JPH044890A

JPH044890A - 新規生理活性物質およびその製造方法

Info

Publication number: JPH044890A
Application number: JP10372990A
Authority: JP
Inventors: Kenji Sugita; 杉田　憲治; Junichi Shoji; 純一東海林; Koichi Matsumoto; 浩一松本; Yoshimi Kawamura; 川村　義己; Shigeru Matsutani; 茂松谷
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1990-04-19
Filing date: 1990-04-19
Publication date: 1992-01-09
Anticipated expiration: 2014-10-12
Also published as: JP2961431B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】で表わきれる化合物またはそのエステルおよび該化合物
の製造法に関する。

更米±韮碧がん研究は、オンコジーンの発見により飛躍的な進歩を
とげた。オンコジーンは、ｓｒｃ、　ｒａｓ。

■などに代表される幾つかのグループに分類することが
できるが、もっとも研究の進んでいるのが癌ファミリー
のオンコジーンである。その遺伝子産物はタンパク質の
チロシン残基をリン酸化する活性を持ち、この活性が細
胞のがん化を引き起こｆのに重要な役割を果た（７てい
ると考えられている。また上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血
小板由来増殖囚−Ｆ（ＰＤＧＦ）、インスリンなどの増
殖因子受容体にもＳｒＣファミリー＝のオンコレン産物
と類似しｔ−アミノ酸配列のドメインがあり、チロシン
キナーゼ活性を持つことが知られている。ナロシンキナ
ーゼ阻害剤としては、ゲニスデイン、ハービマイシンな
どが挙げられる（小）ら、Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｓ　３９．６０６−６０８　（１９８６）および」−原
ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６．２１９８
−２２０６　（１９８６））。

明が解決しようとする課題最近では、オンコジーンと増殖因子および増殖因子受容
体の関連が次々と明らかにされてきているが、明確な作
用機序などは分かっていない。オンコジーンのうち、少
なくともいくつかは、本来正常な細胞の増殖に重要な役
割りを果たしている増殖因子や、増殖因子受容体の遺伝
子の変化したものであることが判明されている。

最も開発の進んでいるｓｒｃ　′Ａンコ／−ンＪＶ　’
ｈの阻害物質はｆ　Ｕ、’ｌｌシンナーゼ活性を阻害４
るので、異隼細胞のみならず正常細胞の千ロノンキナゼ
活性をも阻害【２てしまう恐れがある６そこで異充細胞
に特異性がｋ）す、かつ、ｓｒｃのみならずｒａｓによ
る形質転換をも阻害する物質の発見が望まれていた。

課題を解決するだめの手段オンコジーンはある種のヒト・腫瘍において点突然変異
、欠失、転座、増幅なとの異常を起こしている例が数多
く見いたされ、腫瘍の形成に重曹な役割りを果たしてい
ると考えられている。従って、オンコジーン産物の機能
を阻害する物質を開発することは、がんの基礎研究およ
びがんの化学療法の両方の而から興味深い課題でおると
考えられている。

本発明者らは、これらのことがらを鑑み、鋭意研究を重
ねた結果、式；％式％）で表わされる化合物。より好ま（２〈は、下記式：で表
わされる化合物またはそのニスデルが、従来より知られ
ているミオンコジーンおよびｒａｓオンフジーンの内作
用を阻害する活性を合ゎゼ持つことを発見し、本発明を
完成するに至った。本発明化合物は、細胞膜に存在する
ｓｒｃ産物およびμ産物からがん化に至るまでの共通の
経路を阻害することにより、腫瘍の形成を妨げると考え
られる。

本発明化合物は、オンコジーンで形質転換させた細胞を
、正常な形態の細胞に復帰させる活性（脱形質転換活性
）を持っており、また、細胞増殖阻害作用もあり、制が
ん剤として期待される。

本発明の化合物を産生するアルターナリア　プランジコ
ーラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌ
ａ　）は１９９０年３月２８日から茨城基つくば南東１
丁目１番３号（郵便番号３０５）に　’Ａｌｔｅｒｎａ
ｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ　ＲＦ−３２８Ｊ受肛
番号ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１３８７として寄託されている
。

また、本発明化合物のニスデルとしては、アセテート、
プロピオネートなどが例示される。

（以下余白）以下、本発明をさらに詳しく説明する。

産生菌ＲＦ−３２８株の諸性状コーンミール寒天培地上で、本菌のコロニーは不規則な
形に広がり、その色はオリーブブラウンから暗い茶黒色
で、ビロード状である。菌糸は分枝し、隔壁があり、最
初は透明であるが後でブラウンからオリーブブラウンと
なり、表面は平滑で、その太きは２０〜７．５μｍであ
る。

