JP2676980B2 - 蛍光検出型ゲル電気泳動装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はDNA塩基配列決定などに用いる装置であっ
て、蛍光ラベルしたサンプルをゲル電気泳動させ、泳動
方向と直交する方向に蛍光の励起・受光光学系を走査
し、泳動パターンを検出するゲル電気泳動装置に関する
ものである。

（従来の技術） 蛍光ラベルしたサンプルとは、プライマー部又はダイ
オキシ部に蛍光ラベルし、サンガーの方法で調整したDN
A断片であり、この蛍光ラベルしたサンプルをゲル電気
泳動して得られる展開パターンはそのままDNAの塩基配
列を与える。

蛍光検出型ゲル電気泳動装置の一例は特開昭63−3130
35号公報に記載されている。その引例の装置は、第４図
に示されるものであり、ガラス板に挟まれて図で紙面垂
直方向に延びる泳動ゲル104に蛍光ラベルしたサンプル
が紙面垂直方向に泳動する。ステージ239はガイドレー
ル233に案内され、モータ237で駆動される棒ネジ252の
回転によって泳動方向と直交する図の上下方向に走査さ
れる。ステージ239には集光レンズ260が設けられ、励起
光であるレーザビーム250がミラー251で反射されてレン
ズ260に入射し、ステージ239上のミラー255で反射され
て泳動ゲル104の測定部分を照射する。その測定部分か
ら出た蛍光はステージ239に設けられた集光レンズ221で
集光され、干渉フィルタ223で分光されてレンズ225を通
り、光電子増倍管229で検知される。

（発明が解決しようとする課題） 第４図の装置では、泳動ゲル104と走査方向（ネジ252
とガイドレール233で決まる）、及び集光レンズ260への
励起光の入射方向の三者が全く平行で、かつ泳動ゲル10
4の位置は走査のどの場所でも全く一致していなければ
ならない。この条件はゲル104を交換したときでも、常
に満たされていなければならない。

第５図はこの条件が満たされていない場合を示したも
のである。走査のある場所Ａでは励起光250により照明
されたゲル部分は正しく受光光学系の光軸上にあり、強
い信号が得られるが、ゲル104が挟まれているガラスの
厚さが変化したり、ゲル104とネジ252の平行度が不十分
な場合など、走査の別の場所Ｂでは図のように励起光25
0により照明されたゲル部分と受光光学系の光軸との間
にずれが生じ、信号強度が弱くなり、はなはだしい場合
には信号が検出されなくなる。このように、信号強度が
場所により変化する結果を生じる。

レンズ225はこのずれを軽減するために設けられたも
のであるが、それでもこの光学系の場合、入射角θが散
乱光を減少させるために20〜35度ぐらいと小さく設定さ
れているため、ガラスの厚さの不均一や平行度の誤差に
よるゲル104とステージ239との距離ｘの変動によるゲル
104の励起場所と受光光学系の光軸とのずれを十分補償
できるものではない。

本発明は第４図のように励起・受光光学系を泳動方向
と直交する方向に走査しながら泳動パターンを検出する
装置において、ゲルと走査方向及び励起光入射方向の厳
密な平行関係が保たれない場合においても、正しく蛍光
検出を行なうことのできるゲル電気泳動装置を提供する
ことを目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明では、泳動ゲルのうち励起光で照射された部分
の位置と受光光学系光軸との位置のずれを検出するずれ
検出手段と、励起光光路と受光光学系光軸との相対的位
置関係を変化させる移動手段と、ずれ検出手段の検出出
力を増幅する増幅器と、その増幅された信号出力で移動
手段をずれを解消する方向に動かす負帰還回路とを備え
ている。

（作用） 泳動ゲルのうち励起光で照射された部分が受光光学系
の光軸上の位置からずれると、それに応じてずれ検出手
段が信号を発生し、負帰還回路を介して調整手段がずれ
信号が減少する方向に励起光と受光光学系光軸との相対
位置を変化させ、結果として走査の全領域でいつでも泳
動ゲルの照明された位置が受光光学系の光軸上にあり、
走査の全領域で信号強度が一定となる。

（実施例） 第１図は一実施例を表わす。

２は泳動ゲルであり、例えば６％ポリアクリルアミド
にてなり、ガラス板（例えば厚さ5mmのパイレックスガ
ラス板）に挾まれて、例えば0.35mmの厚さに形成され、
紙面垂直方向に立てられている。泳動ゲル２には蛍光ラ
ベルしたサンプルが紙面垂直方向に電気泳動される。サ
ンプルは例えば蛍光物質FITCでラベルされており、488n
mのアルゴンイオンレーザで励起されて520nmの蛍光を発
する。

