JPH04282319A - メラニン生成阻害物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、皮膚の美白、またはシ
ミもしくはソバカスの除去などに有効なメラニン生成阻
害物質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】地衣類はある種の菌類と藻類から成り立
っている共生体であって、植物学的にも、特異な地位を
占める一群の植物である。このような地衣類の代謝生産
物であるいわゆる地衣成分は、多くの高等・下等植物の
成分とは全く趣きを異にし、化学的に特殊な限られた一
部門である。具体的には朝比奈らにより分類されている
（朝比奈・柴田著「地衣成分の化学」河出書房（１９４
８年））。

【０００３】地衣成分の生理学的意義については、地衣
類の生育が緩慢であることから、微生物の攻撃や小動物
の喰害に対する防御であるとか、また他の菌類とは異な
り日向に生育することから、紫外線に対する防御である
とか考えられている。そのため古来から地衣成分は、こ
れら機能から生じた用途に使用されてきた。例えば、染
料、抗生物質、香料などである。しかし、これら地衣成
分の薬理作用については、ほとんど検討されていないの
が実状である。

【０００４】しかも、地衣類はその生育が遅いのに加え
て、その生育は季節・気候・温度・緯度など自然環境や
更に亜硫酸ガス濃度・ばい煙濃度などの人為的環境の制
約を受け易いために、栽培は非常に難しく成功していな
い。また地衣類は外形がよく似ていても成分の全く異な
るものが多いので、材料の選別に熟練が必要であり、そ
のため天然からの採集は、困難である。近年、地衣成分
を生産する手法として、細胞培養の研究が進められてい
る。細胞培養は、年単位または月単位で生育する天然物
に比べ、はるかに速い速度で生育するので、短時間に目
的とする成分を生産することができ、また天然栽培と違
って天候などの影響を受けず、採取にも多くの人手を煩
わすことなく、しかも工業的規模で計画生産することが
できるという利点を有する。地衣培養細胞を培養して、
その細胞から地衣成分を採取する方法に関しては、先に
、本発明者らの出願（特開昭５８−５６６８９号）があ
るが、メラニン生成阻害物質については自ら記載されて
いない。

【０００５】皮膚の着色の原因となるメラニン色素は、
表皮と真皮との間にあるメラニン細胞（メラノサイト）
内のメラニン生成顆粒において生産され、生成したメラ
ニンは、隣接細胞へ拡散する。このメラノサイト内にお
ける生化学的反応は、現在のところ、次のように推定さ
れている。必須アミノ酸の一つであるチロシンが、チロ
シナーゼの作用により、ドーパからドーパキノンとなり
、これが酵素的または非酵素的酸化作用により赤色色素
および無色色素を経て黒色のメラニンへ変化する過程が
メラニン色素の生成過程である。従って、チロシナーゼ
の生合成を抑制すること、または反応の第一段階である
チロシナーゼの作用を抑制すること、あるいは、中間段
階のキノン類を還元することによってメラニンの生成を
抑制できると考えられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】既に、その抑制手段と
して、チロシナーゼの活性中心である銅と結合する物質
（例えば、チオ尿素、システイン、コウジ酸）、チロシ
ナーゼの基質であるチロシンと競合基質となりうる物質
（例えば、Ｎ−アセチルチロシン、γ−ピロン、ヒノキ
チオール）、チロシナーゼと基質の反応の誘導期を延長
する物質（例えば、ツィーン２０）、ドーパ等のｏ−ジ
ヒドロキシ基と選択的に結合する物質（例えば、モノブ
デンイオン）、ｏ−キノン類と結合する物質（例えば、
アニリン）、ｏ−キノン類に対する還元剤（例えば、ア
スコルビン酸、ヒドロキノンおよびその誘導体）などが
提案されている。これらメラニン生成阻害剤は、いずれ
も化粧品素材としての使用を考えたとき、ヒトに対する
毒性、安定性、官能基的影響を考慮すれば、満足できる
ものはない。従って、安全性の高い、安定なメラニン生
成阻害剤の開発が望まれていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点に鑑み、安全性の点から天然物に着目し、過去生薬と
して使用実績のある地衣類を材料に、その培養物中にメ
ラニン生成阻害物質が存在するかどうかを鋭意研究を重
ねた結果、地衣類を培養し、その培養物からメラニン生
成阻害物質を採取できることを見い出し、本発明を完成
するに至った。

