JPH04507109A - 免疫無防備状態宿主中におけるヒトリンパ球組織 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫無防備状態宿主中におけるヒトリンパ球組織序 発明の分野 本発明は、ヒトリンパ系の、ヒト免疫反応の試験における使用及びヒト抗体を生 産するための使用に係る。

斐 ヒトの免疫系は、侵入する生物、常態でない細胞条件、例えば腫瘍新生等に対す るヒトの健康の保護者である。種々の病理学的条件に対して、体液性及び／又は 細胞性のいずれかまたは両方の応答が存在する。これらの条件の予防あるいは治 療処理において、主要な焦点は病的状態に対する処置の効果に向けられる。多（ の場合において、処置はその条件に対する免疫応答に関し、有利な、あるいは不 利な影響を及ぼす。このような応答についての研究は、ヒト宿主について治療を 使用してみるまでは困難である。

いくつかの疾病についてはワクチン接種が供給されている。多くの場合、そのワ クチンに対する応答の性質、応答の効率、及びワクチンの宿主に対する全身的な 影響について所望される情報をもたらすことができる動物モデルはない。多くの 場合において、そのワクチンを動物によって評価できないことがそのワクチンと しての使用を排除している可能性がある。

ヒトの治療についての不確実性の観点から、治療のヒト免疫系に対する影響を試 験することを可能とする動物モデルを開発する高い必要性がある。

１９７０年代半年代光見されたモノクローナル抗体は、治療の面ではずっと遅れ ているが、診断の分野においては広く開発されている。これは、哺乳動物宿主が 選択的免疫化により任意の抗原に対して一次免疫反応を生起するように誘導する ことができ、そして細胞融合により免疫抗原一種のみに対して特異的な抗体を産 生ずるハイブリドーマ細胞系を作成することにより抗体を産生ずる特異的Ｂ細胞 を不死化できるという観察に基づくものである。当初に約束されていた「魔法の 弾丸」は実現されていない。治療におけるモノクローナル抗体の使用に対する限 界の一つは異種の抗体に対して免疫反応を起こすことであった。少数の例外を除 き殆どの場合において、マウス抗体が誘導するのに最も便利で、マウスＢリンパ 球がモノクローナル抗体を生産するために不死化するのに最も便利であったこと がら、市販及び研究に使用されているモノクローナル抗体に見られるのはマウス モノクローナル抗体であった。ヒトモノクローナル抗体を生産する可能性は、イ ンビトロで一次免疫反応を生起できないということにより制限されていた。従っ て、高い親和性と所望のエピトープに対する特異性とを持ち、ヒト不変部領域と 多形態領域のフレームワーク領域を有する抗体を生産し得る、ヒトモノクローナ ル抗体を生産するための別の方法を開発し得ることには利益がある。

関連文献 ＥＰＯ０３２２２４０は、ヒト胎児組織を免疫無防備状態マウス宿主中に導入す ることを記載している。同時に係属している、１９８９年８月１７日出願の出願 番号３９４．９３９号、１９９０年１月１０日出願の出願番号４６２．８２３号 、及びそれらに引用されている文献も参照されたい。

Ｃ発明の要約〕 本発明は、熟成トマト腐敗性微生物の活性が増加した領域において、トマトの生 産性を改良するものである。本発明の改良方法は、微生物が腐敗性の増殖をして いる領域で、野性種のトマトと比較して、熟成時に細胞壁弱化酵素のレベルが低 いトマトを育成することを含み、かつ得られた熟成トマトに、このような微生物 によって起こる腐敗に対する、実質的な抵抗性が見出されるものである。

