JPH04409A - 共焦点走査型顕微鏡 - Google Patents
共焦点走査型顕微鏡Info
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Abstract
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Description
機構が改良された共焦点走査型顕微鏡に関するものであ
る。
試料上において2次元的に走査させ、その際該試料を透
過した光あるいはそこで反射した光、さらには試料から
発せられた蛍光を光検出器で検出して、試料の拡大像を
担持する電気信号を得るようにした光学式走査型顕微鏡
が公知となっている。
いて光点に結像させる一方、この試料からの光束を再度
点像に結像させてそれを光検出器で検出するように構成
した共焦点走査型顕微鏡は、試料面上にピンホールを配
する必要が無(、実現容易となっている。
る送光光学系と、 上記試料からの光束(透過光、反射光あるいは蛍光)を
集光して点像に結像させる受光光学系と、この点像を検
出する光検出器と、 上記光点を試料上において2次元的に走査させる走査機
構とから構成されるものである。なお特開昭62−21
7218号公報には、この共焦点走査型顕微鏡の一例が
示されている。
して、 ■試料台を2次元的に移動させる機構、あるいは■照明
光ビームを光偏向器によって2次元的に偏向させる機構
が用いられていた。
と試料が飛んでしまうという問題が生じていた。顕微鏡
で観察される試料としては生物試料も多く、この生物試
料を観察する際に高速走査ができないと、生物試料の微
妙な動きを捕えることが不可能となる。また、このよう
な生物試料に限らなくても、はぼリアルタイムで試料像
を撮像したいという要求は広く存在するものであり、高
速走査が不可能であれば、当然、このような要求に応え
ることができない。
、この機構においては、ガルバノメータミラーやAOD
(音響光学光偏向器)等の高価な光偏向器が必要であ
るという難点が有る。またこの■の機構においては、照
明光ビームを光偏向器で振るようにしているから、送光
光学系の対物レンズにはこの光ビームが刻々異なる角度
で入射することになり、それによる収差を補正するため
に対物レンズの設計が困難になるという問題も認められ
ている。特にAODを使用した場合には、対物レンズ以
外にもAODから射出した光束に非点収差が生ずるため
特殊な補正レンズが必要となり、光学系をより複雑なも
のとしている。
簡単で安価に形成することができる共焦点走査型顕微鏡
を提供することを目的とするものである。
焦点走査型顕微鏡は、先に述べたような試料台と、光源
と、送光光学系と、受光光学系と、光検出器と、光点の
2次元走査機構とを備えた共焦点走査型顕微鏡において
、上記送光光学系と受光光学系とを一体的に保持する移
動台と、 この移動台を、上記光点が試料上を一方向に主走査する
ように往復移動させる主走査手段と、上記移動台と試料
台とを、上記主走査の方向とほぼ直交する方向に、該主
走査の速度よりも低い速度で相対移動させて、上記光点
を試料上において副走査させる副走査手段とによって走
査機構を構成したことを特徴とするものである。
ってもよいし、それとは反対に、試料台を移動させるも
のであってもよい。副走査速度は比較的低速とすること
ができるから、上記のように試料台を移動させても、試
料が飛んでしまうことを防止可能である。
が振られることかないから、光学系の設計は光軸上の光
線のみを考えて行なえばよいことになり、該光学系の設
計は非常に容易となる。
する。
型顕微鏡を示すものであり、また第2および3図は、そ
れに用いられた走査機構を詳しく示している。第1図に
示されるように、RGBレーザ10からは、赤色光、緑
色光および青色光からなる照明光11が射出される。こ
の照明光11はビームコンプレッサ12でビーム径が縮
小され、屈折率分布型レンズ13で集光されてシングル
モード光ファイバー14内に入射せしめられる。
おり、該光フアイバー14内を伝搬した照明光11はこ
の一端から出射する。この際光ファイバー14の一端は
、点光源状に照明光11を発することになる。移動台1
5には、コリメーターレンズ16および対物レンズ17
からなる送光光学系18と、対物レンズ19および集光
レンズ20からなる受光光学系21とが、互いに光軸を
一致させて固定されている。
された試料台22が配されている。
行光とされ、次に対物レンズ17によって集光されて、
試料台22に載置された試料23上で微小な光点Pに結
像する。試料23を透過した透過光11′の光束は、受
光光学系21の対物レンズ19によって平行光とされ、
次に集光レンズ20によって集光されて、シングルモー
ド光ファイバー24の一端から該光フアイバー24内に
入射せしめられる。この光ファイバー24の上記一端は
移動台15に固定されており、またその他端には屈折率
分布型レンズ25が接続されている。光フアイバー24
内を伝搬した透過光11゛ はその他端から出射し、上
記屈折率分布型レンズ25によって平行光とされる。
し、その青色光11Bのみがそこで反射し、該青色光1
1Bは第1光検出器27によって検出される。
別のダイクロイックミラー28に入射し、その緑色光1
1Gのみかそこで反射する。この緑色光11Gは、第2
光検出器29によって検出される。そして上記ダイクロ
イックミラー28を透過した透過光11゜(すなわち赤
色光11R)はミラー30において反射して、第3光検
出器31によって検出される。なお上記光検出器27.
