KR0148223B1 - 적혈구세포 냉동방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단위 혈액을 원심 분리시켜 혈장과 혈소판을 제거하고 적혈구 세포의 포장 세포 용적(Packed Cell Volume)이 90% 이상이 되도록 한 후 HES 용액을 함유하는 냉동백(13)에 이 적혈구 세포를 가하여 HES/적혈구 세포의 비가 7%(바람직하게는 6%) w/v 이하가 되게 하여, 백 내용물의 두께를 일정하게 유지하도록 조정된 냉동 프레임(20,21)에 이 냉동백(13)을 위치시키고, 진동없이 이 프레임(20,21)을 액체 질소중에 위치시킴을 특징으로 하여, 장시간 저장할 수 있고 이후에 수혈 목적으로 충분히 순수한 형태로 회수될 수 있는 표준 제공 단위의 적혈구 세포 냉동 방법에 관한 것이다.

Description

적혈구 세포 냉동방법

제1도는 채혈자로부터 표준 단위 혈액을 채혈하는 것으로 부터 냉동백에서 HES와 적혈구 세포를 혼합하기까지의 도식도이고,

제2도는 본 발명에 사용하기 위한 냉동 프레임 중에 사용되는 판의 평면도이고,

제3도는 제1도에 상응하는 평면도로서 판 상에서 냉동백의 위치를 나타내고,

제4도는 냉동백이 위치된 냉동 프레임의 정단면도이다.

본 발명은 오랜 저장 기간 동안 적혈구 세포(red blood cell: erythrocyte)가 수혈에 적합하도록 유지되는 적혈구 세포의 냉동 방법에 관한 것이다.

수혈을 위한 혈액 저장은 널리 공지되어 있다. 혈액은 보통 4℃의 냉장상태에서 보관되며, 이 조건하에서 혈액은 최대 약 5주의 시간적 유효성을 갖는다. 따라서 적절한 공급을 위해서는 끊임없는 헌혈자의 공동협조가 필요된다. 불행하게도 크리스마스 임박시기와 같은 기간에는 혈액공급이 부족하게 된다. 또한, 심한 재난으로 혈액 공급 부족 지역이 생기기도 한다. 또한, 예를 들어, 선택적 수술전에 그 자신의 혈액을 저장해 두고자 하는 사람들이 증가하고 있다. 따라서, 혈액 공급물의 장시간 저장 방법의 요구되게 된다. 혈액의 장기 저장은 혈액을 매우 낮은 온도에서 냉동시킨후 저장함으로써 가능하다. 불행하게도, 공급되는 상태로 혈액을 냉동시키는 것은 불가능한 것으로 판명되었다. 혈액을 약 450ml의 표준 단위로 저장하는 것이 통례이며, 이는 1인으로부터 1회에 채혈되는 양이다. 수혈을 하는 환자는 대부분 이와 같은 단위를 여러개 투여받게 된다. 이와 같은 양의 혈액을 냉동시키면 적혈구 세포의 용혈현상이 나타나서 추후에 혈액을 수혈용으로 쓸수 없다. 용혈에 의해 심장독소인 칼륨과 신장손상을 일으키는 기질(세포파편)이 방출된다. 일반적으로 수혈을 위해서는 적혈구가 실질적으로 1% 이상 용혈 되어서는 안되는 것으로 여겨지고 있다. 혈액을 냉동시켜 저장하는 방법에 있어서, 적혈구 세포로부터 혈장과 혈소판을 분리시키기 위해 혈액을 원심 분리시키고, 이 적혈구 세포를 저온 보호제(cryoprotective agent)와 혼합하고, 이 혼합물을, 일반적으로 액체 질소를 사용하여, 매우 낮은 온도에서 냉동시킨다. 통상적으로 사용되는 저온 보호제는 글리세롤이다. 불행히도, 글리세롤은 독성이며 적혈구 제재를 수혈에 사용하기 위해서는 글리세롤을 제거하기 위해 수회의 세척조작이 필요하다. 이것은 막대한 설비, 고도의 표준기술, 경험 및 담당자의 해당분야에 대한 꾸준한 실습이 요구되는 과정이며, 고도의 무균 영역이 요구된다. 세척 공정은 단위당 약 20분의 시간의 소요되며 적혈구 세포 15 내지 20%를 상실하게 된다. 보다 그럴듯한 저온 보호제는 하이드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch: HES) 또는 레보산(laevosan)이다.

