JPH04305531A - 治療抗凝血剤の投与方法 - Google Patents
治療抗凝血剤の投与方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】血栓症は先進諸国における主要な死因であ
る。現在の療法は非致死的血栓症状を予防しかつ処置す
るため抗凝血剤及び血栓溶解剤の使用に依存している。 最も広く用いられる抗凝血剤のヘパリンは抗トロンビン
IIIの効果を高め、それによりトロンビン活性を遮断
している〔ヘンカ−、血栓及び止血国際学会、ルベン大
学出版、ルベン、1987年(Hemker,Inte
rnationalSociety on Thr
ombosis and Haemostasis
,Leuven University Pres
s,Leuven(1987))〕。その使用はその広
範な結合特異性のために合併症をおこすことが多い〔ヒ
ュイッセら、トロンボシス・リサーチ、第27巻、19
82年、第485−490頁(Huisse et
al.,Thromb.Res.,27(1982)
485−490)〕。
る。現在の療法は非致死的血栓症状を予防しかつ処置す
るため抗凝血剤及び血栓溶解剤の使用に依存している。 最も広く用いられる抗凝血剤のヘパリンは抗トロンビン
IIIの効果を高め、それによりトロンビン活性を遮断
している〔ヘンカ−、血栓及び止血国際学会、ルベン大
学出版、ルベン、1987年(Hemker,Inte
rnationalSociety on Thr
ombosis and Haemostasis
,Leuven University Pres
s,Leuven(1987))〕。その使用はその広
範な結合特異性のために合併症をおこすことが多い〔ヒ
ュイッセら、トロンボシス・リサーチ、第27巻、19
82年、第485−490頁(Huisse et
al.,Thromb.Res.,27(1982)
485−490)〕。
【0002】血液凝固の役割は止血栓の硬化及び安定化
のために不溶性フィブリン基質を形成することである。 架橋フィブリン凝塊の形成はある範囲の十分に特徴付け
られた血漿タンパク質を伴う一連の生化学的相互作用に
起因している。
のために不溶性フィブリン基質を形成することである。 架橋フィブリン凝塊の形成はある範囲の十分に特徴付け
られた血漿タンパク質を伴う一連の生化学的相互作用に
起因している。
【0003】その相互作用は、フィブリン形成に必要な
すべての物質が循環血漿中に前駆形で存在する“内在経
路”と称される経路と、組織に由来するトロンボプラス
チンがプロセスにおいていくつかのステップを迂回して
凝塊形成を促進させる外在経路とに分類される。2つの
経路は高度に相互依存的であり、VII因子、IX因子
及びX因子が相互に活性化される〔J.C.ギジングス
、“血液凝固に関する分子遺伝学及び免疫分析”、エリ
ス・ホーウッド社、チチェスター、イングランド、19
88年、第17頁〔J.C.Giddings,“Mo
lecularGenetics and Imm
unoanalysis in Blood C
oagulation”、Ellis Horwoo
d Ltd.,Chichester,Englan
d,1988,p.17)〕。
すべての物質が循環血漿中に前駆形で存在する“内在経
路”と称される経路と、組織に由来するトロンボプラス
チンがプロセスにおいていくつかのステップを迂回して
凝塊形成を促進させる外在経路とに分類される。2つの
経路は高度に相互依存的であり、VII因子、IX因子
及びX因子が相互に活性化される〔J.C.ギジングス
、“血液凝固に関する分子遺伝学及び免疫分析”、エリ
ス・ホーウッド社、チチェスター、イングランド、19
88年、第17頁〔J.C.Giddings,“Mo
lecularGenetics and Imm
unoanalysis in Blood C
oagulation”、Ellis Horwoo
d Ltd.,Chichester,Englan
d,1988,p.17)〕。
【0004】凝固カスケードにおけるX因子の役割はズ
ーら、“血液凝固の組織因子経路”、止血及び血栓、第
1版(ブルームら編集)、チャーチル・リビングストー
ン、エジンバラ、第124・139頁、1981年〔Z
ur et al.,“Tissue fact
or pathways of blood,c
oagulation”、Haemostasis
and Thrombosis,lst Edit
ion(Bloom et al.,Eds)、C
hurchill Livingstone,Edi
nburgh,pp.124−139(1981)〕;
ジャクソン(Jackson)、“プロトロンビン活性
化の生化学”(The biochemistry
of prothrombin activat
ion)、止血及び血栓、第2版(ブルームら編集)、
チャーチル・リビングストーン、エジンバラ、第165
−191頁1987年;スタインバーグら、“X因子の
活性化”、止血及び血栓、第1版(コールマンら編集)
、リピンコット、フィラデルフィア、第91−111頁
、1982年〔Steinberg et al.
,“The activation of Fa
ctorX”、Haemostasis and
Thrombosis,FirstEdition(C
olman et al.,Eds.)Lippi
ncott,Philadelphia,pp.91−
111(1982)〕で考察されていた。
ーら、“血液凝固の組織因子経路”、止血及び血栓、第
1版(ブルームら編集)、チャーチル・リビングストー
ン、エジンバラ、第124・139頁、1981年〔Z
ur et al.,“Tissue fact
or pathways of blood,c
oagulation”、Haemostasis
and Thrombosis,lst Edit
ion(Bloom et al.,Eds)、C
hurchill Livingstone,Edi
nburgh,pp.124−139(1981)〕;
ジャクソン(Jackson)、“プロトロンビン活性
化の生化学”(The biochemistry
of prothrombin activat
ion)、止血及び血栓、第2版(ブルームら編集)、
チャーチル・リビングストーン、エジンバラ、第165
−191頁1987年;スタインバーグら、“X因子の
活性化”、止血及び血栓、第1版(コールマンら編集)
、リピンコット、フィラデルフィア、第91−111頁
、1982年〔Steinberg et al.
