KR102125084B1 - 신규한 교모세포종 환자 유래 이종 이식 모델 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 교모세포종 환자 유래 이종 이식 모델 및 이의 제법 및 용도에 대한 것으로, 보다 상세하게는 평균 생존기간이 짧은 교모세포종 치료에 있어 빠른 치료 옵션 선택이 가능하게 하는 교모세포종 환자 유래 이종 이식 모델 및 이의 제법 및 이를 이용한 환자 맞춤형 교모세포종 치료 선별 방법에 대한 것이다.
본 발명에 따른 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델은 본래 종양의 특징을 보유한다. 또한, 동소성 이식 방식으로는 두개내 종양을 형성하지 않는 환자 교모세포종 세포조차도 4주 내 종양을 형성하여 환자 유래 세포의 준비기간을 고려하여도 교모세포종 환자에서 초기 수술에서 재발까지의 평균 시간보다 훨씬 짧은 6주 이내 치료 옵션 선별이 가능하다. 아울러, 본 발명에 따른 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델은 피하 내 이식한 교모세포종 모델과 달리 뇌의 미세환경을 모사하여 효과적인 대안이 된다. 추가로, 별도 장비 없이 육안 또는 간이한 간접적 검안경 등을 이용하여 쉽게 모니터닝 할 수 있으며, 교모세포종 모델 제작에 상대적으로 적은 수의 교모세포종 세포가 필요한바 동시에 여러 치료 옵션의 동시 평가를 가능하게 하여 유용하다.
본 발명에 따른 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델은 본래 종양의 특징을 보유한다. 또한, 동소성 이식 방식으로는 두개내 종양을 형성하지 않는 환자 교모세포종 세포조차도 4주 내 종양을 형성하여 환자 유래 세포의 준비기간을 고려하여도 교모세포종 환자에서 초기 수술에서 재발까지의 평균 시간보다 훨씬 짧은 6주 이내 치료 옵션 선별이 가능하다. 아울러, 본 발명에 따른 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델은 피하 내 이식한 교모세포종 모델과 달리 뇌의 미세환경을 모사하여 효과적인 대안이 된다. 추가로, 별도 장비 없이 육안 또는 간이한 간접적 검안경 등을 이용하여 쉽게 모니터닝 할 수 있으며, 교모세포종 모델 제작에 상대적으로 적은 수의 교모세포종 세포가 필요한바 동시에 여러 치료 옵션의 동시 평가를 가능하게 하여 유용하다.
Description
본 발명은 신규한 교모세포종 환자 유래 이종 이식 모델 및 이의 제법 및 용도에 대한 것으로, 보다 상세하게는 평균 생존기간이 짧은 교모세포종 치료에 있어 빠른 치료 옵션 선택을 가능하게 하는 교모세포종 환자 유래 이종 이식 모델 및 이의 제법 및 이를 이용한 환자 맞춤형 교모세포종 치료 선별 방법에 대한 것이다.
교모세포종은 뇌조직에 풍부하게 존재하고 있는 신경교세포에서 시작하는 종양으로 전체 뇌종양의 12~15%를 차지한다고 알려져 있다. 신경교세포는 중추 신경계의 조직을 지지하는 역할을 하며 혈관과 신경세포 사이에 위치하여 신경 세포의 물질대사에 관여하고, 상해나 염증이 있을 때에는 증식하여 세포의 회복을 돕는 일을 하는데 이 신경교세포에서 시작하는 종양이 교모세포종이다. 그러나, 교모세포종은 뇌에서 가장 흔한 암인 동시에 악성인 암이며, 교모세포종의 평균 생존 기간은 15개월 미만이다.
이러한 교모세포종의 종양 특성을 연구하고 다양한 치료 옵션들의 잠재적인 치료 효능을 조사하기 위하여 교모세포종 환자 유래 이종이식(PDX) 모델의 개발이 요구되었다. 이를 위한 알려진 교모세포종의 환자 유래 이종이식 (PDX) 모델은 면역 저하 마우스에서 종양 세포의 피하 또는 두개 내 주입에 기반을 두고 있다. 그러나, 피하 주사를 통해 PDX 종양은 빠르게 발달되었지만 뇌 미세 환경과는 완전히 다른 피하 공간에 국한되는 문제가 있었다. 한편, 두개 내 주입을 통한 경우 종양은 교모세포종을 둘러싼 뇌의 미세환경을 경험하나, 일부 환자에서 유래한 세포는 두개내 종양을 형성하지 못하는 경우가 많고 종종 종양 형성이 느려 치료 효능 평가를 위해서는 긴 시간이 요구되었다. 이에 교모세포종 환자의 생존기간의 중앙값이 15개월 미만인 것을 고려하면 보다 신속하게 수행 할 수 있고 가능한 더 빠르게 형성될 수 있고 뇌의 미세환경을 모사한 교모세포종의 PDX의 확립이 요구되었다.
이에 본 발명자들은 신속하게 교모세포종 모델을 제작할 수 있으면서도 뇌의 미세환경을 모사한 새로운 교모세포종 환자 유래 이종이식 모델을 개발하고자 예의 노력한 결과, 4주내 종양을 형성하여 6주 이내 교모세포종 환자에 대한 치료 옵션을 스크리닝 할 수 있도록 하면서도 뇌의 미세환경을 모방하여 효과적이며 두개내 종양과 달리 별도의 이미징이나 생물발광 이미징 없이 육안으로도 관찰이 가능한 새로운 교모세포종 PDX 모델을 제작하고, 제작된 PDX 모델이 원래 종양세포와 면역조직화학적 특성이 동일하고 본래의 교모세포종의 특징을 유지함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
Verreault M, Schmitt C, Goldwirt L, et al. Preclinical efficacy of the MDM2 inhibitor RG7112 in MDM2-amplified and TP53 wild-type glioblastomas. Clin Cancer Res 2016; 22(5):1185-1196
본 발명의 목적은 새로운 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델 및 그 제법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 동물모델을 이용하여 환자 맞춤형 치료를 위한 정보를 제공하고 교모세포종 치료제를 스크리닝하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새로운 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델 및 그 제법 및 용도를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 교모세포종 환자로부터 분리된 교모세포종 세포들을 인간을 제외한 동물의 유리체내로 주입하는 단계를 포함하는, 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 제조된 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 환자 맞춤형 교모세포종 치료 선별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델에 교모세포종에 대한 후보 치료방법을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 후보 치료방법이 수행된 동물모델의 치료 효과를 확인하는 단계.