【０００８】すなわち、本発明によれば、地衣類を培養
し、その培養物を凍結乾燥した後０〜１５℃の温度で溶
媒抽出することを特徴とするメラニン生成阻害物質の製
造方法が提供される。

【０００９】本発明において使用される地衣培養細胞は
、下記科に属する地衣類であればどの地衣類でも使用す
ることができ、これから常法に従い誘導することによっ
て得られる。例えば、特開昭５８−５６６８９に開示さ
れている方法を採用することができる。

【００１０】材料にできる地衣類には、テロスキステス
科、ムカデゴケ科、スミイボゴケ科、サルオガセ科、ア
ンチゴケ科、ウメノキゴケ科、ロウソクゴケ科、チャシ
ブゴケ科、ホウネンゴケ科、イワタケ科、ハナゴケ科、
センニンゴケ科、キゴケ科、ヘリトリゴケ科、サラゴケ
科、アステロチリア科、ヨロイゴケ科、ツメゴケ科、ハ
ナビラゴケ科、カワラゴケ科、クロサビゴケ科、ヘップ
ゴケ科、イワノリ科、リキナ科、モジゴケ科、チブサゴ
ケ科、キッコウゴケ科、アナイボゴケ科、サネゴケ科、
アオバゴケ科、サンゴゴケ科、ピンゴケ科、ヒョウンモ
ンゴケ科、イワボシゴケ科、キゴウゴケ科、ニササネゴ
ケ科、ホシゴケ科、ケットゴケ科、ホウキタケ科、マッ
タケ科が挙げられるが、なかでもウメノキゴケ科、サル
オガセ科、モジゴケ科、ヘリトリゴケ科、イワタケ科、
チャシブゴケ科に属する地衣類がメラニン生成阻害活性
高い物質が得られるので望ましい。ここで、地衣培養細
胞とは、菌細胞、藻細胞、もしくは、両者の混在した未
分化共生培養組織を意味する。

【００１１】本発明で使用される培地は、何ら限定され
るものではなく、通常は地衣細胞培養に用いられる培地
あるいはその培地組成を改変して用いる。通常用いられ
る培地は、炭素源、窒素源、無機イオン源、ビタミン類
等の微量有機物を含有してるい。ここで炭素源としては
、シュクロースやマンニトール等の炭水化物またはその
誘導体が例示される。窒素源としては、通常アンモニウ
ムイオン、硝酸イオン、アミノ酸またはペプトンのよう
な複雑なタンパク質の分散物等の窒素含有化合物が例示
される。無機イオン源としては、カリウムイオン、カル
シウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン等のカチ
オンと、硫酸イオン、リン酸イオン、塩素イオン等のア
ニオンとから構成される無機塩類、例えば、塩化カルシ
ウムや硫酸マグネシウムが挙げられる。ビタミン類とし
ては、チアミン、ピリドキシン、ニコチン酸、イノシト
ール等が例示される。その他微量有機物として、植物ホ
ルモン（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン
酢酸等のオーキシン類、カイネチン、ベンジルアデニン
等のサイトカイニン類）等を添加してもよい。本発明に
利用される培地として具体的には、リリー・バーネット
培地や、ハマダ培地、麦芽酵母エキス培地の改変培地等
があり、これら培地をｐＨ６前後に調整して用いられる
。

【００１２】培養は、通常３週間から６ケ月間上述した
固体培地あるいは液体培地を用いて行い、培養温度は、
地衣培養細胞によって変化するが、１０〜３０℃、好ま
しくは１５〜２０℃の一定温度条件下で行う。

【００１３】地衣培養細胞からメラニン生成阻害物質を
採取するには、培養を終えた地衣培養細胞を凍結乾燥し
た後に溶媒浸漬する。浸漬は、１時間から２４時間で低
温（０〜１５℃）で行う。これはメラニン生成阻害物質
の安定性による。浸漬する溶媒は、水、極性有機溶媒、
非極性有機溶媒のいずれでもよいが、好ましくは、アル
コールやケトン、エステルなどの極性溶媒、特にアルコ
ールが抽出効率からみて望ましい。

