JP2001502303A

JP2001502303A - 腸細胞発現による治療用遺伝子産生物の送達

Info

Publication number: JP2001502303A
Application number: JP10514853A
Authority: JP
Inventors: ジャーマン、マイケル; ゴールドファイン、アイラ、ディー．; ロスマン、スティーヴン、エス．
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1996-09-19
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2001-02-20
Also published as: US6258789B1; ATE320186T1; DE69735496T2; DK0939590T3; EP0939590A1; EP0939590B1; US20020039574A1; ES2256896T3; US6225290B1; EP0939590A4; DE69735496D1; US6831070B2; US20050026863A1; WO1998011779A1; CA2264744A1; AU729457B2; AU4422197A

Abstract

(57)【要約】ホ乳類対象の腸上皮細胞を遺伝子的に改変して、所望の治療効果を有するタンパク質を発現する遺伝子を機能的に取り込むようにする。腸細胞の形質転換は、ＤＮＡ含有製剤を投与することによって達成され、かつこの製剤は好ましくは経口投与される。経口又は他の胃腸内投与経路は簡単な投与方法を提供する。発現したタンパク質は、胃腸管及び／又は血流に直接分泌されて治療的な血中タンパク質値が得られ、これによってこのタンパク質を必要としている患者を治療する。本発明の送達系は治療用遺伝子産生物の短期間又は長期間送達を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】腸細胞発現による治療用遺伝子産生物の送達本願は、米国出願番号第08/717,084号（1996年９月20日出願）（この出願は参照として本明細書に含まれる）の一部継続出願である。発明の分野本発明は一般的にドラッグデリバリー(drugdellvery)の分野に関し、更に詳細には腸細胞の形質転換による治療用遺伝子産生物の送達に関する。発明の背景タンパク質は代謝から成長、増殖、免疫までの全ての生物学的機能に必須である。そのため、タンパク質は、広範囲なヒト疾病の処置のための薬剤として重要な潜在的な役割を有している。実際、タンパク質は既にガン、血友病、貧血及び糖尿病のような疾病を処置するために成功裏に使用されており、かつ多数の疾病にとっては唯一の有効な処置である。タンパク質医薬品は巨大な治療潜在力を持っているが、これらをより広範に使用することは幾つかの技術的な制限的要因によって制限されている。第一に、タンパク質は他の医薬と比較して製造が依然として困難でありかつ高価である。生物活性形態のタンパク質の大規模な精製がこれらの医薬品の商業化における制限段階の可能性がある。第二に、多くのタンパク質は患者内で代謝されるか又はそうでない場合急速に排泄される。その結果頻繁に再投与しなければならない。最後に、タンパク質医薬品は一般的に注射で投与しなければならない。そのため処置が複雑で費用が高くなり、投与の不快さによっても潜在的な臨床適用が制限される。治療用遺伝子産生物（例えば、タンパク質代償療法用のポリペプチド）をコードするＤＮＡで形質転換した細胞内で発現させて治療用遺伝子産生物を送達することは、種々のホ乳類の疾病を処置しかつ特定のタンパク質又は他の細胞産生物の産生を高める方法として広く注目を浴びている。この前途有望な、しばしば遺伝子治療と称される技術は一般的に、ホ乳類患者の細胞内に外因性遺伝子材料を導入することによって達成される。導入された遺伝子材料はホ乳類患者の異常な（欠陥）遺伝子を置換するように設計する（「遺伝子代償療法」）ことができるか、又はどの欠陥遺伝子も置換しないで、コードされたタンパク質若しくは他の治療用産生物を発現させるように設計する（「遺伝子増量」）ことができる。多数の先天的及び後天的な医学的疾患は種々の遺伝子産生物の不適切な産生から生じているので、遺伝子治療は治療用産生物をコードしている外因性核酸を一時的又は安定的に発現させることによってこれらの疾病を処置する手段を提供する。形質転換細胞内での発現による治療用遺伝子産生物の送達は、ホ乳類対象内の標的細胞を直接形質転換する（インビボ遺伝子治療）か又はインビトロで細胞を形質転換しその後この形質転換細胞をホ乳類対象に移植する（エクスビボ遺伝子治療）ことによって達成することができる。インビボ形質転換を達成するために、機械的手段(例えば、標的細胞内への核酸の直接注射又は粒子衝撃)、組換えウイルス、リポソーム及びレセプター介在エンドサイトーシス（ＲＭＥ）を含む多様な方法が開発されている(総説については、Chang等1994年Gastroenterol．106 :1076〜1084；Morsy等1993年JAMA 270:2338〜2345;及びLedley 1992年J．Pediat r．Gastroenterol．Nutr．14:328〜337参照)。全ての治療法と同様に、最も容易に投与され、最も安価で且つ忠者の応諾が最も得られそうな治療法が選択される治療法である。腸遺伝子治療は遺伝子治療技術分野でそのような治療法を提供する。腸上皮はインビボ遺伝子治療にとって特に魅力のある部位である。というのは、主として、腸上皮は経口又は他の内腔経路で容易に接近でき、その結果外因性核酸を非侵襲的な方法で投与することができるからである。例えば、患者は外因性核酸で構成されるピルを簡単に服用することができ、又は別法として、外因性核酸製剤を或る他の非侵襲的手段（即ち、内視鏡カテーテル法又は直腸坐剤切開のような大手術を必要としない手段）で投与することができる。しかしながら、腸細胞のインビボ形質転換を達成しようとする過去の努力は過酷な障害に遭遇してきた。この分野は主として長期間の形質転換と問題の治療用遺伝子産生物の送達に関係しているので、腸上皮細胞の代謝回転速度が速い（２〜４日）ため、殆どのグループは形質転換用標的として腸上皮細胞を避けてきた (例えば、Sandberg等1994年Hum．Gene Therap．5:303〜309参照)。インビボ形質転換を達成しようとする努力は、遺伝子治療形質転換製剤の標的細胞への接近を阻止すると考えられる腸粘膜層によって更に複雑となるであろう(Sandberg等、上述)。高濃度のＤＮアーゼが腸管に存在することも腸管細胞へのＤＮＡの効果的な導入の打破しがたい障壁であると考えられる。インビボ細胞形質転換用に開発されたベクターや送達系の多くは、それら自体の固有の欠点を有しているか又はインビボ腸細胞形質転換に完全には適していない。例えば、組換えウイルス、特にレトロウイルスは、一般的に生存ウイルスをヒトに投与することに関連した懸念のためＦＤＡの承認取得が遅いことがある。加えて、ウイルスベクターは、免疫応答のため、遺伝子構築物の多数回投与の可能性に伴う問題を提示するので、これらの有用性が大きく制限され得ることが明らかになっている。遺伝子ガンのような機械的手段が骨格筋細胞の形質転換に使用するために設計されているが、腸細胞の形質転換においては、アクセスの問題や器官の性質が繊細であるため特に有用というわけではない。全身治療目的を達成するために（例えば、タンパク質ベースの医薬品の投与を達成するために）設計されている形質転換による医薬品送達の現在の方法にはエクスビボ及びインビボ技術の両方が含まれる。しかしながら、エクスビボ技術には形質転換を達成するために複雑な手順が必要であり、対象が移植片拒絶の危険性に曝され、少なくとも小さな侵襲的手順が必要であるので、移植は中程度の細胞数に制限される。インビボ方法（例えば、血液又は筋肉への直接投与）もしばしば侵襲的な手順が必要であり、標的細胞への形質転換材料送達で困難に遭遇する。更に、忠者の血流を介した形質転換材料の送達は、ＤＮＡやこれに関連した担体を免疫系に暴露することになり、これは有害反応（例えば、投与されたＤＮＡ及び／又はＤＮＡ含有製剤の成分に対する炎症反応）を生じさせる可能性がある。今日、生物医学研究企業はますます速いペースで新しいタンパク質を発見している。既知のタンパク質が治療剤として利用可能になってきているので、これらを使用する実施可能性や簡便性を改良することによって、これら分子の医薬品としての適用を拡大する新規送達系や方法を開発する極めて重要な需要が存在する。本発明はこれらの問題に向けられている。発明の概要腸上皮細胞は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド及び合成核酸を含む）を含有する製剤に暴露することによって遺伝子的に改変される。このような暴露によって核酸が腸上皮細胞内に機能的に取り込まれ、それによって治療上有効なタンパク質をコードしている遺伝子の発現が促進される。ウイルスベクター、ネイキッド（naked）核酸及び／又はリポソーム製剤、好ましくはネイキッド核酸を含む核酸製剤は、該製剤中の核酸が腸上皮細胞に導入されるように胃腸管に送達するのに適する任意の製剤とすることができる。更に詳細には、腸細胞を遺伝子的に改変して機能的な外因性ＤＮＡ配列を機能的に取り込むようにし、この外因性ＤＮＡ配列が発現すると、治療値のタンパク質を得るのに十分な量で細胞から血流及び／又は胃腸系に直接分泌されるタンパク質を産生し、これによってタンパク質を必要としている患者が処置される。かくして、本発明の方法を使用して細胞を遺伝子的に改変して、全身治療を達成するか、及び／又はトランスフェクションされた細胞自体の欠陥を修復することができる。主要な目的は、治療用遺伝子産生物（例えば、タンパク質）の送達方法を提供することである。この方法において、ホ乳類の腸上皮細胞（例えば、小腸又は大腸の細胞）は、十分に機能的な遺伝子（外因性ＤＮＡ）を取り込むことによって遺伝子的に修飾されており、該遺伝子は生物学的に活性で且つ治療上有用なタンパク質を発現し、かつこのタンパク質は修飾された細胞から循環系、胃腸管及び／又は胃腸組織の局所環境中に分泌される。もう１つの目的は、細胞内で機能し生物学的に活性で且つ治療上有用なタンパク質を発現する十分に機能的な遺伝子形態の外因性遺伝子材料をゲノム内に取り込んでいる遺伝子的に形質転換された腸上皮細胞を産生させることである。成いは、トランスフェクションされた核酸は、遺伝子産生物のコード化とは別個に、構造的、酵素的又は他の直接的な細胞内効果を提供することができる。例としては、内在性遺伝子の調節や発現を行うアンチセンス核酸、及び固有の酵素活性を有する核酸配列であるリボザイムの調節や発現を行うアンチセンス核酸が含まれる。本発明は、胃腸（ＧＩ）管を内張りしている細胞の高いタンパク質産生能及び分泌能を利用している点で有益である。腸は身体のなかで２番目に大きい器官であり、かつ最大の免疫器官である。