이때, 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 교모세포종의 유전학적 특성, 면역화학적 특성 및 종양 또는 면역단백질 발현 특성 중 어느 하나 이상을 추가로 분석하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 교모세포종 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델 또는 이로부터 유래된 교모세포종 세포에 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보 물질 처리 후, 상기 동물모델 또는 상기 교모세포종 세포를 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 동물모델의 종양 조직의 크기가 감소하거나 전이가 억제되는 경우이거나 상기 교모세포종 세포의 증식이 억제제거나 사멸하는 경우 후보물질을 교모세포종 치료제로 결정하는 단계.
이때, 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 교모세포종의 유전학적 특성, 면역화학적 특성 및 종양 또는 면역단백질 발현 특성 중 어느 하나 이상을 추가로 분석하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 평균 생존기간이 짧은 교모세포종 치료에 있어 빠른 치료 옵션 선택이 가능하게 하는 새로운 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델 및 그 제법 및 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델은 본래 종양의 특징을 보유한다. 또한, 동소성 이식 방식으로는 두개내 종양을 형성하지 않는 환자 교모세포종 세포조차도 4주 내 종양을 형성하여 환자 유래 세포의 준비기간을 고려하여도 교모세포종 환자에서 초기 수술에서 재발까지의 평균 시간보다 훨씬 짧은 6주 이내 치료 옵션 선별이 가능하다. 아울러, 본 발명에 따른 교모세포종의 환자 유래 이종이식 동물모델은 피하 내 이식한 교모세포종 모델과 달리 뇌의 미세환경을 모사하여 효과적인 대안이 된다. 추가로, 별도 장비 없이 육안 또는 간이한 간접적 검안경 등을 이용하여 쉽게 모니터닝 할 수 있으며, 교모세포종 모델 제작에 상대적으로 적은 수의 교모세포종 세포가 필요한바 동시에 여러 치료 옵션의 동시 평가를 가능하게 하여 유용하다.
도 1은 원발성 및 재발성 교모세포종 환자의 종양 세포 분리 및 배양에 대한 것으로, 1A는 원발성 및 재발성 종양의 H & E 절편(원 배율, x50)의 사진이고, 1B는 정위 생검(stereotactic biopy), 개두술(craniotomy), 화학방사선병행요법(CCRT), 환자 유래 세포 (GBL-28 및 GBL-37)의 준비에 대한 도식 일정이며(이때 주는 초기 진단 및 정위 생검후의 주를 의미함), 1C는 GBL-28과 GBL-37 세포의 사진이다(스케일 바, 100 μm).
도 2는 환자 유래 교모세포종 세포의 동소성 이식시의 불확실성을 나타내는 것으로, 2A는 U-87 MG, GBL-28, GBL-37의 두개내 주사 후 마우스(n = 12)의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타내고, 2B는 각 세포주의 두개내 주사 후 4~6주 마우스(U-87 MG(4주), GBL-28(6주), GBL-37(6주))의 두뇌의 H & E 절편의 사진을 나타내며(노란색 점선은 두개 내 종양을 나타냄, 스케일 바 2mm), 2C는 각 세포주의 두개내 주사 후 4~6주(U-87 MG(4주), GBL-28(6주), GBL-37(6주))에 DAPI와 GFAP에 대한 항체를 사용하여 염색한 뇌 절편의 사진을 나타낸다(노란색 점선은 두개 내 종양을 나타냄, 스케일 바 2mm).
도 3는 유리체내 주사를 통한 교모세포종의 새로운 환자 유래 이종이식 모델 개발에 대한 것으로, 3A는 종양 세포의 유리 체내 주사를 설명하는 개략도이고, 3B는 정상적인 배양 조건을 거친 GBL-28 및 GBL-37의 유리체 내 주사 후 2 내지 5 등급 종양을 갖는 마우스의 상대적 비율이며, 3C는 주입 전 4 시간 동안 저산소증 처리한 GBL-28 및 GBL-37의 유리체내 주사 후 3 및 4 등급 종양을 가진 마우스의 상대적 비율을 나타낸다. 2D는 주입 전에 4 시간 동안 저산소증 처리한 GBL-28과 GBL-37의 유리체 강내 주입 후 4 주안의 H & E 절편의 사진이다(노란색 점선은 수정체와 망막을 나타낸다. 스케일 바, 1 mm).
도 4는 유리체 강내 PDX 종양의 면역 조직 화학적 특성을 나타내는 사진으로, 4A는 DAPI와 인간 미토콘드리아, GFAP, 비멘틴 및 네스틴에 대한 항체를 사용하여 염색 된 안구 절편의 사진(스케일 바, 1 mm)이고, 4B는 인간의 마이토콘드리아, GFAP, 비멘틴 및 네스틴에 대한 항체를 사용하여 염색된 안구 절편의 확대 사진(스케일 바, 20 μm)이다.
도 5는 마우스의 유리체 강내에서 PDX 종양의 OLIG2-면역 양성을 나타내는 사진으로, 인간 OLIG2 항체에 대한 항체를 사용하여 염색된 안구 절편의 확대 사진이다(스케일 바, 10 μm).
도 6은 마우스들의 유리체 강으로부터 종양세포의 분리 및 그 특성을 나타내는 사진으로, 6A는 GBL-28, GBL-37, GBL-28N, GBL-37N, GBL-28H 및 GBL-37H 교모세포종 세포들의 형태학적 특징을 나타내는 사진이고, 6B는 DAPI 및 GFAP 및 인간 미토콘드리아에 대한 항체를 사용하여 염색된 교모세포종 세포의 사진이다(스케일 바, 100 μm).
도 7은 마우스들의 유리체 강으로부터 분리된 종양세포들의 비멘틴-면역양성을 나타내는 사진이다(스케일 바, 100 μm).
도 8은 마우스들의 유리체 강으로부터 분리된 종양세포들의 네스틴-면역양성을 나타내는 사진이다(스케일 바, 100 μm).
