JPS63301782A - 莢膜多糖産生乳酸菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、乳酸飲料、チーズなど乳酸発酵生産加工食品
の製造に有用な莢膜多糖産生乳酸菌に関する。

（従来の技術］ 従来ケフィア粒から莢膜多糖産生乳清菌株全分離する方
法は知られている０、（例えば、日本農芸化学会Ｖｏ１
．６０　、　Ａｔ　２　、１９８６　、Ｐｔ１４−ｔｔ
Ｓ、国立国会図書館所蔵ｒ　Ｋｅｆｉｒ　ｇｒａｉｎの
微生物学的研究」小原直弘昭和５５年輪文に発表され７
’ｌ：Ｓ−１０−ＬＲ株、）（発明が解決しようとする
問題点ｌ 上記の分離株は、上記の文献に発表されているように、
培地の種類、条件によっては、形態異常をしばしばおこ
し正常な増殖が得られない欠点がある。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記の分離株と異なり、培地の種類、条件が
変わっても、正常な増殖が得られ、培養が容易であり、
且つ発酵乳、チーズ、乳酸飲料などの６塊の乳酸発酵生
産品の製造に適用し有利であり、又新規な菌学的特性と
保健性を有する多糖産生乳酸菌を提供するもので、ラク
トバチラス属に属し、（Ｇ＋Ｃ）含有率が４１．９４±
０．１８慢であることを特徴とする。

（実施例１ 次に本発明の詳細な説明する。

本発明により、ケフィアグレインより、上記の目的の新
規乳酸菌を分離する方法は、例えば次のように行なう。

市販ケフィアグレインを、滅菌したｔＯｑｂ脱脂粉乳培
地で植継ぎを行ない、ケフィアグレインの活性化をはか
り、活性化し次ケフィアグレインの少量、例えば０．２
〜１．０２程度を、滅菌した乳鉢に分取し、滅菌水等を
少量加え、ケフィアグレインを十分摩砕する。微細化し
たケフィアグレインを滅菌水で希釈し、ＧＹＰ培地、Ｇ
ＹＰＢ培地などの組成成分を、蒸溜水又は市販牛乳に乳
酸を加え調製した乳酸ホエーに溶かしてｐ４展した培地
に接種し、充分に炭酸ガス置換し次状態で３０℃で３〜
１０日間培養し、出現したコロニーを視診し、次に白金
線で触診して糸を引くような粘性のあるコロニーを選択
し分離した。分離し次醒は、同一分離法を３〜４回繰返
しおこない濁化、、ヲした。純化し几菌は、Ｉｎｄｉａ
　ｉｎｋ法金用いて莢膜多種の確認を行なった。分離、
純化した数棟を、ＧＹＰＢ培地、ＷＹＡ培地などの培地
を用い３０℃で培饗し、増殖が速く、培地粘性の高い１
株を代表菌ＺＫＢ−１０１株とした。該菌株につき、菌
学的性食を検べた結果は下記の通りであつ次。

（１）形態 ■細胞の形及び大きさ　　１×２〜１３μｍの桿菌状■
細胞の多形性　　特に認められない ■運動性　　　　　なし ■胞子　　　　　　形成せず ■ダラム染色性　　十 ■抗酸性　　　　　十 （ｂ）■　ＧＹＰ培地及び■ＧＹＰＢ培地における性状
コロニーの性状 １、形　状二円形 ２　大きさ：０．５〜１０ｍ １　隆　起：凸円形 ４．８　　縁：円滑 五　表　面二円滑 ６、構　造：均質、露滴状 Ｌ　色　ｖ４：白色 ＆　透明度：半透明 ９、硬　度：粘稠 （ｃ）その他の培地 ■下記のＹＰ培地 ■　　Ｉ　　ＮＷＹＰ培地 ■　　＃ＵＮＷＹＰ培地 ■　　Ｉ　　ＩＬＳ培地 ■　ｌ　ミルク培地 （ｄ）生理学的性質 ■硝酸還元　　　　− ■ダラム染色　　　十 ■カタラーゼ　　　− ■ゼラチン液化　　− ■発酵形式　　　　ホモ型孔酸発酵 ■乳酸旋光性　　　ＤＬ＋Ｄ ■色素の生成　　　− ■酵素に対する態度　通性嫌気性 ■乳酸生成　　　　８９〜９０％ Ｏ生育範囲ＰＨ４，５〜６．５ １　温度　　２５〜３７℃ ■リドマスミルク　凝固し色素還元 ＠糖類発酵性ＡＢ　　　　　　　　ＡＢアミグダリンー
　−アラビノース　−−セロビオース−−７２クトース
　＋　＋ガラクトースー　＋　グルコース　　＋　＋グ
ルコネートー　−ラクトース　　＋　＋マルトース　−
　＋　マンニトール　−−マンノース　＋　＋　メリビ
オース　−　＋ラフィノース　−　＋　ラムノース　　
−−リゼース　　−　−サリシン　　　−　−ソルビト
ール　−−スユクロース　＋　＋トレハロース　−　　
−キシロース　　−　　−エスクリン　−−メレチトー
ル　−− （但、Ａは下記表２培地Ｂは下記表２培地Ｊ■莢膜多糖
　　　　十 ■（Ｇ＋Ｃ夛含有率　４１．９４±０．１８■抗変異原
性　　　エイムズ法によりＧｌｕ−ｐ−２に対し抗変異
系効果 を示した。

