NO179435B

NO179435B - Fremgangsmåte for frysing av röde blodceller, fryseramme for bruk derved, og fremgangsmåte for tilberedning av röde blodceller for transfusjon

Info

Publication number: NO179435B
Application number: NO913070A
Authority: NO
Inventors: Michael John Glynn Thomas; Susan Helen Bell; Stuart Graham Nash; Ernest Sidney Parry
Original assignee: Secr Defence Brit
Priority date: 1989-02-08
Filing date: 1991-08-07
Publication date: 1996-07-01
Also published as: GB2245144B; EP0457782A1; DE69006014T2; ATE99948T1; US5309723A; GB9116136D0; NZ232347A; NO913070L; RU2073972C1; AU638229B2; HU211079B; EP0564880A1; FI913735A0; KR920700662A; DK0457782T3; NO179435C; IE63695B1; ES2062509T3; AU4950490A; DE69006014D1

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for frysing av røde blodceller, og en fryseramme 'for bruk derved.

Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for tilberedning av røde blodceller, frosset ved hjelp av den ovennevnte fremgangsmåte, for transfusjon.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av de etter-følgende patentkrav.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører frysing av røde blodceller (erytrocytter) for langtidslagring på en slik måte at de forblir egnet for blodtransfusjon.

Lagring av blod for bruk ved transfusjonstjenester er velkjent. Blod lagres vanligvis under avkjølte betingelser ved 4°C hvor det har en maksimal brukstid på omtrent fem uker. Opprettholdelse av adekvate forsyninger krever derfor kon-tinuerlig samarbeid med donorer. Uheldigvis er det perioder, som f.eks. i forbindelse med juletiden, hvor forsyningene kan bli knappe. Der er også tilfeller hvor alvorlige ulykker etterlater et spesielt område med knappe forsyninger. Også et økende antall personer ønsker å lagre sitt eget blod, f.eks. før elektiv kirurgi. Det er derfor et behov for en fremgangsmåte for langtidslagring av blodforsyninger.

Lang brukslagring av blod er gjort mulig ved å fryse blodet til meget lave temperaturer hvorved det lagres. Uheldigvis

har umiddelbar frysing av levert blod vist seg umulig. Det er vanlig å lagre blod i standard enheter på omtrent 450 ml, idet dette er det volum som doneres av en donor ved en enkel donering. Pasienter som mottar transfusjoner gis vanligvis et helt antall slike enheter. Frysing av et slikt volum av blod

resulterer i hemolyse av de røde blodceller som gjør blodet ubrukbart for fremtidig bruk i transfusjoner. Hemolyse resulterer i frigivelse av kalium som er kardiotoksisk og av stroma (celleavfall) som kan bevirke nyresvikt. Det antas generelt at røde blodceller, for å være brukbare for blod-

transfusjon, ikke må ha vesentlig mer enn 1 % hemolyse. Ved en metode hvorved blod kan lagres for frysing, blir blodet sentrifugert for å separere plasma og blodplater fra røde blodceller, de røde blodceller blandes med et kryobeskyttende middel, og blandingen fryses til en meget lav temperatur, vanlig ved anvendelse av flytende nitrogen. Det mest anvendte kryobeskyttende middel er glyserol. Glyserol er uheldigvis giftig, og fremstilling av røde blodceller for bruk ved transfusjoner krever flere vaskinger for å fjerne glyserolen. Dette er en prosess som involverer dyrt utstyr, krever en høy faglig dyktighet, erfaring og konstant praksis for det ansvarlige personale, og krever også et område med høy sterilitet. Vaskeprosessen tar omtrent tyve minutter pr. enhet og resulterer i tap av mellom 15 og 20 % av cellene. Et mer attraktivt kryobeskyttende middel er hydroksyetylstivelse (HES), eller levosan.

US-PS 3.758.382 beskriver hvorledes prøver av 55 ml helblod inneholdende et antikoagulerende middel (surgjort citrat-dekstrose) ble blandet med 40 % (vekt/volum) HES med gjennomsnittlig molekylvekt 40.000 til 70.000 slik at den endelige konsentrasjon var 12 til 14 % vekt/volum HES. Blandingen ble neddykket i flytende nitrogen ved -190°C og omrørt ved 200 sykluser/minutt inntil den var frosset. Etter lagring ved

-140°C i opptil en uke ble blandingen tint ved neddykning i 60 sekunder, med omrøring ved 160 sykluser/minutt, i et vannbad ved 47°C. Gjenvinningsfaktorer opptil 99 %

(gjennomsnittlig 97,4 %) av røde blodceller ble oppnådd. De volumer som ble anvendt for frysing, nemlig 55 ml, er bare fraksjoner av standard enheter og ville bevirke uønskede komplikasjoner hvis anvendt ved konvensjonelle transfusjons-prosedyrer.