腸壁細胞は、ＧＩ管からの物質の優先的吸収と血流への輸送とを通常の機能として有する膨大な表面積（約300m²）の界面を提供する。これは肺又は筋肉組織には当てはまらない。たとえこの容量のうちの少しを利用しただけでも、多数の重要な治療用タンパク質、例えばホルモン、サイトカイン及び血液凝固タンパク質を血流に提供することができる。更に、本発明ではより大きい治療効果を有する短期作用性タンパク質の連続合成や必要な速度での分泌が保証されるので、このようなタンパク質を使用することができる。本発明の重要な利点は、本発明によってタンパク質医薬品を口から投与できるということである。本発明の送達系は、タンパク質自体の送達を試みているというよりはむしろ、治療用タンパク質をコードしている遺伝子を投与することによってタンパク質を間接的に送達しようとしている。胃腸管内のＤＮＡは消化過程で（胃酸又は腸ＤＮアーゼによって）急速に破壊されるという従来の知識にも拘わらず、本発明では所望の治療用タンパク質をコードしているＤＮＡの経口送達が成功している。ＤＮＡは腸細胞によって吸収され、腸細胞はコードされたタンパク質を合成しこれを血流又は胃腸管に分泌させて治療結果を達成する。この技術には融通性があるので広範囲のタンパク質医薬を全身に、胃腸管に、並びに局所的に送達することができ、送達が広範な治療適用範囲に良好に適合させられる。本発明のもう１つの利点は、治療用遺伝子の患者内での発現が短期間であるため、患者への治療用遺伝子産生物の投与を調節できることである。腸細胞は急速に代謝するので、発現は経口製剤の投与量及び／又は処方を変えることによって容易に修正又は変更することができる。かくして、短期発現は、形質転換細胞の急速な代謝の結果であり、これらの形質転換細胞は通常、約２日又は３日以内に消失する(又は「代謝される(turnover)」)。本発明のこの特徴は、投与量の制御及びＤＮＡ組込み（変異誘発）による長期合併症の危険性の低下の双方で有益である。本発明のもう１つの利点は、この方法が侵襲的手順を完全に回避し、ベクターを最も簡単な態様で−ピル又は他の材料の経口投与によって−投与できることである。胃腸管の内腔は実際には身体の「外側」であり、連続した単層細胞で身体から分離されている。そのため、口から胃腸管に入るものは、最初に胃腸管を内張りしている細胞を横断しない限り、外部空間に留まっており、本当の意味での身体や血流に入ることはできない。しかしながら、一旦遺伝子が腸細胞内で発現されそしてタンパク質産生物が天然の分泌経路から血流に放出されると、治療用タンパク質は現在の注射形態の医薬品と同じ態様で作用する。本発明はまた、先ず血流を介して広範に分布させないで、問題のＤＮＡを、対象の標的細胞に直接投与することに係わっている点で、遺伝子ベクターを血流に投与して他の組織や器官に至らせる遺伝子ベースの治療法より有益である。かくして、本発明を使用するＤＮＡの送達は一層効果的であり、問題のＤＮＡを特定の組織に標的化する更なるメカニズムを必要としていない。なおもう１つの利点は、本発明によって、処置に対する有害反応の主要原因である血流に対する形質転換用ＤＮＡの暴露が最小限になるということである。送達ベクター（特にウイルスベクター）に対する免疫系の反応は、従来の遺伝子ベースの治療法の主要な障害である。他の経路（例えば、静脈内、筋肉内注射、又は肺投与）でベクターを送達すると、ベクターが血液や細胞外流体に暴露される。この暴露により通常、炎症や免疫応答が生じる。これらの有害反応はしばしば再度の施用によって、処置を継続できなくなり完全に無効になる点まで悪化する。本発明はベクターを直接腸に提供するので、最初に対象の血液又は組織を通過させる必要はない。これによってできるだけ多くのＤＮＡ送達過程が、免疫学的及び炎症性応答を開始する全身循環から遮蔽され、このように治療を伴う干渉が最小限になる。本発明のもう１つの利点は、ウイルスベクターよりむしろネイキッドＤＮＡをベクターとして使用できることである。ウイルスベクターは投与やゲノム内へのＤＮＡ取込みが容易であるため、遺伝子治療では一般的であるが、ウイルスベクターは多数回投与の妨げとなるかなりの抗原反応を生じさせることが見い出されている。ネイキッドＤＮＡを使用するとこの問題が回避される。本発明の更にもう１つの利点は、上皮細胞が２，３日以内に腸内腔に脱落して身体から消失するので、長期間の遺伝子投与による潜在的で有害な副作用を回避できることである。本発明のもう１つの利点は、治療用遺伝子産生物が、遺伝子産生物の正常な産生により近い態様及び投与量で対象の血流に送達される（例えば、治療用ポリペプチドのボーラス静脈内注射と比べて）ということである。更になおもう１つの利点は、本発明のドラッグデリバリーシステム(drug deli very system）が患者自身の組織を使用して問題のタンパク質医薬品を産生し、血流に分泌させることである。本発明のもう１つの利点は、ＤＮＡ製剤を（血流にというよりはむしろ）ＧＩ管の内腔に直接投与することによって、より多種多様なトランスフェクションアジュバントの使用が可能になることである。胃腸管は、その生理学的役割の結果、より一層強くなるように設計されているので、より広範な環境条件に対してより一層寛容でき、かつ毒性反応の影響をより受けにくい。かくして、本発明は、ウイルスに基づくベクターに代わって細胞によるＤＮＡ取込みを促進する適当な化学的方法と一緒に使用することができるが、そうでない場合、静脈内、筋肉内又は肺経路での投与には不適当であると思われる。例えば、ＧＩ管は毒性の影響を受けにくく、循環からの標的化を必要としないので、本発明はリポソーム、カチオン脂質を含んでおり且つＤＮＡ取込みを高めるアジュバント、並びに他の様々なアジュバントにまで拡大して使用することができる。本発明はまた、タンパク質ベースの医薬品の送達に関連した多くの技術的障害が回避される点で有益である。第一に、本発明では所望のタンパク質の合成に身体自体の組織を使用するので、タンパク質製造の費用や困難性が回避される。第二に、本発明では遺伝子発現による治療用タンパク質が連続的に製造され且つ分泌されるので、急速な代謝の問題が回避される。最後に、経口投与によって身体内での治療値を達成するために注射する必要性が回避される。本発明の上記及び他の目的、利点並びに特徴は、以下に更に十分に記載したベクター、製剤及び方法論の詳細を読むことによって、当業者に明白となろう。図面の簡単な説明図１は胃腸管を内張りしている上皮細胞層の概略図である。工程１はＤＮＡの投与及び腸管内の細胞による吸収を表し；工程２は治療用タンパク質の合成を表し；かつ工程３は血流へのタンパク質分泌を表す。図２は、腸細胞が絨毛基部の幹細胞から移動した後、絨毛先端から脱落することを示す腸絨毛の概略図である。図３は、本発明による腸上皮細胞の形質転換に有用な代表的な組換えプラスミド構築物の概略図である。図４はｐＦＧＨ構築物のマップであり、ヒト成長ホルモンゲノム配列を含んでいる。図５はｐＦＧＨ.ＣＭＶ構築物のマップであり、ＣＭＶプロモーターと機能的に結合したヒト成長ホルモンゲノム配列を含んでいる。図６はｐＦＧＨ.chymo構築物のマップであり、キモトリプシンＢプロモーターと機能的に結合したヒト成長ホルモンゲノム配列を含んでいる。図７は、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡで構成される溶液に胴断片を暴露した後の全身血（黒棒）と門静脈血（斜線棒）中のヒト成長ホルモン値を示す図である。図８及び９はｐＢＡＴ14.hIns及びｐＢＡＴ16.hInsＧ1.Ｍ2構築物のマップであり、これらはそれぞれ、ＣＭＶプロモーターと機能的に結合したヒトインスリン又はヒトインスリンの変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。図10は本発明による腸細胞の形質転換による糖尿病の好転を示す図である。白四角、正常ラットの血中グルコース値(mg/dl);中心に点のある白四角、ストレプトゾトシン誘発糖尿病を有するラットの血中グルコース値；黒四角、ストレプトゾトシン誘発糖尿病を有しておりそしてインスリンをコード化しているベクターによる腸細胞の形質転換で治療したラットの血中グルコース値。図11は、覚醒動物に十二指腸カテーテルを内在させてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードするＤＮＡ（黒四角）又はコントロールＤＮＡ（白四角）を投与した後のｈＧＨの血漿値を示す図である。各データ点は３つの実験の平均値を表す。図12は、ｐＦＯＸＥＧＦＰ.Ｎ2.ＣＭＶ構築物のマップであり、これはＣＭＶプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質をコードしている。好ましい態様の説明腸上皮細胞を遺伝子的に形質転換する本発明の方法及び遺伝子治療を提供する方法を記載する前に、本発明は、記載した特定の方法論、プロトコール、細胞系、腸細胞、ベクター及び試薬に限定されず、かつ勿論これらは変更できることを理解すべきである。また、本明細書で使用した専門用語は特定の態様を記載する目的のためだけであって、本発明の範囲を制限することを意図しているものではなく、本発明の範囲は、添付の請求の範囲によってのみ制限されるものであると理解すべきである。本明細書及び添付の請求の範囲に用いられるとき、単数形態の「ａ」及び「th e」は、文脈から他に明確に指示されていない限り、複数形態を含むことに注意しなければならない。かくして、例えば、「腸上皮細胞」の表示には複数のこのような細胞が含まれ、「形質転換ベクター」の表示には１つ又はそれより多い形質転換ベクター及び当該技術分野の熟練者に知られているこれらの等価物の表示が含まれる、などである。特記しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で通常の技個を有する者に通常理解されるものと同じ意味を有している。本明細書に記載したものに類似するか又は等価の任意の方法、デバイス及び材料を本発明の実施又は試験に使用できるが、ここでは好ましい方法、デバイス及び材料を記載する。本明細書で言及した刊行物は全て、該刊行物に記載されており、本明細書に記載した発明に関連して用いたと思われる細胞系、ベクター及び方法論を記載し且つ開示する目的で、本明細書で参照として含まれる。本明細書で考察した刊行物は本願の出願日前のこれら刊行物の開示だけを提供する。本明細書に記載したものはいずれも、先行発明によるこのような開示に先行する権利が本発明者にないことを容認したものと解釈すべきではない。定義「腸」とは、胃から肛門まで延び、回旋状の上部（小腸）及び直径がより大きい下部（大腸）で構成されている下部消化管を意昧する。「小腸」とは、十二指腸、空腸及び回腸で構成されている腸領域を意味する。「大腸」とは、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸及び直腸で構成されている腸領域を意味する。「腸上皮細胞」とは、腸の内腔表面を覆っている組織内に含まれる細胞を意味し、これらには小腸の吸収細胞、大腸の円柱上皮細胞、内分泌細胞（大腸及び小腸）及び陰窩細胞（粘液腺細胞、漿液腺細胞及び幹細胞を含む）が含まれるが必ずしもこれらに限定されない。