EP0463042A1 - Procede de detection et/ou d'identification de micro-organismes vivants par vibrometrie - Google Patents

Procede de detection et/ou d'identification de micro-organismes vivants par vibrometrie

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Publication number
EP0463042A1
EP0463042A1 EP19900904858 EP90904858A EP0463042A1 EP 0463042 A1 EP0463042 A1 EP 0463042A1 EP 19900904858 EP19900904858 EP 19900904858 EP 90904858 A EP90904858 A EP 90904858A EP 0463042 A1 EP0463042 A1 EP 0463042A1
Authority
EP
European Patent Office
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substrate
sensor
microorganisms
sample
vibrometry
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19900904858
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas De Sainte-Agathe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SAINTE AGATHE NICOLAS DE
Original Assignee
SAINTE AGATHE NICOLAS DE
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Filing date
Publication date
Application filed by SAINTE AGATHE NICOLAS DE filed Critical SAINTE AGATHE NICOLAS DE
Publication of EP0463042A1 publication Critical patent/EP0463042A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
    • G01N29/22—Details, e.g. general constructional or apparatus details
    • G01N29/24—Probes
    • G01N29/2418—Probes using optoacoustic interaction with the material, e.g. laser radiation, photoacoustics

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and / or identifying living microorganisms by vibrometry.
  • vibrometry is understood to mean the study of pressure waves.
  • the detection and / or identification of microorganisms living in an environment makes it possible to know its physiological state and its pathophysiological state.
  • This analysis is " commonly used in particular in the medical field for the detection of pathogenic states and in the food field for the determination of possible contamination.
  • the term "emission of acoustic signals” means all piezo-mechanical phenomena generated by the microorganisms and transmitted within the substrate which propagates these phenomena.
  • the acoustic signals are collected not in contact with the microorganisms but within the substrate containing them, for example on the surface thereof.
  • Pa such as, for example, piezoelectric sensors, electrodynamic sensors, electrostatic sensors, capacitor sensors, tunnel effect sensors and interferometric sensors.
  • the laser type interferometric sensor will be used according to the invention.
  • the method of the invention consists of: a) directing a laser beam onto the substrate of the sample to be tested; b) analyzing the spectrum of the light beam reflected by the substrate at a point located at a distance from the microorganisms, advantageously several micrometers. c) possibly to compare this with a reference spectrum.
  • the substrate whose albedo is at least 0.02% will be used.
  • the substrate albedo is not sufficient, that is to say is less than 0.02%, there is advantageously interposed between the test sample and the laser beam a device acoustically coupled with the microorganisms via the substrate.
  • This device is advantageously a sheet of reflective material having a thickness sufficiently small to be able to transmit the vibrations of the substrate.
  • a gold leaf having a thickness of between 1 and 5 ⁇ m, preferably 2 ⁇ m, will be used.
  • living micro-organisms is meant in the present description and the claims all biological entities of small size, metabolically active, animal or vegetable, simple or complex capable of being born, of developing and normally of reproducing.
  • microorganisms By way of examples of microorganisms, mention may especially be made of bacteria, acti ⁇ o ycetes, fungi, yeasts, viruses, phages, mycoplasmas, rickettsiae, eukaryotic cells, prokaryotic cells, fragments of 'DNA and RNA, neonodes and protozoa as well as simple or complex cell groups. 0 It has indeed been surprisingly found that living micro-organisms behave like micro-emitters of vibrations. It seems that everything happens as if the biochemical reactions which take place in microorganisms are at the origin of thermoacoustic phenomena which shake up the cellular structures.
  • sample is meant according to the invention any substrate capable of containing microorganisms.
  • biological media such as for example blood, urine, sperm and biological fragments or biopsies and food media, such as milk, juices fruit, preserving juices, food, etc.
  • the process can be implemented with:
  • powder samples In the case of powder samples, they should be placed in an environment conducive to the best acoustic collection, for example in water.
  • the laser beam directed onto the test sample is emitted by a conventional heterodyne laser interferometer.