Ved en utvikling av denne prosess, som tillater frysing av standard enheter av blod, beskriver US-PS 4.018.911 en

fremgangsmåte for frysing av blod under anvendelse av HES med gjennomsnittlig molekylvekt 150.000. Blodet sentrifugeres for å separere plasma og blodplater fra de røde blodceller og noe

av plasmaet blandes med HES. Grunnen til tilsetningen av plasma er at det ble antatt nødvendig for beskyttelse av de røde blodceller. Blandingen av plasma og HES blandes således med et stort sett like stort volum av celler som gir en mengdeandel av HES i den resulterende blanding på omtrent 14 %. En standard enhetsdonasjon av 450 ml er ved dette tidspunkt redusert til omtrent 405 ml.

Blandingen av plasma og HES tilsettes til de røde blodceller i en frysepose og posen anbringes i en holder knyttet til en pendelrister, etter ytterligere blanding. Holderen er fremstilt av to perforerte sideplater av metall som er hengslet og boltet sammen, hvorimellom blodposen holdes ved en fasthet som meddelt av sideplatene fremstilt av rustfritt stål, slik at det opprettholdes et hovedsakelig jevnt tverrsnitt under frysingen. Det jevne tverrsnitt muliggjør den hurtigste frysing, idet stålplatene holder posen hovedsakelig fast under omrøring. Pose og holder neddykkes vertikalt i flytende nitrogen og ristes mens innholdet fryses. Riste-prosessen er nødvendig når en 405 ml enhet fryses på grunn av volumet av enheten og nødvendigheten av å opprettholde en hurtig frysehastighet for å nedsette hemolyse av de røde blodceller til et minimum. Blodet tines for transfusjonsformål ved neddykking i et vannbad ved omtrent 54°C med mekanisk omrøring i en periode på omtrent ett minutt. Med denne behandling kan blodet anvendes umiddelbart for transfusjon (betinget av at hemolysen er ved et tålbart nivå), som er dens vesentlige fordel fremfor blodenheter frosset med glyserol. Dette er på grunn av at det ekstracellulære kryobeskyttende middel HES er ikke-giftig og ikke-immunogent, og ligner glykogen i kroppen, slik at det ikke er noe behov for at det fjernes.

US-PS 4.018.911 beskriver en testmetode for frysing av prøver på bare 25 ml under anvendelse av denne metode hvor gjennomsnittlig 99,2 % av de røde blodceller ble gjenvunnet i den ettertinte tilstand, og 87,3 % var stabile i isotonisk saltoppløsning etter en halv time. Resultater for standard enheter med full størrelse var imidlertid mye dårligere, med cellegjenvinningsgrader ned til 97,2 % og saltoppløsnings-stabilitet ned til 75,7 %.

Bruken av HES som kryobeskyttende middel for frysekonservering av erytrocytter, trombocytter, leukocytter, benmargceller og andre organceller er beskrevet i GB-PS 2.046.772A. Cellene separeres f.eks. ved sentrifugering, celleseparasjon, filtre-ring eller adsorpsjon. En kort beskrivelse av en fryseprosess for erytrocytter refererer til separering av celler ved celle-separering (til forskjell fra sentrifugering, antatt for å etterlate noe plasma sammen med cellene) og tilsetning av en 10 % HES oppløsning i et forhold på 2/3 (HES/erytrocyttkonsen-trasjon) . Gjenvinningsgrader på mellom 95 og 98 % påberopes. Disse tidligere dokumenter indikerer at det kan være mulig å lagre og gjenvinne røde blodceller, under anvendelse av HES som et kryobeskyttende middel, med tålbare hemolysenivåer, i meget små porsjoner (25 ml i US-PS 4.018.911). Det har imidlertid hittil ikke vært mulig å lagre og gjenvinne røde blodceller i mengder som er forlikelige med transfusjons-teknikker. Videre er variasjonen i gjenvinningsgrader for nominelt identiske prøver uakseptabel høy. Mens den potensielle verdi av en transfusjonstjeneste involverende HES kryobeskyttede frosne røde blodceller således har vært kjent i lang tid, har det hittil vist seg umulig å utvikle en fremgangsmåte som gir akseptable hemolysenivåer ved gjenvinning med en tålbar lav variasjon i nivåene.