３はステージであり、クロスローラやアリ溝などのガ
イドローラ（図示略）により案内され、モータ駆動され
る棒ネジ（図示略）の回転により駆動されて泳動方向と
直交する方向に走査される。ステージ３上には励起光で
あるアルゴンイオンレーザビーム１を受ける集光レンズ
４が設けられており、励起光ビーム１は泳動ゲル２及び
ステージ３の走行方向に平行に入射し、レンズ４で集光
される。レンズ４で集光された励起光ビーム１を泳動ゲ
ル２に入射させるために、ステージ３上にはミラー５が
設けられており、ミラー５はガルバノスキャナ（例えば
General Scanning社のG120Dなど）26により回転角を変
化させることができるようになっている。ガルバノスキ
ャナ26に流す電流によりミラー５の回転角が制御され
る。受光光学系に入射する散乱光を減少させるために、
入射角θが20〜35度ぐらいになるように、励起光学系と
受光光学系が設定されている 励起光ビーム１による泳動ゲル２の照明位置からの光
を集光し検出するために、ステージ３上には、対物レン
ズ６、対物レンズ６で集光された光を検出系と制御系と
に分離するハーフミラー７、ハーフミラー７で反射され
た光を集光する集光レンズ８、及び集光レンズ８で集光
された光を受光する位置検出素子（例えば浜松ホトニク
ス社のS2153など）９が設けられている。位置検出素子
９からは位置を示す電流出力X1とX2が取り出される。

10は位置検出素子９からの２つの出力X1,X2から（X1
＋X2）と（X1−X2）を算出する演算回路、11はその２つ
の演算回路出力（X1＋X2），（X1−X2）の除算（X1−X
2）／（X1＋X2）を行なう除算回路（例えばアナログデ
バイセズ社のAD533など）、12はその除算出力を増幅す
る増幅器である。13は増幅器12の出力によりガルバノス
キャナ26を駆動するガルバノミラー駆動回路であり、ガ
ルバノミラー駆動回路13が増幅器12の出力を０にする方
向にミラー５の回転角を制御するように負帰還回路が構
成されている。

ステージ３上には、ハーフミラー７を通過した残りの
光を520nmの干渉フィルタ14を経て集光するために集光
レンズ15が設けられており、集光レンズ15で集光された
蛍光を検出するために光電子増幅管16が設けられてい
る。集光レンズ15は干渉フィルタ14を通った平行で幅の
広い光束を光電子増倍管16の光電面の大きさに縮小する
ためのものであり、光電面が広ければ省略してもよい。

次に、本実施例の動作について説明する。

励起光ビーム１がミラー５で反射されて泳動ゲル２に
入射し、泳動ゲル２の照明位置からの光は対物レンズ６
で集光されてハーフミラー７に入射し、ハーフミラー７
で反射された光は集光レンズ８により位置検出素子９上
にスポットを作る。そのスポットは蛍光が極めて強い場
合は蛍光光であるが、DNA塩基配列決定用のように蛍光
が弱い場合はほとんど励起光のゲルによる散乱光から成
り立っているが、それでも照明位置を検出するには差し
支えない。位置検出素子９の２つの検出出力X1,X2が演
算回路10と除算回路11を経て算出される出力 （X1−X2）／（X1＋X2） は位置検出素子９上のスポットの位置に比例したもので
あり、ちょうどそのスポットが位置検出素子９の中央に
きたときに出力が０となるように設定されている。その
除算回路11の出力は直ちに受光光学系の光軸と励起光照
明位置のずれ信号となる。この信号が増幅されてガルバ
ノミラー駆動回路13にずれを打ち消す方向に入力され
て、走査のいかなる場所においても励起光照明位置を受
光光学系の光軸上におくことができる。

このように励起光照明位置が受光光学系の光軸上にく
るように制御された状態でハーフミラー７からの残りの
蛍光が干渉フィルタ14を経て集光レンズ15で集光され、
光電子増倍管16で検出されるので、光軸ずれのない、す
なわち走査方向に対して感度がどこでも一定な信頼性あ
る測定を行なうことができる。

第２図は他の実施例を表わす。

第２図では走査されるステージ３上には励起光学系と
受光光学系の一部のみを設け、他の部分は固定されたス
テージ20上に設けた実施例である。

泳動ゲル２と平行に、かつ泳動方向と直交する方向に
走査されるステージ３上には、泳動ゲル２に平行に入射
する励起光ビーム１を集光する集光レンズ４が設けら
れ、集光レンズ４で集光された励起光ビーム１を泳動ゲ
ル２に入射させるために、圧電素子19（例えばトーキン
社のLANシリーズの製品など）で駆動されるミラー５が
設けられている。圧電素子19に印加される電圧によりミ
ラー５は矢印のように前後方向に移動して励起光ビーム
１のゲル２への入射位置を変化させる。

