JPH0460632B2

JPH0460632B2 -

Info

Publication number: JPH0460632B2
Application number: JP13594787A
Authority: JP
Inventors: Norihiko Suzuki; Koji Kikuchi; Reito Kotegawa; Akira Ooi; Yoichi Suzuki; Yasuo Matsui; Yoshihiro Ootaki
Original assignee: ZENKOKU NOGYO KYODOKUMIAI RENGOKAI
Current assignee: ZENKOKU NOGYO KYODOKUMIAI RENGOKAI
Priority date: 1987-05-30
Filing date: 1987-05-30
Publication date: 1992-09-28
Also published as: JPS63301782A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は、発酵乳、乳酸飲料、チーズなど乳酸
発酵生産加工食品の製造に有用な莢膜多糖産生乳
酸菌に関する。（従来の技術）従来ケフイア粒から莢膜多糖産生乳酸菌株を分
離する方法は知られている。（例えば、日本農芸
化学会Vo1.60，No.12，1986，P114−115、国立国
会図書館所蔵「Kefir grainの微生物学的研究」
小原直弘昭和55年論文に発表されたＳ−10−LR
株。）（発明が解決しようとする問題点）上記の分離株は、上記の文献に発表されている
ように、培地の種類、条件によつては、形態異常
をしばしばおこし正常な増殖が得られない欠点が
ある。（問題点を解決するための手段）本発明は、上記の分離株と異なり、培地の種
類、条件が変わつても、正常な増殖が得られ、培
養が容易であり、且つ発酵乳、チーズ、乳酸飲料
などの各種の乳酸発酵生産品の製造に適用し有利
である新規な莢膜多糖産生乳酸菌を提供するもの
で、ラクトバチラス属に属し、（Ｇ＋Ｃ）含有率
が41.94±0.18％であり且つ変異原物質G1u−Ｐ−
２、ベンツピレンに対し抗変異原性を示すと共に
IMCカルシノーマ細胞増殖に対し抑制効果を有
する莢膜多糖を産生することを特徴とするZKB
−101株（微工研菌寄第9229号）に存する。（実施例）次に本発明の実施例を説明する。本発明により、ケフイアグレインより、上記の
目的の新規乳酸菌を分離する方法は、例えば次の
ように行なう。市販ケフイアグレインを、滅菌し
た10％脱脂粉乳培地で植継ぎを行ない、ケフイア
グレインの活性化をはかり、活性化したケフイア
グレインの少量、例えば0.2〜1.0ｇ程度を、滅菌
した乳針に分取し、滅菌水等を少量加え、ケフイ
アグレインを十分摩砕する。微細化したケフイア
グレインを滅菌水で希釈し、GYP培地、GYPB
培地などの組成成分を、蒸溜水又は市販牛乳に乳
酸を加え調製した乳酸ホエーに溶かして調製した
培地に接種し、充分に炭酸ガス置換した状態で30
℃で３〜10日間培養し、出現したコロニーを視診
し、次に白金線で触診して糸を引くような粘性の
あるコロニーを選択し分離した。分離した菌は、
同一分離法を３〜４回繰返しおこない純化をし
た。純化した菌は、India ink法を用いて莢膜多
糖の確認を行なつた。分離、純化した数株を、
GYPB培地、WYA培地などの培地を用い30℃で
培養し、増殖が速く、培地粘性の高い１株を代表
菌ZKB−101株とした。該菌株につき、菌学的諸
性質を検べた結果は下記の通りであつた。 (a) 形態細胞の形及び大きさ１×２〜13μｍの桿菌
状細胞の多形性特に認められない運動性なし胞子形成せずグラム染色性＋抗酸性＋ (b) GYP培地及びGYPB培地における性状
コロニーの性状１形状：円形２大きさ：0.5〜10mm ３隆起：凸円形４周縁：円滑５表面：円滑６構造：均質、露滴状７色調：白色８透明度：半透明９硬度：粘稠 (c) 生理学的性質硝酸還元 − グラム染色＋カタラーゼ − ゼラチン液化 − 発酵形式ホモ型乳酸発酵乳酸旋光性Ｄ色素の生成 − 酵素に対する態度通性嫌気性乳酸生成 89〜90％生育範囲PH 4.5〜6.5 〃温度 25〜37℃ リトマスミルク凝固し色素還元糖類発酵性ＡＢＡＢアミグダリン− − アラビノース − − セロビオース− − フラクトース＋＋ガラクトース− ＋グルコース＋＋グルコネート− − クラトース＋＋マルトース − ＋マンニトール − − マンノース＋＋メリビオース − ＋ラフイノース− ＋ラムノース − − リボース − − サリシン − − ソルビトール− − スユクロース＋
＋トレハロース− − キシロース − − エスクリン − − メレチトール − − （但、Ａは下記表２培地Ｂは下記表３培地）莢膜多糖＋（Ｇ＋Ｃ）含有率 41.94±0.18 抗変異原性エイムズ法によりGlu−ｐ−２
に対し抗変異原性を示した。抗腫瘍特に、注射により、ラツトの
IMCカルシノーマ細胞増殖を抑制した。上記の菌学的性質を有する菌株、ZKB−101株
は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第9229号として寄託した。上記の菌学的諸性質に関連し、更に詳細に各種
試験結果につき説明する。乳酸旋光性試験： ZKB−101株をGYPB培地で24時間前培養した
ものを集菌し、生理食塩水で一回洗浄、10倍に希
釈したものを２滴づつを、下記培地(1)〜(5)の各10
mlに接種し、30℃で３日間培養した。その培養液
を遠心分離で除菌し、得た上澄液に1N塩酸でPH
2.0に調整した上で活性炭を加え数分間煮沸した
後、紙にて過する。この各液を減圧濃縮
し、これに1N塩酸１滴とエーテル５mlを加え充
分混合し、一晩放置した後、エーテル属を分取、
エーテルを蒸発させ、その残渣に蒸留純水５mlを
加え、0.45μｍのミリポアにて過してサンプル
液を得る。培地(1)（GYPB培地）（PH5.8）：

