JPH04504122A - 巨大分子タンパク質の制御放出考案物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 子タンパク　の制御放出考案物 本発明は制御放出考案物、特に巨大分子タンパク質の長時間放出用の制御放出考 案物に関する。

又更ｑ皇員 巨大分子タンパク質の動物への放出は、タンパク質の生物活性を動物への投与前 、投与中、投与後にわたって維持する放出考案物の必要性によって複雑化されけ で、巨大タンパク質は沈殿物や集塊を作り、これが生物活性を破壊してタンパク 質の有用性を損なう原因となる。また、タンパク質の湿潤に由来する加水分解反 応がタンパク質の生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）有効性を減じる生物学的に不活性な 産物を生みだすこともある。

この問題を克服するための従来技術法には、巨大分子タンパク質を水の進入を制 限するポリマーコート錠に包み込むことと、巨大分子タンパク質をペレット組成 物に圧縮してベレット表面積を制限することによってタンパク質に接触する水の 量を制限し、タンパク質の放出を制御することと、巨大分子タンパク質を水の進 入やタンパク質の進出を制限する多孔性の考案物に入れること等が含まれている 。これらの方法を記載した特許その他の参考文献は豊富にあり当該技術分野で周 知である。

本発明に特に関係のある従来技術は合衆国特許第４゜１７７．２５６号に含まれ 、これは浸透性溶質を含む分離した貯蔵所（デボ−）が、ポリマー体内に分散し 、そのポリマーが貯蔵所を完全に包囲している薬剤放出考案物を開示している。

ポリマー体は、環境にさらされる規定表面積を調節するように形成される。

水の表面積でポリマー内に入り、貯蔵所を飽和させ、貯蔵所内で浸透圧を生み出 し、これにより貯蔵所がはちきれて内容物を環境へ放出する。最初は′表面近く の貯蔵所だけが影響をうける；時と共に水はポリマー体に浸透しポリマー体深部 におおわれた貯蔵所を破裂させる。長時間放出はポリマー体の大きさと形状によ り達成される；表面積と環境からの水が貯蔵所に到達するにかかる時間を調節す ることによって達成される。

貯蔵所の大きさと組成が均一で水にさらされた後比較的短時間で破裂する。

合衆国特許第３．２４７．０６６号では、透水性ポリマー被覆剤で包囲した薬剤 の核から成る水溶性小球（ビードレット）を開示している。小球を水性環境内に 入れると、水が小球に進入し核が膨張する。膨張した核は被覆剤を「破裂させ」 核中の薬剤を放出する。

小球は胃腸管内で用いられるよう設計され、放出時間は８−１２時間で、低分子 量の有機物、抗生物質等、特にアスピリン、バルビッール酸塩、あるいは同様の 低分子量有機分子、の放出用に設計されている。加えて、本開示発明の好ましい 具体例は、表面積、被覆剤の厚さ、被覆の型等の異なる多数の小球から成り、こ れをソフトシェルカプセル等の製薬担体に入れて投与する。しかし、本発明は非 胃腸管経路で長時間巨大分子タンパク質を放出するための設計ではない。

ウェブら（Ｐｒｏｃｅｅｄ、　Ｉｎｔｅｒｎ、５ｙｖｐ、Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｒｅ １．Ｂｉｏａｃｔ、Ｍａｔｅｒ、、Ｖｏｌ、１５．ｐａｇｅ　４５０（１９８Ｂ ）　）は薬の生体内放出用の時間制御破裂システム（ＴＢＳ）を開示している。

ウェブは被覆剤の厚さの異なる球の組み合わせによって薬剤放出のいかなるパタ ーンを得ることができると述べている。しかし、ウェブのＴＥＳシステムは巨大 分子タンパク質放出の特殊要件に合致するよう設計されてはいない。また、ウェ ブの考案物は「タマネギ様」構造を有する；シｇ糖小球を薬剤が包囲し、薬剤小 球を膨張剤が包囲し、薬剤小球−膨張剤とポリマーが包囲する。

巨大分子タンパク質用の従来の制御放出考案物には問題があるので、放出の様式 と時間を制御し、一方で考案物を動物に投与した時巨大分子タンパク質の安定化 と生物活性を維持する新しい制御放出考案物が引き続き必要とされている。

ｌユｑ量！ 従って、本発明の一目的は巨大分子タンパク質の制御放出考案物を提供すること である。

本発明のもうひとつの目的は、巨大分子タンパク質の安定性と生物活性を維持し ながら放出の様式と時間を制御する巨大分子タンパク質の制御放出考案物を提供 することである。

上記およびその他の目的は多数の不均一な小球を含む内部区画を完全に包囲する 水溶性外側カプセルから成る制御放出考案物を用いて達成される０本小球は、巨 大分子タンパク質を賦形剤、安定化剤、結合剤、界面活性剤、保存剤あるいはこ れらの混合物等の任意の「核剤」を含む核基質を完全に包囲する破裂性ワックス シェルから成る。

動物に投与すると１、水溶性外側カプセルは比較的短時間、１−６時間が典型的 であるが、で溶解し、同時にほとんど全ての小球が水性環境にさらされる。各小 球は環境から液体を吸収し長時間に渡って別個に破裂する。破裂に要する時間は ワックスシェルと核基質の特性に依存する。小球が破裂すると、基質中に含まれ る巨大分子タンパク質が動物体内に放出される。