도 2는 환자 유래 교모세포종 세포의 동소성 이식시의 불확실성을 나타내는 것으로, 2A는 U-87 MG, GBL-28, GBL-37의 두개내 주사 후 마우스(n = 12)의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타내고, 2B는 각 세포주의 두개내 주사 후 4~6주 마우스(U-87 MG(4주), GBL-28(6주), GBL-37(6주))의 두뇌의 H & E 절편의 사진을 나타내며(노란색 점선은 두개 내 종양을 나타냄, 스케일 바 2mm), 2C는 각 세포주의 두개내 주사 후 4~6주(U-87 MG(4주), GBL-28(6주), GBL-37(6주))에 DAPI와 GFAP에 대한 항체를 사용하여 염색한 뇌 절편의 사진을 나타낸다(노란색 점선은 두개 내 종양을 나타냄, 스케일 바 2mm).
도 3는 유리체내 주사를 통한 교모세포종의 새로운 환자 유래 이종이식 모델 개발에 대한 것으로, 3A는 종양 세포의 유리 체내 주사를 설명하는 개략도이고, 3B는 정상적인 배양 조건을 거친 GBL-28 및 GBL-37의 유리체 내 주사 후 2 내지 5 등급 종양을 갖는 마우스의 상대적 비율이며, 3C는 주입 전 4 시간 동안 저산소증 처리한 GBL-28 및 GBL-37의 유리체내 주사 후 3 및 4 등급 종양을 가진 마우스의 상대적 비율을 나타낸다. 2D는 주입 전에 4 시간 동안 저산소증 처리한 GBL-28과 GBL-37의 유리체 강내 주입 후 4 주안의 H & E 절편의 사진이다(노란색 점선은 수정체와 망막을 나타낸다. 스케일 바, 1 mm).
도 4는 유리체 강내 PDX 종양의 면역 조직 화학적 특성을 나타내는 사진으로, 4A는 DAPI와 인간 미토콘드리아, GFAP, 비멘틴 및 네스틴에 대한 항체를 사용하여 염색 된 안구 절편의 사진(스케일 바, 1 mm)이고, 4B는 인간의 마이토콘드리아, GFAP, 비멘틴 및 네스틴에 대한 항체를 사용하여 염색된 안구 절편의 확대 사진(스케일 바, 20 μm)이다.
도 5는 마우스의 유리체 강내에서 PDX 종양의 OLIG2-면역 양성을 나타내는 사진으로, 인간 OLIG2 항체에 대한 항체를 사용하여 염색된 안구 절편의 확대 사진이다(스케일 바, 10 μm).
도 6은 마우스들의 유리체 강으로부터 종양세포의 분리 및 그 특성을 나타내는 사진으로, 6A는 GBL-28, GBL-37, GBL-28N, GBL-37N, GBL-28H 및 GBL-37H 교모세포종 세포들의 형태학적 특징을 나타내는 사진이고, 6B는 DAPI 및 GFAP 및 인간 미토콘드리아에 대한 항체를 사용하여 염색된 교모세포종 세포의 사진이다(스케일 바, 100 μm).
도 7은 마우스들의 유리체 강으로부터 분리된 종양세포들의 비멘틴-면역양성을 나타내는 사진이다(스케일 바, 100 μm).
도 8은 마우스들의 유리체 강으로부터 분리된 종양세포들의 네스틴-면역양성을 나타내는 사진이다(스케일 바, 100 μm).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본 발명에서의 용어 "질환 동물모델"이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환 모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환 모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자 특성, 면역화학적 특성, 종양 및 면역 단백질 발현 특성, 예후 인자들을 알아내고, 발현 유전자 및 발현 단백질들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제효능 및 독성검사를 통해 실용화 가능성 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
본 발명에서의 용어 "환자 유래 이종이식 동물모델(Paient-derived xenograft, PDX)"이란, 환자 유래 암세포 또는 암조직을 면역결핍 동물에 이종이식하여 제작된 암 환자 맞춤형 동물모델로서, 암 환자에서 암과 형태학적 환경이 동일 또는 유사하고, 유전학적 환경이 동일 또는 유사하며 암의 마커 단백질의 발현특성이 동일하며, 암 환자의 유전적, 생리적 및 환경적 특성을 반영한 조건을 제공할 수 있다. 따라서, 환자 유래 이종이식 동물모델에서 항암 효과가 있다고 판단된 항암제 후보물질, 방사선 치료(방사선 수술) 증감제(sensitizer), 면역치료 후보물질 등을 암세포 또는 암 조직 제공 암 환자에게 처리하면, 이를 항암제 후보물질 등을 환자에게 처리한 것과 동일한 효과를 확인할 수 있으므로, 상기 환자 유래 이종이식 동물모델을 이용하면 항암제 등이 실제로 환자에게 적절한 효과를 나타낼 수 있는지 확인할 수 있다는 장점을 가진다.
본 발명에서의 용어 "동물" 또는 "실험동물"은 인간 이의외 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소, 양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 동물은 마우스이다.
본 발명에서의 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적일 수 있음), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장에에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(palliating) "하는 것은 치료를 하지 않는 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 진행의 시간적 추이가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 명세서를 통하여, 문맥에서 달리 표현하지 않으면, "포함하다" 및 "함유하다"란 문구는 제시된 단계 또는 단계들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 단계들의 군이 배제되지 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 구체적으로 본 발명을 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 신규한 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 안구내 종양은 GEAP, 비멘틴, 네스틴 마커에 대한 양성을 나타내어 교모세포종의 조직 및 세포 특성을 나타내며, 또한, 신경교세포(glial cell) 계통의 특징인 OLIG2 양성임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 교모세포종 환자 유래 이종이식 동물모델은, 교모세포종 환자로부터 분리된 교모세포종 세포들을 인간을 제외한 동물의 유리체내로 주입함으로써 제작된다. 이때, "유리체"란 안구 내에서 수정체와 망막 사이를 채우고 있는 무색 투명한 젤 형태의 구조물로서, 초자체라고도 한다. 본 발명에 있어서, 상기 "동물"은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 이때, 동물은 면역 결핍된 동물임을 특징으로 할 수 있으며, "면역 결핍된 동물"이란 교모세포종이 발병될 수 있도록 면역시스템을 구성하는 일부 구성요소를 유전자 수준에서 인위적으로 손상시켜서 정상적인 면역시스템이 구현되지 않도록 조작하여 제조된 동물을 의미한다. 상기 면역결핍 동물로는 신경계가 형성된 동물을 사용할 수 있는데, 바람직하게는 면역결핍되도록 조작된 마우스가 될 수 있다. 예로, Balb/c 누드 마우스를 사용할 수 있다.