胞子柄は単純で、直立しており、直線状かまたはやや曲
がっているのが普通であるが、時には大きく屈曲してい
るものもある。大体は円筒状であるが、時には基部の部
分がふくれていることもあり、隔壁があって、薄いオリ
ーブブラウンから中程度のオリーブブラウン色であり、
表面は平滑で長きは７０μｍぐらいで、太きは４〜６μ
ｍである。

分生胞子は１０もしくはそれ以上が鎖状に連なっており
、時には分枝することもあって頂側性を示し、胞子柄壁
の小孔を通して発生ずる。形は直線状で、円筒状を示し
、通常は先端に向かってわずかに細くなっていて、基部
細胞は丸みを帯び、先端細胞は大体先端を切った円錐形
に似ている。分生胞子には１〜１１個、殆どは６個以下
の横の隔壁があり、また通常０〜６個の縦の隔壁があり
、しはしば隔壁のところでわずかにくびれている。薄い
オリーブブラウンから暗いオリーブブラウン色をしてお
り、表面は平滑かまたは時間の経過とともにわずかにイ
ボ状になる。長きは１８〜９０μｍ、最も幅の広いとこ
ろでの太さは８〜２５μｍである。

以上の諸性状から、本発明化合物を産生ずるＲＦ−３２
８株は、マイコロジカル　ペーパース（Ｍｙｃｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｐａｐｅｒｓ　）　２０巻、８〜１４ページ
（１９４７）にウィルトシルイア−（Ｗｉｌｔｓｈｉｒ
ｅ）により記載きれたアルターナリア　ブラシシコーラ
（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ　
（Ｓｃｈｗ、）Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、　　（１９４７）
）と同種であると同定された。

本発明化合物の製造方法は以下に示される。

グルコース、ポリペプトン、牛肉エキス、酵母エキス、
食塩、水道水からなる培地を入れた三角フラスコに、ア
ルターナリア　ブラシシコーラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ
　ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ　ＲＦ−３２８）を種培養
スラントから接種し、２８°Ｃで３０〜８０時間振盪培
養を行なう。得られた培養液を〉〜ガイモ抽出液、ショ
糖、消泡剤、水道水からなる培地に植菌し、通気下、撹
拌移せ、２８℃で１００〜３００時間培養きせる。これ
により得られた培養液を濾布式遠心分離機により濾液を
得る。これを酢酸エチルなどで抽出し、飽和食塩水で洗
浄した後、濃縮、石油エーテル洗浄の後、粗オイル状物
質を得る。

上記で得られた粗オイル状物質をクロロホルムなどの有
機溶媒に溶かし、シリカゲルカラムに吸着許せ、適当な
溶媒で溶出する。この操作を繰り返すことにより油状の
純物質が得られる。

また上記で得られた、濾液を多孔質ポリマーで充填させ
たカラムに吸着許せ、適当な溶媒で溶出する。活性画分
を減圧濃縮し、粗オイル状物質を得る。許らにこれをシ
リカゲルカラムに吸着きせ、適当な溶媒で溶出し、オイ
ル状の純物質を得てもよい。

以下に本発明の態様を示すが、これらは本発明を何ら限
定するものではない。

（以下余白）黒３！ｉ−例一！− （ａ）発酵工程グルツース２．０％、ポリペプトン１０％、牛肉−１キ
ス０３％、酵母エキス０２％、食塩０１％、水道水より
なる培地８００ｍ１　を含む２ｒ容三角フラスコにアル
タ−づリア　ブラシシコーラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　
ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ　ＲＦ−３２８）を種培養ス
ラントから接種し、振幅７０ｍｍ、毎分１８０回転で、
２８′″Ｃ１７２時間振＠培養を行なう。この培養液８
００ｍ１　ずつを２０％ジャガイモ抽出液、ショ糖２０
％、消泡剤ｐ−２ｏｏｏ（犬日本インキ）００１％、水
道水よりなる培地１５ｐを含む３ＯＮ容ジ〜−ファーメ
ンタ−に植菌し、通気量１０．５９／分、内圧０　、３
５　ｋｇ／ｃｍ’、攪拌回転数３５０ｒｐｍで２８°Ｃ
５１６２時間培養する。

（ｂ）分離工程上記工程で得られた培養液は、濾布式遠心分離機によっ
て濾液４０Ｐを得る。この濾液を、酢酸エチルＩＥＩで
抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、濃縮、石油ニーグル
洗浄１５、粗オイル状物質１０．２５ｇを得る。

