JPH0458317B2

JPH0458317B2 -

Info

Publication number: JPH0458317B2
Application number: JP4583885A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Yamada; Akira Shimizu; Shozo Shiozaki
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1985-03-08
Filing date: 1985-03-08
Publication date: 1992-09-17
Also published as: JPS61205496A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は、微生物の菌体または菌体処理物を酵
素源として用いるアデノシンとシステインからＳ
−アデノシル−Ｌ−システインを効率良く酵素合
成して採取する方法に関する。（従来の技術）Ｓ−アデノシル−Ｌ−システイン（以下、
SACと略称する）は、生体内におけるメチル基
供与反応に関与する重要な生理活性物質として知
られているＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン
の構造類似体であり、化学療法剤や試薬としてそ
の大量生産が期待されている。従来、SACの製造方法としてはアデノシンと
システインを植物や動物から精製したＳ−アデノ
シルホモシステインハイドロラーゼ（EC3311）
の存在下に酵素合成する方法〔バイオケミカ・エ
ト・バイオフイジカ・アクタ（Biochomiea et
Biophysica Acta）742，250（1983）〕が知られて
いる。しかしながら、この方法は酵素の調整に経
費がかかり、工業的製造法とは言い難い。また有
機合成法によつてSACを製造する方法も知られ
ている〔Zhurnal Obshchei Khimii，39，434
（1969）〕がその場合には副生物が多く精製が困難
になるという欠点があつた。（発明が解決しようとする問題点）本発明者らは以上のような実状に鑑み、SAC
の酵素的合成法に関して種々検討を加えた結果、
特定な微生物を用いる場合には菌体抽出物の形態
に限定されることなく、菌体磨砕物であつても、
さらには生菌体や乾燥菌の形態であつても効率よ
くSACを合成しうることを見い出し本発明を完
成するに到つた。（問題点を解決するための手段）かくして本発明によれば、アデノシンとシステ
インをロドシユードモナス
（Rhodopseudomonas）属、シユードモナス
（Pseudomonas）属、アルカリゲネス
（Alcaligenes）属、アシネトバクター
（Acinetobacter）属に属する細菌類；サツカロ
マイセス（Saccharomyces）属、シゾサツカロ
マイセス（Shisosaccharomyces）属、スポロボ
ロマイセス（Sporobolomyces）属、キヤンデイ
ダ（Candida）属に属する酵母類；モナスカス
（Monascus）属、ノイロスポラ（Neurospora）
属、フザリウム（Fusarium）属、シベレラ
（Gibberella）属、グリオクラデイウム
（Gliocladium）属、に属する糸状菌類；ストレ
プトマイセス（Streptomyces）属、ストレプト
ベルチシリウム（Streptoverticillium）属、ミク
ロモノスポラ（Micromonospora）属、ミクロポ
リスポラ（Micropolyspora）属、ミクロエロボ
スポリア（Microellobosporia）属に属する放線
菌類；またはシゾフイラム（Shisophyllum）属、
トラメテス（Trametes）属に属する担子菌類に
属し、かつアデノシンとシステインからSACを
合成する能力を有する微生物の菌体または菌体処
理物の存在下に水性媒体中で接触させて反応せし
め、SACを合成して採取することを特徴とする
SACの製造法が提供される。本発明において酵素源として用いられる微生物
は、上記の属に属し菌体または菌体処理物の形態
でアデノシンとシステインからSACを合成でき
る能力を有するものであればいずれでもよく、そ
の具体例としては、ロドシユードモナス・スフエ
ロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）
IFO12203、シユードモナス・ブチダ
（Pseudomonas putida）IFO12996、シユードモ
ナス・ダキユネ（Pseudomonas dacunhae）
IFO12048、シユードモナス・エルギノーサ
（Pseudomonas seruginosa）IFO 3445、アルカ
リゲネス・フエカリス（Alcaligenes faecalis）
IFO12669、アルカリゲネス・ユウトロフス
（Alcaligenes eutrophus）IAM12305、アシネト
バクター・カルコアセチカス（Acinetobacter
calconcetieus）IFO12552などの細菌類；サツカ
ロマイセス・セレビジエ
（Saccharomycescerevisiae）IFO1805、シゾサ
ツカロマイセス・ポンベ（Shizosaccharomyces
pombe）IFO0346、スポロポロマイセス・ホルサ
チカス（Sporobolomyces holsaticus）
IFO1034、キヤンデイダ・ウチリス（Candida
utilis）IFO0396などの酵母類；モナスカス・ア
ンカ（Monascus anka）IAM8001、モナスカ
ス・ルベー（Monascus ruber）IFO9203、モナ
スカス・セロルベセンス（Monascus
seorubescens）IFO4487、ノイロスポラ・クラツ
サ（Neurospora crasea）IFO6067、フザリウ
ム・クルモラム（Fusarium culmorum）
IFO5902、ジペレラ・フジクロイ（Gibberella
fujikuroi）IFO6605、グリオクラデイウム・デリ
クエセンス（Gliocladium deliquescens）
IFO6617、などの糸状菌類；ストレプトマイセ
ス・ハイグロスコピカス（Streptomyces
hygroscopicus）IFO3192、ストレプトマイセ
ス・クリセオルス（Streptomyces griseolus）
IFO3403、ストレプトベルチシリウム・ケンタケ