〔具体的な実施態様の記述〕 本発明は、免疫無防備状態非霊長類宿主にヒト胎児リンパ球固形組織を含むキメ ラ宿主を提供する。このリンパ球組織は、少なくとも抗原提供細胞、特にＢＩＪ ンパ球、及びＣＤ４及び通常ＣＤ８細胞を含む１９７８球を有することを特徴と するものである。この固形組織は、分泌生成物の製造に使用する、又は免疫系に 応答する病的な状態を治療する物質又は方法に対する、免疫系、特にリンパ系（ また、骨髄系を含んでもよいが、）の応答を評価するのに用いる、免疫系を利用 した各種の方法において使用することができる。

このキメラ宿主は、キメラ宿主中の、生存可能で機能するヒト胎児リンパ球組織 の存在を基礎とするものであり、多くの用途を有する。抗原提示細胞及び下りン パ球が存在することにより、抗原により免疫される機会か与えられ、かつ前もっ て決めた抗原に特異性を有する免疫グロブリンを生成するように再配列された免 疫グロブリン部位を有する８９７８球を製造できるようにする。リンパ系統の細 胞、特に骨髄系統の細胞に関連した細胞が存在することにより、免疫応答の調節 に関する化合物及び方法、つまり、免疫応答に関連した細胞の上昇又は低下を調 整する生成物の評価を可能にする。したがって、薬剤、薬剤の組合せ、及び治療 のモダリティ−を、免疫応答に関連した細胞の増殖の増加及び／又は阻害に関す るその効果に関連して評価することができる。

主題となる発明の最初の範囲となると考えられるのは、ヒトモノクローナル抗体 である。本発明は、インビボにおけるヒト活性化Ｂリンパ球を作り出す方法、及 び前もって定めたエピトープに対するヒトモノクローナル抗体を製造する８９７ ８球を使用する方法を提供する。リンパ球組織は、免疫無防備状態の哺乳動物の 適当な部位で採取する。このリンパ球組織に血管化しかつリンパ管と接続するの に十分な時間を与える。次いで、８９７８球を所望のエピトープを有する適当な 免疫原によって活性化し、８９７８球を刺激して、所望のエピトープに対する特 異性を有する免疫グロブリンを生成させる。十分な刺激を与えた後、このＢＩＪ ンパ球をクローン化し、又は永続性を与えモノクローナル抗体を継続的に生成す るようにできる。得られたモノクローナル抗体をその結合親和性に関連してスク リーニングし、かつ永続化又はクローン化細胞の抗体分泌を常法により継続させ る。

ヒト組織を含む各種リンパ球又は他のリンパ球であって、好ましくはマクロファ ージの相互作用を含む、８９７８球及び１９７８球の相互作用を与えるようなも のを使用することができる。使用することができる組織には、腸間膜及び抹消性 双方のリンパ節、腸間膜を有し又は有しないリンパ球、胸腺、扁桃腺、膵臓、膵 臓、骨等であり、特にリンパ節が好ましい。これらの組織は、妊娠期間が少なく とも４週、通常は少なくとも約６週の胎児組織が好ましく、新生児の組織まで使 用でき、これらは組織又は臓器の性質に依存しており、特に約７週から２２週ま での胎児の組織が好ましい。

異なった器官については、異なった年齢の組織が好ましい。例えば、人リンパ節 については、その年齢は約１５妊娠週（ｇ、ｗ、）と同じか、それ以上が望まし く、好ましくは１６〜２０ｇ、ｗ、であり、人胸線については、約９〜２２ｇ、 ｗ、、好ましくは約２０ｇ、ｗ、未満である。胎児の肝臓組織は、他の組織、特 にリンパ節と組み合わせて使用してもよ（、この場合リンパ節組織は一般的に９ 〜２２ｇ、ｗ、の年齢であろう。骨髄についての組織は、約１２〜２４ｇ、ｗ、 であろう。