29.31としては例えばフォトダイオード等が用いら
れ、それらからは各々、試料23の拡大像の青色成分、
緑色成分、赤色成分を担持する信号SB、SG、SRが
出力される。
.3図を参照して説明する。第2図と第3図はそれぞれ
、移動台15の周辺部分を、第1図の上方側、右方側か
ら見た状態を示している。この移動台15は架台32に
、積層ピエゾ素子33を介して保持されている。積層ピ
エゾ素子33はピエゾ素子駆動回路34から駆動電力を
受けて、移動台15を矢印X方向に高速で往復移動させ
る。この往復移動の振動数は、例えば10k Hzとさ
れる。その場合、主走査幅を100μmとすると、主走
査速度は、10XIO3X100 XlO4X2−2m
/sとなる。なお、光ファイバー14.24は可撓性を
有するので、それぞれ照明光11.透過光11’ を伝
搬させつつ、移動台15の振動を許容する。
ている。この2次元移動ステージ35は、モータ駆動回
路8Bから駆動電流を受けるパルスモータ87により、
マイクロメータ88を介して矢印Y方向に往復移動され
る。それにより試料台22は移動台15に対して相対移
動され、前記光点Pが試料23上を、前記主走査方向X
と直交するY方向に副走査する。なおこの副走査の所要
時間は例えば1/2゜秒とされ、その場合、副走査幅を
100μmとすると、副走査速度は、 20X100 Xl04−0.002 m/ s露2m
m/s と、前記主走査速度よりも十分に低くなる。二゛の程度
の副走査速度であれば、試料台22を移動させても、試
料23が飛んでしまうことを防止できる。
することにより、該試料28の2次元像を担持する時系
列の信号SB、SG、SRが得られる。
積分する等により、画素分割された信号とされる。
ータ駆動回路39から駆動電流を受けるパルスモータ4
0により、主、副走査方向X、Yと直交する矢印Z方向
(すなわち光学系18.21の光軸方向)に移動される
。こうして2次元移動ステージ35をZ方向に所定距離
移動させる毎に前記光点Pの2次元走査を行なえば、合
焦点面の情報のみが光検出器27.29.31によって
検出される。そこで、これらの光検出器27.29.3
1の出力SB、SG。
を2方向に移動させた範囲内で、全ての面に焦点が合っ
た画像を担う信号を得ることが可能となる。
.39には、制御回路41から同期信号が入力され、そ
れにより、光点Pの主、副走査および試料台22のZ方
向移動の同期が取られる。
る。例えばビームコンプレッサ12でビーム径が縮小さ
れた照明光11は、屈折率分布型レンズ13で集光され
てシングルモード光ファイバー14内に入射せしめられ
るが、この屈折率分布型レンズ13の代わりに顕微鏡対
物レンズ等を用いてもよく、またシングルモード光ファ
イバー14は、マルチモードのものにピンホール等をつ
けたものでもよい。
レンズ25は、顕微鏡対物レンズ等であってもよい。そ
して、2次元移動ステージ35に固定された試料台22
をY方向に往復移動(副走査)させるための駆動源であ
るパルスモータ37は、エンコーダ付きのDCモータで
もよく、またこのように試料台22を移動させることに
よって光点Pの副走査を行なう代わりに、移動台15を
移動させることによって光点Pの副走査を行なうように
してもよい。さらに移動台15の移動は積層ピエゾ素子
33を利用して行なう他、例えばボイスコイルおよび超
音波による固体の固有振動を利用した走査方式等を用い
て行なうことも可能である。
共焦点走査型顕微鏡を示すものである。
共に光源および光検出器もまた移動台に一体的に保持さ
れており、これにより光学系がさらに簡素化されたコン
パクトな共焦点走査型顕微鏡が実現されている。第4図
において第1図ないし第3図と共通部分には同じ番号を
付し、それらについての詳細な説明は省略する。この実
施例では、照明光11を発する光源としてレーザダイオ
ード51か用いられており、このレーザダイオード51
