JPH04267897A - Ｄｎａ又はｒｎａの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非放射性標識を用いた
ＤＮＡ又はＲＮＡの検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】医学医療分野における細菌・ウイルス等
の感染症診断、遺伝病の発症前診断や早期診断（予測）
、法医学における個人識別、動・植物の病因診断や育種
等への利用、生物製剤等の規格試験、食品分野などでは
、遺伝子診断が急速に注目されつつある。特に、診断分
野において従来多く採用されている抗原・抗体法や検出
技術面では、例えば、感染抗原に対する抗体の産生に、
あるいはウイルス検出のための感染細胞増殖のための培
養に、数週間から数カ月を要すことで診断結果が出るの
に多大の時間を費やすという欠点を有していた。従来、
ＤＮＡ又はＲＮＡの検出には標的（検体）の１本鎖ＤＮ
Ａ又はＲＮＡに相補的な１本鎖ＤＮＡによるＤＮＡ−Ｄ
ＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡ間の結合を形成させるハイ
ブリダイゼーション法が用いられている。通常、標的に
相補的なＤＮＡは放射性同位元素（３２Ｐ，３５Ｓ，３
Ｈ等）等で標識されＤＮＡプローブと呼ばれる。これら
核酸の相補的な結合は、アデニンとチミン及びグアニン
とシトシンの間で起こる水素結合の塩基対形成による。 この塩基対の形成は非常に正確に相手を認識するもので
、このことがＤＮＡプローブによる検出法の特異性を高
いものにしている。

【０００３】実際の検出操作は、固相担体法が広く採用
されている。これは標的ＤＮＡ又はＲＮＡを担体に固定
化させた後、ＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーシ
ョンを行なう方法で、担体にはニトロセルロース膜やナ
イロン膜が使われる。これらの担体の選択はＤＮＡ又は
ＲＮＡの保持量やＤＮＡプローブの非特異的結合等に大
きく影響するため重要な因子となる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】まず、従来法は放射能
を使用するため、取り扱い上あるいは安全上の問題があ
る。特に、臨床検査部門等では放射能の使用は障害とな
るため非放射性標識法による検出法の開発が望まれてい
る。近年、酵素標識をした抗原−抗体法やビオチン−ア
ビジン法等による非放射性標識法が開発されつつあるが
、検出感度の点で劣る状況にある。多くの場合、固相担
体法が開発されているが、その検出系は酵素反応の生成
物をニトロセルロース膜やナイロン膜に沈着させる方式
でその沈着性が問題となる。沈着性が悪いと酵素反応生
成物は不溶解性であるため、膜から脱離した状態となり
、大きく検出感度に影響する。本法はこれらの点を改善
した、脱放射性標識及び高検出感度の開発にある。他に
、同様な方法による蛍光や化学発光を検出するシステム
も開発されているが、正確性（測定値が安定しない）や
高価な測定用の機器が必要なこともあり、実用上問題を
残している。

【０００５】

【問題点を解決するための手段】本発明者は、上記問題
を解決すべく鋭意検討した結果、非放射性標識法により
迅速・簡便に目的とするＤＮＡ又はＲＮＡを検出する方
法を見出し、本発明に至った。即ち、本発明の要旨は、
検出しようとするＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として、（１
）ジゴキシゲニンで標識されたｄ−Ｘ１　ＴＰ（式中、
Ｘ１　はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵで表わされるデオキシリ
ボヌクレオチドを表わす。）、（２）Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及
びＵから選ばれるＸ１　以外の３種のデオキシリボヌク
レオチド、（３）ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素及
び（４）ランダム・プライマーの存在下に合成して得ら
れる標識された相補的なＤＮＡ鎖と、ポリビニリデンジ
ハライドから成る担体に担持された試料中の１本鎖ＤＮ
Ａ又はＲＮＡとをアニールさせた後、該相補的なＤＮＡ
鎖中のジゴキシゲニンを免疫化学的手法により検出する
ことを特徴とするＤＮＡ又はＲＮＡの検出方法に存する
。