■抗廃瘍　　　　　　特に、注射により、ラットのＩＭ
Ｃカルシノーマ細胞増 殖を抑制し友。

上記の菌学的性質を有する菌株、ＺＫＢ−１ｏｔ株は、
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第９２２
９号として寄託した。

上記の菌学的諾性質に関連し、更に詳細に各種試験結果
につき説明する。

乳酸旋光性試験： ＺＫＢ−１０１ＱＧＹＰＢ培地で２４時間前培養し念も
のを集菌し、生理食塩水で一回洗浄、１０倍に希釈した
ものを２滴づつを、下記培地（１）〜（５）の各１０−
に接種し、３０℃で３日間培養した。その培養液を遠心
分離で除菌し、得た上澄液にＩＮ塩酸でｐ　Ｈ２，ＯＫ
調整した上で活性炭を加え数分間煮沸した後、１紙にて
一過する。

この各戸液を減圧濃縮し、これにＩＮ塩酸１滴とエーテ
ル５−を加え充分混合し、−晩装置し念後、エーテル属
を分取、エーテルを蒸発させ、その残渣に蒸留純水５−
を加え、０．４５μｍのミリポアにて濾過してサンプル
液を得る。

培地（１）（ＧＹＰＢ培地Ｊ　（ＰＨ５，８）　：培地
（２））：前記培地（１）組成より酢酸ソーダを除去し
たもの（ＰＨ５，８３ 培地（３）：前記培地（１）組成よりＢｉｏｓ−２００
０と酢酸ソーダを除去したもの（ＰＩ（５，８）培地（
４）：培地（３）組成でＰ　Ｈ６，８としたもの培地（
５）：前記培地（１）組成によりＢｉｏｓ−２０００を
除去したもの（ＰＨ６，８３ 前記の各サンプル液につき、乳酸の旋光性を、高速液体
クロマトグラフィー法で、シグマ製り一乳酸及びＬ−乳
酸を標準として測定した。高速液クロマトグラフィーは
、次の通りでめつ次。

カラム：　Ｃｆ（ＩＲＡＩ、ＰＡＫ　ＷＨ（φ０．４６
　Ｘ　２５ｅＭＪ溶出液：　０．２５ｍＭ　ＣｕＳＯ４
溶液流　速：１−７分 湛　度：４０で 検出器：　ＳＰＤ　６　ＡＹ　：　２２０　ａｍ各培地
でのＺＫＢ−１０１を培養 糖類発酵性試Ｍ： ＺＫＢ−１０１株１ＧＹＰＢ　　ｍ地で３０℃、２４時
、間前培養した培誉液を遠心分離３，０００　ｒ、ｐ、
ｍ１５分間で巣出し、これを滅耐済生理食塩水で３回遠
沈抗浄を繰り返して接徨用Ｉ！Ｉ！Ｉ液とし比。

下記表２に示す発酵性糖類用基本培地 殺菌条件１１０℃１０分間オー トクレーブ殺菌 組成を、蒸溜水に溶解したもの（ＹＰ培地り、市販の成
分無調整牛乳に乳酸を加えてＩ！Ｍｌ裂し次乳酸ミルク
巾ニー液をラクトース発酵能をもつ酵母で弗酸し無糖と
したものに溶解したもの（ＮＷＹＰ培地］、前述の乳酸
ミルクホエー液を限外−過膜（分画分子量１００，００
０　Ｊで処理し無糖化したもの（ＵＮＷＹＰ培地」に溶
解したもの常培養と炭酸ガス置換による嫌気的培養を行
なつ念、供試糖類としては、前記の１２ＩＩ類発酵性に
列挙したものを前記の基本培地に夫々−２，０％添加し
た。その試験結果は、前記の菌学的性質の糖発酵性の＋
−で示す通りであった。