,“The activation of Fa
ctorX”、Haemostasis and
Thrombosis,FirstEdition(C
olman et al.,Eds.)Lippi
ncott,Philadelphia,pp.91−
111(1982)〕で考察されていた。
【0005】Xa因子は血液凝固カスケードにおいて中
枢的役割を果たす。それはトロンビンの上流における1
ステップで凝固カスケードをコントロールするため、X
a因子阻害剤はトロンビンで作用するものよりもより有
効な抗凝血剤であろう。主にトロンビン活性を遮断する
ヘパリンは、トロンビン産生が血栓の形成に関与してい
る症状で最も広く使用される。しかしながら、それは多
くの生物学的効果を有する不均一な物質であるため(ヒ
ュイッセら)、更に特異的かつ強力な物質の開発を必要
とする。アンチスタシンの特異性及び効力は血栓症の治
療用に更に有効な臨床剤としてその可能な使用に関し、
興味をおこさせた。Xa因子阻害剤であることに加えて
、アンチスタシンは最初にそれが強い抗転移活性を有す
ると確認されたように、重要な生物学的機能を更に有し
ている〔ツジンスキーら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、第262巻、1987年、第9
718−9723頁(Tuszinsky et
al.,J.Biol.Chem.,262(1987
)9718−9723)〕。腫瘍細胞の転移拡散が異常
に促進された血液凝固によって一部媒介されるという証
拠は増えてきているが〔ガシックら、インターナショナ
ル・レビュー・オブ・エクスペリメンタル・パソロジー
、第29巻、1986年、第173−208頁(Gas
ic et al.,Int・Rev・Exp・P
ath.,29(1986)173−208)〕。その
場合に腫瘍細胞によるX因子の直接的活性化が主要原因
であると示唆された〔ファランガ及びゴードン、バイオ
ケミストリー、第24巻、1985年、第5558−5
567頁(Falanga and Gordon
,Biochemistry,24(1985)555
8−5567)〕。フィブリンの細胞周囲沈着は転移上
重要であると考えられ〔ウッド、ジャーナル・オブ・メ
ディシン、第5巻、1974年、第7−22頁(Woo
d,J.Med.,5(1974)7−22)〕、免疫
系に非浸透性の保護カバーを腫瘍細胞に与える〔ゴレリ
ックら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャ
ンサー、第30巻、1982年,第107−112頁(
Gorelik et al.,Int.J.Ca
ncer,30(1982)107−112)〕。この
ためアンチスタシンのXa因子阻害活性はこのタンパク
質が腫瘍拡散を抑制することによるメカニズムであると
推測された。
枢的役割を果たす。それはトロンビンの上流における1
ステップで凝固カスケードをコントロールするため、X
a因子阻害剤はトロンビンで作用するものよりもより有
効な抗凝血剤であろう。主にトロンビン活性を遮断する
ヘパリンは、トロンビン産生が血栓の形成に関与してい
る症状で最も広く使用される。しかしながら、それは多
くの生物学的効果を有する不均一な物質であるため(ヒ
ュイッセら)、更に特異的かつ強力な物質の開発を必要
とする。アンチスタシンの特異性及び効力は血栓症の治
療用に更に有効な臨床剤としてその可能な使用に関し、
興味をおこさせた。Xa因子阻害剤であることに加えて
、アンチスタシンは最初にそれが強い抗転移活性を有す
ると確認されたように、重要な生物学的機能を更に有し
ている〔ツジンスキーら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、第262巻、1987年、第9
718−9723頁(Tuszinsky et
al.,J.Biol.Chem.,262(1987
)9718−9723)〕。腫瘍細胞の転移拡散が異常
に促進された血液凝固によって一部媒介されるという証
拠は増えてきているが〔ガシックら、インターナショナ
ル・レビュー・オブ・エクスペリメンタル・パソロジー
、第29巻、1986年、第173−208頁(Gas
ic et al.,Int・Rev・Exp・P
ath.,29(1986)173−208)〕。その
場合に腫瘍細胞によるX因子の直接的活性化が主要原因
であると示唆された〔ファランガ及びゴードン、バイオ
ケミストリー、第24巻、1985年、第5558−5
567頁(Falanga and Gordon
,Biochemistry,24(1985)555
8−5567)〕。フィブリンの細胞周囲沈着は転移上
重要であると考えられ〔ウッド、ジャーナル・オブ・メ
ディシン、第5巻、1974年、第7−22頁(Woo
d,J.Med.,5(1974)7−22)〕、免疫
系に非浸透性の保護カバーを腫瘍細胞に与える〔ゴレリ
ックら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャ
ンサー、第30巻、1982年,第107−112頁(
Gorelik et al.,Int.J.Ca
ncer,30(1982)107−112)〕。この
ためアンチスタシンのXa因子阻害活性はこのタンパク
質が腫瘍拡散を抑制することによるメカニズムであると
推測された。
【0006】メキシコヒルヘメンテリア・アフィシナリ
ス(Haementeria officinali
s)の唾液腺に存在するシスティンに富むタンパク質ア
ンチスタシンはヒト血液凝固カスケードにおいてXa因
子の強力な阻害剤であることが示された〔ツジンスキー
ら、1987年;ナット(Nutt)ら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第263巻、第
10162−10167頁、1988年;ダンウィッデ
ィ(Dunwiddie)ら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、第264巻、第16694
−16699頁、1989年〕。
ス(Haementeria officinali
s)の唾液腺に存在するシスティンに富むタンパク質ア
ンチスタシンはヒト血液凝固カスケードにおいてXa因
子の強力な阻害剤であることが示された〔ツジンスキー
ら、1987年;ナット(Nutt)ら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第263巻、第
10162−10167頁、1988年;ダンウィッデ
ィ(Dunwiddie)ら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、第264巻、第16694
−16699頁、1989年〕。
【0007】アンチスタシンのような大サイズ分子の治
療投与は困難である。一般に大分子の生体内吸収は小分
子の場合ほど効率的でない。血流中に存在すると、大分
子は望ましくない不活性化の化学的修飾をうけやすい。 したがってそれらは比較的短い半減期及び短い活性期間
を有すると予想される。患者血流中における大分子の治
療レベルは通常静脈内投与によって達成される。例えば
、ハレンバーグら、セミナーズ・イン・トロンボシス・
アンド・ヘモスタシス、第15巻、第4号、1989年
、第414−423頁〔Harenberg et
al.,Seminars in Thromb
osis and Hemostasis,Vol
.15,No.4(1989)pp.414−423〕
では正常ヘパリン(分子量約12,000)と様々なよ
り低い分子量のヘパリン(分子量範囲2,340〜5,
030)とのバイオアベイラビリティを比較している。 小さなヘパリンは正常ヘパリンよりも皮下投与で有効で
ある。皮下投与は正常ヘパリンの投与に適した手段と考
えられる。 大分子アンチスタシンを投与する本出願人らの皮下手段
は血液凝固Xa因子を阻害する上で意外にも有効な方法
であることが示された。
療投与は困難である。一般に大分子の生体内吸収は小分
子の場合ほど効率的でない。血流中に存在すると、大分
子は望ましくない不活性化の化学的修飾をうけやすい。 したがってそれらは比較的短い半減期及び短い活性期間
を有すると予想される。患者血流中における大分子の治
療レベルは通常静脈内投与によって達成される。例えば
、ハレンバーグら、セミナーズ・イン・トロンボシス・
アンド・ヘモスタシス、第15巻、第4号、1989年
、第414−423頁〔Harenberg et
al.,Seminars in Thromb
osis and Hemostasis,Vol
.15,No.4(1989)pp.414−423〕
では正常ヘパリン(分子量約12,000)と様々なよ
り低い分子量のヘパリン(分子量範囲2,340〜5,
030)とのバイオアベイラビリティを比較している。 小さなヘパリンは正常ヘパリンよりも皮下投与で有効で
ある。皮下投与は正常ヘパリンの投与に適した手段と考
えられる。 大分子アンチスタシンを投与する本出願人らの皮下手段
は血液凝固Xa因子を阻害する上で意外にも有効な方法
であることが示された。
【0008】本発明は血流中でアンチスタシンの長期間
治療有効レベルを持続する皮下ボーラス注射法に従いア
ンチスタシン医薬組成物を患者に投与することからなる
血液凝固Xa因子の阻害方法である。本組成物及び注射
法によればXa因子血液凝固阻害を要する患者で有効か
つ都合よく治療することができる。
治療有効レベルを持続する皮下ボーラス注射法に従いア
ンチスタシン医薬組成物を患者に投与することからなる
血液凝固Xa因子の阻害方法である。本組成物及び注射
法によればXa因子血液凝固阻害を要する患者で有効か
つ都合よく治療することができる。
【0009】本発明は血液凝固Xa因子を阻害する上で
十分な適量の医薬アンチスタシン含有組成物を24〜4
8時間に一回皮下ボーラス注射で患者に投与することか
らなる血液凝固阻害方法であって、その場合に組成物が
アンチスタシン/水溶液であり、注射されるアンチスタ
シンの量か約0.05〜5.0mg/kg患者体重であ
る。その方法では長時間、例えば30時間以内にわたり
約10〜100nMの定常状態血漿濃度を保つ。この方
法によれば、凝塊形成時間は増加される。例えば、0.
25mg/kgにおける凝塊形成時間は無アンチスタシ
ン凝塊形成時間の1.5〜2倍である。
十分な適量の医薬アンチスタシン含有組成物を24〜4
8時間に一回皮下ボーラス注射で患者に投与することか
らなる血液凝固阻害方法であって、その場合に組成物が
アンチスタシン/水溶液であり、注射されるアンチスタ
シンの量か約0.05〜5.0mg/kg患者体重であ
る。その方法では長時間、例えば30時間以内にわたり
約10〜100nMの定常状態血漿濃度を保つ。この方
法によれば、凝塊形成時間は増加される。例えば、0.