異種の宿主は、人以外の免疫無防備状態の哺乳動物であろう。免疫無防備状態の 宿主は、種々の方法で免疫無防備状態にされてもよく、その結果、機能的Ｔ及び Ｂリンパ球の実質的欠損がもたらされるであろう。異種の宿主は、免疫無防備状 態の宿主をもたらす種々のレベルでの欠損をもっていてもよい。免疫グロブリン 又はＴ−リンパ球位置の再配列中やファクターレセプター中やＴ−リンパ球中等 における欠損の結果として、この欠損はリンパ球を分泌する機能的抗体の損失を 引起し、特に抗体生産を不能にする。

現在利用可能な５ＣＩＨマウスや馬（馬族）以外の哺乳動物宿主を用いてもよく 、該宿主には、ヒツジ、牛、山羊、ウサギ、霊長類（人以外）、ブタ、イヌ、ネ コ等を含めてもよい。特に重要な動物宿主としては、マウス、ラット、モルモッ ト、例えばカビバラ、ウサギなどの実験動物及び人以外の霊長類、牛、羊、ブタ 、馬などの家畜があげられる。特に重要なものは、先祖細胞から分化し、熟成す るためのリンパ系の能力に遺伝子欠損がある結果として、機能的Ｔ及びＢリンパ 球が欠けている哺乳動物である。すなわち、リンパ細胞のプロセッシングを提供 する胸腺の欠損以外の理由により、該動物は機能的リンパ細胞が欠けているので ある。

これらの哺乳動物として具体的には、ＣＢ−１７５ｃｉｄ／５ｃｊｄマウスがあ げられる。所望により、胚幹細胞の形質転換又は形質転換した造血幹細胞を機能 的骨髄を欠いた宿主、例えば破壊的照射を受けた宿主に導入することによって誘 導された変化にもとづいて免疫無防備状態の宿主を製造してもよい。該欠損は、 レコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂ　１ｎａｓｅ　）遺伝子、レコンビナーゼ用調節 遺伝子、免疫グロブリンの輸送に関与する遺伝子などの数多くの遺伝子のいずれ か、定常部に関連するエクソンの欠損、Ｔ細胞レセプターのローカスサイト（ｆ ｏｃｉ　５ｉｔｅ）における領域、表面免疫グロブリンなどであってもよい。

免疫抗原の導入のために血祭又はリンパ系における好適部位の下流にある種々の 部位を、大組織導入のために選択してもよい。適用できることがわかった部位に は、腋窩、哺乳類脂肪パッド、特に第四哺乳類脂肪パッド、腎臓カプセル及び首 などが含まれる。特に重要なのは、腋窩であり、ここで免疫抗原は足裏のふくら みに導入し、リンパ管により腋窩、特にインブラントしたリンパ節に排出しても よい。

該組織は、死後約４８時間以内に得られた新鮮な組織、または新鮮なものを凍結 した組織、即ち、死後約【２時間以内に凍結し、約−１Ｏ℃以下、通常は凡そ液 体窒素の温度（−７０℃）に維持した組織であってもよい。該組織は、キメラ宿 主に移植した器官由来のもので移植後２〜４週間またはそれ以上経過して切除さ れたものでもよい。この方法において、宿主源から最初に得られた組織は、得ら れるキメラ宿主の総数を実質的に増加させながら大きく膨張することができる。

キメラ宿主から得られた組織は、ヒトを源として得られた組織と類似の方法で処 理してもよい。移植に使用する通常都合よく約１５〜２０ゲージであるトロカー ルの中に容易に適合できるように、該組織を、付着した基質要素を含むかまたは 付着した基質要素を含まない、一般に約０．５〜４ｇ、より一般的には約１〜２ ｆｌである器官の部分または完全な器官として提供してもよい。普通、該組織を 生体外で長い時間培養することはない。場合によっては、全器官移植片を吻合供 与体及び宿主血管、リンパ管等によって移植してもよい。