本発明のその他の目的、利点、新奇の特徴は下記の発明の詳細な説明で明らかに する。

皿１１更 図１は本発明による制御放出考案物の一実施例を示す。

図２は本発明による小球の一実施例を示す。

又里皇旧！星販更 本発明は巨大分子タンパク質を動物へ長時間に渡って放出する制御放出考案物で あり、これは長時間に渡って定期的に破裂するよう設計された多数の不均一小球 を含む内部区画を完全に包囲する水溶性外側カプセルから成る。小球は巨大分子 タンパク質と賦形剤、安定化剤、結合剤、界面活性剤、保存剤、あるいはこれら の混合物等の任意の「核剤」を含む核基質を完全に包囲する破裂性ワックスシェ ルから成る。

動物に植えつけると、外側カプセルは約１−６時間で溶解して小球が直接体液に さらされる。各小球はシェルと基質核パラメーターにより長時間に渡って別個に 破裂する；シェルの破裂により小球に含まれる巨大分子タンパク質が体内に放出 される。

本発明の図解例として図１と２を参照すると、図１に示す制御放出考案物は多数 の不均一小球１２を含む内部区画１４を完全に包囲する水溶性外側カプセル１０ から成る０図２を参照すると、小球（図１で１２と示す）は巨大分子タンパク質 と任意の核剤を含む核基質２２を完全に包囲する破裂性ワックスシェル２０から 成る。

本発明の小球は（１）巨大分子タンパク質と任意の核剤を含む本質的に均一な核 基質と、（２）巨大分子タンパク質に対して非破壊的な本質的に均一なワックス シェルを与えるいずれの方法でも形成することができる；このような方法の幾つ かは技術上既知である。

しかし、巨大分子タンパク質を含む小球の形成には従来技術で扱われなかった特 殊な問題が提起される。

巨大分子タンパク質は高いあるいは低いＰＨまたは高温等の苛酷な環境条件にさ らされるとその生物活性を失う。加えて、タンパク質を有機溶媒にさらすと配座 が変わりタンパク質の生物活性が破壊されることがある。従来技術、特に合衆国 特許第３．２４７．０６６号に開示された多くの方法は今回の小球の製造には有 用ではない。特に、有機溶媒と高温を用いる方法は本タンパク質の生物活性を破 壊することがある。

本発明の小球はマイクロカプセル、錠剤あるいはベレットが好ましい。本考案物 に有用なベレットと錠剤は、たとえば、乾燥粉末を圧縮して約１−５閣の大きさ の小ペレットを作ることにより形成できる。あるいはタンパク質と核剤を水や緩 衝溶液等の適当な液体で湿らせた後、型に入れて、あるいは押し出して成形し、 小ペレットを製造する。本技法はここに記載したように後続のワックス被覆に適 する球状のベレットを作るよう変更できる。

マイクロカプセルは噴霧乾燥、噴霧凍結、噴霧冷却その他の周知の方法で製造で きる。たとえば、巨大分子タンパク質と他の任意の核剤を溶融ワックスあるいは その混合物を混合した後、得られた混合物の乳状化や霧状化等の種々の技法によ り、あるいは成分と溶融ワックスあるいはその混合物の混合物を機械的に処理し 冷却することにより、結果として得られた混合物のマイクロカプセルを形成する 。あるいは、巨大分子タンパク質と核剤とワックスあるいはその混合物の混合物 を冷却して固体とし、その後粉砕等の方法で処理してもよい。これらの方法を用 いて製造したマイクロカプセルは直径約１−１，５００ミクロンである。しかし 、好ましい平均直径は約５０−１０００ミクロンである。

これらの技法の広範な概説はＲｅ＋ｗｉｎｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ ｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、第１６版（１９８０）　、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈ ｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　１８０４２の第８９章、１ ５５３−１５８４頁に記載されている。

本発明の考案物を製造するには、破裂時間に影響するパラメーターに関して不均 一な小球を作らなければならない。本考案物を製造するには数バッチの小球を製 造しこの不均一な小球を調合し混合する必要がある。

小球の破裂に影響するパラメーターには以下のものが含まれるが、これに限られ るものではない；（１）ワックスシェルの透水性、（２）シェルの厚さ、（３） シェルの多孔性、（４）シェルを構成するワックスの型と化学構造、（５）シェ ルの強度あるいは靭性、（６）核基質によって発現する浸透圧、（７）核基質内 の巨大分子タンパク質の装填量。

概して、核基質への包含に適し本発明の制御放出考案物で放出可能な巨大分子タ ンパク質には分子量約２０００から２００．０００ダルトンのタンパク質が含ま れるが、これに限られるものではない。巨大分子タンパク質には天然、組み換え 、合成、および配列が削除、挿入、置換その他で変更されたｍｕｔｅｉｎタンパ ク質と生物活性のあるこれらの断片や誘導体が含まれるが、これに限られるもの ではない。さらに明確にいえば、酵素、酵素阻害荊、抗体、抗原、インターフェ ロン、インスリン、プロラクチン、ソマトメジン、ソマトスタチン、インターロ イキン、ソマドクリニン（ＧＲＦ）およびソマトトロピン等の生物活性タンパク 質が本発明によって放出できる。

とりわけ、ヒトブタ、ウシ、ウマ、ヒツジおよびトリソマトトロピンが本発明の 制御放出考案物を用いて放出できる。ここで、ソマトトロピンは天然、組み換え 、合成および配列が削除、挿入、置換その他で変更されたｍｕｔｅｉｎソマトト ロピンと生物活性のあるこれらの断片および誘導体を含むソマトトロピン活性の ある全タンパク質を含むと定義される。加えて、生物活性のあるタンパク質、ペ プチド、ポリペプチドに結合する金属あるいは金属化合物も酸塩、誘導体、錯体 および抗水和剤と同様に本発明の制御放出考案物への組み込みに適する。