25mg/kgにおける凝塊形成時間は無アンチスタシ
ン凝塊形成時間の1.5〜2倍である。
【0010】下記方法に従い投与されるアンチスタシン
のアミノ酸配列は下記のとおりである:配列番号1参照
のアミノ酸配列は下記のとおりである:配列番号1参照
【0011】本発明では前記配列を有する又は保存アミ
ノ酸置換をうけた配列番号1の配列を有するタンパク質
を血液凝固の阻害を必要とする患者に皮下ボーラス注射
によって24〜48時間毎に一回投与する。タンパク質
はタンパク質−水組成物のような適切な医薬組成物で投
与される。本組成物はいずれか適切なタンパク質・水濃
度、例えば1〜20mg/ml及び例えばpH7.4を
有する。患者体重kg当たりタンパク質約0.05〜5
mg、好ましくは1mg/kgの量のボーラス注射で長
時間、例えば30時間にわたり薬理学上有効な血漿アン
チスタシン濃度を保つ。薬理学上有効な濃度は約5〜1
00nM、好ましくは約40〜80nMの範囲内である
。
ノ酸置換をうけた配列番号1の配列を有するタンパク質
を血液凝固の阻害を必要とする患者に皮下ボーラス注射
によって24〜48時間毎に一回投与する。タンパク質
はタンパク質−水組成物のような適切な医薬組成物で投
与される。本組成物はいずれか適切なタンパク質・水濃
度、例えば1〜20mg/ml及び例えばpH7.4を
有する。患者体重kg当たりタンパク質約0.05〜5
mg、好ましくは1mg/kgの量のボーラス注射で長
時間、例えば30時間にわたり薬理学上有効な血漿アン
チスタシン濃度を保つ。薬理学上有効な濃度は約5〜1
00nM、好ましくは約40〜80nMの範囲内である
。
【0012】これらのタンパク質は多くのタンパク質と
同様にあらゆる無毒性の有機又は無機酸と薬学上許容さ
れる塩を形成することができる。適切な塩を形成する例
示無機酸としてはオルトリン酸一水素ナトリウム及び硫
酸水素カリウムのような塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリ
ン酸金属塩がある。適切な塩を形成する例示有機酸とし
てはモノ、ジ及びトリカルボン酸がある。このような酸
の例は、例えば酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸
、マロン酸、コハク酸、トリフルオロ酢酸、グルタル酸
、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビ
ン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、
ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチ
ル酸、2−フェノキシ安息香酸、メタンスルホン酸及び
2−ヒドロキシエタンスルホン酸のようなスルホン酸で
ある。カルボキシ末端アミノ酸部分の塩としてはあらゆ
る適切な無機又は有機塩基と形成された無毒性のカルボ
ン酸塩がある。例示として、これらの塩には例えばナト
リウム及びカリウムのようなアルカリ金属;カルシウム
及びマグネシウムのようなアルカリ土類金属;アルミニ
ウムを含めたIIIA属の軽金属;例えばトリエチルア
ミンを含めたトリアルキルアミン、プロカイン、ジベン
ジルアミン、1−エテンアミン、N,N′−ジベンジル
エチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン、N−低
級アルキルピペリジン及び他のいずれかの適切なアミン
のような有機一級、二級及び三級アミンの塩がある。
同様にあらゆる無毒性の有機又は無機酸と薬学上許容さ
れる塩を形成することができる。適切な塩を形成する例
示無機酸としてはオルトリン酸一水素ナトリウム及び硫
酸水素カリウムのような塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリ
ン酸金属塩がある。適切な塩を形成する例示有機酸とし
てはモノ、ジ及びトリカルボン酸がある。このような酸
の例は、例えば酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸
、マロン酸、コハク酸、トリフルオロ酢酸、グルタル酸
、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビ
ン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、
ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチ
ル酸、2−フェノキシ安息香酸、メタンスルホン酸及び
2−ヒドロキシエタンスルホン酸のようなスルホン酸で
ある。カルボキシ末端アミノ酸部分の塩としてはあらゆ
る適切な無機又は有機塩基と形成された無毒性のカルボ
ン酸塩がある。例示として、これらの塩には例えばナト
リウム及びカリウムのようなアルカリ金属;カルシウム
及びマグネシウムのようなアルカリ土類金属;アルミニ
ウムを含めたIIIA属の軽金属;例えばトリエチルア
ミンを含めたトリアルキルアミン、プロカイン、ジベン
ジルアミン、1−エテンアミン、N,N′−ジベンジル
エチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン、N−低
級アルキルピペリジン及び他のいずれかの適切なアミン
のような有機一級、二級及び三級アミンの塩がある。
【0013】抗凝血療法は様々な血栓症状、特に散在血
管内凝固に起因する冠状動脈、脳血管障害及び血栓塞栓
症の治療及び予防にとり望ましい。当業者であれば抗凝
血療法を要する情況について容易に気がつく。ここで用
いられる“患者”という用語はヒト、ヒツジ、ウマ、ウ
シ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット及びマウスを含めた霊長
類のような哺乳動物を意味する。
管内凝固に起因する冠状動脈、脳血管障害及び血栓塞栓
症の治療及び予防にとり望ましい。当業者であれば抗凝
血療法を要する情況について容易に気がつく。ここで用
いられる“患者”という用語はヒト、ヒツジ、ウマ、ウ
シ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット及びマウスを含めた霊長
類のような哺乳動物を意味する。
【0014】タンパク質物質は界面活性剤及び他の薬学
上許容されるアジュバントの添加下又は非添加下におい
て水及び油のような無菌液体である製剤キャリアと共に
生理学上許容される希釈液中における物質の溶液又は懸
濁液の注射剤として投与される。これらの製剤で使用可
能な油の例は石油、動物、植物又は合成源の油、例えば
ピーナツ油、大豆油及び鉱油である。一般に塩水、水性
デキストロース及び関連糖溶液、エタノール並びにプロ
ピレングリコール又はポリエチレングリコールのような
グリコール類が特に注射溶液用に好ましい液体キャリア
である。
上許容されるアジュバントの添加下又は非添加下におい
て水及び油のような無菌液体である製剤キャリアと共に
生理学上許容される希釈液中における物質の溶液又は懸
濁液の注射剤として投与される。これらの製剤で使用可
能な油の例は石油、動物、植物又は合成源の油、例えば
ピーナツ油、大豆油及び鉱油である。一般に塩水、水性
デキストロース及び関連糖溶液、エタノール並びにプロ
ピレングリコール又はポリエチレングリコールのような
グリコール類が特に注射溶液用に好ましい液体キャリア
である。
【0015】データは、アンチスタシンの低用量皮下投
与が霊長類で血液凝固Xa因子を阻害する驚くほど有効
な手段であることを示す。霊長類モデルにおける化合物
の分析ではヒトにおいてそれらの効果を強く示唆するこ
とが通常認められる。図3はヒト、アカゲザル、ウサギ
及びイヌ血漿に関するAPTT凝固アッセイにおけるア
ンチスタシンの効力について示す。効力はヒトで最大で
あり、ウサギ又はイヌよりもアカゲザルの方が大きい。
与が霊長類で血液凝固Xa因子を阻害する驚くほど有効
な手段であることを示す。霊長類モデルにおける化合物
の分析ではヒトにおいてそれらの効果を強く示唆するこ
とが通常認められる。図3はヒト、アカゲザル、ウサギ
及びイヌ血漿に関するAPTT凝固アッセイにおけるア
ンチスタシンの効力について示す。効力はヒトで最大で
あり、ウサギ又はイヌよりもアカゲザルの方が大きい。
【0016】本タンパク質は単独でも又は他のタンパク
質と組合せてもよい。例えば、本タンパク質は組織プラ
スミノーゲンアクチベーター媒介血栓溶解再潅流の効力
を高める。本タンパク質は血栓形成後最初に投与され、
組織プラスミノーゲンアクチベーター又は他のプラスミ
ノーゲンアクチベーターがその後に投与される。
質と組合せてもよい。例えば、本タンパク質は組織プラ
スミノーゲンアクチベーター媒介血栓溶解再潅流の効力
を高める。本タンパク質は血栓形成後最初に投与され、
組織プラスミノーゲンアクチベーター又は他のプラスミ
ノーゲンアクチベーターがその後に投与される。
【0017】前記操作に従い投与される抗凝血タンパク
質はハンら、ジーン、第75巻、1989年、第47−
57頁〔Han et al.,Gene,75(
1989)47−57〕で記載されたようにアンチスタ
シンについてコードするcDNAをクローニングかつ発
現させるか又は一般にメリフィールド、ジャーナル・オ
ブアメリカン・ケミカル・ソサエティ、第85巻、第2
149頁、1964年〔Merrifield,J.A
m.Chem.Soc.85、2149(1964)〕
、ホーテン、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス、第82巻、第5132頁
、1985年〔HoughtenProc.Natl.