미합중국 특허 제3,758,382호는, 항응고제(산성화시킨 시트레이트 덱스트로스)를 함유하는 55ml의 전혈 샘플을 40,000 내지 70,000의 평균분자량을 갖는 40% w/v HES와 혼합시켜 최종 농도를 12 내지 14% w/v HES로 만드는 방법을 기술하고 있다. 이 혼합물을 -190℃ 의 액체질소중에 함침시키고 냉동될때까지 200회/분으로 교반시킨다. 일주일 동안 -140℃에서 저장한 후, 이 혼합물을 160회/분의 교반 속도로 교반하면서, 47℃ 의 수욕 중에서 60초동안 함침시켜 해빙시킨다. 99% 이하(평균 97.4%)의 적혈구 세포 회복율이 성취된다. 그러나, 냉동에 사용된 용적, 즉 55ml는 표준 단위의 분획에 불과하며, 통상적인 수혈 방법에 사용할 경우 바람직하지 않은 문제를 유발시킬 수도 있다.

표준 단위의 혈액을 냉동시키기 위한 이러한 공정의 개발 과정중 미합중국 특허 제4018911호는 평균 분자량이 150,000인 HES를 사용하여 혈액을 냉동시키는 방법을 기술하고 있다. 적혈구 세포로부터 혈장과 혈소판을 분리시키기 위해 혈액을 원심 분리시키고 혈장의 일부를 HES와 혼합한다. 혈장을 첨가하는 이유는 적혈구 세포의 보호에 필요한 것으로 여겨지기 때문이다. 혈장과 HES의 혼합물을 대략적으로 등용적의 적혈구 세포와 혼합하여, 생성된 혼합물중에서 HES의 비율이 14%수준이 되도록 한다. 이때, 450ml의 표준 단위의 제공은 약 405ml로 줄어들게 된다. 혈장과 HES의 혼합물을 냉동백(bag)중의 적혈구 세포에 가하고 추가로 더 혼합시킨 다음. 이 백을 펜듀럼 진동기에 부착된 홀더에 위치시킨다. 이 홀더는 경첩을 갖고 있으며 서로 볼트로 연결되어 결합된 두개의 천공 금속 측판으로 구성되며, 이 사이에서 스테인레스강으로 만든 측판에 의해 혈액백을 단단히 고정시킬 수 있도록 하여 냉동동안에 실질적으로 균일한 횡단면을 유지하도록 한다. 이 균일한 횡단면은 가장 빠른 냉동을 가능케 하며, 강판은 핼액백을 요동시키는 동안 실질적으로 견고하게 유지시킨다. 백과 홀더를 액체 질소중에 수직으로 함침시키고 내용물이 냉동되는 동안 진동시킨다. 이 진동방법은 단위 용적으로서 405ml를 냉동시켜야 하고 적혈구 세포의 용혈작용을 최소화시키기 위해 빠른 속도로 냉동시키고자 할때 요구된다. 수혈시 혈액은 실질적으로 54℃ 의 수욕에 함침시키고 실질적으로 1분동안 기계적으로 요동시켜 해빙시킨다. 이런 처리로써 혈액은 바로 수혈에 사용될 수 있으며 (단 용혈이 허용할만한 수준에 있다면), 이것이 글리세롤을 사용하여 혈액 단위를 냉동시키는 방법을 능가하는 주요 장점이다. 이는 세포외 저온보호제 HES가 무독성이고 비면역원성이며 신체의 글리코겐을 닮은 형태이기 때문이며, 이로인해 HES를 제거할 필요가 없다.