は移動台15に一体的に保持されている。このレーザダ
イ−オード51から発せられた照明光11は、同じく移
動台15に一体的に保持された送光光学系18に直接入
射し、これにより前記実施例と同様に試料23上に微小
な光点Pとして結像せしめられる。一方、試料23から
の光束は移動台15に一体的に保持された受光光学系2
1により集光され、アパーチャピンホール53を通過し
た後、同様に移動台15に一体的に保持された光検出器
52に直接入射して、そこで結像する。この実施例にお
いても、光点Pの2次元走査は前記実施例と同様に行な
われ、光検出器52の出力がフレームメモリに取り込ま
れることにより、試料23のZ方向移動範囲内で、全て
の面に焦点が合った画像を担う信号が得られる。
。この第5図に示される実施例は、送光光学系が受光光
学系としても機能する反射型共焦点走査型顕微鏡である
。なおこの第5図においても、第1図ないし第3図と共
通部分には同じ番号を付し、それらについての詳細な説
明は省略する(以下、同様)。
1の実施例と同様にビームコンプレッサ12、屈折率分
布型レンズ13、シングルモード光ファイバー14、送
光光学系18を経て、試料23上に微小な光点Pとして
結像せしめられる。試料23て反射した反射光11”の
光束は、送光光学系18(受光光学系21を兼ねる)の
対物レンズ17によって平行光とされ、次にコリメータ
ーレンズ16によって集光されて、シングルモード光フ
ァイバー14内に戻される。光フアイバー14内を伝搬
した反射光11″は、屈折率分布型レンズ13、ビーム
コンプレッサ12を経てビームスプリッタ61に入射し
、そこで反射され、ダイクロイックミラー26に入射す
る。ダイクロイックミラー26では青色光11Bのみが
反射し、該青色光11Bは第1光検出器27によって検
出される。以下第1実施例と同様に緑色光11G、赤色
光11Rが各々光検出器29.31により検出され、光
検8器27.29.31の出力SB、SG、SRがフレ
ームメモリに取り込まれることにより、試料23の2方
向移動範囲内で、全ての面に焦点が合った画像を担う信
号が得られる。
いて説明する。この第6図の装置は、モノクロ反射型の
共焦点走査型顕微鏡である。この実施例においても、第
4図の装置と同様に、光学系と共に光源および光検出器
もまた移動台15に一体的に保持されている。
おいて用いられた送光光学系18が受光光学系21とし
て兼用されている。そしてこの光学系18内にはハーフ
ミラ−79が配されており、試料23で反射した反射光
11″がこのハーフミラ−79で反射して照明光11か
ら分離し、光検出器52によって検出される。
された実施例について説明する。この走査型蛍光顕微鏡
の主要部は、第1図の装置と同様に構成されている。そ
してこの装置においては、照明光源としてArレーザ7
0が用いられ、そこから発せられた例えば波長481i
nm、 514.5 nm等の照明光71により、試
料72を2次元的に走査する。
が用いられている。
jnisothiocyanate (F I T C
) 、Texas Red。
が注入されている。このような蛍光プローブは上記波長
の照明光71を受けて、固有の波長の蛍光73を発する
。
受光光学系21により集光されて光フアイバー24内に
入射し、そこを伝搬して屈折率分布型レンズ25から出
射する。これらの光7L 73は干渉フィルタ74に通
され、そこで照明光7Iかカットされ、蛍光73のみが
光検出器75によって検出される。
2を2次元的に走査することにより、光検出器75から
は、試料72の2次元拡大像を示す出力Sが得られる。
2の内部から発せられた蛍光73を検出するようにして
いるので、試料72の内部の像を出力可能である。
された実施例について説明する。この走査型顕微鏡の主
要部は、第5図の装置と同様に構成されているが、この
装置においては照明光源として、第7図の装置と同様に
A「レーザ70が用いられている。