機能性Ｔ−及びＢ−リンパ球の欠如に加えて、免疫適格性の更なる低下を、育種 、ナチュラルキラー欠損突然変異体の使用、宿主照射の使用または、例えば、リ ンパ球または骨髄単球血縁体の如き殺されるこれら細胞に特異的な抗体に連結し た免疫細胞毒標識の使用によって達成することができる。特に、免疫適格性が本 発明に従って導入された組織によって与えられる変化の程度に比例する場合には 、生得の免疫能力は、更に、宿主にもともと存在する低いレベル以下に低下され 得る。

宿主は、通常、免疫適格宿主の通常寿命の約２５％未満、通常的１〜２０％のも のである。一般に、宿主は少なくとも約３週齢であり、組織を目的とする位置に 導入できるよう操作するのに充分大きいものである。例えば、約２〜４寿命を有 すると思われるマウスを約３〜１０、通常は４〜８週齢で使用する。宿主内での 組織の成長は、通常、器官によって少なくとも約１〜２倍変化する。

普通、宿主に導入された組織は、成長し、血管化し、そして、免疫前に連結した リンパ管を有することができる。一般に、少な（とも１週間、好ましくは２週間 は老廃物を排出し、通常、移植後２０週間、より一般的には移植後２〜ＩＯ週間 以内に免疫が起こる。

本発明の方法論は、ヒトにとってありふれたエピトープを含む興味あるエピトー プを有するいかなる複合体にも使用することができる。主題のキメラ宿主中でヒ ト蛋白に特異的な抗体を産生ずる作用とは無関係なので、生得のヒト蛋白に対す る抗体を生育することが可能である。興味ある免疫源は、ハプテン及び抗原の両 方であってもよく、この場合、ハプテンは免疫応答を起こさせるために修飾され たものである。興味ある複合体は、一般に約５ｋＤ（キロダルトン）未満、通常 は約２ｋＤ未満の小さな合成有機分子、ポリペプチド及び蛋白、脂質、糖類、及 びそれらを組み合わせたものを含んでもよい。該複合体は、医薬、ホルモン、サ イトカイン類（ｅｙｔｏｋｉｎｅｓ）　、表面膜蛋白、酵素、糖側基、毒素等を 含む人工のまたは天然に存在するものであってもよい。該免疫源は、完全７０イ ンドアジユバント、スペコール（ｓｐｅｅｏｌ　）、百日咳菌ワクチンまたはそ の毒素等の広汎な種類のアジュバントと組み合わせてもよい。通常、その注入量 は、動物の注入位置に依って幅広く変動し、通常、免疫源を約ＩＯ〜１■を含ん で約１０〜５ｍｌで変動する。アジュバントの量は、アジュバントの性質により 通例使用される量が使用される。

投与は、通常皮下、筋肉、腹膜内または血管内である注射によって通常行われ、 注射はヒトリンパ球組織部位から上流方向である。前回の注射の通常１〜６週間 以内、より通常には２〜４週間以内に、ｌまたは２以上のブースター注射を行う ことができる。このブースター注射は、前回の注射組成物と同一の組成、または 濃度、アジュバント等を変えることによって異なる組成を有することができる。

免疫原の投与と共に、血流中の濃度が約０．５〜２０■／ｍｌの範囲となるよう にＩＬ−６を投与することができる。

免疫化が終了した後、組織を採取し、Ｂ−リンパ球は不死化され及び／または適 当にクローン化される。ヒトＢ−リンパ球を不死化することができる様々の融合 相手を用いることができる。例えｉｆＫａｎ−Ｍｉ　ｔｃｈｅ　ｌらによるｒＪ 、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｌａｂ、　Ａｎａｌ、　Ｊ（１９８９）　、３　＋　４１〜 ９参照。融合のために用いられる方法は、融合因子、通常は非イオン性洗浄剤、 の存在下で、融合が充分起こる時間、Ｂ−リンパ球と融合相手を結合させ、次い で融合相手中に示された標識の性状によって、得られた／％イブリドーマを選択 することからなる。この細胞をその後限界稀釈し、汚染された細胞を含まないク ローンを得、均一の抗体組成物を生成することができる。次いでハイブリドーマ をマウスまたはラットのような宿主動物に導入し、腹水液を生成するか、または スピナーフラスコ、ローラーボトル等を使用して機械的に膨張させることもでき る。宿主動物は、新生物移植組織を受容することができるように免疫無防備状態 にされる。