미합중국 특허 제4018911호는 이 방법을 이용하여 단지 25ml의 냉동샘플을 시험하는 시험방법을 기술하고 있는데, 여기서 99.2%의 적혈구 세포가 해빙 후 상태에서 회수되었으며 이중 87.3%가 증장성 식염수중에서 30분후에도 안정하였다. 그러나, 전 크기(full size)의 표준 단위에 대한 결과는 훨씬 저조하여, 세포의 회수율이 97.2% 로 떨어지고 식염수 안정성은 75.7%로 떨어졌다.

적혈구, 혈전구, 백혈구, 골수세포 및 기타 기관세포의 냉동보존을 위한 저온 보호제로서 HES의 용도는 영국 특허원 GB 2046772A에 기술되어 있다. 이 세포들은 예를 들어, 원심분리, 세포분리, 여과 또는 흡착으로 분리시킨다. 적혈구 세포의 냉동 방법에 대한 간단한 설명에서는 세포를 분리하고 (원심 분리와는 구별되는 것으로서 세포와 함께 일부의 혈장을 잔류시킨다.) 2/3(HES/적혈구 농도) 비율로 10% HES 용액을 가하는 세포분리를 언급한다. 95 내지 98% 사이의 회수율이 주장되고 있다.

이들 선행 문헌들은, 허용가능한 용혈수준을 유지하면서, 저온 보호제로서 HES를 사용하여, 매우 적은 배치(25ml, 미합중국 특허 제4018911호)중에 적혈구 세포를 저장 및 회수할 수 있다는 것을 교시하고 있다. 그러나, 지금까지 수혈에 필적할 만한 양의 적혈구 세포를 저장 및 회수하는 것이 가능하지 않았다. 또한, 명목상 동일한 샘플에 대한 회수율의 변화가 허용치 이상으로 만큼 높다. 따라서, HES 냉동 보호된 냉동 적혈구 세포를 수반하는 수혈의 잠재적 가치가 오랫동안 공지되어 왔으나, 아직까지 용혈 수준의 변화가 허용할 만큼 낮으면서 회수시 허용할만한 용혈 수준을 제공하는 방법을 고안하는 것이 불가능한 것으로 밝혀졌었다.

본 발명에 따라, HES를 저온보호제로 사용하여 적혈구 세포를 냉동시키는 방법은 적혈구 세포로부터 혈장과 혈소판을 분리시키기 위해 단위 혈액을 원심 분리시키고, 적혈구와 HES를 혼합하여, 이 혼합물을 냉동시키는 것을 포함하며, 혼합하기 전의 적혈구 세포가 90% 이상의 포장된 세포 용적(Packed Cell Volume)을 가지며, 혼합물중의 HES가 7% w/v 이하의 HES/적혈구 세포로 존재함을 특징으로 한다.

포장된 세포 용적 또는 헤모크릿(haemocrit)은 당해 분야에 널리 공지된 함수이며 문헌에 정의되어 있다.[참조: Sir John V. Davie and S.M. Lewis, Practical Haemotology, 32 페이지, 6판, Chutchill Livingstone 1984, ISBN 044301981-9]. 선행 기술과 달리 본 발명의 방법에서는 혼합물중에 혈장이 실질적으로 없다. 또한, 혈장에 의해 제공될 수 있는 특정 보호 효과의 상실에도 불구하고, 본 발명의 방법은 현저하게 낮은 w/v 퍼센트의 HES/적혈구 세포를 사용한다.

허용가능한 용혈수준의 성취이외에도, 본 발명의 방법의 또다른 장점은 혈장의 부재와 HES의 감소에 있다. 혈장은 다수의 상이한 단백질을 포함하고 있으며, 이중에는 혈액응고를 담당하는 인자도 포함하고 있는데 그중 하나가 인자 8이다. HES가 혈장과 혼합될때, HES의 양이 증가됨에 따라 몇몇의 단백질, 특히 응고인자, 보체 성분, 면역글로불린 및 피브로넥틴등이 점진적으로 불용성이 된다[참조: S. Bell, MSc Thesis, Library of Brunel University].