ンス（Streptovertieillium kentuchense）
IFO12880、ミクロモノスボラ・コエルレア
（Micromonospora coerulea）IFO 13504、ミク
ロポリスポラ・アンジオスポラ
（Micropolyspora angiospora）IFO13155、ミク
ロエロボスポリア・ビオラセア
（Microellobosporia violacea）IFO12517などの
放線菌類およびシゾフイラム・コムネ
（Shisophyllum commune）IFO6504、トラメテ
ス・ギボサ（Trametes gibbosa）IFO4946など
の担子菌類が挙げられる。これらの菌は必要に応
じて２種以上を併用してもよく、また天然及び人
工変異菌であつてもSAC合成能を有するかぎり
同様に使用することができる。本発明におけるSACの合成方法は微生物の菌
体またはその処理物の形態で菌体内酵素の作用を
利用するものであるが、この酵素は微生物を通常
の方法で培養することにより調整することができ
る。微生物を培養する培地は、炭素源、窒素源、
無機源、有機微量栄養源を含有する通常の培地で
よく、微生物の種類に応じて適宜選択して使用す
ればよい。また培養方法は通常液体培地で行なわ
れるが、固体表面培養によつても行うことができ
る。培養条件は微生物の種類に応じて適宜選択す
れば良く、温度15〜80℃、PH3〜12の範囲が用
いられるが、一般的には温度20〜45℃、PH4〜
９の範囲で10〜120時間培養すれば良い。培養中
には通気撹拌を行つて微生物の生育を促進させる
こともできる。本発明におけるSACの合成反応には、前記の
ようにして培養した微生物が菌体または菌体処理
物の形態で使用される。例えば、微生物の培養液
中の菌体をそのまま使用してもSACの合成反応
は進行するが、培養液中の成分が障害になる場合
や菌体量を多く使用したい場合には培養液から分
離した菌体を用いることが好ましい。菌体は生菌
体のままで充分に使用目的を達するが、貯蔵ある
いは取扱いの便宜から風乾菌体、凍結乾燥菌体、
アセトン乾燥菌体などのような乾燥菌体として用
いることもできる。また菌体そのものではなく、
菌体磨砕物や菌体抽出物のような菌体処理物の状
態で使用することも可能である。更に菌体または
菌体処理物を常法に従つて固定化して使用するこ
ともできる。本発明におけるSAC合成反応は酵素反応基質
であるアデノシンとシステインとを微生物菌体ま
たは菌体処理物の存在下に水性媒体中で接触させ
ることによつて行なわれる。反応に供されるシス
テインはＬ体、DL体のいずれであつても使用す
ることができる。また反応の条件は適宜選択すれ
ばよく、基質濃度としてアデノシンを0.001ｍＭ
以上、好ましくは0.01〜100ｍＭ、システイン濃
度を0.001ｍＭ以上、好ましくは0.01〜100ｍＭと
すればよい。更に基質を少量ずつ分割して反応液
中に供することもできる。なお、本発明におけるシステインなる用語は反
応系内においてシステインを供給する物質、例え
ばシスチンをも含むものとして理解されるべきで
ある。反応における系のPHは４〜12、好ましくは５
〜10に保てばよく、PHの調整は通常の方法、た
とえばリン酸カリウムバツフアー、トリスバツフ
アー、塩化アンモニウムバツフアー、グリシンバ
ツフアーなどによつて調整すればよい。反応温度は、反応がよく進行し酵素活性、基質
および生成物に影響のない温度であればよく、通
常は15〜60℃、好ましくは20〜50℃である。反応
時間は基質のSACへの転化率が増大するように
設定すればよく、パツチ式の場合、通常0.1〜48
時間、好ましくは0.5〜36時間である。その他、
目的に応じて水性媒体中にアセトン、エタノール
の如き有機溶培や各種の界面活性剤を添加して反
応を行わせることもできる。かくしてSACを含有する反応液が得られるが、
該反応液からSACを採取する方法は格別制限さ
れるものではなく、例えば次のようにして行われ
る。反応終了後、反応液に15N過塩素酸を添加し、
次いで遠心分離により不溶物を除去し、得られた
上清に重炭酸カリウムを添加し、生じた過塩素酸
カリウムの沈殿を遠心分離により除去し、得られ
た上清を減圧下濃縮して濃縮物をゲル過カラム
クロマトグラフイー（Sephadex Ｇ−10：フアル
マシア社）にかけ、水で溶離することにより
SAC画分を得、次いでこの画分を凍結乾燥する
ことによりSACを得ることができる。（発明の効果）かくして本発明によれば、入手容易な酵素源を
用いることにより、効率よく目的とするSACを
得ることができる。（実施例）以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。ただし本発明はこれらの例のみに限定
されるものではない。なお、実施例におけるSACの定量は次のよう
にして行つた。すなわち、反応終了後、反応液を
直ちに０〜５℃に冷却し、過塩素酸を添加して反
応を停止した。次いで遠心分離にて不溶物を除去
したのち、得られた上澄液にリン酸カリウムバツ
フアー（PH7.0）を添加して、生成した過塩素酸
カリウムを遠心分離により除去した。かくして得
られた上澄液の所定量を採取して高速液体クロマ
トグラフイー（日立製作所製、638−30型、カラ
ム：Cosmocil 5C₁₈，Detecter：UV260nm）を
用いることによりSACの定量を実施した。実施例１グルコース１ｇ／dl、ペプトン1.5ｇ／dl、酵
母エキス0.3ｇ／dl、K₂HPO₄ 0.3ｇ／dl、Nac
0.2ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O 0.02ｇ／dl、寒天２
ｇ／dlからなる寒天斜面培地（PH7.0）で28℃、
24時間培養した第１表記載の細菌の１白金耳を、
グルコース１ｇ／dl、ペプトン1.5ｇ／dl、酵母
エキス0.3ｇ／dl、K₂HPO₄ 0.3ｇ／dl、Nac
0.2ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O 0.02ｇ／dlからなり、
PH7.0に調整、加熱滅菌した液体培地10mlに植菌
し、28℃で40時間振盪培養を行なつた。遠心分離
にて集菌し、0.1Mリン酸カリウムバツフアー
（PH8.0）で洗浄した後、菌体をアデノシン１ｍ
Ｍ、DL・システイン１ｍＭ、リン酸カリウムバ
ツフアー（PH8.0）100ｍＭからなる基質溶液１
mlに懸濁し、30℃で10時間振盪して反応させた。
結果を第１表に示す。

