JPH0431758A - 蛍光検出型ゲル電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＤＮＡ塩基配列決定などに用いる装置であって
、蛍光ラベルしたサンプルをゲル電気泳動させ、泳動方
向と直交する方向に蛍光の励起・受光光学系を走査し、
泳動パターンを検出するゲル電気泳動装置に関するもの
である。

（従来の技術） 蛍光ラベルしたサンプルとは、プライマ一部又はダイオ
キシ部に蛍光ラベルし、サンガーの方法で調整したＤＮ
Ａ断片であり、この蛍光ラベルしたサンプルをゲル電気
泳動して得られる展開パターンはそのままＤＮＡの塩基
配列を与える。

蛍光検出型ゲル電気泳動装置の一例は特開昭６３−３１
３０３５号公報に記載されている。その引例の装置は、
第４図に示されるものであり、ガラス板に挾まれて図で
紙面垂直方向に延びる泳動ゲル１０４に蛍光ラベルした
サンプルが紙面垂直方向に泳動する。ステージ２３９は
ガイドレール２３３に案内され、モ〒り２３７で駆動さ
れる捧ネジ２５２の回転によって泳動方向と直交する図
の上下方向に走査される。ステージ２３９には集光レン
ズ２６０が設けられ、励起光であるレーザビーム２５０
がミラー２５１で反射されてレンズ２６０に入射し、ス
テージ２３９上のミラー２５５で反射されて泳動ゲル１
０４の測定部分を照射する。その測定部分から出た蛍光
はステージ２３９に設けられた集光レンズ２２１で集光
され、干渉フィルタ２２３で分光されてレンズ２２５を
通り、光電子増倍管２２９で検知される。

（発明が解決しようとする課題） 第４図の装置では、泳動ゲル１０４と走査方向（ネジ２
５２とガイドレール２３３で決まる）、及び集光レンズ
２６０への励起光の入射方向の王者が全く平行で、かつ
泳動ゲル１０４の位置は走査のどの場所でも全く一致し
ていなければならない。この条件はゲル１０４を交換し
たときでも、常に満たされていなければならない。

第５図はこの条件が満たされていなり１場合を示したも
のである。走査のある場所Ａでは励起光２５０により照
明されたゲル部分は正しく受光光学系の光軸上にあり、
強い信号が得られるが、ゲル１０４が挾まれているガラ
スの厚さが変化したり、ゲル１０４とネジ２５２の平行
度が不十分な場合など、走査の別の場所Ｂでは図のよう
に励起光２５０により照明されたゲル部分と受光光学系
の光軸との間にずれが生じ、信号強度が弱くなり、はな
はだしい場合には信号が検出されなくなる。このように
、信号強度が場所により変化する結果を生じる。

レンズ２２５はこのずれを軽減するために設けられたも
のであるが、それでもこの光学系の場合、入射角θが散
乱光を減少させるために２０〜３５度ぐらいと小さく設
定されているため、ガラスの厚さの不均一や平行度の誤
差によるゲル１０４とステージ２３９との距離Ｘの変動
によるゲル１０４の励起場所と受光光学系の光軸とのず
れを十分補償できるものではない。

本発明は第４図のように励起・受光光学系を泳動方向と
直交する方向に走査しなから泳動パターンを検出する装
置において、ゲルと走査方向及び励起光入射方向の厳密
な平行関係が保たれない場合においても、正しく蛍光検
出を行なうことのできるゲル電気泳動装置を提供するこ
とを目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明では、泳動ゲルのうち励起光で照明された部分の
位置と受光光学系光軸との位置のずれを検出するずれ検
出手段と、励起光光路と受光光学系光軸との相対的位置
関係を変化させる移動手段と、ずれ検出手段の検出出力
を増幅する増幅器と、その増幅された信号出力で移動手
段をずれを解消する方向に動かす負帰還回路とを備えて
いる。

（作用） 泳動ゲルのうち励起光で照明された部分が受光光学系の
光軸上の位置からずれると、それに応じてずれ検出手段
が信号を発生し、負帰還回路を介して調整手段がずれ信
号が減少する方向に励起光と受光光学系光軸との相対位
置を変化させ、結果として走査の全領域でいつでも泳動
ゲルの照明された位置が受光光学系の光軸上にあり、走
査の全領域で信号強度が一定となる。

（実施例） 第１図は一実施例を表わす。

２は泳動ゲルであり５例えば６％ポリアクリルアミドに
てなり、ガラス板（例えば厚さ５ｍｍのパイレックスガ
ラス板）に挾まれて、例えば０゜３５　ｍ　ｍの厚さに
形成され、紙面垂直方向に立てられている。泳動ゲル２
には蛍光ラベルしたサンプルが紙面垂直方向に電気泳動
される。サンプルは例えば蛍光物質ＦＩＴＣでラベルさ
れており、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザで励起さ
れて５２０ｎｍの蛍光を発する。

３はステージであり、クロスローラやアリ溝などのガイ
トローラ（図示略）により案内され、モータ鮭動される
棒ネジ（図示略）の回転により能動されて泳動方向と直
交する方向に走査される。