이들 단백질은 응집체를 형성하며 이는 혈장이 우유빛 색깔을 나타내도록 한다. 비처리된 혈장을 만나면, 시험관내 또는 생체내에서 이들 응집체들은 또다른 단백질 응집의 위치를 제공할 수 있으며, 동시에 HES가 신선한 혈장중의 더 많은 단백질과 반응할 수 있다. 생성된 파편은 대식세포에 의해 제거되며 일시적으로 환자의 면역 적성을 감소시킬 수 있다. 응고 인자와 피브로넥틴이 영향을 받으므로, 채혈시간은 HES의 용량에 비례하여 연장될 수 있다. HES는 바람직하게는 40% w/v HES의 용액 형태이며, HES는 150,000 내지 200,000의 평균 분자량을 가질 수 있다.

바람직한 단위는 450ml의 표준 제공 단위에 근거하고 있으며, 실질적으로 200ml의 적혈구 세포가 실질적으로 35ml의 40% HES 용액과 혼합되므로 냉동을 위한 총 단위는 약 235ml이다.

적혈구 세포는 HES와 혼합하기 전에, 유리하게는 항응고제 및 보존제(예를 들어, 시트레이트 포스페이트 덱스트로스 아데닌(CPDA), 시트레이트 포스페이트 덱스트로스(CPD) 또는 헤파린)로 처리 할 수 있다.

냉동 공정은 바람직하게는 평행을 유지하면서 서로에 대해 약간 움직일 수 있도록 조정된 2개의 천공 판(이들 사이에 냉동백이 포함된다.)을 갖는 프레임내에 고정된 냉동백중의 혼합물을 사용해 액체 질소중에서 수행한다.

바람직한 프레임은 굽은 형태의 알루미늄 판이며, 이때의 커브의 단면은 실린더형 또는, 바람직하게는 구형의 단면에 해당한다.

냉동백중의 혼합물은 냉동공정안의 국소적인 조밀화에 대단히 민감한 것으로 밝혀졌다. 냉동시 혼합물이 팽창하는 경향이 있으며, 선행기술의 냉동 프레임은 이러한 팽창을 수용하기 위해 냉동 프레임이 뒤틀려 국소적인 팽창이 나타나거나 적절한 팽창을 막음으로써 눌려터지는 손상을 유발시켰다. 평행판의 정상적 이동을 허용하면 냉동 혼합물의 국소적인 조밀화가 피해진다.

본 발명에 따른 방법을 이용하여, 표준 단위의 용적(냉동을 위해 제조되는 경우 235ml)이 선행기술에서 요구되는 바와 같은 냉동백의 진동없이 혼합물을 적당한 속도로 냉동시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이는 설비의 현저한 감축과 조작상의 복잡성을 현저히 줄이게 되는 결과를 낳고, 또한 잠재적인 용혈유발(진동에 의한 적혈구 세포의 물리적 손상)을 피할 수 있게 한다.

원심분리후의 적혈구세포는 바람직하게는 HES가 저장된 냉동백으로 직접 옮긴다.

상기 방법에 의한 냉동 혈액은 바람직하게는 진동없이 (또다른 용혈 가능성을 피하기 위해), 약 43.5℃ 정도의 따뜻한 물중에 대략적으로 사람 체온에 도달 할때까지 약 10분간 함침시켜 수혈용으로 준비한다.

표준 제공 단위에 근거하여, 상기한 혈액 단위의 냉동 및 해빙 방법을 이용하면, 30분에 91% SD± 0.75%의 식염수 안정 세포율 및 해빙시 99.1% ± 0.12%의 평균 회수율을 성취할 수 있음이 밝혀졌다. 혈액은 액체 질소중의 저장으로부터 꺼내어 11분내에 환자에게 수혈할 수 있다.

