JPH04503666A - 赤血球凍結法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 赤血球凍結法 本発明は、長期保存のための、赤血球の凍結に関わるもので、これによって、赤 血球を、長期に輸血に使用できるようにするためのものである。

輸血に使用するための血液の保存法についてはよく知られている。血液は、通常 、４℃の冷凍条件で保存されるが、この場合、血液は、約５週間の最大有効期間 を持つ。したがって、十分な補給量を確保するには、献血者の不断の協力が必要 である。

残念ながら、供給が不足する時期がままある。例えば、クリスマス時期近くがそ うである。また、重大な災害が、ある特定地域を、供給不足にする場合もある。

また、自分の血液を保存しておきたいと望む人の数も増えている。これは、例え ば、緊急を要しない手術に備えるためである。したがって、血液補給の長期保存 についての要求がある。

血液の長期の保存は、血液を、極低温に凍結して保存することによって可能であ る。残念なことに、血液を補給されたままの形で凍結することは、不可能である ことが分かっている。通常は、血液を、約４５０ｍ１単位の標準ユニットとして 保存している。この量は、献血者が１回の献血で与える容量である。輸血を受け る患者は、通常、このユニットの整数倍を与えられる。

このような量の血液を凍結することは、赤血球の溶血を招くので、その血液は、 将来、輸血へ使用することができなくなってしまう。溶血は、心臓毒性を持つカ リウムや、腎不全の原因となる細胞基質（細胞残滓）の遊離を招くからである。

輸血に使用するためには、赤血球は、はぼ１％以上溶血を起こしていてはならな い、と一般に考えられている。ある赤血球の凍結保存法においては、血液を遠心 して、血漿と血小板とを、赤血球から分離し、この赤血球を低温保護剤と混合し 、その混合体を、通常、液体窒素を用いて、極低温に凍結する。普通用いられる 低温保護剤はグリセロールである。残念ながら、グリセロールは有毒であって、 赤血球を輸血用に調製するには、グリセロールを除去するのに、数回の洗浄が必 要である。これは、高価な装置を必要とし、責任者に高度の技能、経験、不断の 訓練を要求し、さらには、高度の無菌領域を要求する工程である。洗浄工程は、 ユニット当り約２０分かかり、１５から２０％の細胞損失を招く。これよりも好 ましい低温保護剤として、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）すなわちレボサン（ １！マｏｓｓｎ）がある。アメリ力特許第３．７５１３８２号には、抗凝固剤（ 酸性化した、シトラード・デキシトロース）を含む５５ｍ１の全血標本を、平均 分子量４０、０００から７０．０００の４０％Ｗ／マＨＥＳと、最終濃度が１２ から１４％ｖ／ｙＨＥｓとなるように混合したことが記載しである。この混合物 を、−１９０℃の液体窒素に浸し、凍結するまで、２００サイクル／分の割合で 撹拌した。−１４０℃で最大１週間保存した後、混合物を、４７℃の水浴に、１ ６０サイクル／分で撹拌しながら、６０秒秒間上て解凍した。赤血球について、 最大９９％（平均９７．４％）という回収率が達成された。凍結に要した容量、 すなわち、５５ｍ１は、標準ユニットのほんの一部でしかないから、もし通常の 輸血操作に用いたならば、好ましくない結果をもたらす可能性がある。この種工 程を開発するにあたって、血液の標準ユニットを凍結させることを考慮して、ア メリカ特許第４０１８９１１号は、平均分子量１５０．０００のＨＥＳを用いた 血液凍結法を記載している。血液は遠心して、血漿及び血小板を、赤血球から分 離し、血漿の若干をＨＥＳと混合する。血漿を加える理由は、これが、赤血球の 保護に必要だと考えられているからである。次に、血漿とＨＥＳの混合物を、は ぼ等容量の細胞と混合する。