得られた抗体は診断及び治療の両目的において種々の方法で使用することができ る。しかしながら、例えば非ヒト抗体のように通常より容易に得られる他の抗体 は、インビトロの診断で使用することができるので、はとんどの場合、この抗体 は、ヒトにおけるインビボの診断及び治療用途のために使用されるであろう。

従って、この抗体は敗血症の治療、特定のＴ−リンパ球レセプターの剥離、ライ の毒性インビボの診断、移植等に関連する受動的免疫化に使用することができる 。

この抗体は、ビオチン、アビジン、酵素、細胞障害剤、例えばリシン、ジフテリ ア毒、アルビン等及びその類似物のような他の化合物に結合して、放射性標識す ることによって変性することができる。

このキメラ宿主は、また特定の標的細胞または特定の免疫優性配列に特異的なヒ トＴ−リンパ球の生成にも使用することかできる。これらのＴ−リンパ球は、Ｃ Ｄ４ヘルパー細胞、ＣＤ８抑制遺伝子細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞毒Ｔ− リンパ球、抗体依存性細胞毒細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴｒＬｓ）等であること ができる。所定の抗原に特異的なり一リンパ球の生成に用いられる同一のシステ ムを、Ｔ−リンパ球が制限される標的主要組織適合性複合体に結合する免疫優先 配列に特異的なＣＤ４ヘルパー細胞の生成に用いることができる。また、その他 のタイプのＴ−リンパ球に対し、適当な刺激を与えることによって、リンパ球組 織と共に新生物組織を用いてＴＩＬｓを生成することができ；また別のタイプの Ｔ−リンバ球に対しては、微生物及びその類似物のような刺激と共に種々のサイ トカイニン及び／または生長因子を用いることによって、ＴＩＬｓを生成するこ とができる。

免疫応答を形成する効率について、及び免疫系への薬物の効果について、ワクチ ン及び薬物の研究にリンパ球組織がまた使用されてもよい。ワクチンにとって、 リンパ節のようなリンパ組織がモノクローナル抗体の作製において記載されるの と実質的に同様な方法で利用されてもよい。多くの異なるワクチンとの応答での ベースラインを提供することによって、−次及び二次免疫応答を形成するワクチ ンの応答に関して、それらのワクチンを比較することができる。加えて、活性化 されたＢ−リンパ球を不死化し、抗体の病原体にたいする防御効果についてそれ らの抗体をスクリーニングすることができる。

加えて、リンパ球組織を使用して、免疫系への薬物の効果を測定することができ る。多様な組織におけるヒト造血細胞の生育能力への薬物の効果、免疫抗原及び ／またはサイトカイン等による刺激に対する薬物の効果を検出することができる 。免疫無防備状態宿主へ骨髄を含む骨を導入し、骨髄中相射的細胞数及び薬物の 治療投与量の存在下及び不在下におけるその数の変化を測定することによって、 骨髄中の造血細胞への薬物の効果の示度を得ることができる。薬物の存在下及び 不在下において免疫抗原で骨髄を刺激し、その免疫応答を評価することによって 、体液免疫応答への薬物効果を測定することができる。その効果の測定のために 、組織切片を調整し、免疫抗原に対するｓｌｇを標識し、及びとりわけ標識され た細胞の数を数えることによって、活性化されてｓｌｇを生産した細胞数を決定 することができる。

次の例は限定としてではなく説明として提供される。

マウスの背後脚上の内証にわたる部位を直接切開する。内証の上部にある脈理ま で垂直に走る主静脈を焼灼する。脂肪を通して切開し、原調リンパ節（ＬＮ）を 露出させた。そのＬＮを除去し、同じ部位にヒト組織を挿入した。縫合し、その 皮膚切開を閉じる。