Acad.Soc.82、5132(1985)〕及び
リビアー(Rivier)らの米国特許第4,244,
946号明細書で記載される当業界で周知の固相合成に
よりゲーシックら、キャンサー・リサーチ・第43巻、
1983年、第1633−1636頁〔Gasic
et al.,CancerRes.,43(198
3)1633−1636〕及びゲーシックら、キャンサ
ー・リサーチ・第44巻、1984年、第5670−5
676頁で記載される精製技術で製造することができる
。保存アミノ酸置換を有するこれらのタンパク質は本発
明の操作による投与に適している。
質はハンら、ジーン、第75巻、1989年、第47−
57頁〔Han et al.,Gene,75(
1989)47−57〕で記載されたようにアンチスタ
シンについてコードするcDNAをクローニングかつ発
現させるか又は一般にメリフィールド、ジャーナル・オ
ブアメリカン・ケミカル・ソサエティ、第85巻、第2
149頁、1964年〔Merrifield,J.A
m.Chem.Soc.85、2149(1964)〕
、ホーテン、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス、第82巻、第5132頁
、1985年〔HoughtenProc.Natl.
Acad.Soc.82、5132(1985)〕及び
リビアー(Rivier)らの米国特許第4,244,
946号明細書で記載される当業界で周知の固相合成に
よりゲーシックら、キャンサー・リサーチ・第43巻、
1983年、第1633−1636頁〔Gasic
et al.,CancerRes.,43(198
3)1633−1636〕及びゲーシックら、キャンサ
ー・リサーチ・第44巻、1984年、第5670−5
676頁で記載される精製技術で製造することができる
。保存アミノ酸置換を有するこれらのタンパク質は本発
明の操作による投与に適している。
【0018】アンチスタシンは2種のcDNAクローン
(ラムダ0−13及びラムダ5C−4)から製造しても
よい(ハンら、ジーン、第75巻、1989年、第47
−57頁参照)。導き出された配列は配列番号1及び6
で示されている。cDNAのクローニング及び発現によ
るアンチスタシンの製造のために、すべての制限エンド
ヌクレアーゼ、DNA修正酵素、逆転写酵素及びターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼはベー
リンガー・マンハイム(BoehringerMann
heim)、ニューイングランド・バイオラブス(Ne
w England Biolabs)、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda R
esearch Laboratories)又はP
L−ファルマシア(PL−Pharmacia)から、
ファージラムダパッケージング抽出物及びウサギ網状赤
血球溶離物はプロメガ・バイオテック(Promege
Biotec)から、放射性同位元素はアマーシャム(
Amersham)から、牛Xa及びV因子はエンザイ
ム・リサーチ・ラブス(Enzyme Resear
ch Labs)から、H−D−フェニルアラニル−
L−ピペコリル−L−アルギニン−p−ニトロアニリド
二塩酸(S2238)はヘレナ・ラブス(Helena
Labs)から、ナイロン膜(ジーンスクリーン・
プラス(GeneScreen Plus* )〕は
ニューイングランド・ヌクレア(New Engla
nd Nuclear)から入手した。
(ラムダ0−13及びラムダ5C−4)から製造しても
よい(ハンら、ジーン、第75巻、1989年、第47
−57頁参照)。導き出された配列は配列番号1及び6
で示されている。cDNAのクローニング及び発現によ
るアンチスタシンの製造のために、すべての制限エンド
ヌクレアーゼ、DNA修正酵素、逆転写酵素及びターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼはベー
リンガー・マンハイム(BoehringerMann
heim)、ニューイングランド・バイオラブス(Ne
w England Biolabs)、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda R
esearch Laboratories)又はP
L−ファルマシア(PL−Pharmacia)から、
ファージラムダパッケージング抽出物及びウサギ網状赤
血球溶離物はプロメガ・バイオテック(Promege
Biotec)から、放射性同位元素はアマーシャム(
Amersham)から、牛Xa及びV因子はエンザイ
ム・リサーチ・ラブス(Enzyme Resear
ch Labs)から、H−D−フェニルアラニル−
L−ピペコリル−L−アルギニン−p−ニトロアニリド
二塩酸(S2238)はヘレナ・ラブス(Helena
Labs)から、ナイロン膜(ジーンスクリーン・
プラス(GeneScreen Plus* )〕は
ニューイングランド・ヌクレア(New Engla
nd Nuclear)から入手した。
【0019】唾液腺がH.オフィシナリスから摘出され
、液体窒素にいれ、使用時まで−70℃で貯蔵された;
ポリ(A)+RNAは腺から抽出された(ハンら、バイ
オケミストリー、第26巻、1987年、第1617−
1625頁)。DNAは〔マニアティスら、分子クロー
ニング:実験マニュアル、コールド・スプリング、ハー
バー、ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー
、ニューヨーク、1982年(Maniatis e
t al.,Molecular Cloning
:A Laboratory Manual,Co
ld Spring Harbor Labor
atory,Cold Spring Harbo
r,NY(1982))で〕記載されるようにして成人
生殖腺又は全幼若動物から得た。RNA及びDNAのノ
ザン及びサザンブロット分析は標準的操作(マニアティ
スら、1982年)に従い行った。
、液体窒素にいれ、使用時まで−70℃で貯蔵された;
ポリ(A)+RNAは腺から抽出された(ハンら、バイ
オケミストリー、第26巻、1987年、第1617−
1625頁)。DNAは〔マニアティスら、分子クロー
ニング:実験マニュアル、コールド・スプリング、ハー
バー、ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー
、ニューヨーク、1982年(Maniatis e
t al.,Molecular Cloning
:A Laboratory Manual,Co
ld Spring Harbor Labor
atory,Cold Spring Harbo
r,NY(1982))で〕記載されるようにして成人
生殖腺又は全幼若動物から得た。RNA及びDNAのノ
ザン及びサザンブロット分析は標準的操作(マニアティ
スら、1982年)に従い行った。
【0020】ラムダgt22cDNA発現ライブラリー
はハン及びラッター(Rutter)〔ジェネティック
・エンジニアリング(Genetic Engine
ering)、第10巻、プレナム・プレス(Plen
um Press)、ニューヨーク、1988年〕に
従いヒル唾液腺ポリ(A)+RNAから作製した。要約
すると、ポリ(A)+RNAはNotI部位、SP6プ
ロモーター及びdTのストレッチを含むプライマー−ア
ダプターを用いて第一鎖cDNAに変換された:配列番
号2参照。得られた第一鎖cDNAはdG(約15nt
)で尾部形成され、SalI部位、T7プロモーター及
びdCのストレッチを含む第二鎖プライマー−アダプタ
ーを用いてds cDNAに変換された:配列番号3
参照。 ds cDNAはNotI及びSalIで開裂され、
ラムダgt22の対応部位に組込んでクローニングされ
た。ライブラリーをスクリーニングするため、2種のオ
リゴが成熟タンパク質のaa残基70〜107に存在す
ることが現在知られているアンチスタシンの予備アミノ
酸配列に基づき合成された(ナットら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、第263巻、19
88年、第10162−10167頁)。配列番号4及
び5参照。これら2種のオリゴは各3′末端において1
8bpの相補的重複を有しており、それによりそれらは
4つの〔α−32P〕dNTPの存在下でアニーリング
され、PolIkで修復された。これにより鎖長114
bp及び256倍縮重である比活性5×109 cpm
/μgのdsプローブを得た。DNAフィルターは20
%ホルムアミド、6×SSC(1×=150mM N
acl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.0)中
42℃でハイブリッド形成され、0.2×SSC/0.
