JPH04504055A - 振動測定法による生きた微生物の検出及び／又は同定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 振動測定法による生きた微生物の検出及び／又は同定方法本願発明の主題は、振 動測定法による生きた微生物の検出及び同定、又は検出あるいは同定方法である 。

より正確には、本願発明は、振動測定法により、基質内に含まれる生きた微生物 を遠隔にて検出及び／又は同定するための迅速かつ自動的な方法に関する。

本願発明において、振動測定法は圧力波の学問を意味すると理解されたい。

媒質内の生きた微生物の検出及び／又は同定を行うことは、微生物の生理学上の 状態及び生理病理学上の状態を知ることが可能となる。このような分析は、通常 行なわれることであり、特に病原の状態の検出に関する医療分野及び汚染の可能 性のある食料品の範囲を決定することに使用される。

現在、この種の分析は、試料を取ってきた後、当該試料（原文引用）に含まれる 微生物の同定を行った後、該微生物を培養するか、あるいは生化学的な定性分析 を行う。この方法は、通常、直ちに結果が必要ではない場合に使用される。実際 、これらの方法は潜伏期、洗浄等の幾つかの段階を含んでいる。

それゆえに、このような分析方法は、分析に長時間を要し、さらに熟練者を必要 とする。

例えば分光測定及びドツプラー測定（ｄｏｐｐｌｅｒｏｍｅｔｒｙ）によって、 微生物の運動の直接光観察により媒質内の微生物の運動を研究することで微生物 の検出あるいは同定を行うことを含む提案がなされている。欧州特許１７９’２ ７０及びドイツ国特許８８８５９３．３０３９ｇ２５は、特にこの目的のために 引用可能である。

媒質内に含まれる生きた微生物を振動測定法によって迅速に検出及び／又は同定 を行う方法が見出され、この方法は、少なくとも一つの超高感度なセンサを使用 し、上記媒質内の微生物が発する微小な振幅の音響信号をとらえ、上記音響信号 と基準信号とを比較することによる。

本願発明によれば、“音響信号を発する”ということは、上記微生物によって発 生する圧電機緘的な（ｐｉｅｚｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ）すべての現象を意味す ると理解し、上記音響信号は上記現象を伝える基質内で伝達される。

本願発明の方法によれば、上記音響信号は微生物に接触することなく微生物を含 む基質内で、例えば上記基質の表面にてとらえられることが示されている。

本発明の目的のため、微少な音圧を検出可能なすべてのセンサ及び変換器が使用 可能であり、好ましくは約２ＸｌＯ−’Ｐａ以下の音圧を検出可能な、例えば圧 電センサ、ダイナミックセンサ、静電センサ、容量センサ、トンネル効果センサ 、干渉センサのようなセンサが使用可能である。

本願発明によれば、レーザ型干渉センサが有効に使用可能である。

本願発明について、上記レーザ型干渉センサを例とし詳細に説明するが、実施例 のみの方法に限定されるものではない。

本願発明の方法は、 （ａ）検査される試料の基質上にレーザビームを向け、（ｂ）数μｍが有効であ るが、微生物から一定距離離れた場所に位置する箇所にて基質によって反射され るレーザビームのスペクトルを分析し、 （ｃ）あるいは上記反射ビームのスペクトルと基準スペクトルとを比較する、 段階を備えている。

最低０．０２％のアルベドを有する基質を使用するのが有効である。

基質のアルベドが十分でない場合、例えば０．０２％以下である場合、基質を介 して微生物に音響的に接続されたデバイスが検査される試料とレーザビームとの 間に有効に置かれる。該デバイスは上記基質の振動を伝送可能なように十分薄い 厚さを有する反射物質筒であることが有益である。

好ましくは、ｌないし５μｍ間の厚さを有し、より好ましくは２μｍ厚である金 箔が使用できる。

本明細書及び特許請求の範囲における“生きた微生物”という語は、発育し、通 常繁殖する、小さく、代謝的に活性で、動物性あるいは植物性の、単一物あるい は複合物の、生まれる可能性のある生物学上のすべての実在物を意味する。