スペコールアシュバントといっしょになった５０ｍｇＪｊｔのトリニトロフェニ ル−キーホールリンペットヘモシアニン（ＴＮＰ−ＫＬＨ）（５ｍｌのＴＮＰ− ＫＬＨ［１０ｍ１．／ｍｔ　］を６ｍｌのスペコールアジュバントと混合する） を足跡へ皮下注射投与し、そこはリンパ管が膝高リンパ節内へ排出しているとこ ろである。−匹のマウスにおける移植片は適切な細胞性を示し、多数のヒトＩｇ Ｇ及び１ｇＭ陽性細胞を含むことが観察された。免疫感作から４日後にその組織 を採取し、組織学的切片を調製し、それらの切片を分析した。その染色手順は次 のようである。免疫したヒト移植片を宿主から外科的に取り出し、液体窒素中で スナップ凍結（ｓｎａｐｆｒｏｚｅｎ）　Ｌ／た。組織をクリオスタットを使用 して８ｍｍ厚さの切片とし、ガラススライドの上に置く。もしすぐに使用しなけ れば、組織を一２０℃に保存する。スライドを湿潤させ、乾燥し、２０分間アセ トン中へ固定する。スライドをその後１ＸＰＢＳで湿らせ、０．１％ＢＳＡ／Ｐ ＢＳで希釈されて１％正常ヒト血清を含むトリニトロフェニル−コンジュゲート アルカリホスファターゼ（ＴＮＰ−Ａ、Ｐ）でインキュベートする。その固形物 をＩ　ＸＰＢＳで３回洗浄する。発色は基質溶液：ナフトール−Ａｓ−ホスフェ ート、０．０５プロパンジオール緩衝液、ｐＨ９，７５で希釈したＤＭＦに溶解 したファストブルーＢＢ塩、及び１０ｍＭのレバミソ−ルーＨｃｌで実施する。

反応を５−１０分間進行させて、スライドを１ＸＰＢＳ中へ沈めることによって 停止させる。そのスライドをその後、３０秒間へマドキシリンで対比染色し、乾 燥し、グリコール／ゼラチンを使用してカバースリップをのせる。

抗−ＴＮＰ生産細胞が染色される場合、いくつかの非常に明瞭な陽性細胞がある 。陽性細胞はブルーの細胞質の染色を示す。その染色は、基質単独での組織の発 色による本来のアルカリホスファターゼに帰すものではないことが示された。

染色のブロッキングはまた、１０ｍｌ／ｍｌのＴＮＰ−ＫＬＨを使って示され、 ｌｏｇ／ｍｌは細胞内染色を阻止しなかった。二重染色はＴＮＰに特異的なヒト １ｇＭ陽性細胞を示した。

ウスの皮下に移植した。移植後の種々の時点で骨を摘出し、骨から回収した細胞 を、ヒト特異的抗体であるＭＥＭ−４３、又はマウス特異的抗体であるＬｙ、　 ５、ｌのいずれかにより染色し、ＦＡＣ３又はシトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ） 標本により分析した。移植片からの切片は通常の組織観察用に調製した。

移植後２−３週後の組織観察又はシトスピン標本によっても、ヒト血液生成は観 察されなかった。ヒト骨移植片から回収した大部分の細胞は、ＭＥＭ−４３に陽 性であった。流動血球計算による散乱分析（Ｓｃａｔｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ ）によってはリンパまたは骨髄細胞集団は見出されなかったので、はとんどの細 胞の起源が非造血性であることが示された。

移植後４−５週の時点で、分析したほとんど金側のシトスピン標本において、造 血組織の兆候くすなわち、芽細胞、未成熟形態のを髄単核白血球及び赤芽球の存 在）が観察された。これらの試料のうちＭＥＭ−４３陽性の細胞は、胎児骨の骨 髄試料のものと類似の分散特性（ｓｃａｔｔｅｒ　ｐｒｏｆｉｌｅ）を示した。