I samsvar med den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for frysing av røde blodceller under anvendelse av HES som et kryobeskyttende middel inkluderende trinnene med å sentrifugere en enhet av blod for å separere plasma og blodplater fra røde blodceller, blanding av de røde blodceller med HES og frysing av blandingen som eventuelt er anbragt i en frysepose og eventuelt å anvende en fryseramme som har to parallelle perforerte plater for å fastholde fryseposen, som er kjennetegnet ved at sentrifugeringen fortsettes inntil det oppnås et sammenpakket cellevolum (PCV) av røde blodceller på minst 90 % og at HES blandes med de røde blodceller for å tilveiebringe en blanding hvori HES er tilstede i høyst 7 % vekt/volum for HES/røde blodceller, foretrukket i 6 % vekt/volum for HES/røde blodceller, idet fremgangsmåten eventuelt omfatter et ytterligere trinn med behandling av de røde blodceller med et antikoagulerende middel før blanding med HES.

Videre tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en fryseramme, for bruk ved fremgangsmåten for frysing av røde blodceller i samsvar med oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved at de to parallelle perforerte plater er tilpasset til å bevege seg noe normalt til hverandre mens de forblir parallelle, idet platene er krummet, foretrukket kuleformet eller sylindrisk krummet, og er eventuelt tilveiebragt med et perforert område 0,9 mm tykt og/eller ikke-perforerte kanter 1,2 mm tykke.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for tilberedning av røde blodceller, frosset ved hjelp av fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen, for transfusjon, som er kjennetegnet ved at blandingen av HES og røde blodceller neddykkes i varmt vann ved omtrent 43,5°C uten risting i en periode på omtrent 10 minutter.

Det sammenpakkede cellevolum, eller hemokritt, er en funksjon som er vel kjent på området og er definert f.eks. på side 32 i Practical Haemotology av Sir John V. Davie og S.M. Lewis, 6. utgave, Churchill Livingstone 1984, ISBN 044301981-9. Det bemerkes at med fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse, i motsetning til den tidligere teknikk, er det hovedsakelig ikke noe plasma i blandingen. Til tross for tapet av noen beskyttende virkning som kunne tilveiebringes av plasmaet, anvender fremgangsmåten i henhold til den forelig gende oppfinnelse også vesentlig mindre prosentandeler vekt/volum av HES røde blodceller.

Bortsett fra oppnåelse av akseptable hemolysenivåer resulterer en ytterligere fordel ved fremgangsmåten fra fravær av plasma og reduksjon i HES. Plasma inneholder mange forskjellige proteiner, inkluderende faktorer som er ansvarlige for blodlevring, hvorav en er faktor 8. Det er funnet at når HES blandes med plasma er det en progressiv tendens for noen proteiner, særlig levrende faktorer, komplementkomponenter, immunglobuliner og fibronektin, til å bli gjort uoppløselige, ettersom mengden av HES øker (S. Bell, MSc Thesis, Library of Brunei University). Disse proteiner danner aggregater som kan bevirke at plasmaet utvikler en melkeaktig farge. Ved å støte på ubehandlet plasma, enten in vivo eller in vitro, kan disse aggregater tjene som fokus for ytterligere proteinaggregasjon, mens samtidig HES kan gi gjensidig påvirkning med mere proteiner i det friske plasma. Det resulterende avfall fjernes ved hjelp av makrofager og kan midlertidig redusere pasientens immunkompetanse. På grunn av at levringsfaktorer og fibronektin er påvirket, kan blødningstidene forlenges i proporsjoner med "dosen" av HES. HES er foretrukket i form av en oppløsning med 40 % vekt/volum HES, og HES kan ha en gjennomsnittlig molekylvekt i området 150.000 til 200.000.

En foretrukket enhet er basert på en standard donorenhet på 450 ml og har hovedsakelig 200 ml røde blodceller blandet med omtrent 35 ml 40 % HES oppløsning til å gi en total enhet for frysing på omtrent 235 ml.