微生物の例として特に、単細胞あるいは複合細胞集合はもちろん、バクテリア、 放線菌、かび、酵母菌、ウィルス、ファージ、マイクプラズマ属、リケッチア、 真核細胞、原核細胞、ＤＮＡ％ＲＮＡ片断、線虫類及び原生動物がある。

実際、驚くべきことに、生きた微生物は振動微放出体（ｍｉｃｒｏ−ｅｍｉｔｔ ｅｒｓ　ｏｆ　ｖｉｂｒａｔｉｏｎｓ）のような振舞いをすることが観察されて いる。まるで微生物内で生じる生化学的な反応が細胞構造をふるわす熱−音響現 象の原因であるかのように、すべてが起こるように思われる。さらに微生物によ って放出される音響信号は、該当の種、微生物の生理学上及び生理病理学上の状 態、並びに微生物が発生する媒質で広まる生理−化学的状態に特有のものである 。

本願発明において、“試料”の語は、微生物を含むことが可能な複数の基質を示 す。そのような試料の例として特に、血液、尿、精液、生物片断、あるいは生検 のような生物上の媒体、及び牛乳、果物ジュース、保存液、食物等のような食料 媒体がある。

上記方法は、固体から粘着性濃度までの試料、固体から液体濃度までの試料、粉 末状の試料にて実行可能である。

粉末試料において、最高の音響をとらえるために例えば水中のような好ましい媒 体内に上記試料を位置させる必要がある。

検査される試料上に向けられるレーザビームは、従来のヘテロダインレーザ干渉 計によって放射される。

光干渉計は、２つの光ビーム、即ち検査される目標物によって反射されるーのビ ームと、位相基準を生成するための他のビームとを混合することで動作する。上 記二つのビームが同じ周波数を有するとき、上記干渉計はホモダイン干渉計であ る。これに対し、基準ビームの周波数が目標物からのビームの周波数と異なると き、干渉計はヘテロダイン干渉計と呼ばれる。

ヘテロダイン干渉計において、微少な周波数差Δωは、２つの音響−光変調器に より、干渉する２つのビームにおける光周波数Ωｌ及びΩ２間で導かれる。基準 ビームと目標によって反射されたビームとの間の干渉により得られる上記周波数 差は、うなり周波数Δωに対応した光強度に変調され、この光は光検出器によっ て検出される。光路長、即ち目標ビームの位相が目標物の運動によって一部変更 され、そしてうなり周波数の位相の変化に直接変換される。

光の位相における変化が光強度の変化へ変換さ、れず、ホモダイン干渉計にて見 られるように、上記うなり周波数における信号の位相変化に変換されるので、ヘ テロダイン干渉計の直線性は、振動の小さい変化に限定されない。

この方法にて、ヘテロダイン干渉計は非常に小さい振動を検出することが可能で ある。

本発明の目的のために適しているレーザ干渉計は、以下に示す有益な性質を有す る。

（１）極めて微細な大きさに適合する細いビーム、（２）振動部分の十分なアル ベド、 （３）少なくとも１０−１１メートルの検出振幅、（４）１００Ｈｚから３００ ＭＨｚまでの広いスペクトル幅、（５）全スペクトルにわたる直線性、 （６）低周波数に比較的影響を受けない感度、（７）生物への応用に適した熱出 力。

ヘテロゲイン干渉計は、特に、Ｂ、　ＣＲＥＴＴＮ及びその他の者による、 ’０ｐｔｉｃ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｖｏｌ、６５、Ｎｏ、３．１９ ８８．　Ｐ、ｌ５７−１６２″：Ｊ、Ｆ、　ＷＩＬＬＥＭＩＮ及びその他の者に よる、”Ｊ、Ａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｓｏｃ、　Ａｓ、、８３（２）、１９８ｇ、　 Ｐ、７ｇ？−７９５’；　５ｉｅｔｓｅ　ＭＪＡＮ　ＮＥＴＴＥＮによる”Ｊ、 Ａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｓ。