下記表３に示す発酵性糖類用培地で、上記の接種用菌液
を接種し、Ｃ０２置換３０℃７日間培＝ｍｔ行ない、０
．Ｄ、　６６０　ａｍで陶の増殖を観察した。この結果
、７ラクトース、ガラクトース、グルコース、２クトー
ス、マルトース、マンノース、メリヒオース、ラフィノ
ース、シュクロースの９ｆｌＩの釉に発酵性を示し次。

表　　３ このように、培地組成の相異により糖の弗酸パターンが
変わることを確認した。

生育温度試験： ＧＹＰＢ培地で３０℃２４時間前培養し、活性化し７’
ｅＺＫＢ−１０１株を使用し、ＧＹＰＢ培地（ＰＨ５，
８ｊＫＩＭずつ接種して、１５　、２０，２５゜２８．
３０，３７，４０ｔ’Ｏ各温度で７日間培養し、菌の増
殖を判定した。７８目１で増殖の認められない温度区に
ついては、培養を継続して１４日目で判定した。

判定結果は、下表に示す通り、１５℃、２０で。

４０℃の３区では増殖が認められなかった。こノコとか
ら、ＺＫＢ−１０１株は、２５〜３７℃の範囲に生育温
度があり、２８〜３０′ｃＫ適性温度があると判定した
。

表　　今 注Ｊ−：増＋１１鰯められず ±：４８時間目時間分増殖を認める。

＋：２４時間目時間分増殖を認二める。

生育ＰＨ試験： 前記と仝様に前培養し活性化し７’ｅ　ＺＫＢ−１Ｏ１
株を、培地初発ＰＨＱ　ＰＨ３，５、４，０、５，０、
５，５。

６．０　、７，０　、８．０　、９．０　　に夫々調整
し、ミリポアフィルタ−で濾過除菌し７’ｅＧＹＰＢ培
地に１滴づつ接種し、３０℃で培養し７日間の生育状態
を観察した。その結果は下記表＄に示す通りであった。

核表から分かるように、Ｐ　Ｈ３，５、４，０，７，０
。

８．０　、９．０では生育は認められず、ＰＨ４，５〜
６．５の範囲で生育し、特にＰＨ５，０〜５．５におい
て生育が旺盛で至適である。

注）−：生育せず ＋：４８時間目時間前確認 昔：２４時間目で生育確認 ミルクに対する挙動： ＺＫＢ−１０１株を、ＧＹＰＢ培地燻培養し次ものを、
次の４種のスキムミルク培地に接種し、２５℃、３０℃
、３５℃の各温度で１４日間培養試験を行なった。

■　１０チスキムミルクＰ　Ｈ６，７ ■　１０チスキムミルクＰ　Ｈ５，９ ■　１０係スキムミルク＋〇、５チ Ｂｌｏｔ−２０００ＰＨ６，７ ■　ｔＯ１ｓスキムミルク＋〇、５チ Ｂｉｏｓ−２０００ＰＨ５，７ その試験結果を、下記表６に示す通りであっ穴。

表内答中の数値Ｎ／１０　ＮａＯＨ液で、生成乳酸を中
和するに必要な滴定値を示す。

上記表から明らかなように、ＺＫＢ−１０１株は、塩度
が２５℃及び３５℃の適性温度であっても、ＰＨが６．
７では生育しない、　Ｂｉｏｓ　−２０００の添加は、
培養温度２５℃、ＰＨ″６．７の場合でも生育可能とな
り、ＰＨ５，９においては、各培養温度区において生育
上の促進効果があることがみとめられた。

莢膜多糖産生能試験： ＺＫＢ−１０１株を、上記の糖類発酵性試験で使用した
と同じ表１の培地と表２の培地の夫々を使用し且つその
夫々の培地において夫々の発酵性糖を糖源としてその培
地組成分として夫々含ませて調整した夫々の培地で、培
養したが、その全ての培地において、糖源を異にしても
、量の多少はあるが、莢膜多糖を産生ずることが認めら
れた。この性質は、他の多糖産生菌と相異し、糖の発酵
性と莢膜多糖産生の間に基質特異性が認められないとい
う特性と考えられる。