本発明に有用なソマトトロピンはいかなる適当な供給源からも得ることができる 。

天然および組み換えソマトトロピンの製造、単離、精製法は技術上周知である。

本発明に有用な種々のソマトトロピンラスのアミノ酸配列は周知である：　Ｃ， Ｈ，Ｌｔ　ｉｎ　ｋｉｒｋ　−Ｏｔｈｍｅｒｒｌｌ！ｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　 ｏｆ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ３／　Ｊ　＋第３版、１２巻、 ５４９−５５２頁（ヒトソマトトロピン）、ＲｏＰ、Ｗｏｙｃｈｉｋ、　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　ｃｉｄ　Ｒｅｓ、＋　１０　７１９７　（１９８２）　（ウシソマト トロピン）、Ｃ，Ｈ，Ｌｉ　Ｓ＋　Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、、１５６　、　４９３−５０８　（１９７ ３）（ヒツジソマトトロピン）　、ｐ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇ　ら、。

ＯＮＡ、２，３７．４５　（１９８３）（ブタソマトトロピン）、以上すべての 文献をここに援用する。

巨大分子タンパク質は重量で小球の約１−７０％、好ましくは約５−５０％を構 成する。

核基質への包含が適している賦形剤、安定化剤、結合剤、保存剤、界面活性剤等 の核剤にはアルギニン、塩酸アルギニン、グリシン、エチレンジアミン四酢酸（ ＥＤＴＡ）　、塩類、リジン、ステアリン酸マグネシウム、シ＝ｒｌ１等が含ま れる。好ましい保存剤には、サリチルアニリド、ソルビン酸、ホウ酸、安息香酸 およびこれらの塩が含まれる。核剤は重量で小球の約３０−９９％、好ましくは 約５０−９０％を構成する。

小球の破裂性ワックスシェルの製造に有用なワックスにはミツろう、ラノリン、 セラックろう、シナろう等の動物性ワックス、硬化大豆油、綿実油、カルナウバ 、カンデリーラ、ベイベリー、サトウキビ等の植物性ワックス、化石あるいは地 ろう（オシケライト、セレシン、モンタン）等の鉱物性ワックスおよび石油ワッ クス（パラフィン、ミクロクリスタリン、スラックあるいはスケールワックス） あるいはこれらの複合物が含まれる。

本発明における使用が好ましいワックス原料はミツろう、植物性ワックス、カル ナウバろう、あるいはこれらの複合物である。

破裂性ワックスシェルは、完成したシェルが望ましい透水性を有するように薄層 修正剤を用いて形成される。使用できる多くの物質の中には、ボロエチレングリ コール、ポリプロピレングリコール、グリセロールエステル、特にｒＭａｚｏｌ 」　（Ｍａｚｏｌは一部アルコキキシル化されたモノおよびジグリセライドであ る）等のグリセロールのエトキシル化エステル、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ワックス 、油等の修正剤が含まれる。

破裂性ワックスシェルは重量で小球の約５−４０％、好ましくは約１０−３０％ を構成する。

水溶性カプセルは比較的短時間、１−６時間が好ましいが、で溶解し、生物学的 適応性があり、巨大分子タンパク質を含む小球ワックスシェルと親和性のある材 料から形成できる。カプセル原料はポリビニルピロリジン、ヒドロキシブロビル メチルヒド吐ジプロピルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース および水ガラスから選択することが好ましい。カプセル原料はヒドロキシプロピ ルセルロースかゼラチンが最も好ましい。

水溶性カプセルは重量で考案物の約１−３０％、好ましくは約５−２０％を構成 する。

本発明の制御放出考案物は、技術上周知の方法を用いて巨大分子タンパク質と任 意の添加剤を含む多数の不均一小球を水溶性カプセルに入れることにより製造さ れる。たとえば、本考案物は標準ゼラチンカプセルを用いて三段階しか必要とし ない操作で製造できる：（１）カプセルの上半分（ふた）の分離；（２）カプセ ルの下半分（本体）の充填、および（３）ふたと本体の再結合、　この操作過程 は技術上既知で製薬産業で広範に用いられている半自動あるいは全自動カプセル 充填機で行うことができる。このような機械は粉末、錠剤、マイクロカプセルあ るいはベレットをカプセル内に充填できる０本目的に適した装置の記載はＲｅｍ ｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｅｔｅｎｃｅｓ、第１６ 巻（１９８０）　、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｗ＋ｐａｎｙ、Ｅａ ｓｔｏｎ、　ＰＡ　１８０４２の第８９章、１５７７頁以降にあ本発明による考 案物を動物に投与すると、水溶性外側カプセルは比較的短時間、典型的には１− ６時間、で溶解し、同時にほとんどすべての小球が水性環境にさらされる。

各小球は長時間に渡って別個に破裂する；各小球が破裂に要する時間はシェルと 核基質のパラメーターと特性に依存する。一般に、各小球の破裂時間は、ワック スシェルの型、厚さ、および多孔性の変化と核基質内の化合物の選択により、シ ェルへの水の浸透性と浸透速度を調節することで制御される。明らかに、小球へ の水の進入が速いほどシェル破裂は早い。従って、シェルが薄く基質の浸透圧が 高い、あるいは比較的透水性が高い小球は水性環境にさらされた後比較的短時間 で破裂しタンパク質を放出する。浸透圧の低いあるいは厚（て透水性の低いシェ ルを有する他の小球は長時間無傷で残り個々のシェルと基質の特性に依って種々 の時間に破裂する。本方法は考案物の寿命期間中巨大分子タンパク質の放出を提 供する：幾分一連の注射に類似している。小球の特性を変化させることにより、 巨大分子タンパク質を動物に望ましい間隔（時間あるいは日）で放出できる。こ の後者の方法は動物への多数回投与の必要性を排除する；１個の植えつけ考案物 が数回の注射のかわりとなりうる。