ｃ、　Ａｓ、、８３（４）、１９８ｇ、　Ｐ、１６６７−１６７４”：　Ｍ、Ａ 、　Ｎ０ＫＥＳによる　”Ｒｅｖ、　Ｓｃｉ。

ｌｎｓｔｒｕｍ　、、４９（６）、１９７ｇ、Ｐ、７２３−７２８”　に記述さ れている。

これらの論文には、ヘテロダイン干渉計が、魚眼の振動やコルティ器官あるいは 巨大軸索ドライ（ｔｈｅ　ｇｉａｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｘｏｎ　ｄｒｙＸ原文 引用）における繊毛のような生物組織のように、極めて微細な目標物におけるナ ノメートルオーダの振動的な運動を測定するために適していることが示されてい る。

しかしながら、ヘテロダイン干渉計は、微生物が発する音響信号の検出に使用可 能なことについては提案されていない。即ち、ヘテロゲイン干渉計を上記音響信 号の検出に使用することは、従来の分析技術と比較して、特に分析速度の点及び 従来の分析に要する複数の段階を無くすこと等においてかなり有益である。

本発明の方法を具現化するための装置は、レーザ干渉計、３軸に沿って移動可能 な支持部によって構成される試料保持器、及び検査される試料によって反射され たビームを分析する分析器から構成される。

以下に示す添付した図面を参照し、本発明についてさらに詳しく説明する。

図１は、本発明の方法を具現化するための装置を図式にて示した図であり、図２ は以下に述べる実施例１及び３によって検査される試料により放出されるスペク トルの記録を示す。

干渉計１は、Ｈｅ−Ｎｅレーザ源１（原文引用）、周波数Ω２の基準ビーム（Ｒ Ｂ）及び検査される試料（ＯＢ）方向へ向けられる周波数Ωｌのビームの周波数 をそれぞれシフトするための音響−光変調器３及び４、分析器６にて分析される うなり周波数（Ωｌ−Ω２）の信号を検出するための光検出器（ＤＥＴ）５から なる。

周波数Ωｌのレーザビームは、試料保持器９上に設けられる槽８内に含まれる微 生物の群体７ａが存在する試料の基質上に向けられる。検査される試料７が固体 であるとき、該試料は試料保持器９上に直接載置されることを書き留めておく。

上記基質のアルベドが不十分なとき、反射物質にてなる薄膜が周波数Ωｌのレー ザビームと上記試料との間に置かれる。例えば金箔１０である上記薄膜は、毛管 現象によって上記試料上に保持される。上記反射物質を置くことは、例えばゲル である、音響結合物質を使用することで容易となることがわかるであろう。

本装置は、又、情報成果を利用可能な情報に相当する有益な信号がないときは、 有益な信号が得られるまで、振動が現れるように３軸に沿って試料保持器の運動 を制御可能とする、手動あるいは自動的に制御される系統１１を含むことができ る。上記レーザビームは、光ファイバによって導くことができ、又、上記基質は 光子に対して不透明とすることができることを書き留めておく。

上記試料あるいは反射物質の薄膜は、干渉計レーザビームの光路に置かれる。レ ーザビーム軸の平行化は、３軸に沿って上記試料保持器を移動することで達成さ れ、焦点合わせは焦点が界面ｔに位置するように対物レンズ１２を移動すること により達成される。

光検出器５にて検出される信号は、分析され、そして紙、磁気媒体、光学的媒体 等のような適宜なバックアップ媒体に保持される基準信号（例えば周波数一時間 スペクトル）と自動的に比較可能である。