  • Optical interferometers work by mixing two beams of light, one of the beams is reflected by the object under examination and the other serves as a phase reference. When the two beams have the same optical frequency, the interferometer is a homody ⁇ e interferometer. On the other hand, when the frequency of the reference beam is different from that of the object, we speak of a heterodyne interferometer.
  • a small frequency difference A is entered using two acousto-optic modulators A T enters the optical frequencies S and - ⁇ _p of the two interfering beams.
  • the interference between the reference beam ' and the beam reflected by the target produces a modulation of light intensity at the frequency of is detected by a photodetector.
  • the length of the optical path and consequently the phase of the object beam is modified by the displacements of the object and directly converted into a phase change in the beat frequency.
  • the linearity of a heterodyne interferometer is not limited to small variations in vibration, since variations in optical phases are not converted into variations in intensity as is the case in homodyne interferometers but in variations in signal phase at the beat frequency.
  • heterodyne interferometers allow the detection of very small variations.
  • the laser interferometers which are suitable for the purposes of the invention advantageously have the following characteristics:
  • Heterodyne interferometers have been described in particular by:
  • heterodyne interferometers are suitable for measuring the vibrational movements of the order of the ⁇ a ⁇ ometer of microscopic objects, such as the vibrations of the fish eye and of biological systems, such as the eyelashes of the organ of Corti or the giant axon of the dryer.
  • the apparatus for implementing the method according to the invention consists of a laser interferometer, of a sample holder consisting of a support which can be moved according to the three . axes and a beam analyzer ⁇ reflected by the sample to be tested.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the apparatus for implementing the method of the invention
  • - Fig. 2 represents the recordings of the spectra emitted by the sample to be tested according to examples 1 and 3 below:
  • the interferometer 1 is made up of a He-Ne laser source (l), acousto-optical modulators (3) and (4) to shift the reference beam (RB) of frequency and the beam directed towards the sample to be tested (0B) from a DET photodetector (5) for detecting the frequency beat signal -J. —SI * ), which is analyzed in the analyzer (6).
  • the laser beam of frequency- ⁇ is directed onto the substrate, of the sample to be tested (7) in which there is a colony of microorganisms (7a), contained in a tank (8), which is placed on a door -sample (9).
  • the sample to be tested (7) when it is solid, can be placed directly on the sample holder (9).
  • a sheet of a reflective material is interposed between the laser beam of frequency _ " _.
  • the sample for example a gold sheet (10), which remains on the It will be indicated that the placement of the reflective material can be facilitated by using an acoustic coupling material, for example a gel.
  • This apparatus may further include a manual or automatic control system (11) which, in the absence of a useful signal corresponding to usable information, controls the movement of the support of the sample along three axes up to obtaining a useful signal showing vibrations.
  • a manual or automatic control system (11) which, in the absence of a useful signal corresponding to usable information, controls the movement of the support of the sample along three axes up to obtaining a useful signal showing vibrations.
  • the laser beam can be conducted by an optical fiber and that the substrate can be opaque to photons.
  • the sample or sheet of reflective material is placed in the path of the laser beam from the interferometer.
  • the collimation is carried out by moving the sample support along three axes and the focusing is carried out by moving the objective (12) so that the focal point is located at the interface t.
  • the signal detected by the photodetector (5) is analyzed and can be automatically compared with reference signals (for example time-frequency spectra), this is observed on suitable supports, such as paper supports, magnetic supports, supports optics, etc.
  • the detected signal differs from that reflected by a stationary mirror located in place of the sample, we are in the presence of living microorganisms.
  • the method of the invention therefore makes it possible to detect the presence of a living microorganism in a given sample. It also makes it possible to determine the sensitivity of a living micro-organism to a given substance; for example it will thus be possible to determine the compounds which inhibit or on the contrary promote the growth of microorganisms. Indeed, it has been found that under the effect of a disturbance (for example photostimulation, magnetic or electric stimulation, complex stimulation by electric spark, by IR, X or UV radiation; thermal, chemical or acoustic disturbance, action of a bactericide) the spectrum of the detected signal is different from that emitted by the micro-organism alone.
