JPH0436652A - 蛍光検出型ゲル電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＤＮＡ塩基配列決定などに用いる装置であって
、蛍光ラベルしたサンプルをゲル電気泳動させ、泳動方
向と直交する方向に蛍光の励起・受光光学系を走査し、
泳動パターンを検出するゲル電気泳動装置に関するもの
である。

（従来の技術） 蛍光ラベルしたサンプルとは、プライマ一部又はダイオ
キシ部に蛍光ラベルし、サンガーの方法でｇｉｓｔ、た
ＤＮＡ断片であり、この蛍光ラベルしたサンプルをゲル
電気泳動して得られる展開パターンはそのままＤＮＡの
塩基配列を与える。

蛍光検出型ゲル電気泳動装置の一例は特開昭６３−３１
３０３５号公報に記載されている。その引例の装置は、
第１１図に示されるものであり、ガラス板に挾まれて図
で紙面垂直方向に延びる泳動ゲル１０４に蛍光ラベルし
たサンプルが紙面垂直方向に泳動する。ステージ２３９
はガイドレール２３３に案内され、モータ２３７で駆動
される棒ネジ２５２の回転によって泳動方向と直交する
図の上下方向に走査される。ステージ２３９には集光レ
ンズ２６０が設けられ、励起光であるレーザビーム２５
０がミラー２５１で反射されてレンズ２６０に入射し、
ステージ２３９上のミラー２５５で反射されて泳動ゲル
１０４の測定部分を照射する。その測定部分から出た蛍
光はステージ２３９に設けられた集光レンズ２２１で集
光され、干渉フィルタ２２３で分光されてレンズ２２５
を通り、光電子増倍管２２９で検知される。

（発明が解決しようとする課題） 第１１図の装置では、泳動ゲル１０４と走査方向（ネジ
２５２とガイドレール２３３で決まる）、及び集光レン
ズ２６０への励起光の入射方向の三者が全く平行で、か
つ泳動ゲル１０４の位置は走査のどの場所でも全く一致
していなければならない。この条件はゲル１０４を交換
したときでも、常に満たされていなければならない。

第１２図はこの条件が満たされていない場合を示したも
のである。走査のある場所Ａでは励起光２５０により照
明されたゲル部分は正しく受光光学系の光軸上にあり、
強い信号が得られるが、ゲル１０４が挾まれているガラ
ス板の厚さが変化したり、ゲル１０４とネジ２５２の平
行度が不十分な場合など、走査の別の場所Ｂでは図のよ
うに励起光２５０により照明されたゲル部分と受光光学
系の光軸との間にずれが生じ、信号強度が弱くなり、は
なはだしい場合には信号が検出されなくなる。このよう
に、信号強度が場所により変化する結果を生じる。

レンズ２２５はこのずれを軽減するために設けられたも
のであるが、それでもこの光学系の場合、入射角θが散
乱光を減少させるために２０〜３５度ぐらいと小さく設
定されているため、ガラス板の厚さの不均一や平行度の
誤差によるゲル１０４とステージ２３９との距離りの変
動によるゲル１０４の励起場所と受光光学系の光軸との
ずれを十分補償できるものではない。

このずれを解消するために励起光のスポット位置を検出
し、光軸を負帰還サーボ機構により動がすことも考えら
れる。しかし、この方法はスポット位置の検出装置が不
可欠であり、複雑となる。

本発明は第１１図のように励起・受光光学系を泳動方向
と直交する方向に走査しなから泳動パターンを検出する
装置において、ゲルと走査方向及び励起光入射方向の厳
密な平行関係が保たれない場合においても、正しく蛍光
検出を行なうことのできるゲル電気泳動装置を励起光ス
ポットの位置検出手段なしで実現することを目的とする
ものである。

（課題を解決するための手段） 第１図により本発明を説明する。

励起・受光光学系を走査する走査機構４４を制御するた
めに走査制御部４６が備えられており、３０は走査機構
４４や走査制御部４６からの出方によって走査場所を検
出したり、ゲルの励起光による照明部分からの散乱光な
どを受けて走査場所を検出する走査場所検出部である。