1%SDS中42℃で30分間洗浄された。ライブラリ
ーはアンチスタシンに対するウサギ抗体(ツジンスキー
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
、第262巻、1987年、第9718−9723頁)
でもスクリーニングされた〔ヤング及びデービス、サイ
エンス、第222巻、1983年、第778−782頁
〔Young and Davis,Scienc
e,222(1983)778−782)〕。
はハン及びラッター(Rutter)〔ジェネティック
・エンジニアリング(Genetic Engine
ering)、第10巻、プレナム・プレス(Plen
um Press)、ニューヨーク、1988年〕に
従いヒル唾液腺ポリ(A)+RNAから作製した。要約
すると、ポリ(A)+RNAはNotI部位、SP6プ
ロモーター及びdTのストレッチを含むプライマー−ア
ダプターを用いて第一鎖cDNAに変換された:配列番
号2参照。得られた第一鎖cDNAはdG(約15nt
)で尾部形成され、SalI部位、T7プロモーター及
びdCのストレッチを含む第二鎖プライマー−アダプタ
ーを用いてds cDNAに変換された:配列番号3
参照。 ds cDNAはNotI及びSalIで開裂され、
ラムダgt22の対応部位に組込んでクローニングされ
た。ライブラリーをスクリーニングするため、2種のオ
リゴが成熟タンパク質のaa残基70〜107に存在す
ることが現在知られているアンチスタシンの予備アミノ
酸配列に基づき合成された(ナットら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、第263巻、19
88年、第10162−10167頁)。配列番号4及
び5参照。これら2種のオリゴは各3′末端において1
8bpの相補的重複を有しており、それによりそれらは
4つの〔α−32P〕dNTPの存在下でアニーリング
され、PolIkで修復された。これにより鎖長114
bp及び256倍縮重である比活性5×109 cpm
/μgのdsプローブを得た。DNAフィルターは20
%ホルムアミド、6×SSC(1×=150mM N
acl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.0)中
42℃でハイブリッド形成され、0.2×SSC/0.
1%SDS中42℃で30分間洗浄された。ライブラリ
ーはアンチスタシンに対するウサギ抗体(ツジンスキー
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
、第262巻、1987年、第9718−9723頁)
でもスクリーニングされた〔ヤング及びデービス、サイ
エンス、第222巻、1983年、第778−782頁
〔Young and Davis,Scienc
e,222(1983)778−782)〕。
【0021】センス及びアンチセンスmRNAの双方が
オリゴ又は抗体プローブを用いて陽性であった単離ファ
ージDNAから直接合成された。インビトロ転写が行わ
れ〔メルトンら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、
1984年、第7035−7057頁〔Melton
et al.,Nucleic Acids
Res.(1984)7035−7057)〕、キャッ
プされた転写体がウサギ網状赤血球溶離物を用いて〔3
5S〕Met存在下インビトロで翻訳された〔ペルハム
及びジャクソン、ヨーロピアン、ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー、第67巻、1976年、第247−
266頁(Pelham and Jackson
,Eur,J.Biochem.,67(1976)2
47−266)〕。標識されたタンパク質は免疫沈降さ
れ、0.1%SDS−15%PAGEで分離された。
オリゴ又は抗体プローブを用いて陽性であった単離ファ
ージDNAから直接合成された。インビトロ転写が行わ
れ〔メルトンら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、
1984年、第7035−7057頁〔Melton
et al.,Nucleic Acids
Res.(1984)7035−7057)〕、キャッ
プされた転写体がウサギ網状赤血球溶離物を用いて〔3
5S〕Met存在下インビトロで翻訳された〔ペルハム
及びジャクソン、ヨーロピアン、ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー、第67巻、1976年、第247−
266頁(Pelham and Jackson
,Eur,J.Biochem.,67(1976)2
47−266)〕。標識されたタンパク質は免疫沈降さ
れ、0.1%SDS−15%PAGEで分離された。
【0022】cDNAインサートのヌクレオチド配列は
ラムダDNA上で直接又はpUC18に組込みサブクロ
ーニング後に決定された〔チェン(Chen)及びシー
バーグ(Seeburg)、DNA、第4巻、1985
年、第165−176頁〕。
ラムダDNA上で直接又はpUC18に組込みサブクロ
ーニング後に決定された〔チェン(Chen)及びシー
バーグ(Seeburg)、DNA、第4巻、1985
年、第165−176頁〕。
【0023】アンチスタシンcDNAは2組の合成オリ
ゴを用いて発現プラスミドに組込み再構築された。要約
すれば、ラムダ0−13からcDNAインサートがAv
aII+HindIIIで切断され、しかる後BglI
I末端を形成するオリゴに結合された。次いでこの再構
築cDNAはバキュロウイルス発現ベクターpAc37
3〔スミスら、モレキュラー・セル・バイオロ、第3巻
、1983年、第2156−2165頁(Smith
et al.,Mol Cell.Biol.3
(1983)2156−2165)〕のBamHI部位
に挿入されたが、その場合において発現はウイルスポリ
ヘドリンプロモーターで行われる。組換えバキュロウイ
ルスはリン酸カルシウム法によりSf9細胞中へのAc
NPV DNAと共に得られたプラスミド(pBD8
8−004−05)の同時トランスフェクト後に単離さ
れた〔サマーズ及びスミス、バキュロウイルスベクター
及び昆虫細胞培養操作法のマニュアル、テキサス・アグ
リカルチュラル・エクスペリメント・セクション・ブレ
チン、第1555号、1987年(Summers
andSmith,A Manual of M
ethods for Bacalovirus
Vectors and Insect Ce
ll Culture Procedures,T
exas AgriculturalExperim
ent Section Bulletin,No
.1555(1987))〕。
ゴを用いて発現プラスミドに組込み再構築された。要約
すれば、ラムダ0−13からcDNAインサートがAv
aII+HindIIIで切断され、しかる後BglI
I末端を形成するオリゴに結合された。次いでこの再構
築cDNAはバキュロウイルス発現ベクターpAc37
3〔スミスら、モレキュラー・セル・バイオロ、第3巻
、1983年、第2156−2165頁(Smith
et al.,Mol Cell.Biol.3
(1983)2156−2165)〕のBamHI部位
に挿入されたが、その場合において発現はウイルスポリ
ヘドリンプロモーターで行われる。組換えバキュロウイ
ルスはリン酸カルシウム法によりSf9細胞中へのAc
NPV DNAと共に得られたプラスミド(pBD8
8−004−05)の同時トランスフェクト後に単離さ
れた〔サマーズ及びスミス、バキュロウイルスベクター
及び昆虫細胞培養操作法のマニュアル、テキサス・アグ
リカルチュラル・エクスペリメント・セクション・ブレ
チン、第1555号、1987年(Summers
andSmith,A Manual of M
ethods for Bacalovirus
Vectors and Insect Ce
ll Culture Procedures,T
exas AgriculturalExperim
ent Section Bulletin,No
.1555(1987))〕。
【0024】無細胞培地中のアンチスタシンがヘパリン
−セファロース上に吸着され、0.55M NaCl
で溶出された(ツジンスキーら、1987年)。溶出液
中のタンパク質は〔トービン(Towbin)ら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスUSA、第76巻、1979年、第4350