  • a disturbance for example photostimulation, magnetic or electric stimulation, complex stimulation by electric spark, by IR, X or UV radiation; thermal, chemical or acoustic disturbance, action of a bactericide
  • the method of the invention is also suitable for studying substances by analyzing the acoustic behavior of microorganisms or mixtures thereof which have been brought into contact with these substances. For example, it is suitable for carrying out antibiograms or studying the fungicidal, herbicidal, insecticidal, mutagenic or toxic properties, etc. of given substances.
  • the method of the invention thus makes it possible, by multiplying the sensors at different points of the substrate and by comparing the detected signals, to locate the microorganisms and to follow in their trajectory in real time thanks to the acoustic signals they emit.
  • This process can be used for the control of fermentations, sterilizations, the production of biosensors usable in analysis laboratories and for all the studies and the control of phenomena related to the environment of microorganisms.
  • EXAMPLE 1 Leaf blade of the celery root APIUM GRAVELENS
  • the gold fragment constitutes the reflective interface necessary for the measurement which is thus carried out at a distance of approximately 13 mm from the plant fragment.
  • the sample holder made it possible by micro-displacements along three axes to move the tube, sample, medium, reflective interface and objective assembly.
  • the focusing and collimation of the optical system were obtained by progressive adjustment of this set with respect to the interferometer.
  • Curve 3 spectrum emitted by the sample according to the operating mode defined above, the sample being photostimulated by bringing a 100 W lamp 15 cm from the transparent tube for
  • Example 1 The procedure of Example 1 was repeated, using a volume-to-volume mixture of sperm and "Glucose Elbiol 5%" as a sample.
  • the emission spectrum of the sperm was recorded by analysis of the signal collected by the photodetector.
  • FONGIBACTYL has spermicidal properties.

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé de détection et/ou d'identification de micro-organismes vivants contenus dans un substrat par vibrométrie, qui consiste à recueillir les signaux acoustiques de très faibles amplitudes émis par ces micro-organismes au sein dudit substrat à l'aide d'un capteur ultrasensible et éventuellement à les comparer à des signaux de référence. Application: contrôle des stérilisations et des fermentations, antibiogrammes.

Description

Procédé de détection et/ou d'identification de micro-organismes vivants par vibrométrie.
La présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou d'identification de micro-organismes vivants par 05 vibrométrie.
Elle concerne plus précisément un procédé rapide et automatique de détection et/ou d'identification à distance de micro-organismes vivants contenus dans un substrat donné par vibrométrie. 10 Dans la présente description on entend par vibrométrie l'étude des ondes de pression.
La détection et/ou l'identification de micro-organismes vivants dans un milieu permet de connaître son état physiologique et son état physiopathologique.Cette analyse est "15 couramment utilisée notamment dans le domaine médical pour la détection des états pathogènes et dans le domaine alimentaire pour la détermination des contaminations éventuelles.
Actuellement ce type d'analyse nécessite, après le prélèvement d'échantillons, soit la mise en culture des 20 micro-organismes contenus dans celui-ci puis l'identification desdits micro-organismes, soit la réalisation de dosages biochimiques. Les procédés couramment utilisés ne permettent pas d'obtenir immédiatement un résultat, en effet ces types de procédés comportent plusieurs étapes d'incubation, de lavages, etc. 25 Ces procédés d'analyse nécessitent donc beaucoup de temps; de plus ils requièrent du personnel expérimenté.
On a également proposé de détecter ou d'identifier des microorganismes en étudiant leurs mouvements dans un milieu donné par observation optique directe de ces mouvements, par exemple par 30 spectrométrie et dopplerométrie optiques. A cet effet, on peut citer notamment le brevet EP 179.270 et les brevets DE 888.593 et
3.039.825.
On a maintenant trouvé un procédé de détection et/ou d'identification rapide de micro-organismes vivants contenus dans 35 un substrat par vibrométrie, qui consiste à recueillir les signaux acoustiques de très faibles amplitudes émis par ces micro-organismes au sein dudit substrat, à l'aide d'au moins un capteur ultrasensible et éventuellement à les comparer avec des signaux de référence. Selon l'invention on entend par "émission de signaux acoustiques" tous phénomènes piézo écaniques générés par les microorganismes et transmis au sein du substrat qui propage ces phénomènes.