【表】培地(2)：前記培地(1)組成より酢酸ソーダを除去し
たもの（PH5.8）培地(3)：前記培地(1)組成よりBios−2000と酢酸
ソーダを除去したもの（PH5.8）培地(4)：培地(3)組成でPH6.8としたもの培地(5)：前記培地(1)組成によりBios−2000を除
去したもの（PH6.8）前記の各サンプル液につき、乳酸の旋光性を、
高速液体クロマトグラフイーで、シグマ製Ｄ−乳
酸及びＬ−乳酸を標準として測定した。高速液体
クロマトグラフイー条件は、次の通りであつた。カラム：CHIRALPAK WH（φ0.46×25cm）溶出液：0.25ｍＭ CuSO₄溶液流速：１ml／分温度：40℃ 検出器：SPD6AV：220nm 測定結果は、下記表１の通りであつた。

【表】糖類発酵性試験： ZKB−101株をGYPB培地で30℃、24時間前培
養した培養液を遠心分離3000r.p.m15分間で集菌
し、これを滅菌済生理食塩水で３回遠沈洗浄を繰
り返して接種用菌液とした。下記表２に示す発酵
性糖類用基本培地

【表】レーブ殺菌
組成を、蒸溜水に溶解したもの（YP培地）、市
販の成分無調整牛乳に乳酸を加えて調製した乳酸
ミルクホエー液をラクトース発酵能をもつ酵母で
発酵し無糖としたものに溶解したもの（NWYP
培地）、前述の乳酸ミルクホエー液を限外過膜
（分画分子量100000）で処理し無糖化したもの
（UNWYP培地）に溶解したものの３種を調整
し、その夫々に上述のZKB−101菌液を接種し、
30℃で培養した。培養は、通常培養と炭酸ガス置
換による嫌気的培養を行なつた。供試糖類として
は、前記の12糖類発酵性に列挙したものを前記の
基本培地に夫々2.0％添加した。その試験結果は、
前記の菌学的性質の糖発酵性の＋−で示す通りで
あつた。下記表３に示す発酵性糖類用培地で、上記の接
種用菌液を接種し、CO₂置換30℃７日間培養を行
ない、O.D.600nmで菌の増殖を観察した。この結
果、フラクトース、ガラクトース、グルコース、
ラクトース、マルトース、マンノース、メリビオ
ース、ラフイノース、シユクロースの９種の糖に
発酵性を示した。

【表】このように、培地組成の相異により糖の発酵パ
ターンが変わることを確認した。生育温度試験： GYPB培地で30℃24時間前培養し、活性化し
たZKB−101株を使用し、GYPB培地（PH5.8）に
１滴ずつ接種して、15，20，25，28，30，37，40
℃の各温度で７日間培養し、菌の増殖を判定し
た。７日目で増殖の認められない温度区について
は、培養を継続して14日目で判定した。判定結果は、下表に示す通り、15℃、20℃、40
℃の３区では増殖が認められなかつた。このこと
から、ZKB−101株は、25〜37℃の範囲に生育温
度があり、28〜30℃に至適温度があると判定し
た。

【表】生育PH試験：前記と同様に前培養し活性化したZKB−101株
を、培地初発PHをPH3.5，4.0，5.0，5.5，6.0，
7.0，8.0，9.0に夫々調整し、0.45μｍミリポアフ
イルター過除菌したGYPB培地に１滴づつ接
種し、30℃で培養７日間の生育状態を観察した。
その結果は下記表５に示す通りであつた。該表か
ら分かるように、PH3.5，4.0，7.0，8.0，9.0では
生育は認められず、PH4.5〜6.5の範囲で生育し、
特にPH5.0〜5.5において生育が旺盛で至適であ
る。