De røde blodceller kan fordelaktig behandles med et antikoagulerende middel og konserveringsmiddel (som f.eks. citratfos-fat, dekstroseadenin (CPDA), citratfosfatdekstrose (CPD) eller heparin) før de blandes med HES.

Fryseprosessen foregår foretrukket i flytende nitrogen med blandingen i en frysepose holdt i en ramme som har to parallelle perforerte plater hvorimellom fryseposen inne-holdes, idet platene er tilpasset for å bevege seg litt normalt i forhold til hverandre mens de forblir parallelle. En foretrukket ramme har aluminiumplater av krum form, idet krumningen er et tverrsnitt med enten sylindrisk eller foretrukket kuleform.

Det er funnet at blandingen i en frysepose er meget følsom for lokal fortykning av posen under fryseprosessen. Det er en tendens til at blandingen ekspanderer ved frysing, og tidligere kjente fryserammer vil enten deformeres til å gi lokal utbuling, for å akkommodere denne utvidelse, eller forhindre adekvat ekspansjon, slik at det bevirkes knuseskade. Ved å tillate normal bevegelse av parallelle plater unngås lokal fortykning av fryseblandingen.

Med fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er volumet av en standard enhet, når fremstilt for frysing (235 ml), slik at det er funnet mulig å fryse blandingen ved passende hastighet uten å riste posen som nødvendig ved tidligere metoder. Dette resulterer i en tydelig reduksjon i kravene til utstyr og i arbeidskomplikasjoner, og man unngår også en mulig årsak til hemolyse (fysikalsk skade på cellene bevirket ved risting).

Røde blodceller blir etter sentrifugering foretrukket ført direkte til en frysepose hvori HES er lagret.

Blod som er frosset ved den ovennevnte fremgangsmåte tilberedes for transfusjon ved neddykking i varmt vann ved omtrent 43,5°C uten risting (slik at en ytterligere mulig grunn for hemolyse unngås) i omtrent ti minutter inntil det når omtrent human kroppstemperatur.

Det er funnet at det ved å anvende den ovennevnte fremgangsmåte for frysing og tining av en blodenhet, basert på en standard donorenhet, kan det oppnås et utbytte av saltoppløs-ningsstabile celler, i løpet av en halv time, på 91 % med standardavvik (SD) ± 0,75 %, og en midlere gjenvinning ved tining på 99,1 % ± 0,12 %. Blod kan være klart for transfusjon til en pasient i løpet av elleve minutter fra fjernelse fra lagring i flytende nitrogen.

En utførelsesform av fremgangsmåten for frysing i samsvar med oppfinnelsen og apparat for bruk derved skal nå beskrives, som eksempel, med henvisning til de vedføyde skjematiske tegninger, hvorav: Fig. 1 er et skjematisk riss av prosedyren fra mottak av en standard enhet av blod fra en donor til blandingen

av HES og røde blodceller i en frysepose,

fig. 2 er et planriss av en plate som anvendes i en fryseramme i oppfinnelsens sammenheng,

fig. 3 er et planriss tilsvarende fig. 1 og viser en

frysepose i posisjon på platen, og

fig. 4 er et snittoppriss av en fryseramme med en frysepose

i posisjon.

En standard enhet av blod (450 ml) fra en donor (ikke vist) doneres gjennom et rør 10 (fig. 1) til en lagringspose 11 inneholdende et antikoagulerende middel og konserveringsmiddel (CPDA) og posen forsegles og anbringes i en sentrifuge (ikke vist). Sentrifugering av posen 11 resulterer i separering av plasma og blodplater som trykkes ut og flyter til en pose 12.

Røde blodceller (hovedsakelig 200 ml) sammenpakket til et PCV på minst 90 %, passerer til en frysepose 13, inneholdende hovedsakelig 35 ml hydroksyetylstivelse (HES), foretrukket 40 % vekt/volum og med molekylvekt 150.000 til 200.000. Dette gir omtrent 25,5 % HES i fluidet utenom og omgivende de røde blodceller, slik at HES er tilstede i høyst 7 % vekt/volum for HES/røde blodceller (foretrukket 6 % vekt/volum HES/røde blodceller).