On notera que selon le procédé de l'invention, les signaux acoustiques sont recueillis non pas au contact des microorganismes mais au sein du substrat les contenant, par exemple à la surface de celui-ci.
Aux fins de l'invention on peut utiliser tous les capteurs et transducteurs qui peuvent détecter des pressions
_5 acoustiques faibles, de préférence inférieures à environ 2 x 10
Pa, tels que par exemple les capteurs piézoélectriques, les capteurs électrodynamiques, les capteurs électrostatiques,les capteurs à condensateur, les capteurs à effet tunnel et les capteurs interférométriques. Avantageusement, on utilisera selon l'invention un capteur interférométrique de type laser.
L'invention va être maintenant décrite en détail en référence à ce type de capteur sans pour autant la limiter à ce seul mode de réalisation. Dans ce cas, le procédé de l'invention consiste : a) à diriger sur le substrat de l'échantillon à tester un faisceau laser; b) à analyser le spectre du faisceau lumineux réfléchi par le substrat en un point situé à distance des microorganismes, avantageusement à plusieurs micromètres. c) éventuellement à comparer celui-ci avec un spectre de référence.
Avantageusement on utilisera au substrat dont l'albedo est d'au moins 0,02 %. Lorsque l'albedo du substrat n'est pas suffisant, c'est-à-dire est inférieur à 0,02 %, on interpose avantageusement entre l'échantillon à tester et le faisceau laser un dispositif couplé acoustiquement avec les microorganismes par l'intermédiaire du substrat. Ce dispositif est avantageusement une feuille d'un matériau réfléchissant ayant une épaisseur suffisamment faible pour pouvoir transmettre les vibrations du substrat.
De préférence, on utilisera une feuille d'or ayant une épaisseur comprise entre 1 et 5 pm, de préférence 2 Ajm.
Par "micro-organismes vivants " on désigne dans la 0 présente description et les revendications toutes entités biologiques de petite taille, métaboliquement actives, animales ou végétales, simples ou complexes capables de naître, de se développer et normalement de se reproduire.
A titre d'exemples de micro-organismes on peut citer 5 notamment les bactéries, les actiπo ycetes, les champignons, les levures, les virus, les phages, les mycoplasmes, les rickettsies, les cellules eucaryotes, les cellules procaryotes, les fragments d'ADN et d'ARN, les né atodes et les protozoaires ainsi que les ensembles cellulaires simples ou complexes. 0 On a en effet constaté de façon surprenante que les micro-organismes vivants se comportent comme des micro-émetteurs de vibrations. Il semble que tout se passe comme si les réactions biochimiques qui ont lieu dans les micro-organismes sont à l'origine de phénomènes thermoacoustiques qui ébranlent les 5 structures cellulaires. De plus les signaux acoustiques émis par les micro-organismes sont caractéristiques de l'espèce considérée, de leur état physiologique et physiopathologique, et des conditions physico-chimiques qui régnent dans le milieu où se trouve ces micro-organismes. 0 Par "échantillon" on désigne selon l'invention tout substrat susceptible de contenir des micro-organismes. A titre d'exemples d'échantillons, on peut citer notamment tous les milieux biologiques, tels que par exemple le sang, l'urine, le sperme t les fragments biologiques ou biopsies et les milieux alimentaires, 5 tels que le lait, les jus de fruits, les jus de conservation, les aliments, etc..
Le procédé peut être mis en oeuvre avec:
- des échantillons de consistance solide à visqueuse;
- des échantillons de consistance solide à liquide; - des échantillons pulvérulents.
Dans le cas des échantillons pulvérulents il y aura lieu de les placer dans un milieu propice au meilleur recueil acoustique, par exemple dans l'eau.
Le faisceau laser dirigé sur l'échantillon à tester est émis par un interféromètre laser hétérodyne classique.