종래 보고된 교모세포종 환자 유래 이종이식 모델은 피하 및 두개 내 주입을 통해 교모세포종의 환자 유래 이종이식모델을 제작하는 것인데, 피하 투여 된 교모세포종 모델은 종양이 피하 조직에 국한되어 있기 때문에 종양의 미세 환경 관련 특징을 확인하는 것은 불가능하다. 또한 이 경우 종양은 혈액 뇌 장벽에 의해 보호되는 뇌종양과 달리 전신 투여를 통해 치료제에 비교적 쉽게 노출되게 되어 실질적인 치료옵션 선택을 위한 대안이 되기 어려웠다. 아울러, 두개내 이식통한 교모세포종 모델은 실제 환자에서 유사한 미세 환경(뇌)를 제공하는 장점은 있으나, 종양형성이 느려 PDX 치료제의 효능을 평가하는 데 45일 이상이 걸리는 경우가 많다. 더욱이 일부 환자에서 유래한 세포는 본 발명의 대조예에서와 같이 두개내 종양을 형성하지 못했다. 더욱이 이 경우 두개 내 종양이 효율적으로 발달하더라도, 종양 형성을 조사하기 위해서는 이미징 또는 생물 발광 이미징이 필요한 단점이 있다.
이에 반하여, 본 발명의 방법에 따라 제작된 유리체내 주입을 통한 교모세포종 환자유래 이종이식 동물모델(PDX)은 몇 가지 장점을 가지고 있다.
첫째, 신속한 교모세포종 PDX를 제조하게 하여 평균 생존기간이 짧은 교모세포종 치료에 있어 빠른 치료 옵션 선택이 가능하게 한다. 교모세포종 환자의 평균 생존 기간은 15 개월 미만이므로, 특히 종래 치료법에 대하여 내성 종양이 있는 경우 2 차 치료 옵션을 선별하기 위해서는 효율적이고 신속한 스크리닝 시스템이 필요하다. 환자 유래 교모세포종 세포를 유리체내 주입 시 플라크 유사 종양 형성이 2 주 이내에 관찰되기 때문에, 주사 후 2 주부터 전신 또는 직접 안구내 투여를 통해 치료 옵션을 스크리닝 할 수 있다. 더욱이 본 발명의 실시예에서 확인할 수 있듯이, 두개내로 주입한 경우 주사 후 6주에서도 두개내 종양을 형성하지 않은 환자의 교모세포종 세포조차도, 유리체내로 주입한 경우 종양형성이 2주 이내 관찰되며 효과적으로 두개내 종양을 형성하게 된다는 점은 주목할 점이다.
특히, 본 발명에 있어서, 환자로부터 분리된 교모세포종 세포는 동물의 유리체내로 주입 전 저산소처리된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이 경우 저산소처리하지 않은 정상배양군에 비하여, 안정적이고 일관된 덩어리 형성을 가져왔다(도 3C). 아울러, 저산소 처리한 경우 모두 유리체 강에서 망막 바깥으로 확장되는 종양을 형성한다는 것도 주목할 사항이다. 즉, 저산소 처리하여 유리체내 주입 시 교모세포종 세포의 침윤성 특징을 확인할 수 있었다. 본 발명에서, "저산소(hypoxia) 처리"란 일반적인 세포 배양 조건의 산소 양보다 적은 양의 산소가 존재하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 저산소 조건은 5% 미만인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 산소 농도 0.01 내지 3%, 더욱 바람직하게는 산소 농도 1% 이하에서 세포를 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 저산소 처리 시간은 1 내지 48시간, 바람직하게는 4 내지 24시간, 더욱 바람직하게는 약 6시간 내지 12시간 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
둘째, 중추 신경계를 구성하는 망막은 본래 종양의 미세 환경을 모방한다. 동적인 시냅스를 가지는 적층된 신경세포와 망막 혈관 구조의 혈액-망막 장벽 시스템은 망막을 뇌의 효과적인 대안으로 만든다. 눈의 망막과 뇌는 공통적으로 여러 신경혈관의 특징을 공유한다. 망막은 다양한 신경 세포 유형들 사이에 여러 개의 시냅스가 형성되는 신경 세포층으로 구성되어있다. 또한, 뇌와 망막의 미세 혈관 내피 세포는 혈관 주위 세포와 성상 세포를 포함한 주변 세포들로 혈액 신경 장벽을 형성한다. 아울러, 미세아교세포(microglia)와 면역세포를 포함한 교모세포종의 종양 미세환경의 다른 세포적 구성요소들이 두뇌와 망막 사이에서 매우 유사하다.
셋째, 교모세포종을 동소성 이식한 경우(두개 내 종양)과 비교하여, 안구내 종양은 육안으로 직접 관찰하거나 간단한 광학 렌즈(78 디옵터 렌즈 등)를 사용하여 간접적 검안경(ophthalmoscope)을 통하여 쉽게 모니터링 할 수 있다. 추가 이미징 시스템이 필요 없기 때문에 종양 형성 검사 및 모니터링을 수행하는 것이 더 쉽다. 또한, 시각적 그레이딩 시스템은 종양 형성의 정량적 분석을 위해 준 정량적 스케일 데이터를 제공한다.
넷째, 본 발명의 방법에 따라 제작된 유리체내 주입을 통한 교모세포종 PDX는 두개내 주입에 비하여 적은 수의 교모세포종 세포가 필요하다. 즉, 유리체내로 주입되는 환자의 교모세포종 세포는 5~10 x 104 세포임을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 종양 제거 수술 시 얻어진 환자의 종양 조직은 한정되어 있는 점을 고려하면 PDX 제작에 적은 수의 세포가 필요한 장점은 한정된 조직으로 더 많은 수의 PDX 제작이 가능하게 하며, 이는 몇 가지 옵션을 동시에 평가할 수 있게 한다. 환자 유래 세포의 준비 시간을 고려하면 모든 수술은 초기 수술에서 재발까지의 평균 시간보다 훨씬 짧은 6 주 내에 완료 될 수 있다.
이러한 장점으로 인하여, 본 발명에 따른 신규한 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델은 다양한 용도로 사용될 수 있다.
이에 본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델에 교모세포종에 대한 후보 치료방법을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 후보 치료방법이 수행된 동물모델의 치료 효과를 확인하는 단계를 포함하는 환자 맞춤형 교모세포종 치료 선별을 위한 정보를 제공하는 방법에 대한 것이다.