もし上記検出信号が、上記試料位置に位置する静止鏡によって反射された光によ る信号と異なる場合には、生きた微生物が存在している。

このように本発明の方法は、与えられた試料内に生きた微生物が存在するか否か の検出を可能にする。又、本発明は与えられた物質に対して生きた微生物の感度 を決定することができる。例えば、本発明の方法は、微生物の成長を禁止あるい は反対に促進する添加物を決定することを可能とする。実際、摂動効果（例えば 、光刺激、磁気的あるいは電気的刺激、電気火花によるＩＲ，ＸあるいはＵＶ放 射線による複合刺激、熱、化学あるいは音響摂動あるい１は殺細曹剤による作用 ）の下では、上記検出信号のスペクトルが微生物＊狛によって放出されるものに よる信号とは異なることが観察１れでいる。

本発明の方法は、又、試験される物質に置かれる微生物あるいはそれらの混合物 の音響上の振舞いを分析することにより物質の試験にも適している。例えば、ア ンチバイオグラム（ａｎｔｉｂｉｏｇｒａｍｓ）の生産、あるいは与えられた物 質の殺真菌剤の、除草剤の、殺虫剤の、突然変異誘発の、あるいは毒性の、性質 等の研究に適している、このように本発明の方法は、基質の種々の点にセンナの 数を増やし、検出される信号を比較することにより、微生物をとらえ１．該微生 物が発する音響信号を使用し実時間にて微生物の通路を追うことを可能とする。

本発明の方法は、発酵及び殺菌消毒過程の監視、研究所における分析及び研究に て使用可能なバイオセンサの生産、及び微生物の周回に関係がある現象の監視に も使用できる。

本発明を以下の′限定されない実施例によって説明する。

実施例１　二　一般□的なセロリ［アピエームグラベレンズ（ＡＰＩＵＭ　ＧＲ ＡＶＥＬＥＮＳ）］の葉の薄膜 新鮮な植物から採取した直径が約３ｍｍの薄膜片断が１ｍｌ管の底に置かれ、金 属の留め金具にてその位置に保持される。上記管は、上述した試料保持器上に置 かれ、管の中には水が満たされる。直径が２　ｌＩｌ’？？、・厚さが２μ−の 金箔片が上記水の表面に置かれる。この金箔：片りは真っ、直ぐな毛管現象効果 により液体の表面に保持される。

二１ｙ）ｉＩｋ、箔片は、植物の片断から約１３ｍｍの距離にて行なわれる測定 記泌要な反射界面を形成する。

Ｂｔ軸に沿って極めて微細に動作する試料保持器は、管、試料、媒質、反射界面 及び目標物の全系を移動させる。

焦点合わせ及び光軸の平行化は、干渉計に関してこの全系の漸進的調整を行うこ とにより達成される。

次の段階は、干渉計からの光検出器により伝送される信号のスペクトル　［図２ を参照し、図２は本試料によって放出されるスペクトルを示す。即ち、図２には 干渉計及び生物要素のない試料・保持器を備えた装置からのバックグランド雑音 （曲線ｌ）とともに、種々の条件におけるスペクトル（曲線２ないし４）が示さ れている。コ（原文引用）。

曲線２及び３にて示されるスペクトルは以下の条件の下で得られる。

曲線２：　上述した動作方法による試料によって放出されるスペクトルである。

試料は暗所に置かれる。

曲線３：　上述した動作方法による試料によって放出されるスペクトルである。

試料は透明な管にて６０秒間、１５ｃｍ以内の距離にて１００Ｗの電球により光 刺激されたものである。

曲線２及び３を見ると、異なる条件下に置かれた試料の音響発光スペクトルは異 なることが判る。種々の試験は、試料が暗所に置かれたとき、あるいは光刺激を 受けたとき、曲線２及び３のスペクトルが常に得られることを観察可能とした。