が予め注入されている。照明光71の照射を受けること
により試料72から発せられた蛍光73は、反射した照
明光71とともに受光光学系21により集光されて光フ
アイバー14内に入射し、そこを伝搬して屈折率分布型
レンズ13から出射する。このレンズ13とArレーザ
70との間に配されたダイクロイックミラー76は、上
記蛍光73のみを反射させて光検出器75に導き、該光
検出器75により蛍光73が検出される。
されたさらに別の実施例について説明する。この走査型
顕微鏡の主要部は第4図の装置と同様に構成されている
が、照明光源としては、生物試料72内に注入された蛍
光プローブが形成する蛍光体の励起波長域の照明光71
を発するレーザダイオード80が用いられている。
千6フイルタ74が配されており、生物試料72から発
せられた蛍光73のみが該フィルタ74を透過して、光
検出器75によって検出される。
成されたさらに別の実施例について説明する。この走査
型顕微鏡においては、第9図の装置において用いられた
送光光学系18が受光光学系21として兼用されている
。そしてこの光学系18内には、第8図中のものと同様
のダイクロイックミラー76が配されており、生物試料
72から発せられた蛍光73がこのダイクロイックミラ
ー76で反射して照明光71から分離し、光検出器75
によって検出される。
ついて説明する。この実施例の共焦点走査型顕微鏡は、
カラー画像を出力する透過型のものである。移動台15
には、赤色レーザダイオード90Rと、緑色レーザダイ
オード90Gと、青色レーザダイオード90Bとが固定
されている。各レーザダイオード90R,90G、90
Bから発せられた赤色光11R1緑色光11G1青色光
11Bはそれぞれ、コリメーターレンズ16R,16G
、16Bによって平行光化される。赤色光11Rはダイ
クロイックミラー91および92を透過し、緑色光11
Gはダイクロイックミラー91で反射した後ダイクロイ
ックミラー92を透過し、そして青色光11Bはダイク
ロイックミラー92で反射して、1本の照明光11とし
て合波される。
料台22に載置された試料23上あるいはその内部で、
微小な光点Pに結像する。試料23を透過した透過光1
1°の光束は、対物レンズ19によって平行光とされる
。
、青色光11Bのみがそこで反射する。この青色光11
Bは集光レンズ20Bで集光され、アパーチャピンホー
ル53Bを通して第1光検出器27によって検出される
。ダイクロイックミラー26を透過した透過光11′
は別のダイクロイックミラー28に入射し、その緑色光
11Gのみがそこで反射する。この緑色光11Gは集光
レンズ20Gで集光され、アパーチャピンホール53G
を通して第2光検出器29によって検出される。そして
上記ダイクロイックミラー28を透過した透過光11°
(すなわち赤色光11R)は集光レンズ20Rで集光
され、アパーチャピンホール53Rを通して第3光検出
器31によって検出される。
イオード等が用いられ、それらからは各々、試料23の
拡大像の青色成分、緑色成分、赤色成分を担持する信号
SB、SG、SRが出力される。なお本実施例において
も、照明光走査機構としては、例えば第1図の装置に使
用されたものを用いればよい。
ついて説明する。この実施例の共焦点走査型顕微鏡は、
カラー画像を出力する反射型のものである。本装置にお
いても、移動台15には赤色レーザダイオード90Rと
、緑色レーザダイオード90Gと、青色レーザダイオー
ド90Bとが固定されている。
と同様に形成されているが、ダイクロイックミラー92
と対物レンズ17との間には、ビームスプリッタ61が
配されている。照明光11は、このビームスプリッタ6
1を透過する。
ンズ17で平行光とされた後、上記ビームスプリッタ6
1で反射して受光光学系21に入射する。この受光光学
系21は、第11図の装置のものと同様に形成されてい
る。
1から各々、試料23の拡大像の青色成分、緑色成分、
赤色成分を担持する信号SB、SG、SRが出力される