【表】ミルクに対する挙動： ZKB−101株を、GYPB培地で前培養したもの
を、次の４種のスキムミルク培地に接種し、25
℃、30℃、35℃の各温度で14日間培養試験を行な
つた。 10％スキムミルクPH6.7 10％スキムミルクPH5.9 10％スキムミルク＋0.5％Bios−2000PH6.7 10％スキムミルク＋0.5％Bios−2000PH5.7 その試験結果は、下記表６に示す通りであつ
た。

【表】表内容中の数値Ｎ／10NaOH液で、生成乳酸
を中和するに必要な滴定値を示す。上記表から明らかなように、ZKB−101株は、
温度が25℃及び35℃の適性温度であつても、PHが
6.7では生育しない。Bios−2000の添加は、培養
温度を25℃、PH6.7の場合でも生育可能となり、
PH5.9においては、各培養温度区において生育上
の促進効果があることがみとめられた。莢膜多糖産生能試験： ZKB−101株を、上記の糖類発酵性試験で使用
したと同じ表１の培地と表２の培地の夫々を使用
し且つその夫々の培地において夫々の発酵性糖を
糖源としてその培地組成分として夫々含ませて調
整した夫々の培地で培養したが、その全ての培地
において、糖源を異にしても量の多少はあるが、
莢膜多糖を産生することが認められた。この性質
は、他の多糖産生菌と相異し、糖の発酵性と莢膜
多糖産生の間に基質特異性が認められないという
特性と考えられる。凍結および凍結乾燥耐性試験：一般に使用されている10％脱脂粉乳に１％グル
タミン酸ソーダを加えた保護剤の存在下で、凍結
および凍結乾燥した。この状態で−20℃で長期保
存後、解凍又は復水したが、死滅なく、これを発
酵生産に使用したが、良好に多糖産生をもたらし
た。即ち、凍結及び凍結乾燥保存性を有する。（Ｇ＋Ｃ）含有率測定： ZKB−101株の分類学的な位置付けを明確にす
るために、DNA中の（Ｇ＋Ｃ）含有率を、市販
DNA−GC Kitを使用して高速液体クロマトグラ
フイーにより測定した。その測定結果は、17サン
プルの測定結果より、平均41.944、分散0.0302、
標準偏差0.1738、最高値42.2300、最低値41.6376
範囲0.5924、変動数0.0041となり、ZKB−101株
の（Ｇ＋Ｃ）含有率は、41.94±0.18となつた。以上のZKB−101株の諸性質について、バージ
エーズマニユアルオブデターミナテイブバク
テリオロジー（Bergey′s Mannual of
Determinative Bacteriolgy）第９版およびその
他の文献により検索した。その結果、ZKB−101
株は、ラクトバチラスに属し、近縁と見られるラ
クトバチラスヘルベテイカス、ラクトバチラス
アシドフイラスの諸性質の或る部分では類似の
点があるが、決定的に相異する点は、後者の両菌
株は、莢膜多糖産生能を有しないこと及びその
（Ｇ＋Ｃ）含有率が夫々37〜40％及び32〜37％で
あり、ZKB−101株と（Ｇ＋Ｃ）含有率が相異す
る。又従来の技術において述べた多糖産生能を有
するＳ−10−LR株と比較した場合は、ZKB−
101株は、通常寒天培地の寒天濃度1.2〜1.5％で
増殖し、コロニーも出現するが該Ｓ 10−LR株
は、増殖しない。又、ZKB−101株では、異常形
態は発現しないが該Ｓ−10−LR株はしばしば螺
旋状の細胞が出現する。又、ILS培地で、ZKB−
101−株は、微弱ではあるが増殖するが、該Ｓ−
10−LR株は増殖できない。更に、該ZKB−101
株の（Ｇ＋Ｃ）含有率が41.94±0.18であるに対
し、後者のそれは、39.3％である（仝文献記載）
点などで、結局、ZKB−101株は、（Ｇ＋Ｃ）含
有率が41.94±0.18％である点において特有であ
り、新規と判定した。更に、ZKB−101株が新菌としての特徴は、下
記詳述するように、IMCカルシノーマ細胞に対
し抑制効果を有する莢膜多糖を産生することであ
る。従来、ケフイアグレインから分離した多糖は
経口投与によりマウスのエーリツヒカルシノーマ
（EC）即ちザルコーマの生長を40〜80％程度阻止
することが報告されているが、ZKB−101株は、
IMCカルシノーマ患部にその多糖物質を注射す
ることにより有効であることが認められる点で新
規の抗ガン性物質を産生することが確認された。 ZKB−101株の産生する莢膜多糖の抗IMC腫瘍効
果試験： ZKB−101株を、GYPB培地に接種し、30℃で
24〜48時間培養し、その培養液を80〜100℃に加
温後8000〜12000r.p.m.15〜30分間遠心分離をお
こない菌体を集菌除去し、上清を得る。この上清
液１量部に対してエタノール1/2量部を添加し攪
拌混合した後3000r.p.m.15分間の遠心分離で沈澱
物を除去する。さらに、この上清液に、エタノー
ル1/2量部を加え、始めのエタノール量と合わせ
上清液に対し等量となるようにし、3000r.p.m，
15分間の遠心分離で沈澱物（粗多糖）を得る。こ
の沈澱物を培養液量の1/10量の蒸溜水に溶解し、
等量のエタノールで再沈澱操作を行う。この操作
を３回繰り返して得られた沈澱物を少量の蒸溜水
で溶解させ、セルロースチユーブで１夜（12〜16
時間）流水透析を行なう。透析後これをそのまゝ
又は減圧濃縮して凍結乾燥を行ない下記試験用の
粗多糖を得る。抗変異原性試験：上記の粗多糖を、微生物を利用したエイムズ
（Ames）法により抗変異原性試験を行なつた。
その結果GLu−ｐ−２において、G1u−ｐ−２
濃縮1.0μｇ／プレート、Ｓ−９ 25μｇ／プレー
トの条件で、コントロールの蒸溜水区では復帰変
異コロニー数が1532個／プレートであるに対し、
粗多糖区では890コロニー／プレートで42％減少
し、ベンツピレン溶液5μｇ／プレート、Ｓ−
９ 50μｇ／プレートの条件で、コントロールの
蒸溜水で復帰変異コロニー数327個／プレートに
対し、粗多糖区では203コロニー／プレートで38
％を減少することができた。抗IMC腫瘍試験：この粗多糖を、日本薬局方注射用蒸溜水或は日
本薬局方生理食塩水を用いて、所定の夫々の濃度
をもつ調整液を夫々作成した。抗IMC腫瘍試験
は、IMCカルシノーマ細胞を２×10⁷セル／mlに
調製した細胞浮遊液をCDF、マウス一匹当り0.05
ml（１×10⁶セル／マウス）皮内に移植し、移植
後３日、７日、10日、14日、17日及び21日に合計
６回、前記の粗多糖調製液（以下ZK426−Ｂと称
す）及び生理食塩水を腫瘍内に注射により0.1
ml／マウス投与した。その投与モデル図は、第１図示の通り、その投
与群構成は下表７に示す通りである。