「短期間生存」上皮細胞、即ち成熟後約２〜３日以内に胃腸内腔に脱落する細胞（幹細胞のような「長期間生存」上皮細胞と対照的な）が特に重要である。「形質転換」とは、新しいＤＮＡ（即ち、細胞にとって外因性ＤＮＡ）を取り込んだ後に細胞内に誘導される一時的な（即ち、エピソームの又は他の非本来的な）又は永久的な（即ち、安定な又は本来的な）遺伝子変化を意味する。「ネイキッドＤＮＡ（naked DNA）」若しくは「ネイキッド核酸（naked nucle ic acid）」又はＤＮＡ配列等とは、ウイルス粒子内に入っていない核酸分子を意味する。ネイキッド核酸は、核酸を標的細胞部位に送達するのを促進する非ウイルス手段（例えば、消化管からの核酸の移動を促進し、核酸を胃酸から保護し、腸粘膜を通って標的上皮細胞の表面にまで浸透させるのに役立つ手段、及び／又は細胞膜に浸透させる手段）及び／又はアジュバントとして働くウイルス若しくは非ウイルス成分（例えば、ネイキッドＤＮＡと組み合わせて投与されるが、標的細胞に送達すべきＤＮＡを含んでいないウイルス粒子）と結合させることができる。「形質転換細胞」とは、問題のタンパク質をコードする核酸分子、即ち核酸で形成されているコドン配列（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）が組換え核酸技術によって導入されている細胞（又はこのような細胞の先駆細胞）を意味する。導入された核酸配列は染色体外要素又は染色体要素として存在することができる。「問題のＤＮＡ」とは、腸細胞、好ましくは腸上皮細胞の形質転換によるホ乳類対象への送達（詳細には、静脈内又は胃腸送達、更に詳細には静脈内送達）に望ましいタンパク質又は他の分子をコードする任意のＤＮＡ配列を意味する。この配列は一般的に、プロモーターのような発現に必要な他の配列と機能的に結合している。「問題のＤＮＡ」という語は、ＤＮＡに限定するように意味したものではなくて、投与するのに望ましいタンパク質又は他の分子をコードする任意の核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を含んでいる。「タンパク質」とは、ポリペプチド（天然（即ち天然生起）又は変異体）、オリゴペプチド、ペプチド又は他のアミノ酸配列を意味する。本明細書で使用するとき、「タンパク質」は、天然即ち全長タンパク質に限定されるのではなくて、所望の活性又は他の望ましい生物学的特徴を有するタンパク質フラグメント、並びに所望の活性又は他の望ましい生物学的特徴を保持しているそのようなタンパク質又はタンパク質フラグメントの変異体又は誘導体を包含するように意味する。変異体タンパク質は、由来する天然タンパク質と比較してアミノ酸配列が改変されているタンパク質を包含しており、該改変にはアミノ酸置換（保存又は非保存）、欠失、又は付加（例えば、融合タンパク質におけるような）を含むことができる。「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書で相互に交換できるように用いられ、どちらかの用語の範囲に限定するように意図していない。「プロモーター」とは、転写を指令するのに十分な最小限のＤＮＡ配列を意味する。「プロモーター」はまた、細胞型特異的、組織特異的に制御可能であるか又は外部シグナル若しくは作用剤で誘導可能なプロモーター依存性遺伝子発現に十分であるプロモーター要素も包含するように意味されている。このような要素は天然遺伝子の5'又は3'領域に位置させることができる。「腸細胞特異的プロモーター」とは、転写アクチベータータンパク質又は他の転写調節遺伝子が結合したとき機能的に結合したＤＮＡ配列の発現を指令するプロモーターを意味し、これらは腸細胞（例えば、腸上皮細胞又は特定の型の腸上皮細胞（例えば、小腸細胞、大腸細胞、腺細胞又は吸収細胞））に固有である。例えば、「腸細胞特異的プロモーター」とは、腸上皮細胞での発現を指令する腸細胞特異的プロモーター、例えばスクラーゼ、ラクターゼ−フロリジンヒドロラーゼ及びカルボニックアンヒドラーゼのプロモーターを意昧する。代表的な腸細胞プロモーターはボル（Boll）等1991年Am．J．Hum．Genet．48:889〜902;ブラディ（Brady）等1991年Biochem．J．277:903〜905;ドラムモンド(Drummond）等1 996年Eur．J．Biochem．236:670〜681;オルセン（Olsen）等1994年FEBS Lett．3 42 :325〜328;ロドロッセ（Rodolosse）等1996年Biochem．J．315:301〜306;ソウデン（Sowden）等1993年Differentiation 53:67〜74;トレーバー（Traber）1990 年Biochem．Biophys．Res．Commun．173:765〜773;トレーバー等1992年Mol．Cel l．Blol．12:3614〜3627;トレルセン（Troelsen）等1994年FEBS Lett．342:291 〜296;トレルセン等1994年FEBS Lett．342:297〜301;及びトレルセン等1992年J ．Biol．Chem．267:20407〜20411に記載されている。「機能的に結合した」とは、適当な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）を調節配列（単数又は複数）と結合させたとき、ＤＮＡコード化配列と調節配列（単数又は複数）とが該コード化配列の遺伝子発現を可能にするような方法で結合されていることを意味する。「機能的に挿入した」とは、細胞内に導入された問題のＤＮＡが、導入ＤＮＡの転写及び翻訳を指令するＤＮＡ配列の近くに配置されており(即ち、例えば問題のＤＮＡによってコードされるポリペプチドの産生を促進する)、その結果、コード化配列が発現されるように配置されていることを意味する。「ホ乳類対象」又は「ホ乳類患者」とは、遺伝子治療が望まれているヒト、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ及びネコ対象を含む任意のホ乳類を意味する。「実質的に含有していない」（例えば、「リポフェクチン、デンドリマー又はウイルス粒子を実質的に含有していない」という語（特に宿主細胞内に核酸配列を導入し得るウイルス粒子）で使用されているような）とは、記載された化合物又は作用剤を比較的殆ど又は実質的に全く含有していないことを意味し、例えば、製剤が記載された化合物又は作用剤を比較的殆ど又は実質的に全く含有していない、例えば、記載された化合物又は作用剤が組成物全体の５％未満、好ましくは１％未満、更に好ましくは0.1％未満、最も好ましくは0.01％〜0.001％未満から検出不可能若しくは不純物レベルで存在する。発明の概観本発明は、腸細胞、好ましくはホ乳類患者の腸上皮細胞の遺伝子改変による遺伝子産生物の送達用組成物及び方法を特徴としている。胃腸（ＧＩ）管は身体内の連続通路を形成する中空管である。胃腸管を身体の真の内部と分離している細胞は胃腸管の内部空間、即ち「内腔」を内張りしている。ＧＩ管の内腔は実際には身体の「外側」であり、連続した単層細胞で身体から分離されている（図１）。口からＧＩ管に入るものはこの外部空間に留まり、ＧＩ管を内張りしている細胞を先ず横断しない限り、本当の意味での身体及び血流に入ることはできない。本発明の治療用遺伝子産生物の送達方法は、ＧＩ管の内腔を内張りしている細胞に焦点を当てている。問題のＤＮＡを含有する形質転換用製剤をＧＩ管に送達する（例えば、口から）ことによって、問題の治療用ＤＮＡは忠者の血流には入らない。問題のＤＮＡを含有する製剤を外部的に投与すると、ＧＩ管の内腔を内張りしている細胞に吸収される。次いで、このＤＮＡはこれらの細胞内で発現される。好ましくは、形質転換腸細胞は、問題のＤＮＡでコードされるタンパク質を発現し、治療上有効量のタンパク質を血流又は胃腸管に、好ましくは天然の分泌経路から血流に分泌する。一度循環に入ると、タンパク質代償療法として役立つ治療用タンパク質は、あたかもこれらが対象によって天然に発現されたかのように、同じ態様で作用する。この他に、又はこれに加えて、治療用遺伝子産生物が所望の治療効果（例えば、抗生物質活性）を提供する外因性タンパク質である場合、この医薬品はあたかもこれが従来の注射方法で送達されたかのように、同じ活性を示す。最終的な治療効果は同じであるが、医薬としてのタンパク質の主要な制限が回避される。かくして、本発明は組換えＤＮＡを口から腸管細胞に投与する（即ち、腸経路）プラットフォームとして役立つことができ、多種多様なタンパク質医薬品の全身的並びに局所的送達が可能になり、その結果本発明は広範囲の治療施用に良好に適合できる。好ましくは、問題のＤＮＡが導入され且つこれを発現する腸細胞は、脳の上皮細胞であり、小腸又は大腸のいずれかの腸細胞であるのがよい。腸上皮細胞の遺伝子改変によって、本発明の方法は、問題のＤＮＡの短期間発現を提供することができる。遺伝子ベースの治療に対する大部分の研究アプローチは、治療用遺伝子の長期間発現を必要とし且つ目指しているが、本発明は短期間発現を行い、これによって多様で重要な利点が提供される。第一に、短期間発現によって対象のニーズにより治療用遺伝子の投与量を調節することができる。この可能性は、腸を内張りしている細胞が通常は約２日又は３日以内に消失するという事実の結果である（図２）。治療が短期間であると意図されるか、又は治療がもはや望まれないとき、投与されたＤＮＡはこれを含んでいる腸細胞と一緒に身体から急速に除去される。更に、標的細胞は短期間生存でありそして最後には分化されるので、ＤＮＡ組込み（即ち、変異形成）による長期間合併症の危険性が低下する。好ましくは、問題のＤＮＡはインスリン、成長ホルモン、血液凝固VIII因子、内因性因子、エリスロポエチン、ＩＸ因子、及び、例えば血漿タンパク質、ホルモン又は血漿プロテアーゼインヒビターを欠いていることがある他の全ての血液因子のいずれかをコードしている。タンパク質送達の標的が胃腸管である場合、問題のＤＮＡはフェニルアラニントランスポーター(フェニルケトン尿症用)、ラクターゼ欠乏症用のラクターゼ、内因性因子、又は他の刷子縁酵素及び輸送体をコードすることができる。問題のＤＮＡは、問題の遺伝子を適切なレベルで発現することができるプロモーターと機能的に結合されるのが好ましい。プロモーターにはウイルスＣＭＶプロモーター及びＲＳＶプロモーターのような遍在的に機能する双方のプロモーター、又はスクラーゼ若しくはラクターゼプロモーターのような腸細胞型に特異的なプロモーターが含まれる(Traber等Molec．Cell．Blol .、1992年、12(8):3614〜3627)。本発明をここで更に詳細に説明する。ベクター及び構築物問題のＤＮＡと機能的に結合した真核生物プロモーターを有する任意の核酸ベクターを本発明で使用して腸細胞を形質転換することができる。