。
ついて説明する。この第13図図示の共焦点走査型顕微
鏡はモノクロ反射型のものであり、第14図は、それに
用いられた走査機構の平面形状を詳しく示している。単
色光レーザ100からは、単一波長の照明光11が射出
される。直線偏光、したこの照明光11は、P偏光状態
で偏光ビームスプリッタ101の膜面101aに入射し
、そこを透過する。
偏波面調整用のλ/2板102を通過し、入射用レンズ
103で集光されて、偏波面保存光ファイバー104内
に入射せしめられる。
に断面形状を示すように、クラッド104 a内にコア
104 bが配され、このコア104bの両側に応力付
与部104 c、 104 cが形成されてなる、いわ
ゆるPANDA型のものが用いられている。そして直線
偏光した照明光11は、λ/2板102を適宜回転させ
ることにより、偏波面の向きが応力付与部104 c、
104 cの並び方向、あるいはそれに直交する方向
と揃う状態にして(本実施例では後者の方向、すなわち
第15図の矢印U方向)、該光フアイバー104内に入
射せしめられる。
ており、該光フアイバー104内を伝搬した照明光11
はこの一端から出射する。この際光ファイバー104の
一端は、点光源状に照明光11を発することになる。移
動台15には、コリメーターレンズ16および対物レン
ズ17からなる送光光学系(受光光学系を兼ねる) 1
gが固定されている。なお、コリメーターレンズ16と
対物レンズ17との間には、λ/4板105が配設され
ている。
行光とされ、λ/4板105を通過して円偏光とされ、
次に対物レンズ17によって集光されて、試料台22に
載置された試料23上で(表面あるいはその内部で)微
小な光点Pに結像する。試料23で反射した反射光11
’は旋回方向が逆向きの円偏光となり、λ/4板105
を通過して、偏波面の向きが照明光11のそれと直交す
る直線偏光とされる。
よって集光されて、偏波面保存光ファイバー104内に
入射せしめられる。このときの反射光11’の偏波面の
向きは、第15図の矢印V方向となる。
から出射し、入射用レンズ103によって平行光とされ
る。
態で偏光ビームスプリッタ101の膜面101aに入射
し、そこで反射する。この反射光11°は、集光レンズ
108で集光され、アパーチャピンホール106を通し
て光検出器75によって検出される。
信号Sが出力される。
101とから構成される光アイソレータを設けたことに
より、反射光11°がレーザ100側に戻ることがなく
なり、より大光量の反射光11”が光検出器75に導か
れるようになる。また、入射用レンズ103や光ファイ
バー104の端面等で反射した照明光11が、光検出器
75に入射することも防止され、S/Nの高い信号Sが
得られるようになる。
4図も参照して説明する。移動台15は、水平に配され
た音叉110の一端部に、光学系18の光軸が垂直とな
る状態で固定されている。この音叉110は、その基部
110 gが架台32に固定されて、所定の固有振動数
で振動可能となっている。そして音叉110の他端部の
側方には、若干の間隔をおいて電磁石111が配設され
ている。
10の固有振動数と等しい周波数の矩形パルス電流が印
加される。こうして音叉110の他端部にパルス的磁界
が作用することにより、音叉110はその固有振動数で
振動する。そこで、この音叉110に固定されている移
動台15は、第13.14図中のX方向(水平方向)に
高速で往復移動し、光点Pの主走査がなされる。
移動可能なX移動ステージ107 X、 Z方向(光学
系18の光軸方向)に往復移動可能なZ移動ステージ1
072.およびXlZ両方向に対して直角なY方向に往
復移動可能なY移動ステージ107Yを介して取り付け
られている。そこで、上記のようにして光点Pの主走査
を行なうとき、同時にY移動ステージ107 Yを往復
駆動させると、光点Pの副走査がなされる。
ジ107 X、 Y移動ステージ107 Y、およびZ