これによって、生成混合物におけるＨＥＳの割合は、１４％の桁になる。４５０ ｍ１の標準献血ユニットは、この時には、約４０５ｍ１に減少している。血漿と ＨＥＳの混合物を、凍結用バッグ中の赤血球に加え、さらに撹拌した後、バッグ を振子式撹拌型付属のホールダーに入れる。ホールダーは、２個の穴の開いた金 属の側板から成り、側板同士は蝶番で接続し、ボルトで結合している。この金属 板の間に、血液バッグは、ステンレス・スチール製の側板から与えられた剛性を 持って保持されるので、凍結中、はぼ均一な断面を維持する。均一な断面によっ て、もっとも急速な凍結が可能であり、スチールプレートは、撹拌中にも、バッ グをほぼ剛性に維持する。バッグとホールダーは、液体窒素に垂直に浸し、内容 物が凍結する間、振とうされる。振とう工程は、４０５ｍ１ユニツトを凍結する 場合、このユニットの容量からして、必要であり、また、急速な凍結速度を維持 するためにも必要である。後者は、赤血球の溶血を最小に抑えるためである。血 液は、輸血の目的のために、はぼ５４℃の水浴に、撹拌しながら、はぼ１分間浸 す。この処置によって、この血液を直ちに輸血に用いることができる（溶血が許 容レベルにあるならば）。これが、この方法が、グリセロール凍結血液ユニット よりも優れる主な利点である。これは、細胞外低温保護性ＨＥＳは、無毒で、生 体グリコーゲンによく似ているので、免疫原性を持たないから、それを除去する 必要がないからである。

アメリカ特許第４０１８９１１号には、この方法によって、わずか２５ｍ１の標 本を凍結する試験法が記載されている。この場合、赤血球において、平均９９． ２％が、解凍後状態において回収され、８７．３％が、３０分後、等張生食液に おいて安定であった。しかしながら、まるまるの標準ユニットについての結果は 、ずっと貧弱なもので、細胞回収率は９７．２％に落ち、生食液での安定性は７ ５．７％に落ちた。

赤血球、血小板、白血球、骨髄細胞、他の臓器細胞を凍結保存するｌこめに、Ｈ ＥＳを低温保護剤として利用することが、英国特許出願ＧＢ　２０４６７？２Ａ に記載しである。細胞を、例えば、遠心、細胞分離法、ろ過、吸着によって分離 する。赤血球の凍結工程について簡単に述べると、細胞を、細胞分離法（遠心と は別、おそらくある程度の血漿を細胞と一緒に残すために用いる）によって分離 し、２／３　（ＨＥＳ／赤血球濃度）の割合で１０％ＨＥＳ溶液を加える。これ によって、９５から９８％の回収率が得られたと主張している。これら従来技術 の文献に徴しても、ＨＥＳを低温保護剤として使用し、溶血を許容レベルに抑え 、ごく小量のバッチで（アメリカ特許第４０１０１１号では２５ｍ１）、赤血球 を保存、回収することは可能であることが明かである。

しかしながら、従来、赤血球を、輸血法と一致する量で保存、回収することは不 可能であ７た。さらに、名目的に同一の標本において、回収率の変動が許容程度 を越えて高い。したがって、ＨＥＳ低温保護凍結赤血球を含む輸血サービスの潜 在的価値は長い間認められてきたにも関わらず、従来、回収に当たって、その溶 血レベルが許容できるもので、レベルの変動が許容できる、そのような方法を考 案することは不可能であった。