ステージ３上には励起光であるアルゴンイオンレーザビ
ーム１を受ける集光レンズ４が設けられており、励起光
ビーム１は泳動ゲル２及びステージ３の走査方向に平行
に入射し、レンズ４で集光される。レンズ４で集光され
た励起光ビーム１を泳動ゲル２に入射させるために、ス
テージ３上にはミラー５が設けられており、ミラー５は
ガルバノスキャナ（例えばＧｅｎｅｒａｌ　Ｓｃａｎｎ
ｉｎｇ社の６１２０Ｄなど）２６により回転角を変化さ
せることができるようになっている。ガルバノスキャナ
２６に流す電流によりミラー５の回転角が制御される。

受光光学系に入射する散乱光を減少させるために、入射
角θが２０〜３５度ぐらいになるように、励起光学系と
受光光学系が設定されている励起光ビーム１による泳動
ゲル２の照明位置からの光を集光し検出するために、ス
テージ３上には、対物レンズ６、対物レンズ６で集光さ
れた光を検出系と制御系とに分離するハーフミラ−７、
ハーフミラ−７で反射された光を集光する集光レンズ８
、及び集光レンズ８で集光された光を受光する位置検出
素子（例えば浜松ホトニクス社の８２１５３など）９が
設けられている。位置検出素子９からは位置を示す電流
出力Ｘ１とｘ２が取り出される。

１０は位置検出素子９からの２つの出力Ｘ１゜Ｘ２から
（Ｘ１＋Ｘ２）と（Ｘｉ−Ｘ２）を算出する演算回路、
１１はその２つの演算回路出力（Ｘ１＋Ｘ２）、（Ｘｉ
−Ｘ２）の除算（Ｘｉ−Ｘ２）／　（Ｘ１十Ｘ２）を行
なう除算回路（例えばアナログデバイセズ社のＡＤ５３
３など）、１２はその除算出力を増幅する増幅器である
。１３は増幅器１２の出力によりガルバノスキャナ２６
を駆動するガルバノミラ−駆動回路であり、ガルバノミ
ラ−駆動回路１３が増幅器１２の出力を０にする方向に
ミラー５の回転角を制御するように負帰還回路が構成さ
れている。

ステージ３上には、ハーフミラ−７を通過した残りの光
を５２０ｎｍの干渉フィルタ１４を経て集光するために
集光レンズ１５が設けられており、集光レンズ１５で集
光された蛍光を検出するために光電子増倍管１６が設け
られている。集光レンズ１５は干渉フィルタ１４を通っ
た平行で幅の広い光束を光電子増倍管１６の光電面の大
きさに縮小するためのものであり、光電面が広ければ省
略してもよい。

次に、本実施例の動作について説明する。

励起光ビーム１がミラー５で反射されて泳動ゲル２に入
射し、泳動ゲル２の照明位置からの光は対物レンズ６で
集光されてハーフミラ−７に入射し、ハーフミラ−７で
反射された光は集光レンズ８により位置検出素子９上に
スポットを作る。そのスポットは蛍光が極めて強い場合
は蛍光光であるが、ＤＮＡ塩基配列決定用のように蛍光
が弱い場合はほとんど励起光のゲルによる散乱光から成
り立っているが、それでも照明位置を検出するには差し
支えない。位置検出素子９の２つの検出出力Ｘｉ、Ｘ２
が演算回路１０と除算回路１１を経て算出される出力 （ＸＩ−Ｘ２）／　（Ｘ１＋Ｘ２） は位置検出素子９上のスポットの位置に比例したもので
あり、ちょうどそのスポットが位置検出素子９の中央に
きたときに出力が０となるように設定されている。その
除算回路１１の出力は直ちに受光光学系の光軸と励起光
照明位置のずれ信号となる。この信号が増幅されてガル
バノミラ−駆動回路１３にずれを打ち消す方向に入力さ
れて、走査のいかなる場所においても励起光照明位置を
受光光学系の光軸上におくことができる。

このように励起光照明位置が受光光学系の光軸上にくる
ように制御された状態でハーフミラ−７からの残りの蛍
光が干渉フィルタ１４を経て集光レンズ１５で集光され
、光電子増倍管１６で検出されるので、光軸ずれのない
、すなわち走査方向に対して感度がどこでも一定な信頼
性ある測定を行なうことができる。

第２図は他の実施例を表わす。

第２図では走査されるステージ３上には励起光学系と受
光光学系の一部のみを設け、他の部分は固定されたステ
ージ２０上に設けた実施例である。

泳動ゲル２と平行に、かっ泳動方向と直交する方向に走
査されるステージ３上には、泳動ゲル２に平行に入射す
る励起光ビーム１を集光する集光レンズ４が設けられ、
集光レンズ４で集光された励起光ビーム１を泳動ゲル２
に入射させるために、圧電素子１９（例えばトーキン社
のＬＡＮシリーズの製品など）で駆動されるミラー５が
設けられている。圧電素子１９に印加される電圧により
ミラー５は矢印のように前後方向に移動して励起光ビー
ム１のゲル２への入射位置を変化させる。