凍結および凍結乾燥耐性試験ニ 一般に使用されている１０悌脱脂粉乳に１チグルタミン
酸ソーダを加えた保護剤の存在下で、凍結および凍結乾
燥した。この状態で一２０℃で長藺保存後、解凍又は復
水したが、死滅なく、これを発酵生産に使用したが、良
好に、多糖産生をもたらした。即ち、凍結及び凍結乾燥
保存性を有する。

（Ｇ＋Ｃｊ含有率測定：′ ＺＫＢ−１０１株の分類学的な位置付けを明確圧するた
めに、ＤＮＡ中の（Ｇ＋Ｃ）含有率を、市販ＤＮＡ−Ｇ
ＣＫ目を使用して高速液体のクロマトグラフィー法によ
り測定した。その測定結果は、１７サンプルの測定結果
より、平均４１．９４４゜分散０．０３０２　、標準篩
差０．１７３８　、最高値４２．２３００　、最低値４
１．６３７６範囲０．５９２４゜変動数０．００４１と
なり、ＺＫＢ−１０１株の（Ｇ＋Ｃ）含有率は、４１．
９４±０．１８となった。

以上のＺＫＢ−１０１株の諸性質について、ノ々−ジエ
ーズマニュアル　オブ　デターミナテイブノ々クテリオ
ロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄ
ｅｌ　−ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ　ｌ第９版およびその他の文献により検索し念、そ
の結果、ＺＫＢ−１０１抹け、ラクトバチラスに属し、
近いと見られるラクトバチラスへルペテイカス、ラクト
バチラスアシドフィラスの諸性質の成る部分では類似の
点があるが、決定的に相異する点け、後者の両菌株は、
莢膜多糖産生能を有しないこと及びその（Ｇ＋ＣＩ含有
率が夫々３９．３士チ及び３６．７±０．７１？あり、
ＺＫＢ−１０１株と（Ｇ＋ＣＪ含有率が相異する。又従
来の技術において述べた多糖産生能を有する８−１Ｏ−
ＬＲ株と比較した場合は、ＺＫＢ−１０１株は、通常寒
天培地の寒天濃度１．２〜１．５％で増殖し、コロニー
も出現するが咳Ｓ　　１Ｏ−ＬＲ９は、増殖しない、又
、ＺＫＢ−１０１株では、異常形態は＠現しないが該Ｓ
−１０−ＬＲ株はしはしば螺旋状の細胞が出現する。又
、ＩＬＳ培地で、ＺＫＢ−ｔｏｔ−株は、増殖するが、
該Ｓ−１０−ＬＲ株は増殖できない。更に、＃ＺＫＢ−
１０１株ｔＤ　（Ｇ＋ＣＩ含有率が４１．９４士０．１
８であるに対し、後者のそれは、３９．３％である（仝
文献記載）点などで、結局、ＺＫＢ−１０１株は、（Ｇ
＋ＣＪ含有本が４１．９４士Ｏ，ｔ　Ｓ　＊である点に
おいて特有であり、新規と判定した。

更に、ＺＫＢ−ｔｏｔ株が新菌としての特徴は、下記詳
述するように、ＩＭＣカルシノーマ細胞に対し抑制効果
を有する莢膜多糖産生能脂粉乳である。従来、ケフィア
グレインから分離した多糖は経口投与によりｉウスのエ
ーリツヒカルシノーマ（ＥＣ）即ちザルコー１の生長を
４０〜８０％程度阻止することが報告されているが、Ｚ
ＫＢ−ｔｏｔ株は、工ＭＣカルシノーマ患ｆｆ１ｓＫそ
の多種物質を注射することにより有効であることが認め
られる点で全く別異の抗ガン法物質金座生することが確
認された。

ＺＫＢ−１０１株の産生ずる莢膜多砧の抗ＩＭＣ臘瘍効
果試験： ＺＫＢ−１０１ａｔ−１ＧＹＰＢ培ＭＫ［ｌＩＬ、３０
℃で２４〜４８時間培養し、その培養液量８０〜１００
℃に加温後８０００〜１２．００　Ｏｒｐｍ１５〜３０
分間遠心分離をおこない菌体を集菌除去し、上清を得る
。この上清液１量部に対しエタノールｂ量部を添加し攪
拌混合し穴径３０００　ｒｐｍ　１５分間の遠心分離で
沈殿物金除去する。さらに、この上清液に、エタノール
１／２量部を加え、始めのエタノール量と合わせ上清液
圧対し等量となるようにし、３０００ｒ、ｐ、ｒｎ。