巨大分子タンパク質の必要用量が動物へ放出されることを保証するため、破裂時 間パラメーターの異なる十分な数の小球を考案物内に組みこまなければならない 。

ソマトトロピン投与用には、破裂時間が約１−１４日間に渡って一律に変化する シェルパラメーターを有する小球が製造される。

小球の大きさは約５０−１０００ミクロンで、約１−７０％のソマトトロピンを 約６５％までの核剤を含む。同様に、ペレットの大きさは約１−５ｍｍで約１− ７０％のソマトトロピンと約６５％までの核剤を含む。

約０．１−２０ｍｇ／動物／日、約１−１０ｍｇ／動物／日が好ましいが、を約 １−１４日間に渡って放出するよう設計された小球の混合物を本発明の外側カプ セルに組みこむ。結果として得られた考案物を動物に植えつけ成長を促進し食餌 利用効率を上げる。

核基質にソマトトロピン、アルギニン、およびショ糖の混合物（重量比１／３／ １）から成り、ワックスシェルはミツろう、カルナウバろう、およびＭａｚｏｌ の８Ｑ／２０／２　（重量比）混合物から成り；外側カプセルはヒドロキシプロ ピルセルロースあるいはゼラチンから成ることが好ましい。

今回の発明によると、巨大分子タンパク質の動物への放出は、動物へ本発明の制 御放出考案物を投与することを含む。外側カプセルは約１−６時間で溶解し、そ れによって小球は直接体液にさらされる。各小球は、厚さ、型等のワックスシェ ルのパラメーターに依って長時間に渡り別個に破裂する。理想的には、薄いシェ ルあるいは比較的透水性の高いシェルが早期に破裂を起こし、タンパク質を即座 に放出する。厚い、あるいは透水性の低いシェルを有する他の小球は長時間無傷 のまま残り個々のシェルの特性に依って種々の時間に破裂する。本方法はインブ ラントの寿命期間に渡ってタンパク質の放出を提供する；幾分一連の注射に類似 している。

今回の発明のもう一つの面では、長時間に渡る動物の成長促進と食餌利用効率上 昇の方法はソマトトロピンを巨大分子タンパク質として含む本発明の考案物を動 物へ投与することから成る。ソマトトロピンは、動物に投与した際、成長促進に 有効となる量で制御放出考案物の小球中に含まれていなければならない。成長の 促進に必要なソマトトロピンの量は、個々のソマトトロピン、動物の型、および 望まれる結果に依って変動するが、ソマトトロピンは一般に放出考案物中の小球 の約１−７０重量％、約５−５０％が好ましいが、の量で存在する。ソマトトロ ピンは成長を促進し食餌利用効率を上げるために典型的には約０．１−２０ｏ＋ ｇ／動物／日、約１−１０ｍｇ／動物／日が好ましいが、の用量で動物に投与す る。

本発明を概説してきたが、下記の実施例を本発明の特定の具体例として示し、そ の実践と利点を明らかにする。実施例は例として与えるもので明細書やクレーム がこれに従うよう制限する意図はない。

叉皇炎上 組み換えブタソマトトロピンの亜鉛錯体（Ｚｎ−ｒｐｓＴ）、アルギニン、およ びシｙｌ！（重量比１／３／１）をＶｏｒｔｅｘ！盪器で混合した。粒子の大き さは２５０ミクロン以下に保った。本混合物から以下のとうりに三層錠を形成し カルナウバろうを振りかけた。カルナウバろう（１５ｍｇ）をシングルステーシ ョンＫｅｙ打錠機の打ち型に置き、続いてＺｎ−ｒｐＳＴ−基質５０ｍｇともう 一つのカルナウバろう１５ｍｇを置いた。ひと振りで圧縮を遂行し、二層のワッ クスで側面を固められたＺｎ−ｒｐＳＴ−基質から成る三層ペレットを製造した 。

凸状ペレットを製造するため凹状押抜き具を用いた。

真空源に接続した針の先端にペレットを保持し、約８５°Ｃに保ったミツろう、 カルナウバろう、およびＭａｚｏｌ（重量比８０／２０／２）の溶解混合物に約 １秒間浸した。−組８ペレットの平均被覆剤重量パーセント（すなわち非被覆ペ レットの重量に対する被覆剤重量の比）は１６．７１１．９であった。被覆ペレ ットをリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭ；ｐＨ７，４）Ｂｍｆｆｉ中に入れ ３７°Ｃ水溶中で震盪した。破裂、ひび割れ、錠内容物の漏出等の目に見える変 化について定期的に確認した。破裂時間は被覆剤がほとんどこわれてｐＳＴを放 出する間の連続観察時間の平均をとって決定した。ｐＳＴの放出は溶液のＵＶ吸 収度を２７６閣で測定して監視した。８ペレツトの平均破裂時間は、この被覆剤 を基質の組み合わせでは４３±１２時間（１，８±０．５日）と決定された。被 覆剤が破裂するとＺｎ−ｒｐｓＴの９０％以上が放出されサイズ分別クロマトグ ラフィーにより本質的に単量体であることが示された。本実験は平均被覆剤重量 パーセントが１６．２±０．８６のもう一組の８ペレツトでも再試した。