동일한 교모세포종이 발병된 환자라고 할지라도 그 특성이 개별적으로 모두 다르므로 개개의 환자에 따라 치료 효과가 다르고 예후가 다를 수 있다. 따라서, 모든 환자에 대하여 동일한 치료방법을 선택하였을 때, 그 효과가 다를 수 있으므로, 다양한 교모세포종의 치료방법 중에서 개개의 환자에 특이적이고 보다 효과적인 치료방법을 선택하거나 새로운 치료방법을 스크리닝할 필요가 있다. 본 발명의 교모세포종 PDX는 이식된 교모세포종 세포가 유래한 환자의 특성을 그대로 반영하므로, 이를 이용하여 그 환자에 적합한 치료방법의 선택을 가져올 수 있다.
상기 후보 치료방법은 목적하는 환자에서 발병된 교모세포종을 치료하기 위한 맞춤형 치료법의 선별에 사용될 수 있는 다양한 치료방법을 의미하는데, 통상적으로 알려진 가능한 모든 교모세포종의 치료방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학적 요법, 방사선 요법, 외과적 요법, 면역세포치료법 또는 이들의 조합이 될 수 있다.
상기 화학적 요법은 통상적으로 알려진 항암활성을 가지는 치료제 후보물질을 환자에게 투여하여 교모세포종을 치료하는 방법을 의미한다. 또한, 상기 방사선 요법은 방사선을 환자에게 처리하여 교모세포종을 치료하는 방법이며, 외과적 요법은 외과수술로서 교모세포종이 발병된 부위를 적출하여 교모세포종을 치료하는 방법이다. 상기 면역세포치료법은 환자의 혈액에서 추출한 말초혈액단핵세포에서 교모세포종에 공격성을 나타내는 면역세포를 분리하고, 이를 환자에서 분리된 교모세포종 세포와 융합시킨 다음, 환자에게 항암백신의 형태로 다시 투여함으로써, 환자에서 발병한 교모세포종을 치료하는 방법이다.
아울러, 환자 맞춤형 교모세포종 치료 선별을 위해서는 바람직하게는, 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 교모세포종의 유전학적 특성, 면역화학적 특성 및 종양 또는 면역단백질 발현 특성 중 어느 하나 이상을 추가로 분석하여 예후를 예측하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 치료 효과 확인은 예컨대 상기 동물모델의 종양 조직의 크기가 감소하거나 전이가 억제되었는지를 확인하는 것으로, 그 제한은 없으나 바람직하게는 상기 동물모델의 안구를 육안으로 직접 관찰하거나 간접적 검안경을 통하여 관찰하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델 또는 이로부터 유래된 교모세포종 세포에 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질 처리 후, 상기 동물모델 또는 상기 교모세포종 세포를 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 동물모델의 종양 조직의 크기가 감소하거나 전이가 억제되는 경우이거나 상기 교모세포종 세포의 증식이 억제제거나 사멸하는 경우 후보물질을 교모세포종 치료제로 결정하는 단계를 포함하는 교모세포종 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 동물모델의 안구를 육안으로 직접 관찰하거나 간접적 검안경을 통하여 관찰하여 종양 조직의 크기 감소를 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 교모세포종 치료제 결정을 위해서는 바람직하게는, 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 교모세포종의 유전학적 특성, 면역화학적 특성 및 종양 또는 면역단백질 발현 특성 중 어느 하나 이상을 추가로 분석하여 예후를 예측하는 것을 특징으로 할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 동물로서 마우스를 이용하여 실험을 수행하였으나, 이에 제한되지 않고 임의의 포유류라면 종류와 무관하게 적용 가능하다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
교모세포종
환자 유래 이종 이식 동물모델(
PDX
)의 제조
1-1: 교모세포종 세포의 분리 및 일차 배양
서울 대학교 병원 임상 시험위원회 (IRB No. H-1009-025-331)의 승인을 받은 39세의 여성 교모세포종 환자에서 1 차 샘플을 채취했다. 초기 증상이 2 주간의 단기 기억 결손이었던 39 세 여자 환자는, 교모세포종이 정위 뇌 생검 (stereotactic brain biopsy)으로 진단되었다(도 1A). 환자는 수술적 종양 제거(1차 수집, 원발성 종양)와 테모졸마이드로 화학방사선 병행요법 치료를 받았다. 초기 수술 3 개월 후 재발성 종양을 통제하기 위해 다른 수술적 종양 제거(2차 수집, 재발된 종양)가 시행되었다. 각 수술에서 종양 조직은 일차 배양을 위해 준비되었으며 교모세포종 세포는 GBL-28 (원발성 종양)과 GBL-37 (재발성 종양)으로 각각 지정되었다 (도 1B).
상기 2차례의 종양 절제 도중 수집된 각각의 샘플들을 칼슘과 마그네슘이 포함 된 HBSS(HankS Balanced Salt Solution)에 넣은 다음 외과용 칼로 잘게 잘랐다. 조직을 1,100 rpm에서 4 분간 원심 분리하고, PIPES 완충액으로 헹구고 37 ℃에서 트립신-EDTA가 포함 된 인산 완충 식염수 (PBS)로 재현탁하였다. 그 다음 조직을 37 ℃에서 90 분 동안 진탕기(rocking shaker)에서 DNase I (20 U/mL)로 분해하고, 10 % 소태아혈청 (FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's media)에 재현탁하고 1,100 rpm에서 4 분 동안 원심 분리하였다. 그 후, 재현탁된 세포를 40-μm 셀 스트레이너로 여과하고 배양 플라스크에서 플레이팅 하였다. 원발성 종양 및 재발된 종양의 세포를 각각 GBL-28 및 GBL-37로 명명 하였다. 이후 실시예에서 유리체내 주사 후 형성된 종양에서 얻은 교모세포종 세포도 동일한 프로토콜에 따라 분리 하였다.
한편, 상기 분리된 세포들 및 이후의 실시예에서 사용한 세포들은 다음과 같이 유지되었다. 즉, 95 % 공기 및 5 % CO2의 가습된 공기에서 37 ℃ 10 % FBS를 함유한 DMEM에서 U-87 MG 세포(카탈로그 번호 HTB-14, ATCC), 상기 GBL-28 및 GBL-37세포를 유지 하였다.