本発明に従って使用できるＤＮＡ配列（又は相当するＲＮＡ配列）を含むベクターは、問題のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む任意の真核生物発現ベクターであることができる。例えば、プラスミドを開裂して結合可能な末端を有する線状ＤＮＡを提供することができる。これらの末端は、結合可能な末端のような相補性を有する外因性ＤＮＡと結合させて、無傷のレプリコンと所望の表現型特性を有する生物学的に機能的な組換えＤＮＡ分子を提供する。宿主内で外因性ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を発現する核酸構築物を産生させる技術は、当該技術分野で知られている（例えば、Kormal等、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA、84:2150〜2154、1987年；Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory M anual 、第２版、1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照のこと。これらはそれぞれ、問題のＤＮＡの真核生物発現用の方法及び組成物に関して、本明細書に参照として含まれる）。種々のベクター（例えば、細菌ベクター、又は真核生物及び原核生物宿主内で複製し得るベクター）を本発明に従って使用することができる。ベクターは、真核生物宿主及び原核生物宿主の双方で複製することができるのが好ましい。真核生物及び原核生物宿主内で複製できる多数のベクターが当該技術分野で知られており且つ市販入手可能である。一般に、本発明により用いられるベクターは、細菌の複製起点及び問題のＤＮＡと機能的に結合した真核生物プロモーターで構成されている。ＤＮＡ構築物は、腸上皮細胞内での問題のＤＮＡの発現を促進するプロモーターを含むのが好ましい。プロモーターは強力な真核生物プロモーターであるのが好ましい。真核細胞内での転写を促進する代表的な真核生物プロモーターにはサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、マウス乳癌ウイルス(ＭＭＴＶ)、ラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)、及びアデノウイルスから得られるプロモーターが含まれる。更に詳細には、代表的なプロモーターにはヒトＣＭＶの前初期遺伝子から得られるプロモーター（Boshart等、Cell 41:521〜530、1985年）及びＲＳＶの末端反復配列（ＬＴＲ）から得られるプロモーター（Gorman等、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 79:6777〜6781、1982年）が含まれる。これら２つのプロモーターのうち、ＣＭＶプロモーターはＲＳＶプロモーターより高い発現レベルを提供するので好ましい。真核生物発現（例えば、腸上皮細胞での）用には、構築物は、問題のＤＮＡと機能的に結合した少なくとも１つの真核生物プロモーターを含有するのが好ましく、これは順次ポリアデニル化配列と機能的に結合している。ポリアデニル化シグナル配列は当該技術分野で知られている多様なポリアデニル化シグナル配列から選択することができる。ポリアデニル化シグナル配列はＳＶ40後期ポリアデニル化シグナル配列であるのが好ましい。この構築物はまた、プロモーターに加えて腸上皮細胞での発現を高める配列（例えば、エンハンサー配列、イントロン）を含むこともできる。例えば、構築物は１つ又はそれより多いイントロンを含むことができ、このイントロンは、特に問題のＤＮＡがｃＤＮＡである（例えば、天然生起配列のイントロンを含有していない）場合、問題のＤＮＡの発現レベルを高めることができる。当該技術分野で知られている種々のイントロンのうち任意のものを使用することができる。イントロンは、ヒトβ-グロビンイントロンであり、問題のＤＮＡの5'位で構築物に挿入されるのが好ましい。構築物を含むか、及び／又は発現する細胞の選択を助ける（例えば、ベクター構築過程中に）ためのマーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子のような）又はβ-ガラクトシダーゼ)、細菌細胞内で構築物が安定して複製するための複製起点(好ましくはコピー数の多い複製起点)、核局在化シグナル、又はＤＮＡ構築物、ＤＮＡ構築物によってコードされるタンパク質若しくはこれらの両方の産生を促進する他の要素のような他の成分を含むことができる。本発明の方法に有用な代表的な構築物の概略図を図３に示す。腸細胞遺伝子治療による処置になじみ易い治療用遺伝子産生物及び条件問題のＤＮＡは、静脈内治療及び／又は胃腸管治療が望ましい任意のタンパク質又は他の遺伝子産生物をコードする任意のＤＮＡ配列であることができる。例えば、静脈内タンパク質治療は、特定のタンパク質欠乏症に関連した先天性又は後天性疾病（例えば、糖尿病、血友病、貧血、重篤な合併型免疫不全）を有しているホ乳類対象の処置に適している。このようなタンパク質欠乏状態は、代償療法による処置、即ち血流タンパク質レベルを少なくとも正常レベルまで回復させるためにタンパク質を発現させる処置になじみ易い。例えば、対象が栄養の吸収に関連したタンパク質欠乏症（例えば、内因性因子、スクラーゼ、ラクターゼ、消化酵素、又は輸送体の欠乏症）を患っている場合、治療用タンパク質を胃腸管に分泌させる（例えば、粘膜細胞へのタンパク質分泌によって）のが適当である。または、ホ乳類対象は、健康なホ乳類対象中に通常存在するタンパク質、又はホ乳類対象にとって外来であるタンパク質の発現又は過剰発現による処置になじみ易い状態を有していることができる。例えば、静脈内タンパク質治療はウイルス(例えば、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）)、細菌、真菌、及び／又は寄生虫感染を有している（特に感染が慢性である、即ち比較的長期間に亘って持続している）ホ乳類対象の処置に用いることができる。所望の効果を達成するために（例えば、正常な代謝過程を高めるために）、本発明の腸細胞遺伝子治療を用いて、正常なホ乳類に存在するタンパク質の発現を高めるか、又は正常なホ乳類には通常存在しないタンパク質を発現させることもできる。例えば、血流中のウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）レベルを高め且つ乳産生を高めるために、ＢＧＨをコードするＤＮＡで乳牛の腸管細胞を形質転換することができる。または、問題のＤＮＡは、遺伝子改変で標的とされた腸細胞の欠陥を修復できる遺伝子産生物をコードするＤＮＡであることができる。例えば、ＤＮＡは腸細胞によるリポタンパク質産生に関連した遺伝子産生物をコードすることができる。問題のＤＮＡは、治療すべきホ乳類対象と同じ種の供給源（例えば、ヒト対ヒト）から得られるのが好ましいが、これは絶対的な要件ではない。特にタンパク質のアミノ酸配列が高度に保持され、異種発生性タンパク質がホ乳類宿主内で該タンパク質に対する顕著で望ましくない抗体応答を誘発するほど顕著には免疫原性でない場合、そのホ乳類対象と異なる種から得られるＤＮＡを使用することもできる。更に、ＤＮＡは化学合成及び／又は細胞内での遺伝子工学によって合成的に産生することができる。代表的で好ましい問題のＤＮＡにはインスリン、成長ホルモン、血液凝固ＶII I因子、内因性因子、及びエリスロポエチンをコードする組換え又は単離ＤＮＡ配列が含まれる。ホ乳類の形質転換腸細胞内でタンパク質（例えば、インスリン、成長ホルモン、血液凝固ＶIII因子、又はエリスロポエチン）をコードするＤＮＡの発現によるホ乳類対象（例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、又はヒト対象、好ましくはウシ又はヒト対象、更に好ましくはヒト対象）の静脈内タンパク質治療が特に重要である。好ましくは、対象はヒト対象であり、発現ＤＮＡはヒトタンパク質（例えば、ヒトインスリン、ヒト成長ホルモン、ヒト血液凝固ＶII I因子又はヒトエリスロポエチン）をコードする。問題のＤＮＡの他の代表例にはプラスミノーゲンアクチベーター(ｔＰＡ)、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、酸性繊維芽細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子β、形質転換用増殖因子β、血小板由来増殖因子、内皮及び可溶性ＣD4が含まれる。一般に、問題のＤＮＡは、遺伝子産生物の産生を低下させる遺伝子（例えば、腸によるリポタンパク質産生に係わる遺伝子）をコードする配列であることができるか又は遺伝子をコードしないが腸によるリポタンパク質の産生を低下させるのに有用な核酸（例えば、リボザイム又はアンチセンス核酸）であることができる。問題のＤＮＡは、合成核酸、例えば、内在性ヌクレアーゼに対する問題のＤＮＡの感受性を変えるか又は細胞取込みを高めることができる修飾合成塩基であることもできる。問題のＤＮＡは、免疫治療用の遺伝子産生物をコードすることができ、感染に対する免疫発生、又はＩ型糖尿病若しくはリウマチ様関節炎におけるような自己免疫疾患を処置するために寛容性の発生を促進することができる。表１は、本発明の腸細胞遺伝子治療によって送達することができる代表的なタンパク質及びタンパク質の種類の表を提供する。表１：本発明で使用される代表的なタンパク質及びタンパク質の種類表１（続き）種々の疾病状態が本発明の腸細胞遺伝子治療を用いる処置になじみ易い。当該技術分野の熟練者は特定の疾病状態を処置するために本発明で産生される適当なタンパク質を認識することができる。主題発明を用いる処置になじみ易い代表的な疾病及びこれらの疾病の処置に用いることができる代表的な適切なタンパク質を表２に示す。表２：本発明を用いる処置になじみ易い代表的な疾病状態表２（続き）静脈内タンパク質治療に望ましい多数のタンパク質が当該技術分野で良く知られており、これらのタンパク質をコードするＤＮＡが単離されている。例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン、内因性因子、血液凝固VIII因子及びエリストポエチンをコードするＤＮＡの配列はジーンバンク（Gen Bank）から入手可能であり、及び／又は科学文献に記載されている(例えば、ヒト血液凝固VIII因子遺伝子：Gitschier等、Nature 312:326〜330、1984年：Wood等、Nature 312:330〜33 7、1984年；ヒト内因性因子：Hewitt等、Genomics 10:432〜440、1991年)。処置で通常用いられるタンパク質は本発明の遺伝子治療法で使用することができる。このようなタンパク質は、例えば、フィジシャンズデスクリフアレンス(1994 Physicians' Desk Reference、第48版、Medical Economics Data Production Co .