【００１４】浸漬液を濾過後、得られた抽出後の溶媒を
留去し、メラニン生成阻害物質を得る。

【００１５】

【発明の効果】本発明によれば、安定性に富むメラニン
生成阻害活性物質の製造が可能であり、得られたメラニ
ン生成阻害物質を用いて、化粧料などの製造が可能であ
る。

【００１６】

【参考例１】チロシナーゼ阻害活性試験方法チロシナー
ゼ阻害活性は以下の方法で評価した。 （１）反応系試薬 反応系試薬として使用したものは以下の通りである。 基質　　：２μＭ　　Ｌ−ドーパ（和光純薬）緩衝液：
０．１Ｍ　　リン酸−カリウム（ｐＨ６．８）溶液阻害
剤：１％地衣培養物抽出物溶液 酵素　　：チロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）　　０．０
５％ｍｇ／ｍｌ（２）チロシナーゼ活性の測定 ■反応液の調製 チロシナーゼ活性の測定に際して、次の表１に示した割
合で混合したＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３の反応液を
それぞれ分光光度計セル（１ｍｌ）に用意する。

【００１７】

【表１】 　　反応液の組成（ｍｌ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｎｏ．
１　　　　　　　Ｎｏ．２　　　　　　　Ｎｏ．３　　
　　　　　　　　─────────────────
───────────　　　　　　緩衝液　　　　　
　　　　　０．５０　　　　　　０．５０　　　　　　
０．５０　　　　　　基質　　　　　　　　　　　　　
　−　　　　　　　　　　０．２０　　　　　　０．２
０　　　　　　阻害剤　　　　　　　　　　　　−　　
　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　０．１０
　　　　　　イオン交換水　　　　０．４８　　　　　
　０．２８　　　　　　０．１８■測定 セルに酵素溶液（０．２０ｍｌ）を加え、添加時より３
分後から４７１ｎｍの吸光度を分光光度計で経時的に測
定する。Ｎｏ．２の吸光度（Ａｂ．２）の最大値を示す
時間でのＮｏ．３の吸光度（Ａｂ．３）、Ｎｏ．１の吸
光度（Ａｂ．１）を下記式に当てはめて阻害率を計算し
た。

【数１】 　　阻害率（％）＝１−（Ａｂ．３　−　Ａｂ．１／Ａ
ｂ．２　−　Ａｂ．１）

【００１８】

【参考例２】メラニン生成阻害作用の測定メラノサイト
に対するチロシナーゼ合成阻害及びチロシナーゼ阻害作
用は培養色素細胞を用いて以下の方法で評価した。 （１）試験培地の調整 牛胎児血清を含まないＥａｇｌｅ’ｓ　　ＭＥＭ培地４
５ｍｌに１％地衣類抽出物溶液を１．２５ｍｌ加え、０
．２μｍのフィルターで濾過した後、牛胎児血清を２ｍ
ｌ加え試験培地とした。 （２）試験方法 試験培地４ｍｌを直系６ｃｍシャーレに入れ、培地色素
細胞（Ｂ−１６メラノーマ）１×１０５／０．２ｍｌを
添加し、３７℃、５％炭酸ガス・空気混合環境で６日間
培養し、４日後に試験培地を交換した。６日後に０．０
２５％トリプシン・０．０１％ＥＤＴＡ混液を添加し細
胞を浮遊させ、７００ｒｐｍ．１０分間遠心で色素細胞
を集め分光光度計６６０ｎｍで生成メラニン量を測定し
た。 地衣類抽出物を含まない培養によるメラニン生成量を無
添加対照とし、メラニン生成阻害率を求めた。