본 발명을 수행하는 방법 및 본 발명에 사용되는 장치가, 첨부된 도식적 도면을 참고로 하여 예로써 기술될 것이다.

도면에서 제1도는 채혈자로부터 표준 단위 혈액을 채혈하는 것으로 부터 냉동백에서 HES와 적혈구 세포를 혼합하기까지의 도식도이고,

제2도는 본 발명에 사용하기 위한 냉동 프레임 중에 사용되는 판의 평면도이고,

제3도는 제1도에 상응하는 평면도로서 판상에서 냉동백의 위치를 나타내고,

제4도는 냉동백이 위치된 냉동 프레임의 정단면도이다.

채혈자(나타내지 않았음)로부터의 표준 단위의 혈액(450ml)을 튜브 10(제1도)을 통해 항응고제 및 보존제(CPDA)를 함유한 저장백 11로 보내고 이를 밀봉하고 원심분리기(나타내지 않았음)에 위치시킨다. 백 11을 원심 분리시키면 혈장 및 혈소판의 분리가 일어나며 이는 배 12로 흘러보낸다.

90% 이상을 PCV에 포장한 적혈구 세포(실질적으로 200ml)를 실질적으로 35ml의 하이드록시에틸 전분(HES), 바람직하게는 분자량 150,000 내지 200,000의 40% w/v HES을 함유하는 냉동백 13으로 통과시킨다. 이는 유체중의 약 25.5%의 HES가 적혈구 세포 외부에 위치하여 적혈구 세포를 적시며, 이로써 HES는 7% w/v 이하의 HES/적혈구 세포(바람직하게는 6% w/v의 HES/적혈구 세포)로 존재한다.

냉동백 13은 편평하고 얇으며 정사각형이다. 백 13을 꺼내어 모든 공기를 제거한 후 밀봉하며 HES와 적혈구 세포를, 예를 들어, 손으로 수분동안 뒤집고 흔들어서 혼합시킨다.

채혈로부터 백 13의 밀봉까지의 공정은 반드시 멸균 조건하에서 수행해야 하며, 바람직하게는 이런 공정은 튜브 10으로부터 냉동백 13으로의 연결이 연속적이고 파손되지 않으며 어떠한 이탈(detachment)이라도 연결부의 동시적인 절단 및 밀봉을 통해 수행할 수 있도록 정렬시킨다. 원심분리 및 적혈구 세포를 용매(HES)와 혼합시키는 일반적 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며(예: US 4018911) 더 이상의 완전한 기술이 본원에서 필요치 않다.

냉동 프레임(제2도, 제3도, 제4도)은 2개의 판 20 및 21을 갖고 있으며, 판 20 및 21 각각은 실질적으로 정방형이고 둥근 표면 부분을 형성하도록 굽어 있으며, 이 구상(sphericity)은 외부의 판이 내부의 판보다 약 3mm가 큰 긴 반경을 갖는 동심구이다. 구상은 예를 들어, 약 33cm 의 프레임 커드(chord)의 중심에서 2cm의 간격을 둔다 (이런 프레임 크기가 표준 단위 혈액을 냉동시키는데 적합한 것으로 밝혀졌다.). 각 판(20,21)의 가장자리는 판이 서로에 대해 위치를 잡을 수 있도록 하는 플렌지 22를 갖고 있다.

각 판은, 양호한 열전도 특성을 갖는 물질, 바람직하게는 알루미늄으로 제조되며, 실질적으로 표면적의 50%를 차지하는 많은 천멍 23(제 2도)을 갖는다. 냉동백 13을 판 21상에 위치시켜 판의 천공부로 냉동백을 완전히 둘러싼다(제3도). 그 후 제2의 판 20을 제1의 판 21 및 백 13위에 위치시키고 제4도에 나타난 24와 같은 여러개의 클립으로 위치를 잡아준다. 각 클립 24의 그립퍼 암(gripper arm) 25은 약간의 신축성이 있으며 프레임 20, 21의 가장자리를 잡을 수 있게 하되 냉동백 13의 위를 누르게 하지 않도록 한다