を髄単核白血球系列の細胞、Ｂ細胞系列、及び赤血球細胞系列が、それぞれＬｅ ｕＭｌ（ＣＤ１５）　、ＣＤｌ０及びＣＤ１９、ならびに抗ヒトグリコフォリン （ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ）　Ａを用いた免疫蛍光染色により示された。

上記の結果によれば、他のヒト組織の非存在下において、少な（とも８週間にわ たり移植された骨の内部でヒト造血細胞が維持され、種々の系列の細胞が検出で きること、並びに骨組織中のヒト細胞の有用性に鑑みれば、造血細胞の維持並び に増殖に関して、種々の化合物の効果や条件を検討できることが示された。

上記の結果から、本発明の方法により、興味の対象となるいかなるエピトープに 対しても、ヒトモノクローナル抗体を製造する唯一の方法が提供されることが明 らかである。取扱い易い動物を選択して容易に免疫でき、常法に従って組織を取 得することができる。ブースターショット（ｂｏｏｓｔｅｒ　５ｈｏｔ）を行い 、複数の動物を使用することにより、特定の抗原における特定のエピトープまた は複数のエピトープに特異的に高い親和性を有する多種類の抗体を得ることがで きる。その結果得られる刺激された８９２８球を、その後、不死化及び／又はク ローニングに用いることにより、ヒトモノクローナル抗体が安定に供給される。

個々の文献や特許出願について参照として本開示に包含することを明確かつ個別 に記載しであるように、本明細書に引用されたすべての文献及び特許出願を参照 として本開示に含める。

理解を明確にする目的で、具体的記述や実施例により上記発明をある程度詳細に 記述してきたが、当業者にとっては、本発明の技術をみれば、請求の範囲に記載 された発明の目的や範囲を逸脱することなく、ある種の変更や修飾をなしうるこ とが全く明らかであろう。

浄１！ｒ（帛容に変更なし） 要　約　書 ヒトリンパ組織を、ヒト免疫系への刺激の効果を調べ、刺激からの情報及び生成 物を得るための機会を提供するために、免疫無防備状態宿主に導入する。特に、 該方法は、リンパ組織を免疫無防備状態宿主に導入し、Ｂ−ＩＪンパ球を適当な 抗原で刺激し、該組織を採取し、そして該Ｂ−リンパ球をモノクローナル抗体の 安定な提供を得るための条件下で、不死化及び／又はクローニングすることによ り、ヒトのモノクローナル抗体を製造するために提供される。