【数２】

【実施例】実施例１ 採集したウメノキゴケ科クズレウチキウメノキゴケ（Ｐ
ａｒｍｅｌｉａｅｎｔｏｔｈｅｉｏｃｈｏｒａ）を乳鉢
で粉砕し微小片とした後、培養試験管中のｐＨ５．５の
麦芽・酵母エキス培地に置床した。１５℃、暗所で培養
し、地衣菌と地衣藻からなるクズレウチキウメノキゴケ
未分化増殖組織を得た。得られた増殖組織を凍結乾燥し
、乳鉢で粉砕して、２００ｍｇをメタノール１０ｍｌに
一昼夜冷浸した。濾過し、得られた抽出液から溶媒を留
去し、メタノール抽出物を得た。メタノール抽出物１０
ｍｇを少量のメタノールに溶解し、更に、イオン交換水
で１ｍｌに希釈し、そのうちの０．１ｍｌを参考例の試
験に供した。チロシナーゼ阻害率は６３％であった。

【００１９】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　阻害率実施例２　　ウ
メノキゴケ科ハイマツゴケ（Ｃｅｔｒａｉａ　　ｊｕｎ
ｉｐｅｒｉｎａ）　　　　　　　６５％　　　　　　３
　　サルオガセ科ナガサルオガセ（Ｕｓｎｅａ　　ｌｏ
ｎｇｉｓｓｉｍａ）　　　　　　　　　４４％　　　　
　　４　　サルオガセ科イワカラタチゴケ（Ｒａｍａｌ
ｉｎａ　　ｙａｓｕｄａｅ）　　　　　　　５４％　　
　　　　５　　モジゴケ科モジゴケ（Ｇｒａｐｈｉｓ　
　ｓｃｒｉｐｔａ）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４６％　　　　　　６　　モジゴケ科モカバイロイ
ワジゴケ（Ｇｒａｐｈｉｓ　　ｓｃｒｉｐｔａ）　　　
　　　３８％　　　　　　　　　　菌培養物 　　　　　　７　　モジゴケ科ヘリトリモジゴケ（Ｐｈ
ａｅｏｇｒａｐｈｉｓ　　ｅｘａｌｔａｔａ）　　　　
５２％　　　　　　８　　ヘリトリゴケ科エノウラヘリ
トリゴケ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
３５％　　　　　　　　　　（Ｌｅｃｉｄｅａ　　ａｄ
ｒｅｓｓｕｌａ）藻培養物　　　　　　９　　ヘリトリ
ゴケ科ヘリトリゴケ（Ｌｅｃｉｄｅａ　　ａｌｂｏｃｏ
ｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）　４１％　　　　１０　　ヘリ
トリゴケ科チズゴケ（Ｒｈｉｚｏｃａｒｐｏｎ　　ｇｅ
ｏｇｒａｐｈｉｃｕｍ）　　　　　４４％　　　　１１
　　イワタケ科シワイワタケ（Ｕｍｂｉｌｉｃａｒｉａ
　　ｃａｒｏｌｉｎｉａｎａ）　　　　　　４５％　　
　　１２　　イワタケ科オオイワブスマ（Ｌａｓａｌｌ
ｉａ　　ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）　　　　　　５２
％　　　　１３　　チャシブゴケ科チャザクロゴケ（Ｈ
ａｅｍａｔｏｍｍａ　　ｏｃｒｏｐｈａｅｕｍ）　　４
８％　　　　１４　　チャシブゴケ科モエギトリハダゴ
ケ（Ｐｅｒｔｕｓａｒｉａ　ｆｌａｖｉｃａｎｓ）４９
％実施例１５ 実施例１と同様の方法で得たウメノキゴケ科クズレウチ
キウメノキゴケ（Ｐａｒｍｅｌｉａ　ｅｎｔｏｔｈｅｉ
ｏｃｈｏｒａ）抽出物２０ｍｇをごく小量のエタノール
に溶解し、さらに、イオン交換水で２ｍｌに希釈し、そ
のうち１．２５ｍｌを参考例２の試験に供した。メラニ
ン生成阻害率は７６％であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　地衣類を培養し、その培養物を凍結乾
   燥した後０〜１５℃の温度で溶媒抽出することを特徴と
   するメラニン生成阻害物質の製造方法。
2. 【請求項２】　　地衣類がウメノキゴケ科、サルオガセ
   科、モジゴケ科、ヘリトリゴケ科、イワタケ科、チャシ
   ブゴケ科に属する地衣類である請求項１記載の製造方法
   。