Les interféromètres optiques fonctionnent par mélange de deux faisceaux de lumière, l'un des faisceaux est réfléchi par l'objet examiné et l'autre sert de référence de phase. Lorsque les deux faisceaux ont la même fréquence optique, l'interféromètre est un interféromètre homodyπe. Par contre, lorsque la fréquence du faisceau de référence est différente de celui de l'objet, on parle d'interféromètre hétérodyne.
Dans un interféromètre hétérodyne on introduit à l'aide de deux modulateurs acousto-optiquεs une faible différence de fréquenceA Tentre les fréquences optiques S et -Λ_p des deux faisceaux interférants. Etant donné cette différence de fréquence, l'interférence entre le faisceau de référence' et le faisceau réfléchi par la cible produit une modulation d'intensité de la lumière à la fréquence de est détectée par un photodétecteur. La longueur du chemin optique et par conséquent la phase du faisceau objet est modifiée par les déplacements de l'objet et directement convertie en un changement de phase de la fréquence de battement.
La linéarité d'un interféromètre hétérodyne n'est pas limitée aux faibles variations de vibrations, puisque les variations de phases optiques ne sont pas converties en variations d'intensité comme c'est le cas dans les interféromètres homodynes mais en variations de phase du signal à la fréquence de battement.
Ainsi les interféromètres hétérodynes permettent la détection de très faibles variations. Les interféromètres laser qui conviennent aux fins de l'invention présentent avantageusement les caractéristiques ci-après:
1) faisceau étroit adapté à l'échelle microscopique, 2) albédo suffisant de la partie vibrante,
-11
3) amplitude de détection d'au moins 10 mètre,
4) largeur spectrale étendue 100 Hz - 300 MHz,
5) linéarité étendue le long du spectre,
6) sensibilité peu perturbée par les basses fréquences, 7) puissance calorique adaptée à la biologie.
Les interféromètres hétérodynes ont été décrits notamment par:
- B. CRETIN et al. Optic Communications vol. 65 n° 3, 1988, p. 157-162; - J.F. ILLEMIN et al. J. Acoustic. Soc. Am. 83 (2),
1988, p 787-795,
- Sietse M. VAN NETTEN J. Acoustic. Soc. Am. 83 (4), 1988, p. 1667-1674 ;
-- M.A. N0KES, Rev. Sci. Instrum. 49 (6) 1978, p. 723-728. Dans ces articles il est indiqué que les interféromètres hétérodynes sont appropriés pour mesurer les mouvements vibratoires de l'ordre du πaπomètre d'objets microscopiques, tels que les vibrations de l'oeil de poisson et de systèmes biologiques, tels que les cils de l'organe de Corti ou l'axone géant de la sèche.
Toutefois on n'a jamais proposé d'utiliser un interféromètre hétérodyne pour la détection des signaux acoustiques émis par des micro-organismes; une telle utilisation procure des avantages considérables par rapport aux techniques d'analyses classiques, notamment la rapidité et la suppression de toutes les étapes classiques.
L'appareillage pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention est constitué d'un interféromètre laser, d'un porte-échantillon constitué d'un support pouvant être déplacé selon les trois . axes et d'un analyseur du faisceau^ réfléchi par l'échantillon à tester.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail en référence aux figures annexées, sur lesquelles: - Fig. 1 est une représentation schématique de l'appareillage pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention ;
- Fig. 2 représente les enregistrements des spectres émis par l'échantillon à tester selon les exemples 1 et 3 ci-après:
L'interféromètre 1 est constitué d'une source laser He-Ne(l), de modulateurs acousto-optiques (3) et (4) pour déplacer en fréquence respectivement le faisceau de référence (RB) de fréqueπce^ et le faisceau dirigé vers l'échantillon à tester (0B) de un photodétecteur DET (5) pour détecter le signal de battement de fréquence -J . —SI*) , lequel est analysé dans l'analyseur (6).