平成　年　月　日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．刺激に対するヒトの造血応答を誘発する方法において；生育可能な造血細胞 を含むヒト胎児リンパ球組織を、免疫無防備状態哺乳動物の、該組織か血管化さ れリンパ管に連結されるようになり、かつ該造血細胞が増殖するような部位に移 植する工程；該リンパ球組織を前記刺激により刺激する工程；及び前記組織中の 前記造血細胞の前記刺激に対する応答に及ぼす前記刺激の効果を測定する工程を 含む上記方法。 前記刺激が、免疫抗原による免疫処置である請求の範囲１記載の方法。 前記刺激が、薬剤との接触である請求の範囲１記載の方法。 免疫無防備状態のヒト以外の哺乳動物のキメラ宿主を免疫抗原で免疫する工程； 及び 前記免疫抗原に対する抗体、すなわちヒト免疫グロブリンを産生するＢ−リンパ 球源としての前記ヒトリンパ球組織を収穫する工程を含む、ヒトの抗体を生産す る方法であって； 前記キメラ宿主が、少なくとも実質的にＢ−又はＴ−リンパ球を欠く免疫無防備 状態であること、前記ヒトリンパ球組織を血管化し得る部位に移植した結果とし て、Ｂ−及びＴ−リンパ球を含む血管化したヒトリンパ球組織を含むこと、及び 免疫抗原に対して少なくとも一次免疫応答することができること、を特徴とする 上記方法。 前記リンパ球組織が、リンパ節である請求の範囲４記載の方法。 前記部位が、膝窩である請求の範囲５記載の方法。 前記部位が、膝窩である請求の範囲５記載の方法。 前記宿主が、マウスである請求の範囲５記載の方法。 前記マウスが、ＣＢ−１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスである請求の範囲８記載の 方法。 前記ヒト組織が、胎児組織である請求の範囲１記載の方法。 免疫無防備状態のヒト以外の哺乳動物のキメラ宿主を、Ｂ−及びＴ−リンパ球を 含む血管化されたヒトリンパ球組織の上流の部位で、免疫抗原で免疫する工程； 前記免疫抗原に対する抗体を産生するＢ−リンパ球源としての前記ヒトリンパ球 組織を収穫する工程；及び 前記免疫抗原のエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体を生産するために 免疫グロブリン産生Ｂ−リンパ球をクローニングする工程を含む、ヒトの抗体を 生産する方法であって； 前記キメラ宿主が、少なくとも実質的にＢ−又はＴ−リンパ球を欠く免疫無防備 状態であること、前記ヒトリンパ球組織を血管化し得る部位に移植した結果とし て、Ｂ−及びＴ−リンパ球を含む血管化したヒトリンパ球組織を含むこと、及び 免疫抗原に対して少なくとも一次免疫応答することができること、を特徴とする 上記方法。 １２．前記Ｂ−リンパ球が、クローニングの前に、融合又はエブシュタイン−バ ール形質転換により不死化される請求の範囲８記載の方法。 １３．免疫無防備状態のＣＢ−１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄキメラマウスを、Ｂ−リ ンパ球及びＴ−リンパ球を含む血管化したヒト胎児リンパ節組織から上流の部位 で免疫抗原により免疫感作すること； 前記抗原に対する抗体を産生するＢ−リンパ球源としての前記ヒトリンパ組織を 採取すること、及び 前記抗原のエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体の生産のために免疫グ ロブリン産生Ｂ−リンパ球をクローニングすることを含み、前記キメラ宿主が、 少なくとも実質的にＢ−リンパ球を欠く免疫無防備状態にされ、前記ヒトリンパ 組織が血管化可能部位に移植された結果、Ｂ−及びＴ−リンパ球を含む血管化し たヒトリンパ組織を含み、そして抗原に対して少なくとも一次免疫応答を行うこ とができることを特徴とするヒトモノクローナル抗体の製造方法。 １４．前記部位が膝窩である請求の範囲１３項記載の方法。 １５．前記免疫感作が、前記リンパ節に流出する足の肉趾への注射により行われ る請求の範囲１４項記載の方法。 １６．前記胎児リンパ節組織が、完全な胎児リンパ節である請求の範囲１３項記 載の方法。 １７．マウスの血管及びリンパ管、並びにアジュバントと共に抗原を用いて感作 した結果を生じる抗原に特有のｓＩｇを有するＢ−リンパ球を含むヒト胎児リン パ節。 １８．前記抗原が抗原に結合したハプテンを含む請求の範囲１７項記載のヒト胎 児リンパ節。 １９．血管化したヒト胎児リンパ節組織及びアジュバントと共に抗原を用いて感 作した結果を生じる抗原に特有のｓＩｇを有する胎児リンパ節組織Ｂ−リンパ球 を有するＢ−リンパ球を含む免疫無防備状態のヒト以外の哺乳動物。 ２０．前記哺乳動物がマウスであり、前記リンパ節が膝窩に移植される請求の範 囲１９項記載の免疫無防備状態のヒト以外の哺乳動物。 ２１．前記マウスがＣＢ−１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスである請求の範囲２０ 項記載の免疫無防備状態のヒト以外の哺乳動物。