、ニュージャージー州モントベール;参照として含まれる)に開示されており、ハリソンズプリンシプルズオブインターナルメディシン（Harrison's Princ iples of Internal Medicine）及び／又はエイエムエイ（ＡＭＡ）「医薬品評価年報（Drug Evaluations Annual）」1993（これらは全て参照として含まれる）に記載された方法を使用して投与することができる。問題のタンパク質をコードするＤＮＡが単離されていない場合、これは当該技術分野の熟練者に良く知られている種々の標準的なプロトコールによって達成することができる(例えば、Sambrook等、同上;Suggs等、Proc．Natl．Acad．Sci． USA 78:6613〜6617、1981年：米国特許第4,394,443号を参照のこと。これらはそれぞれ、問題のタンパク質をコードするＤＮＡの同定及び単離に関して本明細書に参照として含まれる)。例えば、特定のタンパク質をコードするゲノム又はｃＤＮＡクローンは、所望の遺伝子のヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて設計されたハイブリッド形成プローブを使用してゲノム又はｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。これらのプローブは、化学合成で構築するか又は配列データに基づくプライマーを使用してプール又はライブラリーから得られるＤＮＡフラグメントを増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で構築することができる(米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号)。ポリヌクレオチドのハイブリッド形成能が実質的に妨げられない限り、ヌクレオチド置換、欠失、付加等をポリヌクレオチドに取り入れることもできる(Sambrook等、同上)。これらのクローンを発現させるか又は問題のＤＮＡを切断若しくは合成して、他の構築物で使用することができる。所望の場合、問題のＤＮＡは当該技術分野で良く知られた方法を使用して配列を決定することができる。好ましい態様として、本発明で使用される構築物は、形質転換腸上皮細胞から血流へタンパク質の分泌が高められるように設計される。腸上皮細胞は通常、胃腸管の内腔に向けられている先端面と血液供給に向けられた基部側面で分極している。腸上皮は動物の主要な吸収表面であり、そのため物質を腸内腔から血液中に優先的に輸送する。これらの過程はヘキソース、アミノ酸及び電解質で最も広範に研究されているが、より大きい分子も同様に吸収されることが段々明らかになってきている。例えば、小さいポリペプチドは吸収細胞に吸収され、母体抗体タンパク質を吸収した結果として新生児動物の抗原性が達成される。膵臓から種々の消化酵素、並びにインスリンやアルブミンのような他の大きい分子がかなりの速度で腸上皮を横断するという多様な証拠も存在する(参考文献を参照のこと)。実際、血漿アルブミンプール全体が毎日腸上皮を横切って漏れ出ている。タンパク質の浸透性は主として十二指腸及び末端回腸に見られるが、タンパク質は大腸下部から吸収されることも知られており、坐剤はこの目的で治療的に使用されている。タンパク質の腸吸収に関する考察については、例えば、リーボウ（Liebow）等1975年Science 189:472〜474;ゲッツェ（Goetze）等1975年Nature 257 :607〜609;ゲッツェ等1976年Lancet ii:494〜495;ゲッツェ等1978年Biochim ．Biophys．Acta 512:214〜220;ハインリッヒ（Heinrich）等1979年Klin Wochen scht 57:1295〜1297;レイク-ベーカー（Lake-Bakaar）等1980年Gut 21:580〜586 ;マーチン（Martin）等1957年Nature 199:815〜817;アバキアン（Avakian）等19 64年Clin．Pharmacol．Ther．5:712〜715;メゲル（Megel）等1964年Arch．Bioch em．Biophys．108:193〜199；アルパース（Alpers）等1967年J．Blol．Chem．24 2 :5617〜5622;カタヤマ（Katayama）等1972年Biochim．Biophys．Acta 288:172 〜180;カタヤマ等1972年Biochim．Biophys．Acta 288:181〜189;アーバン（Urba n）等1982年J．Pediatr．Gastroenterol．Nutr．1:267〜272：カタヤマ等1968年 Biochim． Biophys．Acta 167:613〜；モリヤ（Moriya）等1967年Chem．Phar．Bull．15:16 62〜1668;アンブラス（Ambrus）等1967年Clin．Pharmacol．Ther．8:362〜368; アルパース等1970年M．Gastroenterology 58:833〜842;ブランベル(Brambel，F. W.R.)1958年Biol．Rev．33:488〜;レブ（Lev）等1973年Gastroenterologia 65:6 0〜;ウォラー（Waller）等1972年Nature 177:608;ダンフォース（Danforth）等1 959年Endocrinology 65:118;及びワルシャウ（Warshaw）等1974年Gastroenterol ogia 66:987を参照のこと。腸で製造され血液中に分泌されるように標的化されるタンパク質には、ＣＣＫ(コレオシストキニン(choleocystokinin))、セクレチン、腸グルカゴン、血管作用性腸ペプチド(ＶＩＰ)、胃酸分泌抑制ペプチド(ＧＩＰ)、ソマトスタチン、神経ペプチドＹ(ＮＰＹ)、膵島アミロイドポリペプチド(ＩＡＰＰ)、ポリペプチドＹ(ＰＰＹ)、グルカゴン様ペプチドＩ（ＧＬＰＩ）、並びに脂質代謝に重要な種々のリポタンパク質が含まれる。問題のＤＮＡは、主として胃腸管へのタンパク質分泌を指令するか又は主として血流へのタンパク質分泌を指令する分泌シグナルを含むのが好ましい。分泌シグナルは、例えば、血流を標的とするタンパク質（例えば、インスリン）又は腸内腔を標的とするタンパク質（例えば、プロテアーゼ、種々の消化酵素、及びムチン）をコードするＤＮＡの部位指令変異誘発によって同定することができる。突然変異体は変異ＤＮＡを腸細胞内での発現、その後、例えば内腔：静脈内の発現比を測定することによってスクリーニングすることができる。または、静脈内指令分泌シグナルと腸内腔指令分泌シグナルとを、例えば、腸内腔指令タンパク質に挿入した推定上の静脈内分泌シグナルで構成されている組換えキメラタンパク質を構築することによって同定することもできる。次いで、静脈内分泌シグナルは血流中への内腔指令タンパク質の発現を再度指令する能力によって同定されよう。推定上の静脈内分泌シグナルと腸内腔分泌シグナルとはそれぞれ、血流又は胃腸管に優先的に分泌されるタンパク質のアミノ酸配列をＤＮＡと比較して同定することもできる。次いで、タンパク質間の相同性領域又は共通のモチーフを上記したようにして試験することができよう。問題のＤＮＡは、治療用タンパク質が融合タンパク質（例えば、Ｎ-末端にβ- ガラクトシダーゼ又はその一部及びＣ-末端部に治療用タンパク質を有する融合タンパク質）として発現されるように、構築物中に挿入することができる。融合タンパク質の産生は、タンパク質を発現する形質転換細胞の同定を促進することができる（例えば、融合タンパク質と結合している抗体を用いる酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって）。例えば、プロテアーゼ抵抗性であるか又は野生型タンパク質に比べて活性が高まっている改変形態の治療用タンパク質を産生することも望ましいと思われる。例えば、酵素を胃腸管に分泌すべき場合、そのタンパク質が消化プロテアーゼに抵抗性であるように修飾することが有益であると思われる。分泌されるタンパク質が腸細胞で利用できずプロセッシングを必要としている場合、正しいプロセッシングが可能になるようにタンパク質を修飾することができる。例えば、プロインスリンは、プロセッシングによって腸細胞でインスリンに成熟させ得るように修飾することができる。更に、治療用タンパク質がホルモンである場合、そのタンパク質の二量体又は多量体コンプレックス形成能力を改変することが望ましいと思われる。例えば、二量体化を防ぐように修飾されたインスリンは野生型、二量体インスリンに比べて作用開始が一層速い。問題のＤＮＡを含む構築物は、標的腸細胞ゲノムへの部位特異的組込みを提供するように設計することもできる。例えば、問題のＤＮＡ及びこれに機能的に結合したプロモーターの側部にサッカロミセスセレビシエTy3の部位特異的組込みマーカーがあるように、構築物を産生することができる。部位特異的組込み用の構築物は更に、組込みマーカーを認識する部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡを含んでいる。このような構築物は、Ty3レトロトランスポゾンと種々の動物レトロウイルスとの相同性を利用している。Ty3レトロトランスポゾンは、多数の異なるｔＲＮＡ遺伝子の５'フランキング領域に問題のＤＮＡを挿入するのを促進し、その結果、産生される組換え細胞に対して有害な影響を与えることなく、問題のＤＮＡの一層効率的な組込みを提供する。このような部位特異的構築物を作成する方法及び組成物は米国特許第5,292,662号に記載されており、この特許はこのような部位特異的挿入ベクターの構築及び使用に関して本明細書に参照として含まれる。腸細胞の形質転換による静脈内及び胃腸タンパク質治療本発明により形質転換した腸上皮細胞は、特に問題のＤＮＡが強力な真核生物プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＭＭＴＶプロモーター）と機能的に結合している場合、問題のＤＮＡの発現を促進し、かつ高いレベルで発現させることができる。次いで、発現したタンパク質は血流又は胃腸管に分泌される。かくして、このようにして発現し且つ分泌されたタンパク質は、多様な状態を有するホ乳類対象の処置に有用である。例えば、適当なタンパク質を胃腸管に分泌すると種々の疾病の予防又は制御に、例えば、小腸及び／又は大腸の慢性的感染（例えば、細菌又は真菌感染）の処置に;腸上皮の変性的疾患の処置に;腸吸収不良症候群（例えば、スプルー）の処置に;又は代償若しくは補充タンパク質療法として有用である。好ましい態様として、タンパク質は静脈内タンパク質治療に十分なレベルで血流中に分泌される。治療用タンパク質の血流レベルは、問題のＤＮＡの多数のコピーを標的細胞のゲノム内に組み込むことによって、並びに／又は強力なプロモーター（例えば、ＣＭＶから得られるプロモーター）及び／若しくはエンハンサー要素を構築物中の問題のＤＮＡと機能的に結合させることによって高めることができる。