Le faisceau laser de fréquence-^ est dirigé sur le substrat, de l'échantillon à tester (7) dans lequel se trouve une coloπnie de micro-organismes (7a) , contenu dans une cuve (8) , laquelle est posée sur un porte-échantillon (9) . On notera que l'échantillon à tester (7), lorsqu'il est solide peut être posé directement sur le porte-échantillon (9). Lorsque l'albedo du substrat n'est pas suffisant, on interpose entre le faisceau laser de fréquence _ "_. et l'échantillon une feuille en un matériau réfléchissant par exemple, une feuille en or (10), qui se maintient sur l'échantillon par capillarité. On indiquera que la mise en place du matériau réfléchissant peut être facilitée en utilisant un matériau de couplage acoustique, par exemple un gel.
Cet appareillage peut comporter en outre un système de commande manuelle ou automatique (11) qui permet, en l'absence d'un signal utile correspondant à une information exploitable, de commander selon trois axes le déplacement du support de l'échantillon jusqu'à l'obtention d'un signal utile faisant apparaître des vibrations. On notera que le faisceau laser peut être conduit par une fibre optique et que le substrat peut être opaque aux photons. L'échantillon ou la feuille de matériau réfléchissant est placé sur le trajet du faisceau laser de l'interféromètre. La collimation est effectuée en déplaçant le support échantillons selon trois axes et la focalisation est effectuée en déplaçant l'objectif (12) pour que le foyer soit situé à l'interface t.
Le signal détecté par le photodétecteur (5) est analysé et peut être comparé automatiquement à des signaux de référence (par exemple spectres temps-fréquence), c'oπservés sur des supports appropriés, tels que les supports papier, les supports magnétiques, les supports optiques, etc..
Si le signal détecté diffère de celui réfléchi par un miroir immobile situé à la place de l'échantillon, on est enprésence de micro-organismes vivants.
Le procédé de l'invention permet donc de détecter la présence d'un micro-organisme vivant dans un échantillon donné. Il permet également de déterminer la sensibilité d'un micro-organisme vivant à une substance donnée; par exemple on pourra ainsi déterminer les composés qui inhibent ou au contraire favorisent la croissance des micro-organismes. En effet, on a constaté que sous l'effet d'une perturbation (par exemple photostimulation, stimulation magnétique ou électrique, stimulation complexe par étincelle électrique, par rayonnements IR, X ou UV ; perturbation thermique, chimique ou acoustique, action d'un bactéricide) le spectre du signal détecté est différent de celui émis par le micro-organisme seul.
Le procédé de l'invention est également adapté à l'étude de substances par l'analyse du comportement acoustique de micro-organismes ou de mélanges de ceux-ci qui ont été mis en présence de ces substances. Par exemple, il convient pour la réalisation d'antibiogrammes ou l'étude des propriétés fongicides, herbicides, insecticides, mutagènes ou toxiques etc.. de substances données.
Le procédé de l'invention permet ainsi, en multipliant les capteurs en différents points du substrat et en comparant les signaux détectés, de localiser les micro-organismes et de suivre en temps réel leur trajectoire grâce aux signaux acoustiques qu'ils émettent.
Ce procédé peut être utilisé pour le contrôle des fermentations, des stérilisations, la réalisation de biocapteurs utilisables en laboratoires d'analyses et pour toutes les études et le contrôle des phénomènes liés à l'environnement des micro-organismes.
L'invention va être maintenant décrite par les exemples illustratifs non limitatifs ci-après: EXEMPLE 1 : Limbe foliaire du céleri-commun APIUM GRAVELENS
Deux fragments de ce limbe d'un diamètre de 3 mm environ, prélevés sur une plante fraiche ont été placés et maintenus par une attache métallique dans le fond d'un tube de 1 ml. Le tube a été placé sur le porte-échantillon, puis rempli d'eau. A la surface du liquide on a déposé un fragment de feuille d'or d'un diamètre de 2 mm et d'une épaisseur de 2 um. Ce fragment d'or a été maintenu à la surface du liquide par simple effet capillaire.
Le fragment d'or constitue l'interface réfléchissante nécessaire à la mesure qui s'effectue ainsi à une distance d'environ 13 mm du fragment végétal.
Le porte-échantillon a permis par micro-déplacements selon trois axes de déplacer l'ensemble tube, échantillon, milieu, interface réfléchissante et objectif. La focalisation et la collimation du système optique ont été obtenus par ajustement progressif de cet ensemble par rapport à l'interféromètre.