그후 프레임 20, 21 및 냉동백 13을 액체 질소의 용기 (나타나지 않음)중에 수직으로 함침시키면 HES/적혈구 세포 혼합물이 약 30초내에 빠르게 냉동된다. 혼합물은 팽창하는 경향이 있으며, 클램프 24의 그립퍼 암 25의 신축성은 판 20, 21이 이런 팽창을 보상하도록 약산 움직일 수 있도록 한다. 판 20, 21의 만곡이 판이 뒤틀리는 것을 방지하므로, 이들은 모든 점에서 서로에 대해 평행을 유지하고 냉동백의 두께가 전체 면적에 걸쳐 일정하도록 냉동백의 두께를 유지시킨다. 냉동백이 국소적으로 팽창하면 국소적 용혈 현상이 증가되므로, 이같은 점은 중요한 것으로 밝혀졌다.

전술한 바와 같이 냉동된 혈액은 액체 질소의 온도하에서 장시간에 걸쳐 보관할 수 있다. 냉동기로 부터 꺼내어 이를 약 10분동안 진동없이 약 43.5℃의 따뜻한 물중에 함침시켜 (이러는 동안 수혈에 사용하기 전의 온도를 바람직하게는 사람 체온까지 상승시킬 수 있다) 수혈용으로 준비하는 것이 바람직하다.

이 방법을 이용하면 용혈 현상이 1% 이내로 성취되며 이는 선행의 냉동 및 제조방법에 비해 눈에 띄게 우수한 적혈구 세포 수율을 성취하는 것으로 밝혀졌다.

다음의 표 1은 상술한 방법으로 냉동시키고 회수한 10개의 샘플에 대해 상술한다. 사용된 냉동 프레임은 두께가 0.9mm인 천공 영역 및 두께가 1.2mm인 비천공 가장자리를 갖는 판 20, 21을 갖는다.

표2는 산소 운반 효율 및 적혈구 생존율이 상기한 방법에 의해 변화되지 않거나 영향받지 않음을 나타내는 주요 변수를 상술한다.

따라서, 본 발명의 방법은 수혈 목적에 허용가능한 재현 가능한 수준의 용혈현상을 갖는 표준 단위의 적혈구 세포의 보존 및 회수 방법을 제공한다는 것을 알 수 있다. 표준 용적이 약 235ml로 감소된다는 것은, 1회에 보다 많은 단위(즉, 보다 많은 적혈구세포)가 환자에게 수혈될 수 있으므로 또다른 장점이다.

수혈 혼합물은 환자에게 해로울 수 있는 불순물이 없으며 HES의 양은 선행 냉동 방법에 사용된 것에 비해 감소된다.

또한, 냉동 프레임과 냉동백을 냉동시키는 과정동안 진동시키는 선행방법과는 달리 전혀 기계설비가 필요치 않으므로 선행 방법에 비해 전체 공정이 현저하게 단순하다. 실제로 조작자는 장갑과 집게이외의 장비를 사용하지 않고 혈액을 냉동시킬 수 있다. 또한, 해빙 방법은, 물통의 물이 '손으로 느껴 따뜻하다'는 것을 판단하고 10분을 세는 것 이외에는 다른 복잡함 없이도 훈련되지 않은 지원자에 의해 수행될 수 있으며, 우수한 결과를 얻을 수 있다.

본 발명의 범주내에서 상기 기술된 방법 및 장치에 다양한 변형이 가해질 수 있음을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 판 20, 21이 구상인 것으로 기술되었으나, 물론 이상적이긴 하나, 실린더형의 곡선 단독 또는 각이 진 일부의 형태도 냉동과정 동안 정상적인 상대적 이동을 허용하면서 충분히 판의 평행 상태를 유지시킬 수 있다. 알루미늄 이외에 다른 재료도 사용될 수 있다.