血流レベルは、対象の標的細胞数をより多く形質転換することによって高めることもできる。上記で考察したように、治療用タンパク質の分泌は、リーダー配列、アミノ酸配列モチーフ又は静脈内指令分泌に介在する他の要素を治療用タンパク質の配列中に組み込むことによって高めることもできる。本発明が、小腸の吸収上皮細胞及び／又は大腸の円柱上皮細胞の形質転換に関係している場合、腸インビボ遺伝子治療法は、これらの短期間生存上皮細胞の代謝速度が比較的速いため、ホ乳類対象による遺伝子産生物の発現は短期間である（例えば、短期間生存上皮細胞の平均寿命は約２日から４日であるので、約２日から３日であることができる）という更なる利点を提供する。本明細書で用いるとき「短期間」とは、所望の遺伝子産生物が２,３日から数日間（例えば、12時間から36時間のような短い期間;又は２日、３日若しくは４日まで、一般的には４日以下の期間）で胃腸管又は血流に送達されることを意味する。対象的に、本発明の文脈において本明細書で用いるとき「長期間」とは、腸でより長い寿命を有している細胞（即ち、それ程急速には代謝しない細胞、例えば幹細胞）が所望の遺伝子産生物を数週間から数カ月間発現することを意味する。かくして、少なくとも一部形質転換された細胞の型（例えば、吸収細胞又は幹細胞）がタンパク質の送達期間（例えば、それぞれ短期間又は長期間）を決定する。ホ乳類対象における短期間遺伝子産生物発現によって、宿主に送達される治療用遺伝子産生物の量を厳密に調整することができる。更に、本発明の遺伝子治療法は一般に、形質転換用核酸の非侵襲的な投与方法に係わっているので、投与を反復することによって所望の治療法を容易に達成することができる。ベクターを腸に投与することによって短期間と長期間の双方の効果を提供することができる。成熟吸収細胞を標的とする場合、その効果は短期間（２〜４日間）である。または、ベクターが絨毛基部の幹細胞を標的とする場合、長期間の効果が生起するであろう。かくして、本発明の方法を用いて、短期間及び長期間の双方の効果を達成することができる。本発明のインビボ遺伝子治療法を用いて達成される腸細胞形質転換の性質は、一時的又は安定的であることができる。「一時的形質転換」とは、成熟細胞及び／又は導入核酸の残存寿命用に導入された核酸が、細胞分割後の娘細胞に運ばれないことを意味する。対照的に、「安定的な形質転換」とは、核酸が複製され細胞分割後の娘細胞に運ばれることを意味する。一時的な形質転換は、医者が短期間の治療法、少量の治療用遺伝子産生物だけの投与、及び／又は投与を反復することによって投与量の力価を測定できることを望む場合、特に有益である。一般的に、形質転換の性質が所望の遺伝子産生物の送達期間、即ち、遺伝子産生物送達が短期間である（例えば、一時的な形質転換の２,３時間から２,３日間）のかそれとも長期間である（例えば、安定的な形質転換の数週間又は数カ月間）のかを、少なくとも部分的に、決定することができる。問題のタンパク質の治療レベルを達成するのに必要な形質転換した腸上皮細胞の実際の数は、達成される腸細胞の形質転換の性質(例えば、一時的又は安定的な形質転換)、発現すべきタンパク質、形質転換細胞によるタンパク質の発現レベル、タンパク質の分泌速度、治療用タンパク質の胃腸管と血流間の分配、及び処置すべき状態を含む数種の要因に従って変動するであろう。例えば、治療用タンパク質の所望の静脈内レベルは、正常な対象に存在するタンパク質レベルを決定する（タンパク質欠乏症を治療するため）ことによるか、又は所望の治療結果を達成するのに必要なタンパク質レベルを決定する（例えば、治療法が既に確立されているタンパク質、例えば、インスリン、ｈＧＨ等の有効治療量に関する情報を使用して）ことによって容易に計算することができる。形質転換細胞から得られるタンパク質の発現レベル及びタンパク質分泌速度は、インビボ動物モデルで（例えば、齧歯類モデル、例えば、ラット又はマウスで）容易に決定することができる。動物モデルでのタンパク質発現レベル及び分泌レベル並びに所望の治療用タンパク質の静脈内概算レベルが与えられると、所望のレベルを達成するために形質転換すべき細胞数は容易に計算することができ、それに従って遺伝子治療プロトコールを実施することができる。製剤腸細胞のインビボ形質転換用の核酸は、腸細胞表面への送達を促進するために様々な方法で製剤化することができる。製剤の形態（例えば、液体、固体、ピル、カプセル）及び組成は、使用される投与方法によって変動するであろう。例えば、製剤を経口投与する場合、核酸は錠剤、ピル、カプセル、溶液（例えば、ゲル、シロップ、スラリー又は懸濁液）、又は他の適当な形態として製剤化することができる。核酸が腸管内における直接置換によって送達される場合、核酸は坐剤（例えば、直腸投与用）又は内視鏡カテーテル法によって投与される溶液若しくは懸濁液として製剤化することができる。製剤はまた、標的とする腸部位によって変えることもできる。例えば、小腸に関係したヌクレアーゼ活性は、大腸に関係したものより大きい。それ故、小腸細胞を形質転換する製剤及び／又は所望の標的細胞に達する前に小腸を通過しなければならない経口投与製剤は、投与される核酸の分解を防止するために抗ヌクレアーゼ組成物を含むことができる。種々のタイプの製剤の調製方法及びこのような製剤の投与方法が当該技術分野で良く知られている（例えば、Remington's Ph armaceutical Sciences、Maack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストンを参照のこと）。さらなる成分によって核酸を標的腸細胞に送達するのを助長する場合、製剤は核酸に加えてこのような成分を含むことができる。問題のＤＮＡは、安定化化合物及び／又は生体適合性医薬担体、例えば、生理食塩液、緩衝化生理食塩液、デキストロース、又は水のような、さらなる成分と共に本発明の医薬組成物中に存在することができるが、これらの成分に限定されない。問題のＤＮＡは、単独又は他の治療剤（例えば、医薬品又はホルモン）を含む他の作用剤と組み合わせて投与することもできる。製剤はまた、例えば、標的細胞へのＤＮＡ送達及び標的細胞による取込みを促進するために有機及び無機化合物（例えば、界面活性剤、塩類、キレート化剤等）を含むこともできる。製剤を経口投与する場合、製剤は、緩衝化剤を含むか又は核酸を胃の酸性から保護し且つ／又は嚥下を促進するために被覆物を含有することができる。これに加えて又はこれに代わって、胃のｐＨがより弱い酸性であるか又はＨ2ブロッカー（例えば、シメチジン）若しくはプロトンポンプインヒビター（例えば、PROL ISEC^TM）のようなＨＣＬ分泌インヒビターが投与されているとき、経口製剤は、消化と消化の間（食間又は就寝時）に投与することができる。製剤はまた、標的腸細胞の表面に達したとき核酸を放出するように設計された時間放出カプセルを含有することもできる。例えば、時間放出製剤は、核酸を腸内部の特定の位置に送達するように（例えば、小腸細胞の形質転換用の核酸（腸に入った後すぐに放出される核酸）を送達するために）、又は腸管の下部細胞（例えば大腸の細胞）を形質転換するために設計することができる。製剤はまた、特定の領域（例えば、激しい蠕動のない）に徐々に放出できるように設計することもできる。製剤はまた、標的腸細胞の形質転換に利用できる無傷核酸の量を高めるためにヌクレアーゼインヒビターを含有することもできる。問題のＤＮＡを、ＤＮＡ−又はＲＮＡ−リポソーム複合体製剤として処方することができる。このような複合体は脂質混合物を含有し、これらの脂質混合物は遺伝子材料（ＤＮＡ又はＲＮＡ）と結合して、遺伝子材料を細胞に送達できるようにする疎水性コアや親水性被覆物を提供する。本発明で用いることができるリポソームには、ＤＯＰＥ(ジオレイルホスファチジルエタノールアミン)、ＣＵＤＭＥＤＡ（N-(5-コレストラム-3-β-オール3-ウレタニル)-N',N'-ジメチルエチレンジアミン）が含まれる。来国特許第5,527,928号並びにＰＣＴ公開第WO 96 /10555号及び第WO 97/11935号（これらは下記作用剤の製造及び使用のために本明細書に参照として含まれる）に記載されているカチオン性輸送試薬及び多機能カチオン性サイトフェクチン（cytofectins）を使用することが特に重要である。リポソームを使用して問題のＤＮＡを導入するとき、先ず動物モデル（例えば、ホ乳動物モデル、好ましくはラット又はマウス）でＤＮＡ：脂質比率の最適値及びＤＮＡと脂質との絶対濃度を、形質転換すべき細胞の特定の型について細胞死と形質転換効率の関数として決定することが好ましい。次に、これらの値を他の対象（例えば、ヒト対象）で使用するか又は使用するために外挿することができる。他の製剤を本発明に従って使用することもできる。このような製剤には、宿主細胞の生物学的特性を変える目的で宿主細胞への送達を促進する担体分子（例えば、抗体又はレセプターリガンド）と結合したＤＮＡ又はＲＮＡが含まれる。「化学的修飾」という用語は、例えば、核酸化合物を担体分子、例えばタンパク質若しくは脂質又はこれらの誘導体と結合できるように核酸を修飾することを意味する。代表的なタンパク質担体分子には、標的とする腸細胞又はレセプターリガンドの細胞に特異的な抗体、即ち標的とする腸細胞の細胞と結合したレセプターと相互作用し得る分子が含まれる。ある態様として、製剤は主としてネイキッドＤＮＡ（例えば、ウイルスベクター内に含まれていないＤＮＡ）で構成されるか、及び／又は界面活性剤（例えばイオン性及び非イオン性界面活性剤、例えばポリブレン等）若しくは粘液破壊剤（例えば、N-アセチルシステイン、ジチオスレイトール及びペプシン）を実質的に含有していない。更に、本発明による腸細胞形質転換用の製剤は、増殖強化因子(例えば、急速には分割しない細胞内への核酸の取り込みを高める因子)、例えば表皮増殖因子、血管形成因子、インスリン様増殖因子-１、インスリン様増殖因子-２、形質転換用増殖因子-α、ガストリン、メトトレキセート、フルオロウラシル、フロキシウリジン及びアラビノシド-Ｃを実質的に含まないことができる。製剤ば、好ましくは腸の標的上皮細胞、更に好ましくは小腸の吸収細胞及び／又は大腸の円柱上皮細胞を標的とするように調製される。腸幹細胞は、特に、短期間治療が望ましい場合、本発明による形質転換の好ましい標的ではない。投与及び腸細胞のインビボ形質転換問題のＤＮＡの胃腸投与は、当該技術分野で良く知られている多様な方法によって達成することができる。一般に、本発明に関連した有用な方法は、問題の治療用遺伝子産生物をコードする核酸を含有する製剤に対して腸の標的細胞（例えば、腸上皮細胞、詳細には小腸又は大腸の上皮細胞）を暴露することに係わっている。このような方法には、核酸の経口投与及び、例えば、坐剤、内視鏡又はカテーテルを使用した腸内腔への直接投与が含まれるがこれらに限定されない。核酸は、対象に対して経口的に投与されるのが好ましい。十分な数の標的腸細胞を形質転換し治療タンパク質レベルの発現を提供するＤＮＡの量は、動物モデルにおけるインビボ形質転換効率、インビボ動物モデルで達成されたタンパク質の発現レベル、及び標的腸細胞の形質転換され易さのような要素に基づいて容易に決定することができる。