移動ステージ107 Zを適宜移動させることにより、
光学系18に対する試料23の位置合わせ(視野探しお
よびフォーカス調整)を行なうことができる。
ジ107 Zを移動させることにより、試料23をZ方
向に移動させた範囲内で、全ての面に焦点が合った画像
を担う信号Sを得ることが可能となる。
においては、送光光学系と受光光学系とを一体的に移動
台に保持させ、この移動台を往復移動させて光点の主走
査を行なうように構成したから、試料台を高速で移動さ
せる必要がなく、よって試料が飛んでしまうことを防止
可能で、また、高速走査も可能となる。
ビームが振られることがないから、光学系の設計が容易
となり、またガルバノメータミラーやAOD等の高価な
光偏向器が不要で簡単な構造となっているから、本装置
は従来の共焦点走査型顕微鏡に比べて安価に形成可能と
なる。
鏡を示す概略正面図、 第2図と第3図はそれぞれ、上記共焦点走査型顕微鏡の
要部を示す平面図と側面図、 第4.5.6.7.8.9、l0111.12および1
3図はそれぞれ、本発明の第2.3.4.5.6.7.
8.9、lOおよび11実施例による共焦点走査型顕微
鏡を示す概略正面図、 第14図は、上記第11実施例の共焦点走査型顕微鏡に
用いられた照明光走査機構の平面図、第15図は、上記
第11実施例の共焦点走査型顕微鏡に用いられた偏波面
保存光ファイバーの断面図である。 10・・・RGBレーザ 11.71・・・照明光
11゛ ・・・透過光 11”・・・反射光1
1B・・・青色光 11G・・・緑色光11R
・・・赤色光 14.24・・・光ファイバー
15・・・移動台 16、IBB、16G、16R・・・コリメーターレン
ズ17.19・・・対物レンズ 1B・・・送光光学
系20.20B、 20G、 2OR,108・・・集
光レンズ21・・・受光光学系 22・・・試料
台23.72・・・試料 26.28.76.91.92・・・ダイクロイックミ
ラー27.29.31.52.75・・・光検出器30
・・・ミラー 32・・・架台33・・・積
層ピエゾ素子 34・・・ピエゾ素子駆動回路35・
・・2次元移動ステージ 36.39・・・モータ駆動回路 37.40・・・パ
ルスモータ38・・・マイクロメータ 41・・・
制御回路51.80・・・レーザダイオード 53.53B、 53G、 53R,10B・・・アパ
ーチャピンホール 61・・・ビームスプリッタ 70・・・Arレーサ7
3・・・蛍光 74・・・干6フイルタ7
9・・・ハーフミラ− 90B・・・青色レーザダイオード 90G・・・緑色レーザダイオード 90R・・・赤色レーザダイオード 100・・・単色光レーザ 101・・・偏光ビームスプリッタ 1.02・・・λ/2板 103・・・入射用レ
ンズ104・・・偏波面保存光ファイバー 105・・・λ/4板 X・・・X移動ステージ Y・・・Y移動ステージ 2・・・Z移動ステージ ・・・音叉 111・・・電磁石・・・パル
ス電源 第 図 第 図 、−一人一、 第 図 第 図 第 図 第 図 第 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 試料が載置される試料台と、 照明光を発する光源と、 この照明光を試料上において微小な光点として結像させ
る送光光学系と、 前記試料からの光束を集光して点像に結像させる受光光
学系と、 この点像を検出する光検出器と、 前記送光光学系と受光光学系とを一体的に保持する移動
台と、 この移動台を、前記光点が前記試料上を一方向に主走査
するように往復移動させる主走査手段と、前記移動台と
試料台とを、前記主走査の方向とほぼ直交する方向に、
該主走査の速度よりも低い速度で相対移動させて、前記
光点を前記試料上において副走査させる副走査手段とか
らなる共焦点走査型顕微鏡。
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