１５分間の遠心分離で沈澱物Ｃ粗多糖）ｆｔ得る。

この沈澱物を培養液量のし１ｏ量の蒸溜水に痔解し、等
量のエタノールで再沈澱操作を行う。この操作金３回繰
り返して得られた沈澱物を少量の蒸溜水で溶解させ、セ
ルロースチューブで１夜（１２〜１６時間）流水透析を
行なう、透析後これをそのま＼又は減圧濃縮して凍結乾
燥を行ない下記試験用の粗多糖を得る。

抗変異原性試＠： 上記の粗多糖を、微生物を利用し次エイムズ（Ａｍｅｓ
Ｊ法により抗変異原性試験を行なつ念。

その結果ＧＬｕ−ｐ−２において、■Ｇｌｕ−ｐ　−２
！１度１．０μり／プレート、Ｓ−９２５μｆ／プレー
トの条件で、コントロールの蒸溜水区では復帰変異コロ
ニー数が１５３２コロニー／フレートであるに対し、粗
多糖区では８９０コロニー／プレートで４２％減少し、
■ペンツピレン溶液５μｆ／プレー）、Ｓ−９５０μ？
／プレートの条件で、コントロールの蒸溜水で復帰変異
コロニー数３２７コロニープレートに対し、粗多糖区で
は２０３コロニー／プレートで３８％を減少することが
できた。

抗ＩＭＣ膣瘍試験： この粗多糖を、日本薬局方注射用蒸溜水或は日本薬局方
生理食塩水金用いて、所定の夫々の濃度をもつ調整液を
夫々作成し穴、抗ＩＭＣ腫ｌ試験は、ＩＭＣカルシノー
マ細胞１２Ｘ１０’セル／−に調製し食細胞浮遊液をＣ
ＤＦ、マウス−匹当り０．０５ｄ（ｔＸｌｏ　　方今／
マウスＪ皮内に移植し、移植後３日、７日、１０日、１
４日、１７日及び２１日に合計６回、前記の粗多糖調製
ｇ（以下ＺＫ４２６−Ｂと称す）及び生理食塩水ヲ眸痙
内に注射により０．１ｄ／マウス投与し念。

その投与モデル図は、第１図示の通り、その投与群構成
は下表７に示す通りである。

抗腫瘍性効果の判定は、原則として、週２回、肺瘍径（
長径×短径）をノギスを用いて測定したう又移植後２４
日０Ｋ屠殺して腫瘍重量を測定し、腫瘍縮小率（Ｔ／Ｃ
チ１を算出した。その結果は、第２図に示す通りであつ
穴、解剖時に測定した腫瘍重量縮小率（Ｔ／Ｃ＊Ｊは、
５０μｔ／マクス群で３００±４０ｘａｐ５９　Ｔｏ　
、　１００μＦ／マウス群で２２４ｘ１２６ｓｗ（４４
％り。

２００μＦ／マウス群で２３３±９８Ｗｑ（４６Ｌ）を
示した。又、第２図から明らかなように、多糖液の注射
によりＩＭＣＩＩＩ！炉の増殖速度をお、〈らせること
かでき、多糖液の濃度が高いほど抑制効果が大きいこと
が分る。

（発明の効果Ｊ このように本発明は、ラクトノセチラスＭｉＫ属しくＧ
＋ＣＪ含有率が４１．９４±０６１８俤である新規な莢
膜多糖産生乳酸菌を提供したもので、乳酸発酵生産品の
製造に使用し、粘性のある発酵生産を提供でき、酸量と
共に使用し得られ、更にはその新菌よりＩＭＣカルシノ
ーマ細胞の増殖を抑制すると共に変異原物質Ｇ　Ｌ　ｕ
　−ｐ　−２＋ペンツピレンに対し抗変異原性効果を有
する多糖を産生ずる等の効果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は投与モデル図、第２図は、本発明新菌が産生す
る莢膜多種のＩＭＣカルシノーマに対する抗ガン性を示
す特性曲線を示すグラフである。 手続補正書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ラクトバチラス属に属し、（Ｇ＋Ｃ）含有率が４１
   ．９４±０．１８％であることを特徴とする莢膜多糖産
   生乳酸菌。 ２　ラクトバチラス属に属し、（Ｇ＋Ｃ）含有率が４１
   ．９４±０、１８％であり且つ変異原物質Ｇｌｕ−Ｐ−
   ２に対し抗変異原効果を示すと共にＩＭＣカルシノーマ
   細胞増殖に対し抑制効果を有する莢膜多糖を産生するこ
   とを特徴とする莢膜多糖産生乳酸菌。