平均破裂時間は５０±２６時間であった。

叉隻斑主 下記の材料を用いて実施例１の処置を繰り返し次の結果を得た： Ｚｎ−ｒｐＳＴ−基質ペレット：実施例１と同じ被覆剤：実施例１と同じ 平均被覆剤重量％：３２．Ｏ±１．　９平均破裂時間：１１０±５０時間 平均放出ＳＴ％：９６±９ 裏族烈主 下記の材料を用いて実施例１の処置を繰り返し次の結果を得た： Ｚｎ−ｒｐＳＴ−基質ペレット：実施例１と同じ被覆剤：ミツろう／カルナウバ ろう／Ｍａｚｏ１平均被覆剤重量％：３２．０±１．１ 平均破裂時間＝１８±１時間 平均放出ＳＴ％：８４±１５ １施勇土 下記の材料を用いて実施例１の処置を繰り返し次の結果を得た： タンパク質−基剤ペレット：ウシ血清アルブミン／ショＩＩ（重量比５０１５０ ） 被覆剤：ミツろう／カルナウバろう／Ｍａｚｏ１平均被覆剤重量％：ｉｅ、７± ０．８６平均破裂時間：８．５±１．２日 平均放出タンパク質％：９２±９ 叉豊開旦 下記の材料を用いて実施例１の処置を繰り返し次の結果を得た： タンパク質−基質ペレット：リゾチーム／シｇ糖（重量比５０１５０　） 被覆剤：ミツろう／カルナウバろう／Ｍａｚｏ１平均被覆剤重量％：ｉ’ｙ、ｘ ±０．９９平均破裂時間：１４．８±２．０日 平均放出タンパク質％：６７ １隻斑旦 組み換えブタソマトトロピンの亜鉛錯体（Ｚｎ−ｒｐＳＴ）、アルギニン、およ びシ＝ｄｌ（重量比１／３／１）のペレットを実施例１に記載したようにミツろ う−カルナウバろう−Ｍａｚｏ　ｌ　（８０：　２０　：　１０）の混合物で被 覆した。被覆ペレットをブタに植えつけ定期的に血液標本を採取しソマトトロピ ン濃度と尿素を分析した。放射免疫検定（ＲＩ　Ａ）を用いて測定した血清中ソ マトトロピン濃度の上昇は、被覆ペレットが動物体内でタンパク質を放出するこ とを示した。放出されたタンパク質の効力は血中尿素窒素（ＢＵＮ）の低下によ って測定した。実験計画を表１に示す：結果を表２に示す。

表２を参照すると、ＲＩＡ結果は明らかに被覆ペレットが非被覆ペレットより遅 れてソマトトロピンを放出したことを示している。ＢＵＮ結果は被覆ペレットか ら放出されたソマトトロピンが有効であることを示している；従って被覆処理は タンパク質の生物活性に変化を与えなかった。放出遅延時間は上述のパラメータ ーの変更により変えることができる。

１施勇土 組み換えブタソマトトロピンの亜鉛錯体（Ｚｎ−ｒｐｓＴ）、アルギニン、およ びシ！！１１（重量比１／３／１）のペレットを実施例１に記載したようにミツ ろう−カルナウバろう−Ｍａｚｏｌの混合物で被覆した。

被覆ペレットをブタに植えつけ実施例６に記載したように定期的に血液標本を採 取しソマトトロピン濃度と尿素を分析した。実験計画を表３に示す；結果を表４ に示す。

表４を参照すると、血清ソマトトロピンの濃度上昇が被覆ペレットが動物にタン パク質を放出することを示した。血中尿素窒素（ＢＵＮ）測定値はＺｎ−ｒｐＳ Ｔの生体内放出で達成された遅延時間の決定に用いられた。認められた遅延時間 は以下のとうりである。

（平均と標準偏差）： 処置４：２．６±０．５日；処置５：５．７±１．４日；処置２：く１日；処置 ３：データが分散しすぎて有意な平均遅延時間がめられない。

１隻炎ｌ 乳糖基ｆ（プラセボ）とＺｎ−ｒｐｓＴ−基質（活性物質）から凸状ペレット（ 直径：４．Ｏｍ＋）を作った。

ブラセボの組成は以下のとうりであった：乳糖　１９．４５ｍｇ アビセル　２９．１７ｍｇ アカシア　０．９７ｍｇ ステアリン酸マグネシウム　０．３９ＢＦＤｅ色素　＃１　０．０２＋ｗｇ 活性物質の組成は以下のとうりであった：Ｚｎ−ｒｐｓＴ　１０．ＯＯ＋ｗｇ Ｌ−アルギニン　２９．５０ｏ＋ｇ シ＝Ｉｔ１Ｍ　１０．００ａ＋ｇ ステアリン酸マグネシウム　０．５０ｍｇブラセボ１．９８ｋｇと活性物質２０ ｇの混合物を市販の噴霧被覆機内で流動化した。

ステアリン（一部水素化した綿実油；　Ｄｕｒｋｅｅ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　 Ｆｏｏｄｓ、（：１ｅｖｅｌａｎｄ、０ｈｉｏ）　、ミツろうおよび湿潤剤（ポ リプロピレングリコールかＭａｚｏｌ）の混合物を全成分を一緒に溶融して調製 した。その後、ペレットが流動化している間に溶融混合物を噴霧被覆機の底から 噴霧した。ペレットに望ましい量のワックス被覆がなされた時、本工程を止めて 被覆された活性物質を分離した。ペレットを実施例１のように被覆剤重量％と破 裂時間に関して評価した。結果は表５に示す。湿潤剤の濃度も表５に示す。