−4354頁で)記載されるようにセントリコン−10
(Centricon−10(商標))膜を用いて濃縮
され、0.1%SDS−11.5%PAGEで分離され
、ナイロン膜上に電気ブロットされ、1:250希釈の
モルモット抗アンチスタシンと共にインキュベートされ
た。
−セファロース上に吸着され、0.55M NaCl
で溶出された(ツジンスキーら、1987年)。溶出液
中のタンパク質は〔トービン(Towbin)ら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスUSA、第76巻、1979年、第4350
−4354頁で)記載されるようにセントリコン−10
(Centricon−10(商標))膜を用いて濃縮
され、0.1%SDS−11.5%PAGEで分離され
、ナイロン膜上に電気ブロットされ、1:250希釈の
モルモット抗アンチスタシンと共にインキュベートされ
た。
【0025】ラムダgt22cDNA発現ライブラリー
構築において、各cDNAはSP6及びT7ポリメラー
ゼプロモーターで隣接形成され、しかる後一方向でla
cZ遺伝子の3′末端に挿入された。このライブラリー
はV8プロテアーゼ開裂で形成されたアンチスタシンペ
プチドから選択されたアミノ酸配列に基づきデザインさ
れた数種の縮重オリゴプローブを用いてスクリーニング
された(ナットら、1988年)。各プローブにおける
配列縮重はG/Tミスマッチを行いかつショウジョウバ
エに関して公表されたコドン用法を利用して減少させた
(マルヤマら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第
14巻、1986年、第151−197頁)。ノザンブ
ロット分析がこれらプローブのハイブリッド形成特異性
を試験しかつアンチスタシンmRNAのサイズを仮決定
するために行われた。唾液腺RNAとのハイブリッド形
成で、鎖長114bp及び256倍縮重である1つのプ
ローブは約750ntの一本鎖RNA種を検出した。同
サイズのRNAバンドは後の実験で配列決定されたcD
NAプローブを用いて検出された。
構築において、各cDNAはSP6及びT7ポリメラー
ゼプロモーターで隣接形成され、しかる後一方向でla
cZ遺伝子の3′末端に挿入された。このライブラリー
はV8プロテアーゼ開裂で形成されたアンチスタシンペ
プチドから選択されたアミノ酸配列に基づきデザインさ
れた数種の縮重オリゴプローブを用いてスクリーニング
された(ナットら、1988年)。各プローブにおける
配列縮重はG/Tミスマッチを行いかつショウジョウバ
エに関して公表されたコドン用法を利用して減少させた
(マルヤマら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第
14巻、1986年、第151−197頁)。ノザンブ
ロット分析がこれらプローブのハイブリッド形成特異性
を試験しかつアンチスタシンmRNAのサイズを仮決定
するために行われた。唾液腺RNAとのハイブリッド形
成で、鎖長114bp及び256倍縮重である1つのプ
ローブは約750ntの一本鎖RNA種を検出した。同
サイズのRNAバンドは後の実験で配列決定されたcD
NAプローブを用いて検出された。
【0026】ラムダgt22ライブラリーから約2×1
06 プラークのうち40の陽性クローンが114bp
オリゴプローブを用いて確認された。アンチスタシンに
対するウサギ抗体で同数の組換えプラークをスクリーニ
ングすることにより、更に10の陽性クローンが確認さ
れ、そのうち3つはオリゴプローブとハイブリッド形成
した。一部の候補アンチスタシンクローンは免疫反応性
タンパク質についてコードしうるそれらの能力に関しイ
ンビトロで試験された。T7 RNAポリメラーゼに
よる2種の精製組換えファージDNA(ラムダ0−13
及びラムダ5C−4)の転写、しかる後ウサギ網状赤血
球溶離物中における翻訳により、これらの抗体で特異的
に沈降する17kDaタンパク質を得た。ポリ(A)+
RNAを用いてインビトロ翻訳反応物に合成アンチセン
スRNA(SP7ポリメラーゼで同ファージDNAの転
写により産生された)を加え、検出可能なアンチスタシ
ンを除去した。
06 プラークのうち40の陽性クローンが114bp
オリゴプローブを用いて確認された。アンチスタシンに
対するウサギ抗体で同数の組換えプラークをスクリーニ
ングすることにより、更に10の陽性クローンが確認さ
れ、そのうち3つはオリゴプローブとハイブリッド形成
した。一部の候補アンチスタシンクローンは免疫反応性
タンパク質についてコードしうるそれらの能力に関しイ
ンビトロで試験された。T7 RNAポリメラーゼに
よる2種の精製組換えファージDNA(ラムダ0−13
及びラムダ5C−4)の転写、しかる後ウサギ網状赤血
球溶離物中における翻訳により、これらの抗体で特異的
に沈降する17kDaタンパク質を得た。ポリ(A)+
RNAを用いてインビトロ翻訳反応物に合成アンチセン
スRNA(SP7ポリメラーゼで同ファージDNAの転
写により産生された)を加え、検出可能なアンチスタシ
ンを除去した。
【0027】インビトロで免疫反応性タンパク質を産生
した2種のcDNAインサート(ラムダ0−13及びラ
ムダ5C−4)のヌクレオチド配列はハンら、第52頁
で示されている。cDNAクローンラムダ5C−4から
導き出されたアンチスタシンmRNA411ntの非遮
断ORFを含んでいる。このORFは59ntのATに
富む(95%)5′非翻訳配列しかる後G又はC残基で
場合により遮断されたTA反復からなる195ntの3
′非翻訳領域で先行されている。ポリアデニル化に関す
るヘキサヌクレオチドAATAAAコンセンサスシグナ
ルはポリ(A)+トラクトの14nt前でみられる。 このため、このcDNAは約100ntとしてポリ(A
)+トラクトの鎖長を仮定した場合にサイズがノザンブ
ロット分析で750ntサイズと一致するmRNA配列
についてコードしている。
した2種のcDNAインサート(ラムダ0−13及びラ
ムダ5C−4)のヌクレオチド配列はハンら、第52頁
で示されている。cDNAクローンラムダ5C−4から
導き出されたアンチスタシンmRNA411ntの非遮
断ORFを含んでいる。このORFは59ntのATに
富む(95%)5′非翻訳配列しかる後G又はC残基で
場合により遮断されたTA反復からなる195ntの3
′非翻訳領域で先行されている。ポリアデニル化に関す
るヘキサヌクレオチドAATAAAコンセンサスシグナ
ルはポリ(A)+トラクトの14nt前でみられる。 このため、このcDNAは約100ntとしてポリ(A
)+トラクトの鎖長を仮定した場合にサイズがノザンブ
ロット分析で750ntサイズと一致するmRNA配列
についてコードしている。
【0028】ORFの翻訳で、最近解明された成熟タン
パク質の配列と非常によくマッチする137aa配列を
得た(ナットら、1988年)。成熟アンチスタシンの
N末端Gln残基は2連続Met残基で始まる18aa
プレペプチドにより先行されている。これらの18aa
残基はシグナルペプチドで代表される2つの荷電残基で
隣接された13aaの疎水コアを含んでいる(ハンら、
第52頁)。
パク質の配列と非常によくマッチする137aa配列を
得た(ナットら、1988年)。成熟アンチスタシンの
N末端Gln残基は2連続Met残基で始まる18aa
プレペプチドにより先行されている。これらの18aa
残基はシグナルペプチドで代表される2つの荷電残基で
隣接された13aaの疎水コアを含んでいる(ハンら、
第52頁)。
【0029】アンチスタシンのアミノ酸配列決定では2
残基で変異体の存在を示した:aa5(Arg/Gly
)及びaa35(Met/Val)(ナットら、198
8年)。独立cDNAクローンの直接ヌクレオチド配列
分析ではaa35における変異を確認し、残基30(G
ly/Glu)及び54(Arg/Ile)で更に変異
を示した。
残基で変異体の存在を示した:aa5(Arg/Gly
)及びaa35(Met/Val)(ナットら、198
8年)。独立cDNAクローンの直接ヌクレオチド配列
分析ではaa35における変異を確認し、残基30(G
ly/Glu)及び54(Arg/Ile)で更に変異
を示した。
【0030】ヒルゲノムにおけるアンチスタシン座の複
雑性がサザンブロット分析で研究された。ヒルゲノムD
NAは制限エンドヌクレアーゼで切断され、ラムダ0−
13からのcDNAインサートとのハイブリッド形成に
より分析された。5種の制限エンドヌクレアーゼは個々
に又は4種の基本カッターと組合せでほとんどのケース
において単一バンドパターンを示した。この結果はヒル