【表】実施例２グルコース５ｇ／dl、ペプトン0.5ｇ／dl、酵
母エキス0.1ｇ／dl、KH₂PO₄ 0.2ｇ／dl、
K₂HPO₄0.1ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O 0.02ｇ／dl、
寒天２ｇ／dlからなる寒天斜面培地（PH6.0）で
28℃、48時間培養した第２表記載の酵母菌体の１
白金耳を、グルコース５ｇ／dl、ペプトン0.5
ｇ／dl、酵母エキス0.1ｇ／dl、KH₂PO₄ 0.2ｇ／
dl、K₂HPO₄0.1ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O 0.02
ｇ／dlからなりPH6.5に調整、加熱滅菌した液体
培地10mlに植菌し、28℃で40時間振盪培養を行な
つた。遠心分離にて集菌し、0.1Mリン酸カリウ
ムバツフアー（PH8.0）で洗浄した後、菌体をア
デノシン10ｍＭ、DL・システイン10ｍＭ、リン
酸カリウムバツフアー（PH8.0）100ｍＭからな
る基質溶液１mlに懸濁し、30℃で２時間振盪して
反応させた。結果を第２表に示す。

【表】実施例３実施例２と同じ方法で培養したのち、過にて
集菌し生理食塩水で洗浄した第３表記載の糸状菌
の菌体を用い、反応時間を変えること以外は実施
例２と同様に反応させた。SAC収量を第３表に
示した。

【表】実施例４酵母エキス0.2ｇ／dl、Solucble Starch １
ｇ／dl、寒天２ｇ／dlからなる寒天斜面倍地
（PH7.2）で28℃、48時間培養した第４表記載の
放線菌の菌体の１白金耳を、ペプトン１ｇ／dl、
肉エキス0.5ｇ／dl、酵母エキス0.1ｇ／dl、
Nacl0.5ｇ／dlからなり、PH7.1に調整、加熱滅
菌した液体培地10mlに植菌し、28℃で40時間、振
盪培養を行なつた。次いで実施例１と同じ方法で
得た菌体を用い反応時間が２時間であること以外
は実施例１と同じ反応条件で反応させた。結果を
第４表に示す。