Fryseposen 13 har plan, tynn, kvadratisk form. Posen 13 fjernes så og forsegles etter utpressing av eventuell luft, og HES og de røde blodceller blandes f.eks. ved manuell inversjon og rotasjon i flere minutter.

Fremgangsmåten fra donering av blodet til forsegling av posen 13 må gjennomføres under sterile omgivelser, og foretrukket anordnes prosedyren slik at forbindelsene fra røret 10 til fryseposen 13 er kontinuerlige og ubrutte, og at eventuelle løsgjøringer kan gjennomføres ved samtidig kutting og forsegling av alle forbindelser. Den generelle prosess med sentrifugering og blanding av de røde blodceller med løsningsmiddel (HES) er velkjent på området - f.eks. i US-PS 4.018.911 - og behøver følgelig ingen mer utførlig beskrivelse heri.

En fryseramme (fig. 2, 3, 4) har to plater 20, 21, som hver er hovedsakelig kvadratisk og krummet til å danne en del av overflaten av en kule, idet kulene er konsentriske og den ytre med en radius omtrent 3 mm større enn den indre. Kuleformen er f.eks. av en størrelsesorden slik at der er en 2 cm forskyvning av senteret av en rammekorde på omtrent 33 cm (denne rammestørrelse er funnet å være egnet for frysing av en standard enhet av blod). Kantene av hver plate 20, 21 har flenser 22 for å muliggjøre lokalisering av platene i forhold til hverandre.

Hver plate er tildannet fra et material, foretrukket aluminium, med gode varmeledende egenskaper, og har et flertall perforeringer 23 (fig. 2) som opptar hovedsakelig 50 % av overflatearealet. Fryseposen 13 anbringes på platen 21 slik at den er fullstendig omgitt av perforerte deler av platen (se fig. 3). Den andre plate 20 anbringes over den første plate.21 og posen 13 og fastholdes i posisjon av et antall klemmer som f.eks. vist ved 24 i fig. 4. Gripearmer 25 på hver klemme 24 har en svak grad av bøyelighet og er anbragt slik at de griper kantene av rammene 20, 21 hvor de ikke ligger over fryseposen 13.

Rammen 20, 21 og fryseposen 13 neddykkes så vertikalt i en beholder (ikke vist) med flytende nitrogen idet blandingen HES/røde blodceller hurtig fryses i løpet av omtrent tretti sekunder. Der er en tendens til at blandingen ekspanderer ved frysingen og fleksibiliteten av gripearmene 25 på klemmene 24 tillater at platene 20, 21 beveger seg noe fra hverandre for å kompensere for denne ekspansjon. Krumningen av platene 20, 21forhindrer dem imidlertid fra deformasjon, med det resultat at de forblir parallelle med hverandre ved alle punkter og opp-rettholder tykkelsen av fryseposen konstant over hele dennes område. Det er funnet at dette er viktig, ettersom lokal ekspandering av fryseposen er funnet å resultere i en økt lokal hemolyse.

Blod frosset som beskrevet i det foregående kan lagres ved temperaturen for flytende nitrogen i betraktelige tids-perioder. Når det fjernes fra fryseren blir det forberedt for transfusjon ved neddykking i varmt vann ved omtrent 43,5°C uten risting i en periode på omtrent ti minutter hvorunder dets temperatur tillates å stige til foretrukket human blodtemperatur før det anvendes for transfusjon.

Det er funnet at ved å anvende denne fremgangsmåte oppnås hemolysegrader av størrelsesorden ikke dårligere enn 1 %, som er et betraktelig bedre utbytte av røde blodceller enn det som oppnås med tidligere metoder for frysing og preparering.

Den etterfølgende tabell 1 gir detaljer av ti prøver som fryses og gjenvinnes ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i det foregående. Den anvendte fryseramme hadde perforerte områder på platene 20, 21 med tykkelse 0,9 mm og ikke-perforerte kanter av platene med tykkelse 1,2 mm.

midlere Vi times stabilitet midlere gjenvinning = 99,1 % i saltoppløsning = 91,0 % st.avvik (SD) 0,12 %

st.avvik (SD) 0,75 %

Midlere plasmastabilitet er 4 % høyere enn saltoppløsnings-stabilitet.

Tabell 2 angir i detalj viktige parametre som viser at effektiviteten av oksygentilførsel og overlevelse av røde blodceller er uendret eller ikke vesentlig påvirket ved den ovenfor beskrevne metode.