ゲノムがアンチスタシン遺伝子の単一コピーを含むこと
を示唆している。
雑性がサザンブロット分析で研究された。ヒルゲノムD
NAは制限エンドヌクレアーゼで切断され、ラムダ0−
13からのcDNAインサートとのハイブリッド形成に
より分析された。5種の制限エンドヌクレアーゼは個々
に又は4種の基本カッターと組合せでほとんどのケース
において単一バンドパターンを示した。この結果はヒル
ゲノムがアンチスタシン遺伝子の単一コピーを含むこと
を示唆している。
【0031】完全アンチスタシンcDNA配列は5′及
び3′末端で修正され、遺伝子カセットはpBD88−
004−5を得るためバキュロウイルス発現ベクターp
Ac373に挿入された。このベクターはポリヘドリン
プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びAcNPV
との相同的組換え用に十分隣接したウイルス配列を含ん
でいる。このプラスミド及びウイルスDNAは組換えウ
イルスの産生及び精製のため昆虫細胞系Sf9に同時ト
ランスフェクトされた。アンチスタシン活性はXa因子
によるプロトロンビンからトロンビンへの変換の阻害率
を調べることで測定された。抗Xa因子活性はトランス
フェクト後5日目に培養上澄で検出された。1:4希釈
の増殖培地は擬トランスフェクト培養から採取された培
地と比較してXa因子活性の阻害を示した。この阻害は
1:50希釈のモルモット抗アンチスタシン血清とのサ
ンプルのプレインキュベートで消失された。活性に基づ
き培地中における一過性発現アンチスタシンのレベルは
40ng/mlであった。免疫ブロット分析は3種の異
なる組換えバキュロウイルスでトランスフェクトされた
昆虫細胞から産生されたアンチスタシンに関して行われ
た。15kDaタンパク質がアンチスタシン特異抗体で
検出された。このタンパク質は電気泳動移動性に関して
天然タンパク質と区別できるが、但しRNAのインビト
ロ翻訳から誘導され17aaプレペプチドのプロセッシ
ングと一致するタンパク質よりもやや速く移動した。
び3′末端で修正され、遺伝子カセットはpBD88−
004−5を得るためバキュロウイルス発現ベクターp
Ac373に挿入された。このベクターはポリヘドリン
プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びAcNPV
との相同的組換え用に十分隣接したウイルス配列を含ん
でいる。このプラスミド及びウイルスDNAは組換えウ
イルスの産生及び精製のため昆虫細胞系Sf9に同時ト
ランスフェクトされた。アンチスタシン活性はXa因子
によるプロトロンビンからトロンビンへの変換の阻害率
を調べることで測定された。抗Xa因子活性はトランス
フェクト後5日目に培養上澄で検出された。1:4希釈
の増殖培地は擬トランスフェクト培養から採取された培
地と比較してXa因子活性の阻害を示した。この阻害は
1:50希釈のモルモット抗アンチスタシン血清とのサ
ンプルのプレインキュベートで消失された。活性に基づ
き培地中における一過性発現アンチスタシンのレベルは
40ng/mlであった。免疫ブロット分析は3種の異
なる組換えバキュロウイルスでトランスフェクトされた
昆虫細胞から産生されたアンチスタシンに関して行われ
た。15kDaタンパク質がアンチスタシン特異抗体で
検出された。このタンパク質は電気泳動移動性に関して
天然タンパク質と区別できるが、但しRNAのインビト
ロ翻訳から誘導され17aaプレペプチドのプロセッシ
ングと一致するタンパク質よりもやや速く移動した。
【0032】図4は昆虫細胞におけるアンチスタシンc
DNAを発現する発現プラスミドの概略図である。上方
向矢印はシグナルペプチターゼで認識される推定開裂部
位を示す。完全アンチスタシンORFの5′及び3′末
端を再構築するために用いられた2つの制限部位(Av
aII及びHindIII)が示されている。5′及び
3′オリゴにおけるヌクレオチド配列の部分も示されて
いる。下部のケースにおけるヌクレオチド配列はBam
HIクローニング部位のベクター配列を表す。
DNAを発現する発現プラスミドの概略図である。上方
向矢印はシグナルペプチターゼで認識される推定開裂部
位を示す。完全アンチスタシンORFの5′及び3′末
端を再構築するために用いられた2つの制限部位(Av
aII及びHindIII)が示されている。5′及び
3′オリゴにおけるヌクレオチド配列の部分も示されて
いる。下部のケースにおけるヌクレオチド配列はBam
HIクローニング部位のベクター配列を表す。
【表1】
【0033】実施例1
直接アミノ酸組成分析で二重に定量された水中14.5
mg/mlアンチスタシンストック溶液がこの研究で用
いられた物質源であった。アンチスタシンを上部背中の
肩甲骨間の大体中間の位置で2匹の覚醒アカゲザルに皮
下投与した。1mg/kgの用量はサル#89−041
の場合ストック溶液0.175ml(2.54mg)及
びサル#89−043の場合0.195ml(2.83
mg)の注射で行った。血液サンプルはアンチスタシン
の投与前とアンチスタシン投与後0.5、12、46、
8、12、24及び30時間目に3.8%クエン酸ナト
リウム(クエン酸ナトリウム最終濃度0.38%)で集
めた。血漿を遠心分離で得て、分析前−70℃で貯蔵し
た。生体外凝固時間は活性化部分トロンボプラスチン時
間及びプロトロンビン時間凝固アッセイの双方を用いて
調べた。
mg/mlアンチスタシンストック溶液がこの研究で用
いられた物質源であった。アンチスタシンを上部背中の
肩甲骨間の大体中間の位置で2匹の覚醒アカゲザルに皮
下投与した。1mg/kgの用量はサル#89−041
の場合ストック溶液0.175ml(2.54mg)及
びサル#89−043の場合0.195ml(2.83
mg)の注射で行った。血液サンプルはアンチスタシン
の投与前とアンチスタシン投与後0.5、12、46、
8、12、24及び30時間目に3.8%クエン酸ナト
リウム(クエン酸ナトリウム最終濃度0.38%)で集
めた。血漿を遠心分離で得て、分析前−70℃で貯蔵し
た。生体外凝固時間は活性化部分トロンボプラスチン時
間及びプロトロンビン時間凝固アッセイの双方を用いて
調べた。
【0034】活性化部分トロンボプラスチン時間(AP
TT) 血液サンプルをクエン酸ナトリウム(最終濃度0.38
%)で集め、血漿を10〜15分間の遠心分離で得た。 凝固時間はMLAエレクトラ(Electra)700
装置で各サンプルに関して二重に測定した。要約すると
、血漿100μlを装置内のキュベットに直接加え、3
7℃で5分間インキュベートした。インキュベート後、
アクチン活性化セファロプラスチン試薬100μlしか
る後0.02M CaCl2 溶液100μlを加え
、凝固時間を秒単位で測定した。
TT) 血液サンプルをクエン酸ナトリウム(最終濃度0.38
%)で集め、血漿を10〜15分間の遠心分離で得た。 凝固時間はMLAエレクトラ(Electra)700
装置で各サンプルに関して二重に測定した。要約すると
、血漿100μlを装置内のキュベットに直接加え、3
7℃で5分間インキュベートした。インキュベート後、
アクチン活性化セファロプラスチン試薬100μlしか
る後0.02M CaCl2 溶液100μlを加え
、凝固時間を秒単位で測定した。
【0035】プロトロンビン時間(PT)血漿サンプル
を前記のように得た。血漿100μlをMLA700内
のキュベットに直接加え、37℃で3分間インキュベー
トした。インキュベート後トロンボプラスチンC試薬(
カルシウム含有ウサギ脳トロンボプラスチン)200μ
lを加え、凝固時間を秒単位で測定した。 図1及び図2で示された生体外凝固時間データは、高ア
ンチスタシンレベルが長時間維持されることを示してい
る。図1及び2はAPTT及びPT凝固時間のピーク延
長がボーラス時の後約2〜4時間生じることを示す。ボ
ーラス時の後30時間目におけるAPTT凝固時間の増
加は1.86倍である。ボーラス時の後30時間目にお
けるPT凝固時間の増加は1.69倍である。高アンチ
スタシンレベルはサル#89−041及び#89−04
3に関するAPTTの各々2.23倍及び1.81倍延
長で示されるようにボーラス時の後30分間目で非常に
明確である。最大アンチスタシンレベルはボーラス時の
後2〜4時間で達し、APTT及びPT凝固時間の各々
5.7倍及び3.8倍のピーク延長と関連している。こ
れらの凝固時間増加は100〜120nMのピーク血漿
アンチスタシン濃度に対応している。30時間後血漿ア
ンチスタシン濃度は25〜30nMである。生体外組換