例えば、標的腸細胞が小腸上皮細胞であり且つ核酸がネイキッドＤＮＡとして経口的に投与される場合、標的小腸上皮細胞を形質転換するのに有効なＤＮＡ濃度を提供し且つ血液又は胃腸管のどちらかで治療タンパク質値を提供するために、ネイキッドＤＮＡは小腸に到達するのに十分な濃度で投与される。一般に、核酸は、使用される製剤に依存して約１mgから１ｇ、一般的には約100mgから約１ｇまでの範囲で投与される。一般に、ヒトの投与量は、ラット又はマウスモデルで有効な投与量の約200倍である。例えば、今日までのところ、動物モデル（ラット）における最も有効な投与量は約32μｇから約64μｇまでである。かくして、ヒトで予想される有効投与量は約６mgから約12mgまでである。製剤は、所望のタンパク質の所望の発現レベル及び／又は所望の治療期間に依存して、例えば、１日数回、毎日又は週に数回投与することができる。タンパク質治療の評価本発明の送達系は、投与が望まれる治療用遺伝子産生物、特にタンパク質に関連して使用することができる。この送達系は静脈内治療の有効性が未だ試験されていないタンパク質と共に使用することができるが、この送達系は有効性が良好に確立されているタンパク質又は他の遺伝子産生物（例えば、ｈＧＨ、インスリン等）をコードするＤＮＡと共に使用することもできる。更に、以下の実施例が与えられると、通常の技側を有する技術者は、この送達系によって問題のＤＮＡを送達した後にインスリンやｈＧＨが動物モデルの血流に効率的に提供されるので、他のタンパク質も特許請求された送達系を使用して容易に送達できると容易に決定することができる。この特許請求された発明の送達系は、広範な治療用遺伝子産生物に関連して使用できるので、問題のＤＮＡによってコードされる遺伝子産生物の発現効果を多様な方法でモニターすることができる。一般的に、対象から得られる血液サンプル又は腸粘膜分泌サンプルを治療用タンパク質の存在についてアッセイすることができる。このようなサンプル中で問題のタンパク質を検出するのに適当なアッセイは当該技術分野で良く知られている。例えば、腸細胞遺伝子治療が静脈内タンパク質治療を達成するために実施されている場合、血液サンプルは、ＥＬＩＳＡアッセイで治療用タンパク質と特異的に結合する抗体を使用してタンパク質の存在について試験することができる。このアッセイは定性的又は定量的に実施することができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、並びにサンプル中のタンパク質を検出する他の免疫学的アッセイは、Antibodies:A Laboratory Manual（1988年、Harlow 及びLane編集、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）中に記載されている。これに代わって、又はこれに加えて、タンパク質治療の有効性は、治療用タンパク質に関連した活性（例えば、酵素活性）について、血液又は腸分泌サンプルを試験して評価することができる。例えば、治療用タンパク質が抗菌活性を有している場合、試験サンプルによる細菌増殖阻止能力を試験して治療法の有効性を試験することができる。更に、腸細胞遺伝子治療の有効性は、改善についてホ乳類対象の状態をモニターして評価することができる。例えば、治療用タンパク質がエリスロポエチンである場合、対象の血液は、貧血に関連した鉄分含有量又は他のパラメーターについて試験する。治療用タンパク質がインスリンである場合、治療法の有効性はホ乳類対象の血中グルコース値を試験するか又はインスリンを測定して（例えば、ヒトインスリンラジオイムノアッセイキット、Linco Resear ch Inc.、ミズーリー州セントルイス、を使用して）評価することができる。実施例以下の実施例は、当業界の通常の技量を有する者に、本発明をどのように実施するのかに関する完全な開示及び説明を提供するために記載するものであって、本発明者が発明と考える範囲を限定するように意図したものではない。使用した数字（例えば、量、温度等）に関して正確を期すように努力したが、実験誤差及び逸脱によるものが存在しよう。他に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。実施例１：腸細胞形質転換用ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を発現するベクターの構築ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現用の４つの構築物は、当該技術分野で良く知られている技術（例えば、Sambrook等、同上参照）を使用して調製した。第１の構築物、ｐＦＧＨは、市販入手可能なベクターpBLUESCRIPT SK+(登録商標)(Stra tagene、カリフォルニア州ラジョラ)にゲノムｈＧＨＤＮＡ配列が挿入されている(図２)。このｈＧＨコード化配列はプロモーターと結合していないので、このベクターはｈＧＨを全く又はほんの低いレベルでしか発現しない。かくして、このｐＦＧＨ構築物は、腸におけるｈＧＨ発現のネガティブ・コントロール(negat ive control)として使用する。第２の構築物、ｐＦＧＨ.ＣＭＶは、ｐＦＧＨベクターのゲノムｈＧＨ配列の上流にヒトＣＭＶの前初期遺伝子から得られるプロモーターを機能的に挿入することによって構築した(図３)。第３の構築物、ｐＦＧＨ.chymoは、ｐＦＧＨベクターのゲノムｈＧＨ配列の上流にラットキモトリプシンＢ遺伝子プロモーターを機能的に挿入することによって構築した(図４)。第４の構築物、ｐＦＧＨ.ＲＳＶは、ｐＦＧＨベクターのゲノムｈＧＨ配列の上流にＲＳＶの末端反復配列（ＬＴＲ）から得られるプロモーターを機能的に挿入することによって構築した。実施例２:腸内腔へのネイキッドＤＮＡの導入によるヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡのインビボ遺伝子導入ｐＦＧＨ.ＣＭＶを使用して、約300ｇの成熟ラットの腸上皮を形質転換した（ｐＦＧＨ.ＣＭＶ 10匹のラット;リポフェクチンを有するｐＦＧＨ.ＣＭＶ、４匹のラット;ポリカチオン性デンドリマーを有するｐＦＧＨ.ＣＭＶ、４匹のラット ;ネガティブ・コントロール（ＰＢＳ）、１匹のラット;及びネガティブ・コントロール（手術せず）、８匹のラット）。ラットをペントバルビタールで麻酔した。開腹術を実施し、上部十二指腸又は末端回腸を確認した。腸を５cm長さで結紮し、少量の静脈血分別物を得、ｐＦＧＨ.ＣＭＶを含むリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）400μｌ、又はＰＢＳ単独400 μｌ（ネガティブ・コントロールの１番）を腸に徐々に注射するか又は注入し、適所に15分間放置した。使用した溶液の量によって腸が僅かに膨張する。ベクター含有溶液は、ＰＢＳ400μｌ当たりＤＮＡ20〜200μｇ;６％リポフェクチン（形質転換効率を高めるために使用されるカチオン脂質）を有するＰＢＳ400μｌ当たりＤＮＡ32μｇ;又はデンドリマー128μｇを有するＰＢＳ中100μｌ当たりＤＮＡ32μｇで構成されていた。次に、弾性の紐を除去し、腸を正常な位置に戻し、腹部を縫合材で閉じた。手術後の回復は満足できるものであり、病気の徴候又は症状はその後の48時間に亘って認められなかった。剖検で、腸は全ての点で正常に見えた。このトランスフェクション法で、腸細胞の約５〜10％にベクターが直接接近する。 24時間後に、ペントバルビタールでラットを再度麻酔し、組織を摘出し、そして屠殺前に血液サンプルを採取した。トランスフェクション前後の血液サンプルを調製し、各サンプルでイムノアッセイを使用して成長ホルモンをｈＧＨについて測定した。血清サンプル中のｈＧＨ値は、合わせたサンプルを３回洗浄してガンマ計数前に新しい管に入れたことを除いて、ｈＧＨラジオイムーンアッセイ（ Nichols Institute）を使用して測定した。各アッセイは３回重複して実施し、１組のコントロールサンプルと比較した。ｐＦＧＨ.ＣＭＶベクターだけ（ネイキッドＤＮＡ）を投与したラットは、ＤＮＡを投与しなかったラットのバックグラウンドｈＧＨ交差反応性値と比較して、より高いｈＧＨ値を全身及び門脈血サンプル中で示した(図５)。リポフェクチンを追加しても形質転換効率は高くならず(血液サンプル中のｈＧＨの存在で測定して)、むしろネイキッドＤＮＡの使用と比べて形質転換効率は顕著に低下した。同様に、ＤＮＡとデンドリマーを投与したラットの形質転換効率はネイキッドＤＮＡ単独の使用と比べて低下した。かくして、単純なＰＢＳ溶液にｈＧＨをコードするネイキッドＤＮＡを投与すると、腸細胞の形質転換が成功裏にもたらされるだけでなく、リポフェクチン又はデンドリマーを含有する製剤中の同じ構築物の投与よりも、効率的な腸細胞形質転換及びその後の静脈内分泌がもたらされた。更に、十二指腸及び回腸投与後の血漿値も同様に上昇し、腸細胞の形質転換がこれら２つの部位で類似した効率レベルで達成されたことを示した。実施例３:腸細胞形質転換用ヒトインスリン（hIns）を発現するベクターの構築ヒトインスリン及びヒトインスリン変異体発現用の２つのベクター構築物は、当該技術分野で良く知られている技術（例えば、Sambrook等、同上参照）を使用して調製した。第１の構築物、ｐＢＡＴ14.hinsは、市販で入手可能なベクターp BLUESCRIPT SK+(商標)(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ)にヒトインスリンをコードするｃＤＮＡ配列が挿入されている(図６Ａ)。このヒトインスリンコード化配列はヒトＣＭＶの前初期遺伝子から得られるプロモーターと機能的に結合しており、このプロモーターはヒトβ-グロビンの最初のイントロンとヒトインスリンコード化ｃＤＮＡ配列の上流に位置している。第２の構築物、ｐＢＡＴ 16.hinsＧ1.M2は、ヒトインスリンの変異体をコードするヌクレオチド配列の上流にＣＭＶプロモーターを機能的に結合することによって構築した(図６Ｂ)。ヒトインスリン変異体での突然変異によって、非内分泌細胞でも適当なプロセッシングが可能になるように、ペプチドＣとＡの間の第２のプロテアーゼ部位がフリン認識部位に変わっている。実施例４:腸内腔へのネイキッドＤＮＡの導入によるヒトインスリンをコードするＤＮＡのインビボ遺伝子導入ストレプトゾトシンを50mg／kg静脈内注射してラットに実験的糖尿病を誘発させた。ストレプトゾトシン処置によって注射後24時間以内に高い血糖値が生じる。ストレプトゾトシン注射後直ちに、ラットをペントバルビタールで麻酔し、上記のように開腹術を実施した。材料（ＰＢＳ単独か、インスリンベクターｐＢＡＴ16.hInsＧ1.Ｍ2を有するＰＢＳのどちらか）１mlを、ストレプトゾトシン処置動物とコントロール動物の両方の幽門接合部のすぐ下の十二指腸に点滴した。材料は主としてネイキッドＤＮＡで構成されていた。