３２は励起光光路と受光光学系光軸との相対的位置関係
を変化させる移動手段である。３４はゲルの励起光によ
る照明位置からの散乱光や蛍光を検出するための光学系
と光検出部を備えた信号検出手段である。

３６は測定に用いられるゲルが装着されサンプルが測定
部に到着する前の較正用走査における走査領域内のいく
つかの走査場所で移動手段３２を作動させ、信号検出手
段３４からの信号にもとづいてゲルの励起光による照明
部分が受光光学系光軸上にくるときの移動手段３２の移
動量に関係した較正データを求め、走査場所データとと
もに記憶部３８へ記憶させる較正部であり、３８は較正
データを走査場所データとともに記憶する記憶部である
。４ｏは測定時に記憶部３８から走査場所に対応した較
正データを読み出し各走査場所ごとに移動手段３２の移
動量を設定する移動手段制御部である。測定時には信号
検出手段３４による検出信号（実信号）は信号処理部４
２に取り込まれて処理される。

（作用） 第７図を参照すると、測定に用いるゲル４を装着し、サ
ンプルが泳動して測定点に達するまでの間に走査領域内
の一点で励起・受光光学系の載っている移動ステージ１
３を止め、そこで受光光学系光軸と励起光光路の交点が
励起光源側のガラス板５ａの外側→ガラス板５ａの内側
→ゲル４→反対側のガラス板５ｂの内側→ガラス板５ｂ
の外側と動くように、励起光光路又は受光光学系光軸を
移動させ、その移動に対して受光光学系（蛍光測定用の
分光手段は除いてもよい）出力をとる。その出カブロッ
トは第６図に示されるようになる。

最初のピーク（入射角α）はガラス板５ａの表面での励
起光の散乱光であり、これは幅が狭い。次のピーク（入
射角β）はゲル４による散乱又は蛍光によるものであり
、このピークではゲル４が励起光で照明された場所は正
しく受光光学系光軸上にある。このとき、移動手段３２
に与えられた移動量に対応した電圧や電流などの数値を
この走査点での較正データとする。

以上の操作をサンプルが測定点に泳動してくるまでの時
間に走査領域内の多数の点で行ない、各走査点に対して
移動手段３２に与えられた較正データを表として記憶部
３８に記憶する。

較正データを測定した走査点のピッチよりも狭いピッチ
で測定を行なうためには、測定した較正データをもとに
して補間法により他の測定点の較正データを算出し、そ
れも記憶部３８に記憶させておけばよい。

サンプルが泳動して測定点に達する少し前から通常の走
査を行ない、測定を開始する。このときは走査に同期し
て走査の各点で記憶部３８から呼び出した較正データに
従って移動手段制御部４０が移動手段３２を制御し、励
起光光路又は受光光学系光軸を変化させる。較正データ
は走査の各点でゲル４が励起光で照明された場所が受光
光学系光軸上にくるように作成されたもの又はそれをも
とに算出されたものであるので、測定用の走査中は常に
ゲル４の励起光照明場所が受光光学系光軸上にくる条件
が満たされることになり、ずれはなくなる。

（実施例） 第２図は一実施例を表わす。

４は泳動ゲルであり、例えば６％ポリアクリルアミドに
てなり、ガラス板（例えば厚さ５ｍｍのパイレックスガ
ラス板）５ａ、５ｂに挾まれて、例えば０．３５ｍｍの
厚さに形成され、紙面垂直方向に立てられている。泳動
ゲル４には蛍光ラベルしたサンプルが紙面垂直方向に電
気泳動される。

サンプルは例えば蛍光物質ＦＩＴＣでラベルされており
、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザで励起されて５２
０ｎｍの蛍光を発する。