泳動ゲル２の照明位置からの光を受光するために、ス
テージ３上には対物レンズ６と、対物レンズ６で集光さ
れた光を走査方向と平行にステージ３の外部へ導くため
のミラー17が設けられている。

固定されたステージ20上には、制御系として、ミラー
17からの光を分離するためのハーフミラー18、ハーフミ
ラー18を通過した光を集光する集光レンズ８、及び位置
検出素子９が設けられている。10,11,12は第１図と同じ
くそれぞれ演算回路、除算回路及び増幅器である。13a
は圧電素子19の駆動回路であり、増幅器12の信号はゲル
２上の照明位置が受光光学系の光軸上からずれるのを少
なくする方向に駆動回路13aに入力される。

固定ステージ20上には、検出系として、ハーフミラー
18で反射された光が入射する干渉フィルタ14、干渉フィ
ルタ14を通った光を集光する集光レンズ15、及び集光レ
ンズ15で集光された光を検出する光電子増倍管16が設け
られている。

第２図の実施例において、ゲル２の照明位置からの光
は対物レンズ６、ミラー17、ハーフミラー18及び集光レ
ンズ８を経て位置検出素子９上にスポットを形成し、そ
のスポット位置の信号は演算回路10、除算回路11、増幅
器12を経て駆動回路13aから圧電素子19に負帰還され、
励起光レーザ１のゲル照明位置が受光光学系の光軸上に
くるように傾向される。そのように制御された状態で干
渉フィルタ14から集光レンズ15を経て光電子増倍管16で
蛍光検出が行なわれる。

第２図の実施例では、走査用ステージ３の外部で蛍光
検出と照明位置のずれ検出を行なうので、走査系が軽量
化され、耐久性や走査性能が良くなる。

移動手段としてはミラー５をガルバノスキャナ26で回
転させたり、圧電素子19で移動させるものの他に、ミラ
ー５をステッピングモータで移動させるものであっても
よい。さらに、第３図に示されるように、ミラー５を固
定し、励起光ビーム１を音響光学素子21を介してミラー
５に入射させ、ゲルの照明位置と受光光学系の光軸との
ずれに応じて駆動回路から音響光学素子21に駆動電圧を
印加するようにしてもよい。

また、第２図の実施例において、ミラー５を移動させ
る代わりに、泳動ゲル２の照明位置からの光を反射させ
るミラー17を、例えばサーボモータで駆動してゲルの照
明位置からの光が正しく光電子増倍管16に入射するよう
に負帰還制御するようにしてもよい。

（発明の効果） 本発明では泳動ゲルのうち励起光ビームで照明されて
いる部分と受光光学系光軸とのずれを検出し、そのずれ
をなくすように励起光光路と受光光学系光軸との相対的
位置関係に負帰還をかけるようにしたので、加工誤差、
組立て誤差、調整誤差によって必然的に起こる励起光ビ
ームの泳動ゲル中の照明位置と受光光学系光軸とのずれ
を自動的に解消することができ、感度が走査点の場所に
より異なるという問題を克服することができる。

また、加工誤差や組立て誤差、調整誤差などが仮りに
あったとしても、性能に影響がでないことになり、加
工、組立て、調整が楽になり、装置コストが低下する。

【図面の簡単な説明】

第１図は一実施例を示す概略平面図、第２図は他の実施
例を示す概略平面図、第３図はさらに他の実施例におけ
る移動手段の例を示す概略平面図、第４図は従来のゲル
電気泳動装置を示す概略平面図、第５図は第４図の問題
点を示す要部平面図である。 １……励起光ビーム、２……泳動ゲル、３……走査ステ
ージ、５……ミラー、７……ハーフミラー、９……位置
検出素子、10……演算回路、11……除算回路、12……増
幅器、13……ガルバノミラー駆動回路、13a……圧電素
子駆動回路、14……干渉フィルタ、16……光電子増倍
管、19……圧電素子、21……音響光学素子、26……ガル
バノスキャナ。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】蛍光ラベルしたサンプルをゲル電気泳動さ
   せ、泳動方向と直交する方向に蛍光の励起・受光光学系
   を走査して泳動パターンを検出する装置において、泳動
   ゲルのうち励起光で照射された部分の位置と受光光学系
   光軸との位置のずれを検出するずれ検出手段と、励起光
   光路と受光光学系光軸との相対的位置関係を変化させる
   移動手段と、前記ずれ検出手段の検出出力を増幅する増
   幅器と、その増幅された信号出力で前記移動手段を前記
   ずれを解消する方向に動かす負帰還回路とを備えた蛍光
   検出型ゲル電気泳動装置。