（ｅ）精製工程＋２（ｂ　）　′ｒ得られた粗物質をり「Ｊ　Ｕホルム
に溶解し、シリカゲルカラム（ローバーカラｊ２、カイ
スＢ、メルク社）に吸着させ、塩化メグ−レンで洗浄後
、塩化メチレン：メタノール（９６：４）混液で活性物
質を溶出する。溶出液を濃縮し、再びシリカゲルカラム
にかけ、クロロホルム：イソブ［７ビルアル：１−ル（
９７：３）混液で活性物質を溶出する。溶出液の溶奴を
留去（７で、無色消状の本発明化合物０．５１　ｇを得
た。

分子式：Ｃ，、Ｈ□０゜Ｓ　　ＩＭＳ、ＨＲＭＳ　：　　Ｃ，、Ｈ，，０４ｍ／
ｚ　　２　１　３　（ＭＨ”）［α　コ　ニ”’　　−３５，８（ｃ、　　０．５２．
　　ＭｅＯＨ）ＵＶ　　λ：：？８　末端吸収ありＩ　Ｒ（ＣＩ（Ｃ１，）、　　３６０４．　２９８８．
　１６０４．　１４５２．　９６５゜８９３　　（Ｃｍ
−’）　（第１図参照）溶解性：易溶性：水、メタノー
ル、酢酸エチル難溶性二ｎ−ヘキザン呈色反応二ａ硫酸で茶色外観：無色油状ＴＬＣ（シリカゲル６０Ｆ□、（メルクネ土））ＣＨＩ
ＣＩＩ　−ＭｅＯＨ（９：１）　：　Ｒｆ　Ｏ，２６Ｅ
ｔＯＡｃ−Ｍｅａｌ　（９：１）　’　Ｒｆ　Ｏ，４８
性質：　Ｘ）Ｈ２，０で分解ＮＭＲ：　’Ｈお、ｌ’　”Ｃで渭ｊ定（第２図および
第３図参照）抗菌活性：１０００７／ｍｌで反応性はな（７（以下余
白）実験例１使用した培養液：ダルベツコ・イーグルＭＥＭ培地（日
永製薬）９．５ｇと７％次酸水素十トリウムを２０ｍ１
．１ｆ！の蒸留水に加え、次いで終濃度１０容量％とな
るようにの牛胎児血清（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、　Ｉｎｃ、　）を添加して調製した。

住人ヘークライト社製の９６穴プラスチツクデイツンユ
に上記培養液１００１１Ｎ、ｒａｓ　およびｓｒｅの両
オンコンーンで形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞を５Ｘ１
０’細胞／穴および被験検体を２倍希釈濃度列で添加（
２，３７℃で５％炭酸ガスインキュヘーター内で培養し
た。２４時間後に細胞の形態を観察し、脱形質転換活性
を求めた。また、培養２日後にＭＴＴ法（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　６５．５５〜６３　（１９８３））により生細胞の
比率を測定することによって、５０％増殖阻害濃度（ｒ
ｃ、。）を求めた。

その結果、本発明化合物は、１ｇｇ／ｍ１以上の濃度で
脱形質転換活性を示した。また、本発明化合物のＩＣｓ
、は８ｇｇ／ｍｌであった。

米１１礼至ヒト赤血球は、ヘパリンを含む注射筒で採取した後、１
５００回転／分、１５分の遠心で沈殿させ、１０％牛脂
児血清を含むＭＥＭ培地で３×１０１細胞／ｍｌの濃度
に調製きれた。このヒト赤血球溶液と、本被験化合物と
の希釈液（２０〜１０００　μｇ／ｍｌ）を当量ずつ混
合し、３７°Ｃの５％次酸ガス培養器内で２日間培養し
た。１５００回転／分、５分の遠心後、上清のヘモグロ
ビン量をオートリーダー（米国ダイナチック社）で５３
８ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。

結果、本発明化合物は５００ｔ１ｇ／ｍ１の濃度におい
ても３７℃、２日間の培養で、全くヒト赤血球に対し溶
血作用を示きなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明化合物のＩＲ１第２図は本発明化合物の
’Ｈ−ＮＭＲ１第３図は本発明化合物の口Ｃ−ＮＭＲを
示す。（以下余白）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる化合物またはそのエステル。
（２）真菌類アルターナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ
）に属する請求項１記載の化合物の産生菌を培養し、該
培養培地から該化合物を得ることを特徴とする該化合物
の製造法。