１３は移動ステージであり、クロスローラやアリ溝など
のガイドレール２８により案内され、走査用モータ１５
で駆動される棒ネジ１４の回転により駆動されて泳動方
向と直交する方向に走査される。ステージ１３上には励
起光であるアルゴンイオンレーザビームｌを受ける集光
レンズ２が設けられており、励起光ビーム１は泳動ゲル
４及びステージ１３の走査方向に平行に入射し、レンズ
２で集光される。レンズ２で集光された励起光ビーム１
を泳動ゲル４に入射させるために、ステージ１３上には
ミラー３が設けられており、ミラー３はガルバノスキャ
ナ（例えばＧｅｎｅｒａｌ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ社の０１
２０Ｄなど）１１により回転角を変化させることができ
るようになっている。ガルバノスキャナ１１に流す電流
によりミラー３の回転角が制御される。受光光学系に入
射する散乱光を減少させるために、入射角θが２０〜３
５度ぐらいになるように、励起光学系と受光光学系が設
定されている 励起光ビーム１による泳動ゲル４の照明位Ｍ６からの光
を集光し検出するために、ステージ１３上には、対物レ
ンズ７、対物レンズ７で集光された光を５２０ｎｍの干
渉フィルタ８を経て集光するために集光レンズ９が設け
られており、集光レンズ９で集光された蛍光を検出する
ために光電子増倍管１０が設けられている。集光レンズ
９は干渉フィルタ８を通った平行で幅の広い光束を光電
子増倍管１０の光電面の大きさに縮小するためのもので
あり、光電子増倍管１０の光電面が広ければ省略しても
よい。

１６はＡ／Ｄ変換器であり、光電子増倍管１０の検出信
号をデジタル信号に変換してマイクロコンピュータ１２
に取り込む。

ミラー３はガルバノスキャナ１１によって回転角が制御
されるが、その制御信号はマイクロコンピュータ１２か
ら与えられる。

移動ステージ１３は棒ネジ１４が走査用モータ１５によ
って回転することによって走査されるが、走査用モータ
１５にはエンコーダが取りつけられており、ステージ１
３の走査場所の情報がそのエンコーダからマイクロコン
ピュータ１２に取り込まれる。

第１図と第２図の対応関係を示すと、移動手段３２はミ
ラー３とガルバノスキャナ１１に対応し、走査機構４４
は棒ネジ１４と走査用モータ１５に対応し、信号検出手
段３４は光電子増倍管１０に対応し、走査場所検出部３
０、較正部３６．記憶部３８．移動手段制御部４０、信
号処理部４２及び走査制御部４６はマイクロコンピュー
タ１２により実現される。

動作の例を説明するにあたり、第２図で走査領域は全部
で２５６ｍｍとし、上方から下方へＸ＝０〜２５６の座
標で表わされるところを走査するものとし、受光光学系
光軸ＡがＸ＝Ｏ〜２５６の範囲内を移動するものとする
。信号取込み点（８Ｉ！ｌ定点）を５１２個所とすると
、Ｘの０．５ｍｍ移動ごとに蛍光信号がマイクロコンピ
ュータ１２に取り込まれる。

信号取込み点のＸ座標をＸｉ　（ｉ＝１．２．・・・・
・・５１２）とおき、その内の４個ごとの信号取込み点
（Ｘ４．　Ｘ、、　Ｘ□２．・・・・・・Ｘ５□２）が
励起光光軸を動かして励起光照明位置６が受光光学系光
軸Ａ上にくるように較正データが測定された点であると
する。

一実施例の動作を第３図、第４図及び第５図のフローチ
ャートと、第６図及び第７図を参照して説明する。

オペレータはゲルを装着し、サンプルを投入して泳動を
開始する。

第３図はＸ座ＩＮ　Ｘ４−　Ｘｓ−・・・・・・ｘｓ１
２に対して受光光学系光軸上に励起光照明位置がくるよ
うなガルバノミラ−３の回転角θｉを見出す較正プロセ
スである。