1-2: 실험동물의 준비
6 주령의 수컷 Balb/c 누드 마우스를 Central Laboratory Animals에서 구입하여 12 시간 암흑주기하에 유지시켰다. 모든 동물 실험은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용을 위한 안과 및 안과 연구 협회 (Association of Vision and Ophthalmology)의 성명서에 따라 수행되었으며 서울 대학교 및 서울 대학교 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았다.
1-3: (대조예) 종래의 방법(교모세포종 세포의 동소성 이식)에 따른 교모세포종 동물모델의 제조 및 환자 유래 교모세포종 세포의 동소성 이식의 비확실성
깊은 마취 후, 실시예 1-2의 마우스는 정위 프레임(David Kopf Instruments)에 배치되었다. 소규모 두개골절제술을 정중선에서 2-3 mm, 관상 봉합에서 1 mm 앞쪽으로 시행 하였다. 실시예 1-1의 교모세포종 세포들 (U-87 MG, GBL-28, GBL-37, 3 x 105 세포 5 μL)를 뇌 실질 내로 3 mm 깊이 정위적으로 주입 하였다. 종양 세포 주입 후 4~6 주에, 마우스 뇌의 얇은 박편(10 μm)을 H & E(hematoxylin and eosin) 염색과 GFAP의 면역 형광 염색을 위해 처리하였다. 즉, 마우스 뇌의 얇은 박편을 PBS로 세척하고, 0.05 % (v / v) 사포닌 및 5 % (v / v) 정상 염소 혈청을 함유하는 PBS가 3 분간 스며들게 한 후, 비특이적 결합을 차단하기 위하여 1시간 동안 1.5 % 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS로 처리하였다. 그 다음, 상기 슬라이스를 4 ℃에서 하룻밤 동안 항-GFAP 항체(1 : 100, 카탈로그 번호 M0761 또는 Z0334, Dako), 항-인간 미토콘드리아 항체(1 : 100, 카탈로그 번호 MAB1273, Millipore 또는 cat.no.PA5-29550, Life Technologies), 항-비멘틴 항체 (1 : 100, 카탈로그 번호 ab11256, abcam), 항-네스틴 항체(1 : 100, 카탈로그 번호 MAB5326, Millipore) 및 항- 희돌기교세포 전사 인자 2(OLIG2; 1:100; cat. no. sc-293163, Santa Cruz)로 표지하고, 대응되는 Alexa Fluor 488 또는 594 IgG (1 : 500, cat.no.A11008, A11029, A11032, A11037, A11055 및 A21207, Life Technologies)로 1시간 동안 처리 하였다. 핵 염색은 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, Sigma)를 사용하여 수행되었다. 이어서, 슬라이드를 형광 현미경 (Leica) 하에서 관찰 하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, U-87 MG 군과 달리 교모세포종 환자에서 분리한 원발성 및 재발성 종양 유래 세포를 이식한 군에서는 6주가 경과하였음에도 두개내 종양을 형성하지 못했다. 이전에도 동소성 이식시술은 본 발명자들을 포함한 여러 연구자들에 의해 반복적으로 수행되었지만, 몇몇 환자 유래 세포는 느리게 두개내 종양을 형성하거나 전혀 종양을 발생시키지 못했다. 도 2는 환자 유래 교모세포종 세포의 동소성 이식시의 낮은 신뢰성을 나타내는 것으로, 2A는 U-87 MG, GBL-28, GBL-37의 두개내 주사 후 마우스(n = 12)의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 본 발명의 대조예에서 Balb / c 누드 마우스의 줄무늬체(striatum) 내로 U-87 MG, GBL-28 및 GBL-37을 3 x 105 세포 주입 하였을 때, U-87 MG 군과 환자 유래 교모세포종 세포들 군들간 생존율 패턴은 상당히 달랐다 (P 값 <0.0001;도 2A). 이때, GraphPad Prism (GraphPad Software)을 사용하여 통계 분석을 수행하였고, GBL-28, GBL-37 및 U-87 MG의 동소성 이식 수술을 시행 한 그룹 간 통계적으로 유의한 차이를 알아 내기 위해 로그 순위 테스트를 수행하였다. <0.05의 P 값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
도 2B는 각 세포주의 두개내 주사 후 4~6주 마우스(U-87 MG(4주), GBL-28(6주), GBL-37(6주))의 두뇌의 H & E 절편의 대표 사진을 나타내며(노란색 점선은 두개 내 종양을 나타냄, 스케일 바 2mm), 2C는 각 세포주의 두개내 주사 후 4~6주(U-87 MG(4주), GBL-28(6주), GBL-37(6주))에 DAPI와 GFAP에 대한 항체를 사용하여 염색한 뇌 절편의 대표 사진을 나타낸다(노란색 점선은 두개 내 종양을 나타냄, 스케일 바 2mm). 조직 검사 및 면역 조직 화학 검사에서 U-87 MG 세포는 두개 내 종양이 잘 형성되어 있었고 (도 2B와 2C, 왼쪽), GBL-28과 GBL-37 세포는 두개 내 주입 후 6 주 후에도 종양이 형성되지 않았다. (2B 및 2C, 중간 및 우측).
1-4: (실험예) 교모세포종 세포의 유리체내 주입 및 신규한 교모세포종 동물모델의 제조
실시예 1-1에서 수득한 GBL-28 및 GBL-37 세포들을 각각 1 x 105 세포들을 실시예 1-2의 6 주령 수컷 Balb/c 누드 마우스의 유리체강 내로 주입하였다. 추가로, 실시예 1-1에서 수득한 GBL-28 및 GBL-37 세포 각각 1 x 105 세포들을 4시간 동안 저산소 상태 (1 % O2)로 처리한 후 실시예 1-2의 6 주령 수컷 Balb/c 누드 마우스의 유리체강 내로 주입하였다. 주사 후 2 주부터 안구를 매일 검사하여 종양 형성을 관찰하였다.