実施例２ １容量から精液と５％のエルパイオル（Ｅｌｂｉｏｌ）グルコースとの混合物容 量までの試料を使用し、実施例１の動作方法を繰り返した。

精液の発光スペクトルは、光検出器によってとらえられる信号を分析することで 記録される。

上記試料を含む管に“フォンジバーチール（ＦＯＮＧＩＢＡＣＴＹＬ）”を３滴 加えることで上記記録されたスペクトルが一部変更する。

実際、繰り返し測定したところ、上記放出のゆっくりとした（約２００秒）漸進 的な消滅があり、システムのバックグランドノイズレベルへの復帰が観察された 。このことから、フオンジバーチールは精液的な（ｓｐｅｒｍｉｃｉｄａｌ）性 質を有することが結論付けられる。

本実施例は、本発明の方法が試料と関連する物質の作用を試験すること、例えば 検査される試料に含まれる微生物に対して毒となる量を決定することにも使用可 能であることを示している。

実施例３ 発芽後１０日経過して得られた、一般的な若い大豆［グリシンヒスパイダ（ＧＬ ＹＣＥＮＥ　ＨＩＳＰＩＤＡ）］の空気中の茎の先端、が試料保持器上で、光の 焦点が直接当たる位置に置かれる。

この植物の表面は、十分滑らかであり、間に金箔を置かなくとも測定のための光 は上記試料上にて直接反射する。

検出信号の分析結果は曲線４（図２参照）にて示されている。

Ｆｉｇ、　１ 曳度（ｄＢ） 圃う皮＠−（ＫＨｚ） 国際調査報告 −一一一−―−一一−−ｍ　ＰＣＴ／ｌ”Ｒ９０１００１フ１国際調査報告 ＦＲ９０００１７１ ＳＡ　３５５６３

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも一つの超高感度センサを使用し基質内の生きた微生物により放出 される極小振幅の音響信号をとらえることを特徴とする、振動測定法による、基 質に含まれる生きた微生物の高速検出及び／又は同定方法。
2. ２．上記超高感度センサは圧電センサ、ダイナミックセンサ、静電センサ、容量 センサ、トンネル効果センサあるいは干渉センサである、請求項１記載の振動測 定法による、基質に含まれる生きた微生物の高速検出及び／文は同定方法。
3. ３．上記超高感度センサはレーザを使用したの干渉計型センサである、請求項１ 又は２記載の振動測定法による、基質に含まれる生きた微生物の高速検出及び／ 又は同定方法。
4. ４．レーザ使用の上記干渉計型センサは、（ａ）検査される試料の基質上にレー ザビームを向け、（ｂ）微生物から一定距離離れた場所に位置する箇所にて基質 によって反射されるレーザビームのスペクトルを分析し、（ｃ）上記スペクトル と基準スペクトルとを可能な限り比較する、段階を備えた、請求項３記載の振動 測定法による、基質に含まれる生きた微生物の高速検出及び／又は同定方法。
5. ５．上記基質のアルベドは少なくとも０．０２％である、請求項４記載の振動測 定法による、基質に含まれる生きた微生物の高速検出及び／又は同定方法。
6. ６．厚さの薄い反射物質からなる薄板が検査試料とレーザビームとの間に挿入さ れる、請求項４記載の振動測定法による、基質に含まれる生きた微生物の高速検 出及び／又は同定方法。
7. ７．上記薄板は金箔である、請求項６記載の振動測定法による、基質に含まれる 生きた微生物の高速検出及び／又は同定方法。
8. ８．上記微生物は測定中摂動を受けやすい、請求項１ないし７のいずれか一つに 記載の振動測定法による、基質に含まれる生きた微生物の高速検出及び／又は同 定方法。
9. ９．ヘテロダインレーザ干渉計と、３軸に沿って移動可能な支持部によって構成 される試料保持器と、検査される試料によって反射されたビームを分析する分析 器と、あるいは媒介である基質を介して微生物に音響的に接続される厚さの薄い 反射物質からなる薄板と、を備えた、請求項４ないし８のいずれか一つに記載の 振動測定法による、基質に含まれる生きた微生物の高速検出及び／又は同定方法 を使用した検出及び／又は同定方法を具現化するための検出及び／又は同定装置 。