【０００６】本発明においては、まず、検出しようとす
るＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として、（１）非放射性のジ
ゴキシゲニンで標識されたｄ−Ｘ１　ＴＰ（式中、Ｘ１
　はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵで表わされるデオキシリボヌ
クレオチドを表わす）、（２）Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵか
ら選ばれるＸ１　以外の３種のデオキシリボヌクレオチ
ド、（３）ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素及び（４
）ランダム・プライマーをプライマー伸長法、ニック・
トランスレーション法、テイリング法等によりプローブ
に取り込ませてＤＮＡを標識して（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰは
ＤｉｇとｄＵＴＰの間が立体障害を考慮してスペーサー
の介在により結合されている）、担体固定法によりポリ
ビニリデンジフルロライド（ＰＶＤＦ）等のポリビニリ
デンジハライドに担持させた標的ＤＮＡ又はＲＮＡとの
ハイブリダイゼーションを行ない、標識ＤＮＡ−ＲＮＡ
又は標識ＤＮＡ−ＲＮＡ結合（ハイブリッド）を形成さ
せる。

【０００７】このハイブリッドに酵素標識ジゴキシゲニ
ン抗体、例えば、抗ジゴキシゲニン・アルカリホスファ
ターゼ複合体；抗−Ｄｉｇ・ＡＬＰを付加し、酵素免疫
測定法によってＡＬＰの基質であるＢＣＩＰ（５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）とＮＢＴ（ニ
トロブルーテトラアゾリウム塩）との発色反応により、
標的ＤＮＡ又はＲＮＡを検出する。

【０００８】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。

【０００９】（１）ジゴキシゲニン標識ＤＮＡの合成・
単離 ■．ジゴキシゲニン標識ｄ−Ｘ１　ＴＰ（Ｄｉｇ−ｄ−
Ｘ１　ＴＰ） 上述のｄ−Ｘ１　ＴＰにスペーサーを介してジゴキシゲ
ニンを付加したものでＤＮＡ標識用の部位となるもので
ある。このジゴキシゲニンを抗原として認識する抗ジゴ
キシゲニン抗体に酵素を付加させ、酵素の基質との反応
により生ずる発色から酵素量、すなわちＤＮＡ量を検出
しようとするものである。標識用の部位となるデオキシ
三リン酸種は相補性を有するものであれば、知られてい
るデオキシ（アデノシン、グアノシン、シトシン、チミ
ジン又はウリジン）三リン酸やそれらの誘電体であって
も構わない。又付加する酵素種もアルカリホスファター
ゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、パーオキシダー
ゼ、ウレアーゼ等各種の酵素が利用できる。

【００１０】 ■．標識ＤＮＡの合成方法 前述したようにいくつかの標識方法が知られているが、
利用法は目的によりことなる。一般には標識用の部位の
取り込み量が多く、高検出感度が期待出来るプライマー
伸長法が有利である。まず標識用ＤＮＡを熱変性により
１本鎖とし、これに各配列種からなるヘキサ・デオキシ
核酸（ランダム・ヘキサマー）を加えて１本鎖ＤＮＡに
付加させ、Ｄｉｇ−ｄＸ１　ＴＰ及びＤＮＡポリメラー
ゼによる鎖（ヘキサマー）伸長反応を行ない、Ｄｉｇ−
ｄＸ１　ＴＰを取り込ませる。ＤＮＡポリメラーゼは反
応の開始点としてオリゴマー部位を要求する。

【００１１】 ■．標識ＤＮＡの単離方法 ＤＮＡポリメラーゼ反応物は分子量分画用ゲルによる単
離・精製を行なう。

【００１２】操作をなるべく簡便に行なうため、スピン
・カラム（市販）と呼ばれるセファデックスＧ−２５又
はＧ−５０を詰めたカラムを用い、２，０００−３，０
０００ｒｐｍ，２−４分の簡単な遠心分離により分画を
行なう。精製の有無は目的に依存し高感度の検出を要求
する場合は、取り込まれなかった過剰のＤｉｇ−ｄＸ１
　ＴＰによる非特異結合を避けるため精製操作は必要で
ある。