유리체내 주입법은 망막모세포종의 동소성 모델을 확립하고 망막 신경 조직에 치료제를 전달하는 방법이다. 유리체내 투여된 세포들은 일차적으로 수정체와 망막 사이의 유리체 강내에 안구 종양을 형성한다(도 3A). 그런 다음, 종양은 (각막과 수정체 사이) 전방(anterior chamber)으로 확장되어 안구 전체를 점유할 수 있다. Balb / c 누드 마우스의 유리체 강내와 망막이 육안으로 관찰되거나 간접 검안경을 통해 관찰 될 수 있기 때문에 종양 형성 정도는 단순한 시각적 등급 시스템으로 등급을 매길 수 있다. 시각적 등급 시스템은 종양 형성 정도를 0 부터 5까지의 등급을 사용하였다: 등급 0 (종양 형성 없음), 등급 1 (줄무늬 종양), 등급 2 (플라크 유사 종양), 등급 3 (명확한 종괴 형성), 등급4 (유리체를 가득 채운 종양), 등급 5 (구체 확대 또는 안구 파열이 동반 됨).
그 결과, 실시예 1-3에서 볼 수 있듯이 기존의 방식(동소성 이식)에 따른 환자 유래 교모세포종 세포의 이식은 종양세포 주입 후 6주까지도 두개내 종양을 형성하는데 실패한 것과 달리, 본 발명에 따른 유리체내 주사에 따른 방법의 경우 환자 유래 교모세포종 세포들은 효과적으로 유리체내 주사 후 2주부터는 플라크 유사 종양으로서, 4주까지는 종괴로 두개 내 종양을 형성하였다.
흥미롭게도, 정상 상태(도 3B) 및 4시간 동안 저산소 상태(1 % O2)로 처리(도 3C)한 세포들의 주입 후 종양 형성에 다른 패턴이 있었다. 정상 상태에서 배양 한 후에 주사한 세포는 다양한 등급의 종양을 형성했다(도 3B). 대조적으로, 저산소 처리는 안정적이고 일관된 덩어리 형성을 가져왔다(도 3C). 도 3에서, 3B는 정상적인 배양 조건을 거친 GBL-28 및 GBL-37의 유리체 내 주사 후 2 내지 5 등급 종양을 갖는 마우스의 상대적 비율이며, 3C는 주입 전 4 시간 동안 저산소증 처리한 GBL-28 및 GBL-37의 유리체내 주사 후 3 및 4 등급 종양을 가진 마우스의 상대적 비율을 나타낸다.
아울러, 저산소 처리(도 3D)한 경우 교모세포종 세포의 침윤성 특징을 설명하는 GBL-28과 GBL-37 세포 모두 유리체 강에서 망막 바깥으로 확장되는 종양을 형성한다는 것도 주목할 사항이다. 3D는 주입 전에 4 시간 동안 저산소증 처리한 GBL-28과 GBL-37의 유리체 강내 주입 후 4 주안의 H & E 절편의 대표 사진이다(노란색 점선은 수정체와 망막을 나타낸다. 스케일 바, 1 mm). 이때, 실험을 위하여 마우스 안구의 얇은 박편(10 μm)은 상기 실시예 1-3과 같이 준비 및 테스트하였다.
신규한 교모세포종 PDX 종양의 면역조직화학적 특성 분석
본 발명에 따른 신규한 교모세포종 PDX에 있어, 유리체 강내의 PDX 종양에 대한 면역 조직 화학적 특성을 조사하여 원래의 종양과의 유사성을 확인하고, 이들 세포가 마우스 유래가 아닌 주입된 종양 세포에 의한 것인지 확인하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.
먼저, 본 발명에 따른 교모세포종 PDX 종양조직을 살펴보기 전, 원래 종양, 즉 GBL-28과 GBL-37의 원래 종양의 특성을 살펴보았다. 교모세포종 환자의 조직 검사상 원발성 및 재발성 종양 모두 WHO grade IV 교모세포종 (표 1)였다. 또한 두 종양 모두 면역 조직 화학 분석에서 GFAP, 비멘틴(vimentin) 및 네스틴(nestin)에 양성이었다 (표 1). 두 세포 모두 신경교세포(glial cell)의 형태학적 특징을 보였다 (도 1C).
| 특성 | 원발성 종양 | 재발성 종양 |
| WHO 등급 | IV/IV | IV/IV |
| Increased cellularity | 유 | 유 |
| Nuclear polymorphism | 유 | 유 |
| Mitosis (pHH3) | 25/10 HPF | 27/10 HPF |
| Vascular endothelial hyperplasia | 유 | 무 |
| Necrosis | 유 | 유 |
| 면역조직화학성 | ||
| GFAP | 양성 | 양성 |
| Vimentin | 양성 | 양성 |
| Nestin | 양성 | 양성 |
HPF, high-power field; pHH3, phosphohistone H3
한편, 실시예 1-4의 마우스 안구의 얇은 박편을 PBS로 세척하고, 0.05 % (v /v) 사포닌 및 5 % (v/v) 정상 염소 혈청을 함유하는 PBS가 3 분간 스며들게 한 후, 비특이적 결합을 차단하기 위하여 1시간 동안 1.5 % 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS로 처리하였다. 그 다음, 상기 슬라이스를 4 ℃에서 하룻밤 동안 항-GFAP 항체 (1:100, 카탈로그 번호 M0761 또는 Z0334, Dako), 항-인간 미토콘드리아 항체 (1:100, 카탈로그 번호 MAB1273, Millipore 또는 cat.no.PA5-29550, Life Technologies), 항-비멘틴 항체 (1:100, cat.no. ab11256, abcam), 항-네스틴 항체 (1:100, 카탈로그 번호 MAB5326, Millipore) 및 항-희돌기교세포 전사 인자 2(OLIG2; 1:100; cat. no. sc-293163, Santa Cruz)로 표지하고, 대응되는 Alexa Fluor 488 또는 594 IgG (1 : 500, cat.no.A11008, A11029, A11032, A11037, A11055 및 A21207, Life Technologies)로 1시간 동안 처리 하였다. 핵 염색은 DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Sigma)를 사용하여 수행되었다. 이어서, 슬라이드를 형광 현미경 (Leica) 하에서 관찰 하였다.
그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이, 실시예 1-4의 교모세포종 동물모델의 유리체 강내 및 망막 외부의 종양은 GFAP, 비멘틴, 네스틴 및 인간 마이토콘드리아에 양성이었다. 아울러, 모든 마커는 그들의 세포 내 위치를 나타내는 세포질 패턴을 보여 주었다 (도 4B). 표 1에 나타난 바와 같이, GBL-28과 GBL-37의 원래 종양은 GFAP, 비멘틴 및 네스틴에 양성인바 본 발명에 따른 교모세포종 PDX의 종양은 본래 종양의 특징을 유지함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1-4의 교모세포종 동물모델의 유리체 강내 및 망막 외부의 종양은 신경교세포(glial cell) 계통의 특정 마커 중 하나 인 OLIG2에 양성 반응을 보였다.