本発明によれば、ＨＥＳを低温保護剤として用いる赤血球凍結法は、１ユニツト の血液を遠心して、血漿と血小板を赤血球から分離し、その赤血球をＨＥＳと混 合し、その混合物を凍結するという諸手順を含む。この方法は、混合物の凍結が 、混合前の赤血球が９０％以上の赤血球容積率（Ｐｌｃｋｃｄ　Ｃ！ｌｌ　Ｙ＋ １ｗ５ｅ）を持ち、混合物におけるＨＥＳの存在が、７％Ｖ／マＨＥＳ／赤血球 である、という特徴を有する。赤血球容積率、すなわち、ヘマトクリットは、こ の分野で既知の機能値であって、例えば、５ｉｒｌｏｂｅ　Ｖ　Ｄｉｗｉｃ　ｇ ｎｄ　Ｓ　Ｍ　Ｌｅｖｉｉ著、６版、Ｃｈｉ＋ｃｈｉｌｌＬｉｙｉｎ４＋１ｏｎ ｅ　１９８４．　ｌ５ＢＮ　０４４３０１９８１−９．　ＰｚｃｔｉｃｓｌＨ＊ ｅｓ＊ｊｏｌｏｇ　（実習血液学）３２頁に定義されている。本発明の方法にお いては、従来のものとは異なり、混合物の中にほとんど血漿は存在しない、こと を特記すべきであろう。さらに、血漿によって得られる保護作用は失われるけれ ども、本発明による方法は、有意に低い％Ｗ／マＨＥＳ／赤血球を用いている。

溶血を許容レベルに収めたことの他に、本方法のもう一つの利点は、血漿の無い こと、ＨＥＳの減量、にある。血漿は、各種の蛋白を含む。その中には、血液凝 固にあづかる複数の因子−一その一つにファクター８があるｍ−がある。従来既 に明らかにされたところであるが、ＨＥＳを血漿と混ぜた場合、ある種の蛋白、 特に凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、フィブロネクチンが、ＨＥＳの量が 増すにつれて、不溶性を増す（Ｓ　Ｂｅｌ！。

ＭＳｃ　Ｔｈｅｓ口、Ｌｉｂ＋＊Ｂ　ｏｆ　Ｂ＋ｍａｅｌ　ＵＩｌｉｗｅ＋＋１ １７）　。上記蛋白は集合体を形成し、これが、血漿にミルク色を帯びさせる原 因となる。インビボであれ、インビトロであれ、未処理の血漿に出会うと、この 集合体は、さらなる蛋白集合の核としての役を演じ、一方、同時に、ＨＥＳは、 新鮮な血漿中のさらに多（の蛋白と反応する機会を持つことになる。その結果生 成される残滓は、マクロファージによって取り除かれるが、一過性に、患者の免 疫能力を低下させることがある。凝固因子とフィブロネクチンが侵されるために 、出血時間は、ＨＥＳの「用量」に比例して延びることがある。できれば、ＨＥ Ｓは、４０％マ／マＨＥＳ溶液の形で、また、ＨＥＳは、平均分子量が、１５０ ．Ｎｏから２００、０００の範囲のものがよい。

このましいユニットは、４５０ｍ１の標準献血ユニットに基づき、２　Ｇ　０　 ｎｌの赤血球を、３５ｍ１の４０％ＨＥＳ溶液と混合し、凍結用の全ユニットと して、約２３５ｍ１になる。

赤血球はできれば、ＨＥＳと混ぜる前に、抗凝固剤や防腐剤（例えば、ＣＰＤＡ 、ＣＰＤまたはヘパリン）で処理した方がよい。

凍結工程はできれば、液体窒素の中で、混合物を、フレームに保持した凍結用バ ッグに入れて行なうのがよい。フレームには、２個の平行な、穴の開いたプレー トがあって、そのプレートの間に凍結用バッグが挟まれ、プレートは、平行を保 ちながら、互いにわずかではあるが直角方向（ｎｏｒｉｇｌ）に動くことができ るように作られている。

好ましいフレームとしては、曲面形のアルミニウムのプレートを持ち、その曲面 が円筒形、もしくは好ましくは球形の断面であるのがよい。

凍結用バッグの中の混合物は、凍結工程進行中、バッグの局部的な厚みにきわめ て敏感であることが従来判明している。混合物は、凍結によって拡大する傾向が あり、従来の凍結用フレームは歪んで、局部的に膨張させたり、そのような膨張 を許容したり、または、適当な膨張を妨げたりし、破損傷害の原因となった。平 行プレートの直角方向の動きを可能にすることによって、凍結混合物の局部的な 膨らみを避けることができる。