【表】抗腫瘍性効果の判定は、原則として、週２回、
腫瘍径（長径×短径）をノギスを用いて測定し
た。又移植後24日目に屠殺して腫瘍重量を測定
し、腫瘍縮小率（Ｔ／Ｃ％）を算出した。その結
果は、第２図に示す通りであつた。解剖時に測定
した腫瘍重量縮小率（Ｔ／Ｃ％）は、50μｇ／マ
ウス群で300±40mg59％、100μｇ／マウス群で
224±126mg（44％）、200μｇ／マウス群で233±
98mg（46％）を示した。又、第２図から明らかな
ように、多糖液の注射によりIMC腫瘍の増殖速
度をおくらせることができ、多糖液の濃度が高い
ほど抑制効果が大きいことが分る。（発明の効果）このように本発明は、新規な莢膜多糖産生乳酸
菌として、ラクトバチラス属に属し（Ｇ＋Ｃ）含
有率が41.94±0.18％であり且つ変異原物質G1u−
ｐ−２、ベンツピレンに対し抗変異原性を示すと
共にIMCカルシノーマ細胞増殖に対し抑制効果
を有する莢膜多糖を産生するZKB−101株（微工
研菌寄第9229号）を提供したので、これをケフイ
アなどの乳酸飲料、その他各種乳酸発酵生産品の
製造に使用し、産生される莢膜多糖により品質の
安定良好な発酵乳などの発酵生産が可能となり、
また保健性のある乳酸発酵製品を提供できるなど
の効果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は投与モデル図、第２図は、本発明新菌
が産生する莢膜多糖のIMCカルシノーマに対す
る抗ガン性を示す特性曲線を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１ラクトバチラス属に属し、（Ｇ＋Ｃ）含有率
が41.94±0.18％であり且つ変異原物質G1u−Ｐ−
２、ベンツピレンに対し抗変異原性を示すと共に
IMCカルシノーマ細胞増殖に対し抑制効果を有
する莢膜多糖を産生することを特徴とする莢膜多
糖生乳酸菌ZKB−101株（微工研菌寄第9229号）。