【表】実施例５グルコース２ｇ／dl、酵母エキス0.3ｇ／dl、
ペプトン0.3ｇ／dl、K₂HPO₄ 0.1ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O 0.05ｇ／dl、寒天２ｇ／dlから
なる寒天斜面培地（PH5.0）で28℃、96時間培養
した第５表に示す担子菌の菌体１白金耳をグルコ
ース２ｇ／dl、酵母エキス0.3ｇ／dl、ペプトン
0.3ｇ／dl、K₂HPO₄ 0.1ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O
0.05ｇ／dlからなりPH5.0に調整、加熱滅菌した
液体培地10mlに植菌し、28℃で90時間、振盪培養
を行なつた。過にて集菌し、生理食塩水で洗浄
した夫々の菌体を用い、反応時間が4.5時間であ
ること以外は実施例１と同じ反応条件で反応させ
た。SAC収量を第５表に示した。

【表】実施例６実施例１と同じ反応条件の寒天斜面培地で培養
したアルカリゲネス・フエカリスIFO12669の１
白金耳を実施例１と同じ組成の液体培地５mlに植
菌し、28℃で24時間振盪し前培養を行つた。次に
この前培養液５mlを、２坂口フラスコに入れた
前培養と同じ組成の加熱滅菌した培地500mlに植
菌し、28℃で40時間振盪し本培養を行つた。本培
養終了後、生理食塩水で一回洗浄し、次に遠心分
離にて集菌した。集菌した菌体は通風下約15時間
室温にて乾燥した後、更に五酸化リンを入れた減
圧デシケーター中、５℃で１日乾燥した。次にこ
の乾燥菌体を乳鉢で粉末状にすりつぶし、再び減
圧デシケーター中で乾燥することにより、乾燥菌
体を調製した。アデノシン２ｍＭ、DL−システ
イン４ｍＭ、リン酸カリウムバツフアー
（PH6.5）50ｍＭからなる基質溶液１mlに上記乾
燥菌体50mgを加え、37℃で１時間振盪して反応さ
せた。SACの収量は0.31mo／mlであつた。実施例７実施例６と同じ方法で調整したシユードモナ
ス・ブチダIFO12996の乾燥菌体５ｇ及びアデノ
シン221mgを35℃に加温した100ｍMNH₄Cl−
NH₄OHバツフアー（PH9.0）100mlに添加し撹
拌した。次いで100mgのＬ−システインを10mgず
つ10回に分割して30分毎に添加した。添加終了
後、更に１時間撹拌を継続し反応させたところ、
反応液中に101mgのSACが合成された。その後、
冷却下に30％過塩素酸水溶液40mlを添加して反応
を停止した後、遠心分離により菌体残渣などの不
溶物を除去した。次いで得られた上清液に0.5M
KHCO₃水溶液を添加しPH6.0に調製し、生成し
た過塩素酸カリウムの沈殿を遠心分離にて除去し
た。かくして得られた上清液を減圧下に濃縮し、
得られた濃縮液をSephadex Ｇ−10（２cmφ×200
cm）カラムクロマトグラフイーにかけ、水で溶出
することによりSAC画分を得、次いで凍結乾燥
することにより白色固体88mgを得た。シリカゲル薄層クロマトグラフイー、高速液体
クロマトグラフイー、ペーパークロマトグラフイ
ー、赤外吸収スペクトル、比旋光度を測定したと
ころ、この白色固体物はSACであることが確認
された。

Claims

【特許請求の範囲】１ロドシユードモナス属、シユードモナス属、
アルカリゲネス属、アシネトバクター属、サツカ
ロマイセス属、シゾサツカロマイセス属、スポロ
ボマイセス属、キヤンデイダ属、モナスカス属、
ノイロスポラ属、フザリウム属、シベレラ属、グ
リオクラデイウム属、ストレプトマイセス属、ス
トレプトベルチシリウム属、ミクロモノスポラ
属、ミクロポリスポラ属、ミクロエロボスポリア
属、シゾフイラム属に属し、アデノシンとシステ
インよりＳ−アデノシル−Ｌ−システインを合成
する能力を有する微生物の菌体または菌体処理物
の存在下に、アデノシンとシステインを水性媒体
中で接触させて反応せしめ、Ｓ−アデノシル−Ｌ
−システインを合成して採取することを特徴とす
るＳ−アデノシル−Ｌ−システインの製造法。２微生物の菌体が生菌体または乾燥菌体である
特許請求の範囲第１項記載の製造法。３微生物の菌体処理が菌体磨砕物または菌体抽
出物である特許請求の範囲第１項記載の製造法。