本発明による方法においては、標準ユニットの容量は、凍結用（２３５ｍｌ）に 調製する場合、次のことが十分可能である程度のものであった。すなわち、混合 物を、従来の方法では必要とされるような、凍結用バッグを撹拌するという手間 もかけず、十分な速さで凍結することのできる容量であった。このことは、装置 要件、操作の複雑性を大きく減らすことにつながり、また、溶血の原因（撹拌に よる細胞にたいする物理的損傷）を回避することにもなる。

遠心後の赤血球は、できれば、直接、ＨＥＳの保存されている凍結用バッグに移 す。

上記の方法によって凍結された血液は、できれば、次のようにして輸血用に調製 する。すなわち、約４３．５℃の温水に、撹拌せずに（こうして、もう一つの溶 血原因を避ける）、約１０分、はぼヒトの体温に達するまで、浸す。

上記の方法を用いて、標準献血ユニットに基づいて、血液ユニットを凍結、解凍 すると、半時間で、９１％±０．７５％（ＳＤ）の生食酸安定細胞、解凍時、９ ９．１％±０．１２％の平均収率を得ることができることが判明した。血液は、 液体窒素保存状態から取り出して１１分以内に患者に輸血することができる。

本発明を実行する一つの方法、および、本発明に使用される装置を次に述べるが 、実施例として、添付の模式図を参考にして述べるにとどめる。この内、第１図 は、献血者から標準ユニットの血液を受け取ってから、凍結用バッグでＨＥＳと 赤血球を混合するまでの操作を、模式的に描いたものである。第２図は、本発明 に用いられる凍結用フレームの中に組み込まれるプレートの平面図である。第３ 図は、第１図に相当する平面図であって、凍結用バッグをプレートに載せたとこ ろを示す。第４図は、凍結用バッグを収めた凍結用フレームの断面における高ま りである。

献血者（示していない）からの血液は、チューブ１０　（第１図）を通じて、保 存バッグ１１に与えられる。１１は、抗凝固剤、防腐剤（ＣＰＤＡ）を含んでお り、密封され、遠心器（示していない）に置かれる。バッグ１１を遠心すると、 血漿と血小板が分離される。これらは押し出されて、バッグ１２に流れる。赤血 球容積率９０％以上にパックされた赤血球は、溶血バッグ１３に至る。

１３は、約３５ｍ１のヒドロキシエチル澱粉（）ＴＥＳ）で、できれば４０％ｖ ／ｌで、分子量１５０．０００から２００．０００のものを含んでいる。

これによって、赤血球の外部にあって、赤血球を洗う液体において、約２５５％ のＨＥ　Ｓが得られる。これは、ＨＥＳの全体パーセントとしては、７％Ｗ／マ 　（できれば６％Ｗ／マ）以下のものである。

凍結用バッグ１３は、偏平な、四角形である。次に、バッグ１３を取り出し、空 気を完全に追い出した後、密封する。それから、ＨＥＳと赤血球を、例えば、手 で、数分ひっくり返したり、回したりして、混ぜ合わせる。

献血から、バッグ１３の密封までの工程は、無菌環境で行なわなければならない 。また、この工程は、できれば、チューブ１０から凍結用バッグＩ３までの接続 が連続的で、継目のないように配置しであること、また、取り外しは、接合部に おいて切り放しと密封が同時に起こるように行なわれることが望ましい。遠心、 赤血球と溶媒（ＨＥＳ）を混合する一般的な方法については、この分野において 既知のものでありｍ−例えば、アメリカ特許第４０１０１１号参照−一、ここで これ以上述べる必要はない。