【００１３】（２）標的のＤＮＡ又はＲＮＡ検体中の標
的ＤＮＡ又はＲＮＡは下記で述べる担体に担持するため
前処理を行なう。検体中に蛋白質が共存する場合は蛋白
質分解酵素（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ｋが適当）による
分解を行なう。この操作は蛋白質が担体に結合すること
によりＤＮＡ又はＲＮＡの結合を妨げることや標識ＤＮ
Ａの非特異的結合の要因になること、及びＤＮＡ又はＲ
ＮＡの担持操作を障害（吸引法の場合）する等のため必
要とする。諸妨害要因となるその他の物質の共存も除去
操作が必要である（担体を通過する小分子は共存可能）
。この様にして得られたＤＮＡは１本鎖化しＲＮＡはそ
のままの状態で担体に担持される。

【００１４】その際、高検出感度を得るためには、ＤＮ
Ａ又はＲＮＡは長鎖の状態が好ましく断片化操作はしな
い。 （３）担体 本発明で担体として用いられるポリビニリデンジハライ
ドのうち、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）
はイモビロンと言う名で市販されており入手可能である
。ＰＶＤＦは前処理として１００％メタノールに浸し（
約２０秒間）、次いでドット・ブロット用バッファー（
ＩＭ酢酸アンモニウム等）もしくはサザン・ブロット用
バッファー（２０×ＳＳＣ、０．３Ｍ　　アルカリ溶液
等）等に浸けることが必要である。ＰＶＤＦ膜はテンプ
レート等によるドット・ブロットやサザン・ブロットに
よるＤＮＡ又はＲＮＡの担持後、風乾し、さらに８０℃
，６０分の加熱をすることにより、より強固な担体操作
を受ける。

【００１５】（４）ハイブリダイゼーションＤＮＡ又は
ＲＮＡの担持した担体はブロッキング剤（スキム・ミル
ク、牛アルブミン、ゼラチン等）により、標識ＤＮＡが
結合しないように担持された部分以外の部分をブロック
する。次いで、標識ＤＮＡが相補する２本鎖形成反応を
行なう。ここで、担持したＤＮＡ又はＲＮＡ中に標識Ｄ
ＮＡに相補する領域が存在すれば、２本鎖結合が形成さ
れる。

【００１６】（５）検出方法 ハイブリダイゼーション後の担体を充分洗浄し、これに
抗ジゴキシゲニン抗体・酵素複合体を加えて、ＤＮＡプ
ローブに取り込まれたＤｉｇ−ｄＵＴＰとの抗原・抗体
反応を行なう。次いで、酵素の基質、たとえば、ＡＬＰ
の場合はＢＣＩＰとＮＢＴを加えて発色反応を行なう。 ＤＮＡプローブに相補する域が存在していれば、ＤＮＡ
又はＲＮＡが担持された部位は濃い紫色に着色する。こ
れを相応するＤＮＡの標準曲線により定量する。着色部
位の判定はデンシト・メーター等の機器の利用が有利で
ある。

【００１７】（６）応用 本法は核酸の２本鎖結合の相補性を利用しているもので
、解離した鎖の再結合の際一方の鎖の標識によりＤＮＡ
又はＲＮＡを検出しようとするものである。再結合の際
、相対するデオキシヌクレオチドを強く認識するために
、特異性が高く精度の良い核酸検出法である。すなわち
４つのデオキシヌクレオチドの組み合わせによる塩基配
列は「４」のＮ乗となり、鎖が長くなれば、ＤＮＡ又は
ＲＮＡ中に存在する同配列はほぼ皆無となる。よって、
プローブの塩基配列の長さが非特異結合を避ける重要な
因子となる。本法はこの高い特異性からくる精度面で遺
伝子診断や生物製剤規格試験法あるいは法医学面等に有
用である。