最初はガルバノミラ−３の角度θを励起光ビーム１の入
射方向と平行にしておく（θ＝０）。次に、ミラー３の
回転角θを変えて、θ＝４５度（励起光ビーム１がゲル
４に垂直に入射する角度）になるまでミラー３を回転さ
せ、そのときの光電子増倍管１０の出力を取る。この出
力をプロットすると第６図のようになる。第６図の最初
のピーク（θ＝α）は励起光がガラス板５ａの表面で散
乱される点が受光光学系光軸上にきたものであり。

次のピーク（θ＝β）は励起光ビーム１がゲル４を照明
した部分がちょうど受光光学系光軸上にきた求める点で
ある（第７図参照）。β位置のピークはα位置のピーク
よりも幅が広い。これは、ゲル４が厚さをもっていて、
しかも励起光ビーム１の入射がゲル４に平行に近い角度
で行なわれるためである。第６図に示される光電子増倍
管出力はほとんど励起光の散乱であり、その波長は励起
光の波長であるが、この光は非常に強く、蛍光用干渉フ
ィルタ８は特に取り外さなくても十分に信号を得ること
ができる。しかし、干渉フィルタ８を取り除いてもよい
。また、θをβ以上に増加させたときの種々のピークは
励起光ビーム１がガラス板５ａ、５ｂ中で多重反射をし
たものであり、この場合は関係がない。したがって、２
番目の山が１番目の山よりも半値幅（１／ｅ幅などでも
よい）が広ければ、この２番目の山の極大を与えるθを
θｉとおき、走査位置Ｘｉとともに記憶する。これが終
わると、次に移動台を動かし、Ｘ（ｉ＋４）、Ｘ（ｉ＋
８）、・・・・・・の点で同じ較正操作を行ない、Ｘ、
２．まで行なう。これで較正データθ、。

θ０．・・・・・・θ５工２が決定される６第４図は第
３図の較正プロセスでまだ決定されていない走査位置の
較正データを補間法で求める補間プロセスである。第４
図には線形の補間法が示されているが、線形でなくても
適当な曲線で補間してもよい。

第５図は測定プロセスである。

測定点にステージ１３を順次動かし、その測定点でミラ
ー３の角度を較正プロセスと補間プロセスで求められた
較正データの角度に設定し、信号を取り込む。実際には
ミラー３及びステージ１３は慣性をもつので、測定点で
ステージ１３がいちいち止まることはなく、連続的に走
査及びそれに同期したミラー３の角度設定が行なわれて
いく。

第８図は第２図においてミラー３を回転させる代りに、
ミラー３ｂを圧電素子２６に取りつけ、圧電素子２６に
電圧を与えてミラー３ｂを移動させることにより励起光
光路を移動させるようにしたものである。圧電素子２６
としては例えばトーキン社のＬＡＮシリーズの製品など
を用いることができる。

第９図は励起光光路を移動させる他の実施例を表わした
ものであり、ミラー３ｃを固定し、励起光ビーム１を音
響光学素子２７を介してミラー３Ｃに入射させるように
したものである。音響光学素子２７に印加される電圧に
よりゲル４に入射する励起光光路が変化する。

第１０図はさらに他の実施例を表わしたものである。

第２図の実施例と比較すると、第１０図では光電変換部
が移動ステージ１３外にあり、励起光光路の方向を変え
るためのミラー３ａもステージ１３外にあり、走査用及
びミラー角度を設定するための走査・制御用マイクロコ
ンピュータ１２ａと、信号取込み用のマイクロコンピュ
ータ１２ｂとが別になっている点が相違している。

励起光ビーム１はガルバノミラ−３ａに反射されてマス
ク２１を通り、ステージ１３へ入射する。

ステージ１３上には凸レンズの一部を切断したレンズ２
ａが設けられており、励起光ビーム１はこのレンズ２ａ
で偏向され集光されてゲル４を照明する。凸レンズ２ａ
の焦点は受光光学系光軸とゲル４のおおよその交点にあ
る。凸レンズの切断品２ａの代りに第２図のように通常
の凸レンズとミラーを組み合わせたり、凸レンズとウェ
ッジプリズムを組み合わせるようにしてもよい。