表５を参照すると、被覆剤重量が増すにつれ破裂時間が減少することが明らかで ある。破裂時間はＭａｚｏｌとポリプロピレングリコールの選択によっても変動 しスＩＬ亀 ２４頭の去勢ブタを個別の畜舎で飼い現行のＮＰＣ勧告に合致もしくはそれを上 回る強化トウモロコシ−大豆食餌を与えた。第０日に血液１０ｍ１を採取し、動 物を秤量してから無作為に三処置群に割り付けた：（１）対照（プラセボ；Ｚｎ −ｒｐＳＴ　０．　Ｏａｇ　筋注／ブタ／日）　；（２）　Ｚｎ−ｒｐＳＴ　２ ｍｇ　筋注／ブタ／日；および（３）Ｚｎ−ｒｐＳＴ含有のワックスペレットの １週１回の植えつけ。

第３処置群は３週間、週に１回の植えつけを行った（第０．７．１４日）。

インブラントは以下の組成を有する６個の植えつけ可能なペレット（非被覆ｌ、 ワックス被覆５）を含む：Ｚｎ−ｒｐＳＴ〜１６ｍｇ、アルギニン１６ｍｇ、シ ュＩ！１６ｍｇ、ポロビニルピロリドン〜３ｍｇおよびステアリン酸マグネシウ ム”０．　５ａ＋ｇ、ワックス被覆剤の平均重量は６．８±１．２ｍｇであった 。ペレットの直径は０．４１であった。合計ｐＳＴ／インブラントは〜９６ｍｇ であった。

動物は第０．７．１４．２１日に採血し、第０．７．１４．２１．２８および３ ５日に秤量した。

一箇所を繰り返し刺激することを避けるために注射あるいは植えつけは首の左右 交互に行った。食餌効率計算のため第０日から第３５日まで毎週食餌を秤量した 。ブタの状態は毎日監視した。

本試験は完全無作為割り付は試験として行った。ＢＵＮとｐＳＴデータは共分散 分析で分析し第０日測定値をｃｏｖａｒｉａｔｅとして繰り返し使用した（ＳＡ Ｓ使用手引：統計、Ｖｅｒｓｔｏｎ　５　Ｅ　ｄ　、　Ｓ　Ａ　Ｓ　Ｉｎ５ｔｉ ｔｕｔｅ。

Ｉｎｃ、、　Ｃａｒｙ、ＮＣ，１９８５）　＊食餌、体重、体重増加および食餌 効率データは分散分析で分析した。

処置群間の差はＦ保ｌｉｔ検定により比較した平均の分離は最少二乗差を用いて 行った。

比較はＢＵＮとＰＳＴデータに関して、１）対照群（プラセボ）対処置群、２） 処置群内で第０日測定値日から第２１日までを行った。

血中尿素窒素、動物の体重および食餌消費量はｐＳＴ生物活性の評価のために収 集したデータである。ＢＵＮと食餌効率（食餌摂取量／体重増加）の低下は動物 の成長能力の向上を示す。加えて、植えつけた材料の可能な放出時間の評価のた めに血清ｐＳＴ濃度を決定した。結果から第７．１４および２１日の第２、第３ 処置群のＢＵＮは対照群と比べて有意に低下したことが示された（Ｐ＜、０５） 。加えて、ＢＵＮ低下に及ぼす第２、第３処置の効果をさらに証明する処置相夏 作用までの時間も観察された。

ｐＳＴワックスペレットインブラントの効果を体重、体重増加、１日平均体重増 加、食餌摂取量、１日平均食餌摂取量および全体食餌効率のパラメーターで評価 した。これらの値は異なる３つの時期について計算し分析した：処置期（第０日 から第２１日）、処置後期（第２１日から第３５日）、および処置期プラス処置 後期（第０日から第３５日）。結果は各々表６，７゜８に示す。

表６を参照すると、処置期間中ＰＳＴ植えつけ動物（第３処置群）はプラセボ投 与群をしのいでいる。この群は平均重量、全体重増加、１日平均増加（ＡＤ（１ ；）および全体食餌効率が勝っていた（ｐ＜、０５）。１日２ｍｇのＰＳＴ注射 を受けている正の対照群は、インブラント群より全体重増加とＡＤｑが有意に高 かった。

従って、インブラント群の体重増加は処置期間中、正と質の対照群の中間であっ た。

表７を参照すると、処置後期間中は、平均体重以外の全成長パラメーターに対し て処置の残余効果はなかった。毎日注射した動物の平均体重はプラセボあるいは ＰＳＴ植えつけ群より高かった（Ｐ＜、０５）。処置期間中にインブラント群で 築かれた体重増加は有意義を処置後まで維持するには不十分であった。

表８を参照すると、第２、第３処置群の全体食餌効率に対する初期の効果は試験 期間中持続した。処置期間中の〜３０％改善からは減退したが、第０日から第３ ５日までのＰＳＴ植えつけ動物の全体に渡る改善は対照値より１８％高かった。

免疫学的に活性なＰＳＴが植えつけ１週間後も依然として存在しているか決定す るために血清ｐＳＴを放射免疫検定法で測定した。

植えつけを受けた動物はブラセボ群および２４時間前にｐｓ７２ｍｇを１回注射 した１日１回注射群よりｐｓＴ濃度が高かった（ｐ＜、０５）。従って、インブ ラントは血液採取の２４時間以内にＰＳＴを放出したに違いない。これらの結果 から第Ｏ１７および１４日に植え付けたｐＳＴは放出され７日後も免疫学的に活 性であることが示される。

要約すると、ｐＳＴのワックス被覆インブラントは７日間生物学的に活性であっ た。処置期間（第０日〜第２１日）中ＢＵＮ濃度は低下し食餌効率は向上した。

全体食餌効率は試験期間中を通してｐＳＴによって減少した。インブラント群は 動物の体重と動物の体重増加において正および負の対照群の中間の効果を示した 。

インブラントを受けた動物は高用量のｐＳＴを受容していたと思われ、これが動 物の食餌摂取に悪影響を及ぼし体重増加をそこなったのかもしれない。成長能力 のパラメーターとして全体食餌効率を用いると、治療期間中（〜３０％）および 全試験期間中（〜１８％）ともｐｓＴインブラントは２ｍｇ／ブタの１日１回の 筋肉注射と生物学的に同様であった。