또한, 본 방법이 표준 단위 혈액에 사용되도록 의도되었지만, 통상적인 채혈 및 수혈 실시와 합치되기 위해, 이는 보다 작은 형태로도 사용될 수 있다. 예를 들어 이것은 실험목적 또는 희귀 혈액 타입의 샘플의 보존을 위한 새세이(sachet), 즉 소형 크기의 백, 예를 들어 5cm 크기의 제제에 사용될 수 있다.

Claims (21)

1. 단위 혈액을 원심 분리시켜 적혈구세포로부터 혈장 및 혈소판을 분리시키고, 적혈구 세포를 HES(하이드록시에틸 전분)와 혼합시킨 후, 이 혼합물을 냉동시키는 단계를 포함하고, HES와의 혼합전에 적혈구 세포가 90%이상의 포장된 세포 용적(Packed Cell Volume)을 가지며 혼합물중의 HES가 7% w/v 이하의 HES/적혈구 세포의 비로 존재함을 특징으로 하는, 저온보호제로서 HES를 사용하는 적혈구 세포 냉동방법.
2. 제1항에 있어서, HES가 6% w/v의 HES/적혈구 세포의 비로 존재함을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, HES가 40% w/v HES의 용액 형태임을 특징으로 하는 방법
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, HES의 평균분자량이 150,000 내지 200,000임을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단위 혈액이 표준 제공 단위 450ml에 기준함을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적혈구 세포를 HES와 혼합하기 전에 항응고제로 처리하는 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 냉동을 액체질소중에서 실시함을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혼합물이 냉동백중에 있음을 특징으로 하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 냉동백이 냉동시키는 동안 두개의 평행한 천공판을 갖는 프레임 중에 고정됨을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 판이 서로 평행하게 있으면서 서로에 대해 약간 움직이도록 조종됨을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 판이 굽어져 있음을 특징으로 하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 판이 둥글게 굽어져 있음을 특징으로 하는 방법.
13. 제11항에 있어서, 판이 실린더형으로 굽어져 있음을 특징으로 하는 방법.
14. 제9항에 있어서, 프레임이 알루미늄으로 형성됨을 특징으로 하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 판의 천공 영역의 두께가 0.9mm임을 특징으로 하는 방법.
16. 제14항에 있어서, 판의 비천공 가장자리의 두께가 1.2mm임을 특징으로 하는 방법.
17. 제9항에 있어서, 냉동시키는 동안 프레임을 진동시키지 않음을 특징으로 하는 방법.
18. 평행을 유지하면서 서로에 대해 약간 움직일 수 있도록 클립으로 고정시킨 두개의 평행한 천공 판이 굽어져 있음을 특징으로 하는, 제1항에 청구된 적혈구 세포 냉동 방법에 사용하기 위한 냉동 프레임.
19. 제18항에 있어서, 판이 둥글게 굽어져 있음을 특징으로하는 냉동 프레임.
20. 450ml의 표준 제공 단위의 혈액을 원심 분리시켜 혈장 및 혈소판을 제거시키고 실질적으로 200ml의 용적을 차지하는 90% 이상의 적혈구 세포 포장 세포 용적을 얻고, 적혈구 세포를 평균 분자량이 150,000 내지 200,000인 HES의 40% w/v HES 용액을 실질적으로 35ml 함유하는 냉동백중에 도입시키고, 이 냉동백을 평행인 상태를 유지하면서 서로에 대해 약간 이동할 수 있도록 조정된 두개의 평행한 굽은 판을 갖는 냉동 프레임내에 위치시키고, 이 냉동 프레임을 액체 질소중에 위치시켜, HES 와 적혈구 세포의 혼합물이 냉동될때까지 진동시킴없이 그 내부에 방치시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 적혈구 세포 냉동방법.
21. 제1항에 따른 방법으로 냉동시킨 적혈구 세포와 HES의 혼합물을 진동없이 약 10분 동안 약 43.5℃의 따뜻한 물중에 함침시킴을 특징으로하여, 수혈용의 적혈구 세포를 제조하는 방법.