ステージ１３上にはゲル４又はガラス板５ａ。

５ｂからの光を取り込む対物レンズ７と、対物レンズ７
で平行光とされた光をステージ１３外へ導くミラー２０
が設けられている。ステージ１３の外部には、ミラー２
０から導かれた平行光の向きを変えるミラー２１、蛍光
用干渉フィルタ８、集光レンズ９及び集光レンズ９で適
当な大きさに集光された蛍光を光電変換する光電子増倍
管１０が設けられている。１６はＡ／Ｄ変換器であり、
Ａ／Ｄ変換器１６を経てマイクロコンピュータ１２ｂに
取り込まれた信号は外部のコンピュータ２２に導かれて
塩基配列決定のデータ処理が行なわれる。

走査・制御用マイクロコンピュータ１２ａは走査用モー
タ１５に対し駆動に必要な駆動信号を与える。走査領域
の両端にはセンサ２３，２４が設けられている。走査領
域の端部のセンサ２３，２４からの信号がマイクロコン
ピュータ１２ａに取り込まれ、走査領域の端部に来たら
駆動信号により駆動方向を変える。走査用モータ１５に
はエンコーダが設けられており、エンコーダ信号がマイ
クロコンピュータ１２ａにフィードバックされてモータ
１５の回転速度が一定に保たれる。

マイクロコンピュータ１２ｂはもっばら光電子増倍管１
０の信号を取り込むＡ／Ｄ変換器１６の制御に用いられ
る。この場合、特にＡ／Ｄ変換器１６のクロックと、走
査用モータ１５のクロックとは同期しているわけではな
く、単に走査の初めと終わりを示す信号がセンサ２３，
２４の出力としてマイクロコンピュータ１２ｂに与えら
れるにすぎない。実際にはこのような構成でも差し支え
なく、マイクロコンピュータを１２ａと１２ｂに分離す
ることにより、プログラムはずっと容易になる。

第１０図の実施例の動作を示すフローチャートは第３図
、第４図及び第５図に示されたものとほとんど同じであ
る。相違点は、第３図ではガルバノミラ−を回転する角
度（ストローク）は第２図のものより小さくてよいが、
回転角の精度はより高くなければならない点である。第
３図の較正プロセスと第４図の保管プロセスではマイク
ロコンピュータ１２ａと１２ｂが同時に働き、計算し、
記憶するが、第５図の測定プロセスではマイクロコンピ
ュータ１２ａと１２ｂが全く独立の動作をする。第３図
と第４図で決定された較正データθｉの値は走査位置Ｘ
ｉとともにマイクロコンピュータ１２ａのメモリに記憶
され、マイクロコンピュータ１２ａの制御下で走査と同
期してガルバノミラ−３８の角度θを変える。それと並
列にマイクロコンピュータ１２ｂでは光電子増倍管１０
の信号出力を取り込み、外部コンピュータ２２に電送し
て泳動パターンを得る。

第１０図の実施例が第２図の実施例より優れている点は
、ステージ１３上の部品点数が少なく軽量化できる点と
、マイクロコンピュータを分離したことによりプログラ
ムが楽になる点である。

実施例では励起光光路と受光光学系光軸との相対的な位
置関係を変化させる移動手段として、いずれも励起光光
路を変化させるものを示しているが、励起光光路を固定
し、受光光学系光軸を移動させる方式にすることもでき
る。その方式としては１例えば走査点で移動台を走査方
向に移動させたり、第２図に鎖線で示されるように、受
光光学系光軸にガラスブロック２９を配置し、これを回
転させるようにする方式がある。