上記の教義に照らして本発明の多くの修正法および変法は明らかに可能である。

従って添付した特許請求の範囲内で本発明は明細書に記載した以外の方法で実行 可能であると理解される。

１上処１星：　負の対照 動物数　＝　４ 玉ｌ処１塁’　Ｚ　ｎ　ｒ　ｐ　Ｓ　Ｔを含有する非被覆三層ペレット。

動物数　二　８ 組成　：　上層および下層にカルナウバろうを１５ｍｇづつ含有する１３０ｍｇ の三層ペレット；中間層にはＺｎ−ｒｐＳ Ｔ２０ｍｇ、アルギニン５９ｍｇ、シロ１！２０ｍｇおよびステアリン酸マグネ シウム１ｍｇを含有する；長さ：〜０゜９　ｃｍ　；直径：Ｑ、４ｃｍ。

投与　；　第０日に１頭に１ペレツトを写真の皮下に植えつける。

員主処１皿：　Ｚｎ、−ｒｐＳＴを含有する被覆三層ペレット。

動物数　：１２ 組成　二　上層および下層にカルナウバろうを１５ｍｇづつ含有する１３０ｍｇ の三層ペレット；中間層にはＺｎ−ｒｐｓ Ｔ２０ｍｇ、アルギニン５９ｍｇ、シロｔＪｉ２０ｍｇおよびステアリン酸マグ ネシウム１ｍｇを含有する；ペレットを ８６°Ｃに保った溶融ミツろう−カル ナウバろう−Ｍａ　ｚ　ｏ　１混合物 （８０／２０／１０）に２回浸して 被覆する；長さ：〜１．ｌｔｍ；直 径：０．５ａｍ。

投与　：　第０日に１頭に１ペレツトを写真の皮下に植えつける。

処置群　第０日、６時間、第１日、第２日、第Ｏ日、６時間、第１日、第２日Ｓ ＥＮは平均の標準偏差 ｌ−主 処ｍ脱皿 出土処１！二　負の対照 動物数　：　４ １１処１星：　Ｚｎ−ｒｐｓＴを含有する非被覆三層ベレット 動物数　：　４ 組成　二　上層および下層にカルナウバろうを１５ｍｇづつ含有し中間層にＺｎ −ｒｐｓＴ２０ｍｇ、アルギニン５９ｍｇ、シｇ糖２０ｍｇ、ステアリン酸マグ ネシウムｌｏｇを含有する１３０＋ｗｇの三層ベレット；長さ：〜０．９Ｃ１！ Ｉ；直径：〜０．４ｃｍ投与　：　動物１頭に１ベレツトを皮下に植えつける。

■±１１印：　Ｚ　ｎ　−ｒ　ｐ　Ｓ　Ｔを含有する被覆三層ベレット。

動物数　：　８ 組成　：　第２処置群に記載したとうりのベレットを８６°Ｃに保った溶融ミツ ろう／カルナウバろう（８０／２０）に１回浸 して被覆する；長さ：〜１．１ｃｍ；直径：Ａ−０，５ｃｍ 投与　：　動物１頭に１ベレツトを皮下に植えつける。

員互恭１血：　Ｚｎ−ｒｐＳＴを含有する被覆三層ベレット。

動物数　＝　８ 組成　：　第２処置群に記載したとうりのベレットを８６°Ｃに保った溶融ミツ ろう／カルナウバろう／Ｍａ　ｚ　ｏ　１　（８０／２０／２）に１回浸して被 覆する；長さ： 〜１．ＩＣＩＩ；直径：〜０．　５Ｃ１１投与　：　動物１頭に１ベレツトを皮 下に植えつける。

第１処！里：　Ｚｎ−ｒｐＳＴを含有する被覆三層ベレット。

動物数　二　８ 組成　：　第２処置群に記載したとうりのベレットを８６°Ｃに保った溶融ミツ ろう／カルナウバろう／Ｍａ　ｚ　ｏ　１　（８０／２０／２）に２回浸して被 覆する；長さ ：”１，１ｃｍ；直径：〜０．　５ｃｍ投与　：　動物１頭に１ベレツトを皮下 に植えつける。

ｌ−土 ＲＩＡとＢＵＮデータ１の比較 ’ＢＵＮデータを上の行にＲＩＡデータを下の行に示す。

糞−エ ワックスで噴霧被覆したＰＳＴ−基質ベレットから得られた結果１ 組番号、被覆型０、被覆剤重量パーセント、破裂時間（時間）、放出ＳＴ％ ０被覆剤Ａニステアリン／ミツろう／ポリプロピレングリコール（８０／２０／ ２） 被覆剤Ｂニステアリン／ミツろう／ポリプロピレングリコール（８０／２０／１ ） 被覆剤Ｃニステアリン／ミツろう／Ｍａｚｏｌ（８被覆剤Ｄニステアリン／ミツ ろう／Ｍａｚｏｌ（８一士値は平均上標準偏差 表一旦 第２１日までの成長パラメーターに対する処置の効果１ 処置群ゝ 平均体重（ｋｇ） 全体重増加（ｋｇ） ＡＤＧ　（ｋｇ／ｄ）’ 食餌摂取量（ｋｇ） ＡＤＦ　Ｉ　（ｋｇ／ｄ）’ 全体Ｆ／Ｇ” ａ　成長パラメーターは第０日から第２１日までの期間を合計して評価した。