えアンチスタシン濃度はコントロールアカゲザル血漿で
測定された組換えアンチスタシン濃度対APTT時間の
標準曲線から決定された。
を前記のように得た。血漿100μlをMLA700内
のキュベットに直接加え、37℃で3分間インキュベー
トした。インキュベート後トロンボプラスチンC試薬(
カルシウム含有ウサギ脳トロンボプラスチン)200μ
lを加え、凝固時間を秒単位で測定した。 図1及び図2で示された生体外凝固時間データは、高ア
ンチスタシンレベルが長時間維持されることを示してい
る。図1及び2はAPTT及びPT凝固時間のピーク延
長がボーラス時の後約2〜4時間生じることを示す。ボ
ーラス時の後30時間目におけるAPTT凝固時間の増
加は1.86倍である。ボーラス時の後30時間目にお
けるPT凝固時間の増加は1.69倍である。高アンチ
スタシンレベルはサル#89−041及び#89−04
3に関するAPTTの各々2.23倍及び1.81倍延
長で示されるようにボーラス時の後30分間目で非常に
明確である。最大アンチスタシンレベルはボーラス時の
後2〜4時間で達し、APTT及びPT凝固時間の各々
5.7倍及び3.8倍のピーク延長と関連している。こ
れらの凝固時間増加は100〜120nMのピーク血漿
アンチスタシン濃度に対応している。30時間後血漿ア
ンチスタシン濃度は25〜30nMである。生体外組換
えアンチスタシン濃度はコントロールアカゲザル血漿で
測定された組換えアンチスタシン濃度対APTT時間の
標準曲線から決定された。
【0036】これらのデータは、臨床設定で標準ヘパリ
ンの効力(コントロールより1.5〜2倍増加)に必要
と思われるよりも十分多い凝固時間増加を得るためアン
チスタシンが1mg/kgの比較的少ない用量で皮下ボ
ーラス注射投与から十分吸収されることを示している。 更に、血漿中で得られるアンチスタシンのレベルは30
時間の全時間経過にわたりよく維持されている。
ンの効力(コントロールより1.5〜2倍増加)に必要
と思われるよりも十分多い凝固時間増加を得るためアン
チスタシンが1mg/kgの比較的少ない用量で皮下ボ
ーラス注射投与から十分吸収されることを示している。 更に、血漿中で得られるアンチスタシンのレベルは30
時間の全時間経過にわたりよく維持されている。
【配列表】配列番号:1
【化1】
配列番号:2
【化2】
配列番号:3
【化3】
配列番号:4
【化4】
配列番号:5
【化5】
配列番号:6
【化6】
【図1】生体外活性化部分トロンボプラスチン凝固時間
【図2】生体外プロトロンビン凝固時間
【図3】ヒト、
アカゲザル、ウサギ及びイヌ血漿に関するインビトロ活
性化部分トロンボプラスチン凝固時間
アカゲザル、ウサギ及びイヌ血漿に関するインビトロ活
性化部分トロンボプラスチン凝固時間
【図4】昆虫細胞
でアンチスタシンcDNAを発現する発現プラスミドの
概略図
でアンチスタシンcDNAを発現する発現プラスミドの
概略図
Claims (4)
- 【請求項1】 霊長類において血液凝固を阻害するた
めの方法であって、Xa因子を阻害する上で十分な適量
の医薬アンチスタシン含有組成物を24〜48時間毎に
一回皮下ボーラス注射で霊長類に投与し、その場合に組
成物がアンチスタシン/水溶液であり、注射されるアン
チスタシンの量が約0.05〜5.0mg/kg患者体
重であることを特徴とする方法。 - 【請求項2】 約1〜100nMの定常状態血漿アン
チスタシン濃度が30時間にわたり達成される、請求項
1記載の方法。 - 【請求項3】 濃度が約40〜80nMである、請求
項2記載の方法。 - 【請求項4】 血液凝固の阻害を必要とする霊長類へ
のボーラス注射による投与に適し、水中に薬理学上許容
される濃度のアンチスタシンを含有することを特徴とす
る医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US55727890A | 1990-07-24 | 1990-07-24 | |
US557278 | 1990-07-24 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04305531A true JPH04305531A (ja) | 1992-10-28 |
Family
ID=24224760
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3184241A Pending JPH04305531A (ja) | 1990-07-24 | 1991-07-24 | 治療抗凝血剤の投与方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0468764A1 (ja) |
JP (1) | JPH04305531A (ja) |
CA (1) | CA2047527A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7691839B2 (en) | 2005-09-28 | 2010-04-06 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for blocking platelet and cell adhesion, cell migration and inflammation |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4588587A (en) * | 1983-03-01 | 1986-05-13 | Pennsylvania Hospital | Method of treatment to inhibit metastasis |
EP0209061B1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-01-12 | Hoechst Aktiengesellschaft | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel |
NO170430C (no) * | 1986-09-18 | 1992-10-14 | Pennsylvania Hospital | Fremgangsmaate for fremstilling av et protein som har antikoagulerende og anti-metastatiske egenskaper |
US4832849A (en) * | 1988-06-16 | 1989-05-23 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Extraction and purification of an anticoagulant principle from the south american leech, haementeria ghilianii |
IL86856A0 (en) * | 1988-06-24 | 1988-11-30 | Yissum Res Dev Co | Bovine xa factor and pharmaceutical compositions containing the same |
KR0185973B1 (ko) * | 1989-06-20 | 1999-05-01 | 게리 디. 스트리트 | 남미의 거머리인 헤멘테리아 길리아니로부터의 항전이 물질 길란텐 |
-
1991
- 1991-07-22 CA CA002047527A patent/CA2047527A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-24 EP EP91306739A patent/EP0468764A1/en not_active Withdrawn
- 1991-07-24 JP JP3184241A patent/JPH04305531A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1988 * |
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1989 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2047527A1 (en) | 1992-01-25 |
EP0468764A1 (en) | 1992-01-29 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 19941006 |