凍結用フレーム（第２．３．４図）は、２枚のプレート、２０．２１を有してい る。各々はぼ正方形であり、曲面をなし、球面の一部を形成する。球は同心円で あり、外方円は、内方円よりも約３ｍ大きい半径を持つ。球形性は、例えば、約 ３３ｃ＋ｍのフレーム・コードの中心で２ｃｍのずれが起こる程度のものである （この大きさのフレームが、標準ユニットの血液を凍結させるのに適当であるこ とが判明した）。各プレート２０．２１の端には、縁２２がついており、プレー ト同士が相互に所定の位置につけるようになっている。各プレートは、熱伝導性 の良い材料、できれば、アルミニウムから出来ており、複数個の穴２３（第２図 ）を有する。この穴は、表面積のほぼ５０％を占める。凍結用バッグ１３をプレ ート２１に、プレートの穴開き部で完全に覆われるように納める（第３図参照） 。次に、第２のプレート２０を、第１のプレート２１とバッグ１３の上に置き、 いくつかのクリップで、第４図２４に見られるような具合いに、所定の位置に保 持する。各クリップ２４の捕捉腕２５は、若干の弾力性を持ち、かつ、フレーム ２Ｇ、２＋の端を掴むように置かれる。ただし、凍結用バッグ１３の上にはかか らないようにする。次に、フレーム２０．２＋および凍結用バッグ１３を垂直に 、液体窒素のバット（示していない）に浸し、ＨＥＳ・赤血球混合物を、約３０ 秒以内に急速に凍結させる。混合物は、凍結時、膨張する傾向を示すが、クラン プ２４の捕捉腕２５の弾力性によって、プレート２Ｇ、２１が、この膨張の代償 として、少し互いに遠ざかることができる。しかしながら、プレート２０．２１ の曲面によって、プレートは歪められず、その結果、すべての点において、両プ レートは、互いに平行のままであり、その全面積に渡って凍結バッグの厚みを定 常に保つ。

このことは重要である。なぜなら、凍結バッグの局所的膨張は、局所的溶血の増 加を招くことが判明しているからである。

上記のようにして凍結させた血液は、相当の長期間、液体窒素の温度で保存でき る。冷凍器から取り出した場合には、約１０分間は撹拌せずに、約４３．５℃の 温水に付けて輸血に備えるのが望ましい。すなわち、この１０分間に、血液の温 度が、輸血に使用する前に、好ましくは、ヒト血液の温度まで上がることができ るわけである。

水洗を用いれば、１％未満程度の溶血レベルが実現できることが判明した。これ は、初期の凍結法、調製法で達せられたものよりもはるかに優れた赤血球の収量 である。

下記の表１は、前述の方法によって凍結、回収した１０個の標本の詳細を表わし たものである。用いた凍結用フレームは、シートの厚さ　０．９ｍｍ、端の厚さ 　１．２ｍｍの穴開きシート付きのもの生食液安定性（％）　回収率（％） １／２時間　２時間 ９１．５　８８，５　９９．３　パック１９０、１　８７．５　９９．１　パッ ク２９２　８９　９９、０　パック３ ９２．５　９０　９９．２　パック４ ９０、３　８７．８　９９．１　パック５９（１，４ｇｙ、　８　９９．４　パ ック６９０、６　８ｇ、　２　９１１．９　パック９９Ｇ、５　８８．２　９８ ．９　バック１０生食液中での平均半時間安定率　平均回収率＝　９９．１％、 −９１，０％、ＳＤ　Ｏ，７５％　ＳＤ、０．１２％平均血漿安定率は、生食液 安定率よりも４％高い。