泳動ゲル２の照明位置からの光を受光するために、ステ
ージ３上には対物レンズ６と、対物レンズ６で集光され
た光を走査方向と平行にステージ３の外部へ導くための
ミラー１７が設けられている。

固定されたステージ２０上には、制御系として、ミラー
１７からの光を分離するためのハーフミラ−１８，ハー
フミラ−１８を通過した光を集光する集光レンズ８、及
び位置検出素子９が設けられている。１０，１１．１２
は第１図と同じくそれぞれ演算回路、除算回路及び増幅
器である。１３ａは圧電素子１９の駆動回路であり、増
幅器１２の信号はゲル２上の照明位置が受光光学系の光
軸上からずれるのを少なくする方向に駆動回路１３ａに
入力される。

固定ステージ２０上には、検出系として、ハーフミラ−
１８で反射された光が入射する干渉フィルタ１４、干渉
フィルタ１４を通った光を集光する集光レンズ１５、及
び集光レンズ１５で集光された光を検出する光電子増倍
管１６が設けられている。

第２図の実施例において、ゲル２の照明位置がらの光は
対物レンズ６、ミラー１７、ハーフミラ−１８及び集光
レンズ８を経て位置検出素子９上にスポットを形成し、
そのスポット位置の信号は演算回路１０、除算回路１１
、増幅器１２を経て駆動回路１３ａから圧電素子１９に
負帰還され、励起光レーザ１のゲル照明位置が受光光学
系の光軸上にくるように偏向される。そのように制御さ
れた状態で干渉フィルタ１４から集光レンズ１５を経て
光電子増倍管１６で蛍光検出が行なわれる。

第２図の実施例では、走査用ステージ３の外部で蛍光検
量と照明位置のずれ検出を行なうので、走査系が軽量化
され、耐久性や走査性能が良くなる。

移動手段としてはミラー５をガルバノスキャナ２６で回
転させたり、圧電素子１９で移動させるものの他に、ミ
ラー５をステッピングモータで移動させるものであって
もよい。さらに、第３図に示されるように、ミラー５を
固定し、励起光ビーム１を音響光学素子２１を介してミ
ラー５に入射させ、ゲルの照明位置と受光光学系の光軸
とのずれに応じて駆動回路から音響光学素子２１に駆動
電圧を印加するようにしてもよい。

また、第２図の実施例において、ミラー５を移動させる
代わりに、泳動ゲル２の照明位置からの光を反射させる
ミラー１７を、例えばサーボモータで駆動してゲルの照
明位置からの光が正しく光電子増倍管１６に入射するよ
うに負帰還制御する゛ようにしてもよい。

（発明の効果） 本発明では泳動ゲルのうち励起光ビームで照明されてい
る部分と受光光学系光軸とのずれを検出し、そのずれを
なくすように励起光光路と受光光学系光軸との相対的位
置関係に負帰還をかけるようにしたので、加工誤差、組
立て誤差、調整誤差によって必然的に起こる励起光ビー
ムの泳動ゲル中の照明位置と受光光学系光軸とのずれを
自動的に解消することができ、感度が走査点の場所によ
す異なるという問題を克服することができる。

また、加工誤差や組立て誤差、調整誤差などが仮りにあ
ったとしても、性能に影響がでないことになり、加工、
組立て、調整が楽になり、装置コストが低下する。

【図面の簡単な説明】

例における移動手段の例を示す概略平面図、第４図は従
来のゲル電気泳動装置を示す概略平面図、第５図は第４
図の問題点を示す要部平面図である。 １・・・・・・励起光ビーム、２・・目・・泳動ゲル、
３・・・・・・走査ステージ、５・・・・・・ミラー　
７・・・・・・ハーフミラ９・・・・・・位置検出素子
、１０・・・・・・演算回路、１１・・・・・・除算回
路、１２・・・・・・増幅器、１３・旧・・ガルバノミ
ラ−駆動回路、１３ａ・・・・・・圧電素子駆動回路、
１４・・・・・・干渉フィルタ、１６・・目・・光電子
増倍管、１９・・・・・・圧電素子、２１・・・・・・
音響光学素子。 ２６・・・・・・ガルバノスキャナ。 特許出願人　株式会社島津製作所

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛍光ラベルしたサンプルをゲル電気泳動させ、泳
   動方向と直交する方向に蛍光の励起・受光光学系を走査
   して泳動パターンを検出する装置において、泳動ゲルの
   うち励起光で照明された部分の位置と受光光学系光軸と
   の位置のずれを検出するずれ検出手段と、励起光光路と
   受光光学系光軸との相対的位置関係を変化させる移動手
   段と、前記ずれ検出手段の検出出力を増幅する増幅器と
   、その増幅された信号出力で前記移動手段を前記ずれを
   解消する方向に動かす負帰還回路とを備えた蛍光検出型
   ゲル電気泳動装置。