（発明の効果） 本発明ではゲル電気泳動装置に装着されたゲルに対し、
測定が開始される前に較正プロセスを設け、走査を行な
って各走査点についてゲルが届起光によって照明された
部分が受光光学系光軸上に来るようにするための較正デ
ータを求めておき、測定にあたってはその較正データを
用いて励起光光路と受光光学系光軸との相対的位置関係
を制御しながら測定を行なうようにしたので、加工誤差
。

組立て誤差、調整誤差によって必然的に起こり得る受光
光学系光軸と励起光照明位置とのずれが根本的に解消さ
れ、感度ムラもなくなる。また、ゲルを保持するガラス
板を交換しても全く差し支えない。したがって、逆に加
工誤差や組立て誤差、調整誤差が存在しても性能上は全
く問題がないことになり、加工、組立て、調整が楽にな
り、装置コストも低下する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を示すブロック図、第２図は一実施例を
示す概略平面図、第３図は一実施例の動作における較正
プロセスを示すフローチャート図、第４図は補間プロセ
スを示すフローチャート図、第５図は測定プロセスを示
すフローチャート図。 第６図は較正時の光電子増倍管出力を示す波形図。 第７図はガルバノミラ−の回転による励起光光路の変化
を示す概略平面図、第８図及び第９Ｖはそれぞれ他の実
施例における励起光光路の移動手段を示す概略平面図、
第１０図は他の実施列を示す概略平面図である。第１１
図は従来のゲル電気泳動装置を示す概略平面図、第１２
図は第１１図の問題点を示す要部平面図である。 １・・・・・・励起光ビーム、３，３ａ・・・・・・ガ
ルバノミラ−１４・・・・・・泳動ゲル、５ａ、５ｂ・
・・・・ガラス板、６・・・・・・励起光ビームのゲル
照明位置、Ａ・・・・・・受光光学系光軸、１１・・・
・・・ガルバノスキャナ、１２゜１２ａ、１２ｂ・・・
・・・マイクロコンピュータ、１３・・・・・・ステー
ジ、１４・・・・・・走査機構の捧ネジ、１５・・・・
・・走査用モータ、３０・・・・・・走査場所検出部、
３２・・・・・・移動手段、３４・・・・・・信号検出
手段、３６・・・・・・較正部、３８・・・・・・記憶
部、４０・・・・・・移動手段制御部、４２・・・・・
・信号処理部、４４・・・・・・走査機構、４６・・・
・・・走査制御部。 特許出願人　株式会社島津製作所

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛍光ラベルしたサンプルをゲル電気泳動させ、泳
   動方向と直交する方向に蛍光の励起・受光光学系を走査
   して泳動パターンを検出する装置において、励起・受光
   光学系の走査場所を検出する走査場所検出部と、励起光
   光路と受光光学系光軸との相対的位置関係を変化させる
   移動手段と、測定に用いられるゲルが装着されサンプル
   が測定部に到着する前の較正用走査における走査領域内
   のいくつかの走査場所で前記移動手段を作動させ、信号
   検出手段からの信号にもとづいてゲルの励起光による照
   明部分が受光光学系光軸上にくるときの前記移動手段の
   移動量に関係した較正データを求め、走査場所データと
   ともに後記記憶部へ記憶させる較正部と、較正データを
   走査場所データとともに記憶する記憶部と、測定時に前
   記記憶部から走査場所に対応した較正データを読み出し
   各走査場所ごとに前記移動手段の移動量を設定する移動
   手段制御部とを備えた蛍光検出型ゲル電気泳動装置。
2. （２）較正部は、励起光光路又は受光光学系光軸を、受
   光光学系光軸と励起光光路の交点がゲルを支持するガラ
   ス板の励起光源側の外側にある状態を始点に同交点が同
   ガラス板の同光源と反対側の外側にくる方向に向かって
   順に移動させたとき、その移動に対する受光光学系光軸
   上の光電変換器の出力の極大のうち、最初から２番目の
   山で幅が最初のものより有意に広い山の極大を与える移
   動量に関係したデータを較正データとする請求項１に記
   載の蛍光検出型ゲル電気泳動装置。