第２表は、酸素輸送効率、赤血球生存率が、上記方法によって変化しないこと、 ないし、目立った影響を受けないことを示す重要なパラメータを詳しく載せたも のである。

第２表、ＰＳＯ，ＤＰＧ成績 バック番号　ＣＰＤＡ　における　凍結前　凍結後全新鮮血　混合物−一　混合 物−一 ２４時間長以下　赤血球　赤血球 ＤＰＧ　ＰＳＯＤＰＧ　ＰＳＯＤＰＧ　ＰＳＯＤＰＧ９１０　２８．５　３．４ ３　２７．５　３．８６　２４　３．８２９１１　２７　４．３８　２６　４． ８８　２５　３．８５９１２　２６　４．０１　２３．５４．４　２３　３．８ ６９＋３　２５　３．８２　２５　４ｊ３　２４　３．７６９１４　２６．５３ ．５６　２５　３．８６　２３　３．８６９１５　２７　４．７８　２７．５４ ．６６　２６　３．８４００１　２８　６．２？　２７．５　４．７２　２５． ５　５．７９００２　２７　３．４３　２６　４．５　２５．５５．５６００３ 　２９　５．１９　２８　５．２２　２５．Ｓ５．４１００４　２１１　５．２ 　２１１．Ｓ５．２８　２８　４．８８００５　２７　３．０１　２７　３．６ ３　２６．Ｓ３．３１００６　２５．５　５．０８　２６．５　４．５８　２８ 　４．５７６４８　２７．５　４．２１　２８．５　３．５１　２７　４．３９ ０４９　２６　４．１９　２６　４．Ｈ２６３，７２０５０２５，５４，３２３ ４，２２３４，０５Ｇ５．＋　２７　４．６６　２７　４．５Ｇ　２６　５．４ １０５２　２５．５　４．３９　２Ｇ　４．８１　２５．５　４．７３Ｇ５３　 ２３．５　３．７５　２４　３．７４　２３．５　３．２２６２５　２５．５　 ２．９１　２５．５　２．９　２２　３．０＋４４９　２７．５　３．４８　２ Ｇ、５　３．３２　２２．５　３．７９０７１　２６　３．４８　２７　４．１ ９　２Ｇ、５３．４平均　２６．６　４．＋５　２６．４　４．２７　２４．７ 　４．１９ＳＤ　Ｉ、２？　０．８１　１．６　０．６１　３．８３　０．６４ 単位、ＰＳＯｍｓＨｇ、ＤＰＧ　＠Ｍ／１したがって、これからも明らかなよう に、水洗は、輸血目的のために許容できる溶血レベルを繰り返し与えることので きる、標準ユニッ］・赤血球の保存、回収法を供給する。標準ユニットの容積が 約２３５ｍ１に減少するという事実は、患者に、一時に、より多くのユニットを （すなわち、より多くの赤血球を）輸血できるというもう一つの利点となる。

輸血用混合物は、患者にとって有害となる不純物をほとんど含まず、また、ＨＥ Ｓの量も、従来の凍結法で用いられるそれの約２５％に減少してしている。さら に、全工程が、従来の凍結法で記載されたものよりも相当に簡単になっている。

なぜなら、本工程では、凍結処理の間、凍結用フレームや凍結用ツク・ソゲを振 動させるのに必要な機構を要しないからである。事実、オペレーターは、血液を 凍結するのに、ただ保護手袋と一組の大ピンセット（ｔｏａｄ）を用意しさえす ればよい。また、解凍操作も、未熟なボランチアが、「手で触って熱い」と判断 されるそのような水を含む容器よりも複雑なものは何も持たずに、ＩＯ分程で実 行することができ、しかも、好成績を収めることができる。

すぐ分かるように、上記の方法・装置については各種変法の実施が、本発明の範 囲内において、可能である。例えば、プレート２０．２１を球形と記載したけれ ども、これはもちろん理想であって、円筒曲面だけ、または、何らかの角度形で も、凍結過程において、両プレートの直角方向の相対的運動を可能としながらも 、両プレート間の平行性を維持するのに十分である。また、アルミニウムではな く、他の材料でも使用できる。

また、次のことも理解されなければならない。水洗は、従来の献血者・輸血慣行 に合わせて、標準ユニットの血液に用いることを意図したものであるけれども、 もつと小さいユニットに用いることもできる。例えば、水洗は、実験目的、希な 血液標本保存のためのサシェットーーこれは、例えば、５ｃｎ平方の大きさの小 袋であるｍ−の調製に用いることができる。

