施例の測定用試薬（分散液）液では、９μｇ
　／　ｍ　Ａの濃度においてＣＲＰの定量を行なった。

比較例粒径０．７２１μｍのポリスチレンラテックスＣ日本合
成ゴム製）の蒸留水分散液（固形分１０％）の０．５ｍ
℃に、Ｎ／＋５ワン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）の５ｒｎ
Ｊ２及びＣＲＰ抗体溶液（１０ｍ　ｇ　／　ｍ　１２　
）を加え、室温で３時間振盪し、抗体感作固体微粒子を
得た。

得られた抗体感作固体微粒子を遠心分離で回収し、更に
Ｎ／１５リン酸塩緩衝液（ｐＨ８゜Ｏ）で洗浄後、１％
濃度で牛血清アルブミンを含むＰＢＳ　（ｐＨ７，２）
に分散させて抗体感作固体微粒子の分散液を得た。

この分散液を用い実施例１の１−３〜１−５項と同様に
して、乾燥試薬の調製、ＰＢＳへの再分散及び抗原濃度
の定量用検量線の作成を行った。

なお、本比較例の測定用試薬（分散液）液では、１５μ
ｇ　／　ｍ℃の濃度においてＣＲＰの定量を行なった。

表　　１［発明の効果］本発明の検出試薬に用いた担体としてのアミド基とカル
ボキシル基を有する変性ポリスチレン微粒子は、水を主
体とする液媒体への分散性に優れ、分散液としＬＡＩＡ
用の検出試薬として用いることで、定性分析のみならず
、光学的手法を用いた定量分析を行うことができる。

また、本発明の検出試薬は、乾燥品としての保存安定性
に優れるばかりでなく、再分散性においても優れており
、再分散して調製した分散液は、ＬＡＩＡ用の検出試薬
として、定性分析及び光学的手法を用いた定量分析に再
現性良い結果を与えるものとして好適に用いることがで
きる。

また、乾燥品の再分散による分散液の調製に当たっては
、特別に強度な攪拌条件による攪拌を行う必要がなく、
検出感度の低下を招くことなく短時間で測定用試薬（分
散液）の調製が行え、測定時間の短縮化が計れる。

【図面の簡単な説明】第１図はスチレン／アクリルアミド共重合体のアルカリ
水溶液での処理における処理時間とアミド基のカルボキ
シル基への変換率との関係を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１）検体中の被検出物質に対して免疫的に活性な物質を
固定した固体微粒子を含む検出試薬において、前記固体
微粒子がアミド基とカルボキシル基を有する変性ポリス
チレンであることを特徴とする検出試薬。２）変性ポリスチレンが、スチレンからなる成分Ａと、
アミド基を有するモノマーからなる成分Ｂとの共重合体
のアミド基の一部を加水分解してカルボキシル基に変換
して得られたものである請求項１に記載の検出試薬。３）共重合体中での成分Ａと成分Ｂのモル比が、１：０
．５〜１：０．００１の範囲にある請求項２に記載の検
出試薬。４）成分Ｂがアクリルアミドである請求項２または３に
記載の検出試薬。５）乾燥状態にある請求項１〜４のいずれかに記載の検
出試薬。