L'étape suivante a consisté à analyser et les spectres du signal transmis par le photo-détecteur de l'interféromètre à voir Figure 2 sur laquelle figurent les spectres émis par cet échantillon : (courbes 2 à 4) placés dans différentes conditions ainsi que le bruit de fond de l'ensemble interféromètre porte-échantillon vide d'éléments biologiques (courbe 1) ~~\ les spectres représentés par les courbes 2 et 3 ont été obtenus dans les conditions ci-après: Courbe 2: spectre émis par l'échantillon selon le mode opératoire défini ci-dessus, l'échantillon étant dans l'obscurité.
Courbe 3: spectre émis par l'échantillon selon le mode opératoire défini ci-dessus, l'échantillon étant photostimulé en approchant une lampe de 100 W à 15 cm du tube transparent pendant
60 secondes.
On constate en observant les courbes 2 et 3 que les spectres d'émission acoustique de l'échantillon placé dans des conditions différentes sont également différents. Divers essais ont permis de constater que les spectres des courbes (2) et (3) étaient toujours obtenus lorsque l'on plaçait l'échantillon soit dans l'obscurité, soit lorsqu'on l'a photostimulé. EXEMPLE 2.
On a répété le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant comme échantillon un mélange volume à volume de sperme et de "Glucose Elbiol 5 %".
On a enregistré le spectre d'émission du sperme par analyse du signal recueilli par le photodétecteur.
L'introduction dans le tube contenant l'échantillon ci-dessus de 3 gouttes de "F0NGIBACTYL" modifie le spectre enregistré.
En effet, dès reprise de la mesure on observe lentement (environ 200 secondes) une extinction progressive de l'émission et un retour au bruit de fond du système. On en conclut que le FONGIBACTYL possède des propriétés spermicides.
Cet exemple montre que le procédé de l'invention permet de tester l'action d'une substance à l'égard 'un échantillon donné, par exemple de déterminer les doses toxiques pour le micro-organisme contenu dans l'échantillon à tester. EXEMPLE 3
L'extrémité de la tige aérienne d'un jeune plant de soja commun GLYCENE HISPIDA obtenu au bout de 10 jours de germination a été placé, au foyer optique directement sur le porte-échantillon.
La surface de cette plante étant suffisamment lisse et réfléchissante la mesure a été effectuée directement sur l'échantillon sans l'interposition d'une feuille d'or.
L'analyse du signal détecté a donné la courbe 4 (voir Figure 2) .

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection et/ou d'identification rapide de micro-organismes vivants contenus dans un substrat par vibrométrie, caractérisé en ce qu'il consiste à recueillir les signaux acoustiques de très faibles amplitudes émis par ces micro-organismes au sein dudit substrat à l'aide d'au moins un capteur ultrasensible.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le capteur ultrasensible est un capteur piézoélectrique, un capteur électrodynamique, un capteur électrostatique, un capteur à condensateur, un capteur à effet tunnel ou un capteur interférométrique.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé_en ce que le capteur .ultrasensible est un capteur interférométrique de type laser.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste : a) à diriger sur le substrat de l'échantillon à tester un faisceau laser; b) à analyser le spectre du faisceau lumineux réfléchi par le substrat en un point situé à distance des microorganismes ; c) éventuellement à comparer celui-ci avec un spectre de référence.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'albedo du substrat est d'au moins 0,02 %.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on interpose entre l'échantillon à tester et le faisceau laser une feuille en un matériau réfléchissant de faible épaisseur.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la feuille en matériau réfléchissant est une feuille d'or.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications l à 7, caractérisé en ce que les microorganismes sont soumis à une perturbation au cours de la mesure.
9. Appareillage pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce qu'il 12
comprend un interféromètre laser hétérodyne, un porte-échantillon constitué d'un support pouvant être déplacé selon les trois axes, d'un analyseur du faisceau réfléchi par le substrat de l'échantillon à tester, et éventuellement d'une feuille en matériau réfléchissant de faible épaisseur couplée acoustiquement aux microorganismes par l'intermédiaire du substrat.
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