Det kan derfor sees at fremgangsmåten tilveiebringer en metode for konservering og gjenvinning av standard enheter av røde blodceller med et gjentagbart nivå for hemolyse som er akseptabelt for transfusjonsformål. Det faktum at volumet av standardenheten reduseres til omtrent 235 ml er en ytterligere fordel ettersom det tillater at flere enheter (dvs. flere røde blodceller) kan transfuseres inn i en pasient på en gang.

Transfusjonsblandingen er hovedsakelig fri for forurensninger som kunne skade en pasient og mengden av HES er redusert i sammenligning med den som ble anvendt innen tidligere kjente frysemetoder.

Videre ansees hele fremgangsmåten å være enklere enn tidligere beskrevne fremgangsmåter ettersom den ikke krever noe utstyr som f.eks. er nødvendig for å vibrere fryseramme og frysepose under en fryseprosess. En operatør kan faktisk fryse blod uten anvendelse av annet utstyr enn beskyttelseshansker og et par tenger. Tineprosessen kan også gjennomføres av uøvet personell uten noe mer komplisert enn en bøtte av antatt"lunkent" vann, anslagsvis i ti minutter, og fremdeles oppnå utmerkede resultater.

Forskjellige modifikasjoner av den ovenfor beskrevne fremgangsmåte og utstyret kan anvendes. Selv om platene 20, 21 er beskrevet f.eks. med kuleform, og dette er selvfølgelig ideelt, er det mulig at sylindrisk krumning alene eller noen form for vinklet utforming kan være tilstrekkelig til å opprettholde den parallelle natur av platene mens normal relativ bevegelse under fryseprosessen fremdeles tillates. Andre materialer enn aluminium kan også anvendes.

Mens fremgangsmåten er ment for bruk med standard enheter av blod, for å være forlikelig med konvensjonell praksis for donering og transfusjoner, kan den også anvendes, for mindre enheter. Den kan f.eks. anvendes ved fremstilling av småposer - dvs. poser med ministørrelse, f.eks. med dimensjoner på 5 cm i kvadrat - for lagring for forsøksvirksomhet eller for prøver av sjeldne blodtyper.

Claims

1. Fremgangsmåte for frysing av røde blodceller under anvendelse av HES som et kryobeskyttende middel inkluderende trinnene med å sentrifugere en enhet av blod for å separere plasma og blodplater fra røde blodceller, blanding av de røde blodceller med HES og frysing av blandingen som eventuelt er'anbragt i en frysepose og eventuelt å anvende en fryseramme som har to parallelle perforerte plater for å fastholde fryseposen, karakterisert vedat sentrifugeringen fortsettes inntil det oppnås et sammenpakket cellevolum (PCV) av røde blodceller på minst 90 % og at HES blandes med de røde blodceller for å tilveiebringe en blanding hvori HES er tilstede i høyst 7 % vekt/volum for HES/røde blodceller, foretrukket i 6 % vekt/volum for HES/røde blodceller, idet fremgangsmåten eventuelt omfatter et ytterligere trinn med behandling av de røde blodceller med et antikoagulerende middel før blanding med HES.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat de røde blodceller blandes med HES i form av en oppløsning av 40 % vekt/volum HES.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2,karakterisert vedat de røde blodceller blandes med HES som har en gjennomsnittlig molekylvekt i området 150.000 til 200.000.

4. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1-3,karakterisert vedat rammen ikke ristes under frysing.

5. Fryseramme, for bruk ved fremgangsmåten for frysing av røde blodceller som angitt i ett eller flere av kravene 1-4,karakterisert vedat de to parallelle perforerte plater er tilpasset til å bevege seg noe normalt til hverandre mens de forblir parallelle, idet platene er krummet, foretrukket kuleformet eller sylindrisk krummet, og er eventuelt tilveiebragt med et perforert område 0,9 mm tykt og/eller ikke-perforerte kanter 1,2 mm tykke.

6. Fremgangsmåte for tilberedning av røde blodceller, frosset ved hjelp av fremgangsmåten som angitt i ett eller flere av kravene 1-4, for transfusjon, karakterisert vedat blandingen av HES og røde blodceller neddykkes i varmt vann ved omtrent 43,5°C uten risting i en periode på omtrent 10 minutter.