リポフェクチン、デンドリマー又は細胞へのＤＮＡ導入を高める他の材料は使用しなかった。次に、腹部を縫合材で閉じた。コントロール染料測定によって、約１時間に亘ってこの材料が大部分十二指腸上部に残っていることが示された。手術後の回復は満足できるものであり、病気の徴候又は症状はその後の48時間に亘って観察されなかった。剖検で、腸は全ての点で正常に見えた。手術直前及び処置後24時間毎に血液サンプルを取得した。非処置ラットの正常な血中グルコース値を示すために、処置を受けなかった（手術又はストレプトゾトシン処置無し）ラットをネガティブ・コントロールとして使用した。結果を図７に示す。ストレプトゾトシン誘発糖尿病は、処置後約48時間の間インスリンベクター処置ラットで好転し、血中グルコースは正常又はほぼ正常値に維持された。これらのデータは、ラットの腸細胞がヒトインスリンをコードするベクターで首尾良く形質転換され、ヒトインスリンが発現され且つ血流に分泌され、ヒトインスリンがストレプトゾトシン処置ラットの糖尿病症候群を首尾良く抑制したことを示している。更に、ベクターがもはや有効でなくなったとき(約48時間後)、ストレプトゾトシン処置ラットで糖尿病が再発した。実施例５:腸内腔へのネイキッドＤＮＡの反復送達によるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードするＤＮＡのインビボ遺伝子導入試験動物に投与するために、ｐＦＧＨ構築物（図４）及びｐＦＧＨ.ＣＭＶ（図５）を調製した。プラスミドのコード化領域がｈＧＨではなくて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ;Clontech、カリフォルニア州）をコードしていることを除いてｐＦＧＨ.ＣＭＶと同一の構築物ｐＧＦＰ.ＣＭＶ.Ｎ2.ＣＭＶをコントロールとして使用した。雄スプラーグ・ドゥリーラット、260g〜280gには、手術前に一夜絶食させた（水は自由に与えた）ときを除いて、いつもラブチャウ（lab chow）のバランスのとれた食事を与えた。動物をペントバルビタール（50mg／体重kg）で麻酔し、十二指腸に内在ポリエチレンカテーテルを入れた。カテーテルは横隔膜の下の近位体壁から挿入し、そして肋骨ケージを越えて耳のちょうど後で耳の間の点まで皮下をたどらせた。ここでカテーテルは皮膚を通過させ３本の結紮糸で固定した。カテーテルの外部末端は取り外し可能な気密プラグで蓋をした。最初のＤＮＡ投与前２日間、動物を休息させた。０日に、カテーテルに注入したリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）1.6ml中のＤＮＡ32μｇを各動物に投与した。32マイクログラムのｐＦＧＨ.ＣＭＶ又はｐＦＯＸＧＦＰ.Ｎ2.ＣＭＶ（コントロール）のどちらかを32μｇ、覚醒ラットの内在カテーテルに毎日注入して経口投与を模擬した。コントロール動物には等量のコントロールプラスミドを投与した。血流へのｈＧＨ送達を評価するために、朝遅くに血液を心臓穿刺によって取り出し、血漿を12,000×ｇで15分間沈降させて調製した。ｈＧＨについてアッセイする前に上清液を−80℃で保存した。ヒト特異的な被覆ビーズ法（Nichols Inst itute、カリフォルニア州サンジュアンカピストラノ）を使用してｈＧＨをイムノアッセイで測定した。図11はｈＧＨコード化ＤＮＡの反復投与の効果を示す。血漿ｈＧＨレベルは24 時間後にバックグラウンド以上に上昇し、試験期間中上昇したまま維持された。これらのデータは、本発明の遺伝子に基づくタンパク質送達系を使用すると、反復投与によってタンパク質送達が長時間維持され得ることを証明している。実施例６:ネイキッドＤＮＡ投与後の形質転換腸上皮細胞の同定及び特徴決定本発明の方法を使用して形質転換される腸細胞の型、及び形質転換用構築物によってコードされるタンパク質の発現を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする構築物のインビボ投与後に、ラット腸細胞におけるＧＦＰの発現を検査して測定する。ＰＢＳ単独（ネガティブ・コントロール）又はＧＦＰコード化ベクターｐＦＯＸＥＧＦＰ.Ｎ2.ＣＭＶ（図８：German及びWang 1994年Mol．Cell．B lol．14:4067も参照のこと）を有するＰＢＳのいずれかを1ml実施例４に記載したようにして、ラットの幽門接合部のすぐ下の十二指腸に点滴する。次に、腹部を縫合材で閉じる。処置後24時間目に、組織サンプルをラットの腸から取得して 1.5％グルタルアルデヒド中で固定し、冷凍切片を調製する。蛍光顕微鏡を使用して切片中でＧＦＰの発現を検出し、ＧＦＰを発現している細胞の数及び型を測定する。実施例７:ネイキッドＤＮＡを使用するヒトにおける経口遺伝子治療問題のＤＮＡは当該技術分野で良く知られている方法に従ってカプセル（「遺伝子ピル」）として製剤化する。このカプセルは、問題のＤＮＡを約100mgから1 000mg含有する。このカプセルは、リポソーム、ウイルス取込み要素、ＤＮアーゼインヒビター、及び／又は種々の腸被覆物を更に含むことができる。好ましくは、カプセルは主としてネイキッドＤＮＡ（即ち、ウイルス取込み要素、デンドリマー、リポフェクチン又は細胞取込みを高めるために従来の製剤で使用される他の成分若しくは作用剤を有していないＤＮＡ）で構成され、ＤＮアーゼ又は胃腸管を移動して所望の腸細胞に到達する間に生じる可能性のある分解若しくは損傷に対してＤＮＡを保護する成分を更に含むことができる。上記のピルを、ピル内のＤＮＡによってコードされるタンパク質の十分な発現レベルを達成するように、ヒト患者に投与する。ピルは、所望のタンパク質の所望の発現レベル及び／又は所望の治療期間に依存して、例えば、１日数回、毎日又は週に数回投与することができる。治療法は、例えば、忠者の血流中に存在するタンパク質レベルを検査する（タンパク質が血流中に分泌される場合）か又は患者の状態の改善若しくは安定化についてモニターして評価することができる。実施例８:坐剤にネイキッドＤＮＡを使用する腸細胞遺伝子治療問題のＤＮＡは当該技術分野で良く知られている方法に従って坐剤として製剤化する。この坐剤は問題のＤＮＡを約100mgから1000mg含有する。この坐剤は、リポソーム、ウイルス取込み要素、ＤＮアーゼインヒビター及び／又は種々の腸被覆物を更に含むことができる。好ましくは、坐剤は主としてネイキッドＤＮＡ（即ち、ウイルス取込み要素、デンドリマー、リポフェクチン又は細胞取込み高めるために従来の製剤で使用される他の成分若しくは作用剤を有していないＤＮＡ）で構成され、ＤＮアーゼ又は胃腸管を移動して所望の腸細胞に到達する間に生じる可能性のある分解若しくは損傷に対してＤＮＡを保護する成分を更に含むことができる。上記坐剤を、坐剤内のＤＮＡによってコードされるタンパク質の十分な発現レベルを達成するように、ヒト患者に投与する。坐剤は、所望のタンパク質の所望の発現レベル及び／又は所望の治療期間に依存して、例えば、１日数回、毎日又は週に数回投与することができる。治療法は、例えば、患者の血流中に存在するタンパク質レベルを検査する（タンパク質が血流中に分泌される場合）か又は患者の状態の改善若しくは安定化についてモニターして評価することができる。上記した方法に類似する方法に従って、本発明による遺伝子導入によって腸上皮細胞のゲノム内に挿入されたＤＮＡから他の治療用タンパク質を発現させることができる。本発明が今や十分に説明されているので、添付の請求の範囲の精神又は範囲から離れることなく、多くの変更や修正をなし得ることは当該技術分野で通常の技個を有する者にとって明白であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｋ 37/24 31/04 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ゴールドファイン、アイラ、ディー. アメリカ合衆国 94904 カリフォルニア州ケントフィールドグッドヒルロード 640 (72)発明者ロスマン、スティーヴン、エス. アメリカ合衆国 94708 カリフォルニア州バークリーアカシアアベニュー 98

Claims

【特許請求の範囲】 1．対象の血流に治療用遺伝子産生物を送達する方法であって、該方法は、タンパク質をコードする核酸分子とこれに機能的に結合した真核生物プロモーター（promoting）配列とを含有する構築物を、前記配列がホ乳類患者が必要としているタンパク質を発現し且つ該タンパク質が腸細胞から分泌されるように、前記構築物で前記腸細胞の遺伝子形質転換を生じさせる態様でホ乳類患者の胃腸管に投与し；かつ前記の遺伝子的に形質転換された細胞が治療上有効量のタンパク質を発現できるようにし、それによって患者を治療することを有する、上記方法。 2．前記腸細胞が小腸の吸収細胞である請求項３記載の方法。 3．前記腸細胞が大腸の円柱上皮細胞である請求項１記載の方法。 4．前記タンパク質が血流に分泌される請求項１記載の方法。 5．前記タンパク質が胃腸管に分泌される請求項１記載の方法。 6．前記核酸がネイキッド核酸として投与される請求項１記載の方法。 7．前記投与が経口投与である請求項１記載の方法。 8．前記ホ乳類患者における治療用タンパク質の発現が約２日から３日の期間である請求項１記載の方法。 9．インビボで腸上皮細胞を形質転換する方法であって、該方法は、タンパク質をコードする核酸分子とこれに機能的に結合した真核生物プロモーター配列とを含有する構築物をホ乳類対象の胃腸管に導入し、この導入によって遺伝子改変腸細胞が生じ、かつ前記配列が前記患者が必要としているタンパク質を発現し且つ該タンパク質が前記細胞から分泌されることを有する、上記方法。 10.前記タンパク質が血流に分泌される請求項９記載の方法。 11.治療用遺伝子産生物をコードする核酸分子とこれに機能的に結合した真核生物プロモーター配列とを含有する構築物；及び前記構築物で腸細胞の遺伝子形質転換を生じさせる態様で該構築物をホ乳類対象の胃腸管に導入する手段を有する治療用遺伝子産生物の送達系であって、前記構築物を前記胃腸管に導入することによって、前記核酸による腸上皮細胞の形質転換、コードされた治療用遺伝子産生物の発現及び送達が生じる、治療用遺伝子産生物の送達系。 12.前記遺伝子産生物がタンパク質でありかつ該タンパク質がホ乳類対象の胃腸管又は血流に分泌される請求項11記載の系。 13.前記形質転換細胞が小腸の吸収細胞または大腸の円柱上皮細胞である請求項 11記載の系。 14.ホ乳類患者の胃腸管への投与に適している医薬組成物であって、該組成物が問題のＤＮＡをコードするＤＮＡ構築物を含有し、かつ該構築物がホ乳類患者の腸細胞内で治療用タンパク質を発現するのに適している、上記医薬組成物。 15.前記製剤がリポフェクチン、デンドリマー及びウイルス成分を実質的に含有していない請求項14記載の医薬組成物。 16.前記組成物が経口投与用に製剤化されている請求項14記載の医薬組成物。 17.前記組成物が直腸を通って胃腸管に直接挿入するように製剤化されている請求項14記載の医薬組成物。