이는 본 발명에 따른 교모세포종 이종이식모델의 종양의 면역조직화학적 특성이 본래의 환자의 종양의 특징을 그대로 유지하고 있다는 것을 보여주는 것으로, 본 발명에 따른 교모세포종 이종이식모델이 환자의 치료옵션 선택을 위하여 사용될 수 있음을 제시한다.
신규한 교모세포종 PDX 종양의 종양 세포 분리 및 특성 규명
본 발명에 따른 신규한 교모세포종 PDX에서 종양세포를 분리하고 원래 종양 세포(GBL-28 및 GBL-37)과의 유사성을 확인하고, 아울러 실시예 1-4의 마우스 모델 중 정상 배양조건을 갖는 GBL-28 및 GBL-37를 주입한 PDX 의 종양에서 분리한 세포와 주입 전 4시간 동안 저산소 처리한 후 주입한 PDX 의 종양에서 분리한 세포간 특성을 비교하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.
실시예 1-1과 같은 방법으로 실시예 1-4의 마우스모델의 종양에서 세포들을 분리배양하여 4-웰 챔버 슬라이드 (Nunc)에 접종하고 밤새 안정화시켰다. 세포를 4 ℃에서 1 % 파라포름알데히드로 10 분간 고정시키고 0.1 % Triton X-100 용액 (카탈로그 번호 T8787, Sigma)으로 3 분간 실온에서 침투시켰다. 비특이적 결합을 최소화하기 위해 1 % 소 혈청 알부민으로 처리 한 후 4 ℃에서 밤새 항 GFAP 항체, 항-인간 미토콘드리아 항체, 항-비멘틴 항체, 항-네스틴 항체로 세포를 표지하고, 대응하는 Alexa Fluor 488 또는 594 IgG (1 : 500, 카탈로그 번호 A11008, A11029, A11032, A11037, A11055 및 A21207, Life Technologies)를 1 시간 동안 처리 하였다. 핵 염색은 DAPI를 사용하여 수행되었다. 이어서, 슬라이드를 형광 현미경 (Leica) 하에서 관찰 하였다.
그 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 교모세포종 모델의 종양에서 분리된 세포들은 모두 그들의 모세포, 즉 원래 종양에서 분리된 교모세포종 세포의 형태학적 특성을 유지 하였다. 아울러, 도 6B에 나타난 바와 같이, GFAP 마커에 대해서도 원래 종양에서 분리된 세포와 동일하게 양성으로 나타났다. 또한, 본 발명에 따른 교모세포종 모델의 종양에서 분리된 세포들은 모두 비멘틴(도 7) 및 네스틴(도 8) 마커 역시 원래 종양에서 분리된 세포와 동일하게 양성으로 나타났다. 도 6 내지 8에서, GBL-28 및 GBL-37은 각각 교모세포종 환자의 원발성 및 재발성 종양으로부터 분리한 세포들이고, GBL-28N 및 GBL-37N은 실시예 1-4에서 교모세포종 모델 제작 시 정상 배양 조건을 갖는 GBL-28 및 GBL-37 세포를 유리체내 주입한 후 4 주째에 마우스로부터 분리한 세포들이며, GBL-28H 및 GBL-37H는 실시예 1-4에서 교모세포종 모델 제작 시 마우스내 주입 전 GBL-28 및 GBL-37 세포를 4시간 동안 저산소 처리한 다음 유리체내 주입한 후 4 주째에 마우스로부터 분리한 세포들이다.
이는 본 발명에 따른 교모세포종 이종이식모델이 종양 세포 분리 실험을 통해서도 원래 종양의 특징을 유지한다는 것을 보여주는 것으로, 본 발명에 따른 교모세포종 이종이식모델이 환자의 치료옵션 선택을 위하여 사용될 수 있음을 제시한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
부호 없음
Claims (15)
- 교모세포종 환자로부터 분리된 교모세포종 세포들을 인간을 제외한 동물의 유리체내로 주입하는 단계를 포함하는, 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 교모세포종 세포들은 저산소 처리된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 저산소 처리는 상기 교모세포종 세포들을 산소 농도 1% 이하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 교모세포종 세포들은 5~10×104의 세포들을 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 교모세포종 세포들은 원발성 또는 재발성 교모세포종 환자에서 분리된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델.
- 제6항에 있어서, 상기 동물모델의 안구내 종양은 GEAP, 비멘틴 및 네스틴 마커에 대한 양성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델.
- 제7항에 있어서, 상기 동물모델은 추가로 OLIG2 마커에 대한 양성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델.
- 다음의 단계를 포함하는 환자 맞춤형 교모세포종 치료 선별을 위한 정보를 제공하는 방법:
(a) 제6항의 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델에 교모세포종에 대한 후보 치료방법을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 후보 치료방법이 수행된 동물모델의 치료 효과를 확인하는 단계. - 제9항에 있어서, 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 교모세포종의 유전학적 특성, 면역화학적 특성 및 종양 또는 면역단백질 발현 특성 중 어느 하나 이상을 추가로 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 후보 치료방법은 화학적 요법, 방사선 요법, 외과적 요법, 면역세포치료법 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 치료 효과 확인은 상기 동물모델의 안구를 육안으로 직접 관찰하거나 간접적 검안경을 통하여 관찰하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음 단계를 포함하는 교모세포종 치료제의 스크리닝 방법.
(a) 제6항의 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델 또는 이로부터 유래된 교모세포종 세포에 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보 물질 처리 후, 상기 동물모델 또는 상기 교모세포종 세포를 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 동물모델의 종양 조직의 크기가 감소하거나 전이가 억제되는 경우이거나 상기 교모세포종 세포의 증식이 억제제거나 사멸하는 경우 후보물질을 교모세포종 치료제로 결정하는 단계. - 제13항에 있어서, 상기 교모세포종 환자 유래 이종 이식 동물모델의 교모세포종의 유전학적 특성, 면역화학적 특성 및 종양 또는 면역단백질 발현 특성 중 어느 하나 이상을 추가로 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 동물모델의 안구를 육안으로 직접 관찰하거나 간접적 검안경을 통하여 관찰하여 종양 조직의 크기 감소를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
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