補正書の写しく翻訳カ提出書（特許法第１８４条の８）平成３年８月８日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＥＳを低温保護剤として用いる赤血球の凍結法であって、１ユニットの血 液を遠心して血漿と血小板を赤血球から分離し、赤血球をＨＥＳと混合し、その 混合物を凍結するという諸手順を含み、混合前の赤血球は、９０％以上の赤血球 容積率を持ち、混合物中のＨＥＳは、７％ｗ／ｖＨＥＳ／赤血球以下で存在する ことを特徴とする前記凍結法。
2. ２．請求項１に記載の方法であって、ＨＥＳが６％ｗ／ｖＨＥＳ／赤血球の割合 で存在することを特徴とする該方法。
3. ３．請求項１または請求項２に記載の方法であって、ＨＥＳが４０％ｗ／ｖＨＥ Ｓ溶液という形で存在することを特徴とする該方法。
4. ４．請求項１から３までのいずれか一つに記載の方法であって、ＨＥＳの平均分 子量が１５０．０００から２００，０００の範囲にあることを特徴とする該方法 。
5. ５．請求項１から４までのいずれか一つに記載の方法であって、血液ユニットが ４５０ｍｌの標準献血ユニットに基づくことを特徴とする該方法。
6. ６．請求項１から５までのいずれか一つに記載の方法であって、赤血球が、ＨＥ Ｓと混合される前に、抗凝固剤で処理される該方法。
7. ７．請求項１から６までのいずれか一つに記載の方法であって、凍結が液体窒素 中で行なわれることを特徴とする該方法。
8. ８．請求項１から７までのいずれか一つに記載の方法であって、混合物が凍結用 バッグに入れられることを特徴とする該方法。
9. ９．請求項８に記載の方法であって、凍結用バッグが、凍結中、２枚の平行な穴 開きプレートを有するフレーム内に保持されることを特徴する該方法。
10. １０．請求項９に記載の方法であって、両プレートが、平行を保ちながら、互い に直角方向（ｎｏｒｍａｌ）に僅かであるが動けるようになっていることを特徴 とする該方法。
11. １１．請求項１０に記載の方法であって、両プレートがカーブしていることを特 徴とする該方法。
12. １２．請求項１１に記載の方法であって、両プレートが球形曲面を描くことを特 徴とする該方法。
13. １３．請求項１１に記載の方法であって、両プレートが円筒曲面を描くことを特 徴とする該方法。
14. １４．請求項９から１３までのいずれか一つに記載の方法であって、フレームが アルミニウムでできていることを特徴とする該方法。
15. １５．請求項１４に記載の方法であって、両プレートの穴開き領域が０．９ｍｍ 厚であることを特徴とする該方法。
16. １６．請求項１４または１５に記載の方法であって、両プレートの穴の開いてい ない端が１．２ｍｍ厚であることを特徴とする該方法。
17. １７．請求項９から１６までのいずれか一つに記載の方法であって、フレームを 凍結中振とうしないことを特徴とする該方法。
18. １８．実質的にここに記載した通りの、ＨＥＳを低温保護剤として使用する赤血 球の凍結法。
19. １９．請求項９から１６までのいずれか一つによって特徴づけられる方法で使用 される凍結用フレーム。
20. ２０．実質的にここで記載した通りの凍結用フレーム。
21. ２１．赤血球の凍結法であって、４５０ｍｌの標準献血ユニットの血液を選心し て血漿と血小板を取り除き、ほぼ２００ｍｌの容積を占めながら、９０％以上の 赤血球容積率を達成し、その赤血球を、平均分子量が１５０，０００から２００ ，０００の範囲であるようなＨＥＳの、ほぼ３５ｍｌの４０％ｗ／ｖＨＥＳ溶波 を含む凍結用バッグに投入し、その原信用バッグを、平行を保ちながら互いに直 角方向に僅かではあるが動くようにできている二個の平行曲面プレートを有する 凍結用フレーム内に置き、その凍結用フレームを液体窒素の中に入れ、それを、 振とうすることなくＨＥＳと赤血球の混合物が凍結するまで、そこに放置する、 という諸手順を含むことを特徴とする該方法。
22. ２２．赤血球の調製法であって、請求項１から１８のいずれか一つの方法、また は、請求項２１の方法によって輸血用に凍結され、ＨＥＳと赤血球の混合物を、 約４３．５℃の温水に、振とうすることなく、約１０分間浸すことを特徴とする 該方法。