ｂ　パラメーター内に異なる肩付き文字（ｘ、ｙ、ｚ）のある平均値は有意水準 く、０５で差がある。

Ｃ第０日から第２１日までの１日平均体重増加。

ｄ　第０日から第２１日までの１日平均食餌摂取量。

ｅ　第０日から第２１日までの全体食餌効率。

表−１ 第２１日から第３５日までの成長パラメーターに対する処置の効果１ （表の項目は表６に同じ：訳者） ａ　成長パラメーターは第２１日から第３５日までの期間を合計して評価した。

ｂ　パラメーター内に異なる肩付き文字（ｘ、ｙ、ｚ）のある平均値は有意水準 く、０５で差がある。

Ｃ第２１日から第３５日までの１日平均体重増加。

ｄ　第２１日から第３５日までの１日平均食餌摂取量。

ｅ　第２１日から第３５日までの全体食餌効率。

ｌ−主 第３５日までの成長パラメーターに対する処置の効果 （表の項目は表６に同じ：訳者） ａ　成長パラメーターは第０日から第３５日までの期間を合計し評価した。

ｂ　パラメーター内に異なる肩付き文字（ｘ、ｙ、ｚ）のある平均値は有意水準 Ｐ＜、０５で差がある。

Ｃ第０日から第３５日までの１日平均体重増加。

ｄ　第０日から第３５日までの１日平均食餌摂取量。

ｅ　第０日から第３５日までの全体食餌効率。

寸 国際調査報告 ＋ｍ、、、、＋、、、＋ａｍ、、＋、、、、ｍ、　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０１３ ４０．、、−、、、−、、−、−、、、ＰＣＴＡＩＳ　Ｑｆｌ／ｌＩ？’１Ａｆ １国際調査報告 ρＣＴ／ＵＳ　９０１０１３４０ Ｓ＾　３５５３８

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．動物に長時間に渡って巨大分子タンパク質を放出するための制御放出考案物 であって、複数の不均一な小球を含む内部区画で、前記小球が巨大分子タンパク 質を含む核基質を完全に包囲する破裂性ワックスシェルから成る内部区画と；前 記内部分画を完全に包囲する水溶性外側カプセルから成る考案物。
2. ２．前記巨大分子タンパク質が、酵素、酵素阻害剤、抗体、抗原、インターフェ ロン、インスリン、プロラクチン、ソマトメジン、ソマトスタチン、インターロ イキン、ソマトクリニン（ＧＲＦ）およびソマトトロピンから成る部類中から選 択した巨大分子タンパク質である請求項１に記載の制御放出考案物。
3. ３．前記巨大分子タンパク質がソマトトロピンである請求項１に記載の制御放出 考案物。
4. ４．前記ソマトトロピンが、ヒト，ウシ，ヒツジ，トリ，ウマ，およびブタソマ トトロピンからなる部類中から選択したソマトトロピンである請求項３に記載の 制御放出考案物。
5. ５．前記ソマトトロピンがブタソマトトロピンである請求項３に記載の制御放出 考案物。
6. ６．前記タンパク質が前記小球の約１−７０重量パーセントである請求項１に記 載の制御放出考案物。
7. ７．前記核基質がさらに賦形剤、安定化剤、結合剤、界面活性剤、保存剤、ある いはこれらの混合物等の核剤を含む請求項１に記載の制御放出考案物。
8. ８．前記核剤が前記小球の約３０−９９％である請求項７に記載の制御放出考案 物。
9. ９．前記小球がペレット，錠剤あるいはマイクロカプセルである請求項１に記載 の制御放出考案物。
10. １０．前記小球がマイクロカプセルである請求項１に記載の制御放出考案物。
11. １１．前記外側カプセルがポリビニルピロリジン，ヒドロキシプロピルメチルセ ルロース，ゼラチン，ヒドロキシプロピルセルロース，あるいは水ガラスから成 るカプセルである請求項１に記載の制御放出考案物。
12. １２．前記外側カプセルがヒドウキシプロピルセルロースあるいはゼラチンから 成るカプセルである請求項１に記載の制御放出考案物。
13. １３．動物へ長時間に渡って巨大分子タンパク質を放出する方法で、前記動物に 請求項１に記載の考案物を投与することを含む方法。
14. １４．前記巨大分子タンパク質が酵素，酵素阻害剤，抗体，抗原，インターフェ ロン，インスリン，プロラクチン，ソマトメジン，ソマトスタチン，インターロ イキン，ソマトクリニン（ＧＲＦ）およびソマトトロピンから成る部類中から選 択した巨大分子タンパク質である請求項１３に記載の方法。
15. １５．前記巨大分子タンパク質がソマトトロピンである請求項１３に記載の方法 。
16. １６．前記ソマトトロピンが、ヒト，ウシ，ヒツジ，トリ，ウマ，およびブタソ マトトロピンからなる部類中から選択したソマトトロピンである請求項１５に記 載の方法。
17. １７．前記ソマトトロピンがブタソマトトロビンである請求項１５に記載の方法 。
18. １８．動物の成長を促進し食餌利用効率を上げる方法で、前記巨大分子タンパク 質がソマトトロピンである請求項１に記載の考案物を前記動物へ投与することを 含む方法。
19. １９．前記ソマトトロピンがヒト，ウシ，ヒツジ，トリ，ウマ，およびブタソマ トトロピンからなる部類中から選択したソマトトロピンである請求項１８に記載 の方法。
20. ２０．前記ソマトトロピンがブタソマトトロピンである請求項１８に記載の方法 。