【００１８】

【実施例】本発明について、以下に実施例を挙げてより
詳細に述べるが、その要旨を越えない限り、これらに限
定されるものではない。 （実施例１）ドット・ブロッド法 希釈用バッフアーＴＥ（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）により標準曲線用
のＤＮＡであるｐＢＲ３２８（直鎖型，ベーリンガー・
マンハイム社製）濃度の希釈系列を作成する。担体とす
るＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）は使用前にメチルアルコ
ールに２０秒間浸け、その後、２×ＳＳＣ（２倍のＳＳ
Ｃ溶液，０．０３Ｍ　　クエン酸三ナトリウム、０．３
Ｍ塩化ナトリウム）に浸し調製しておく。希釈した標準
ＤＮＡ又は、サンプルＤＮＡはドット・テンプレート（
ＢｉｏＲａｄ社製）を使用して軽い吸引下、ＰＶＤＦ膜
に添加してＰＶＤＦ−ＤＮＡ結合を形成する。その際、
ＤＮＡは０．３Ｎ　　ＮａＯＨあるいは９５℃，１０分
の加熱により１本鎖ＤＮＡとしておく。ＰＶＤＦ膜は次
いで、２×ＳＳＣでよく洗浄後テンプレートから取り出
し、風乾、８０℃，６０分の加熱によりＤＮＡをより強
固にＰＶＤＦ膜に固定させる。続いて、膜を０．１×Ｓ
ＳＣ，０．１％ＳＤＳ（ナトリウムドデシルサルフェー
ト）により６８℃，６０分振盪下、洗浄する。洗浄後、
膜はＢｕｆｆｅｒ−１（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，１５０ｍＭ　　ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）に浸してお
く。

【００１９】ＤＮＡの標識 標識用ＤＮＡは標識化の前に９５℃，１０分の加熱処理
により１本鎖化し、ドライアイスで冷却しておいた水−
アルコールのバスに浸け、急冷する。１．５ｍｌエッペ
ンドルフ・チューブに熱処理したＤＮＡ　　１μｇ、ラ
ンダムヘキサヌクレオチド混合液（ベーリンガー・マン
ハイム社製）２μｌ、デオキシリボヌクレオチド三リン
酸混合液（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰを含む　　ベーリンガー・
マンハイム社製）２μｌ、を加えて蒸留水で全量を１９
μｌとする。これにＤＮＡポリメラーゼ（クレノウエン
ザイム）１μｌ（ベーリンガー・マンハイム社製）を加
えて３７℃，６０分の酵素反応を行ない　　２μｌのＥ
ＤＴＡ溶液（０．２Ｍ　　ｐＨ８．０）により反応を停
止する。 続いて、標識されたＤＮＡを精製する。ＤＮＡ精製用ス
ピンカラム（ベーリンガー・マンハイム社製）を準備し
、室温下、カラム内の空気抜きを行なう。スイング型遠
心器によりカラムを２，０００ｒｐｍ、２分遠心し、カ
ラム内のバッファーを除去する。カラムに反応液を上層
して同、２，０００ｒｐｍ、４分の遠心を行ない、遠心
画分を得る。この遠心画分に標識ＤＮＡが含まれる。 使用直前まで−２０℃に凍結しておく（長期間保存可能
）。

【００２０】ハイブリダイゼーションハイブリダイゼー
ション溶液を以下のように調製する。

【００２１】 　　　　２０×ＳＳＣ　　　　　　　　　　　　　　　
　５．０　　　　ｍｌ　　（５　　Ｘ　　ＳＳＣ）　　
　　１０％ラウロイルザルコシン　　０．２　　　　ｍ
ｌ　　（０．１％ｗ／ｖ）　　　　１０％　　ＳＤＳ　
　　　　　　　　　　　　　０．０４　　ｍｌ　　（０
．０２％ｗ／ｖ）　　　　ブロッキング試薬　　　　　
　　　　　　　０．１　　　　ｇ　　　　（０．５％ｗ
／ｖ）　　　　Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１４．８　　ｍｌ　　（　　）内
は最終濃度 ＰＶＤＦ膜をハイブリダイゼーション・バッグ（コスモ
バイオ社製）に入れ、膜１００ｃｍ２　当たり１６ｍｌ
のハイブリダイゼーション溶液を加えて、６８℃，６０
分のプレハイブリダイゼーションを振盪下行なう。続い
て、新しいハイブリダイゼーション溶液（４ｍｌ／１０
０ｃｍ２　）に交換して、Ｄｉｇ標識ＤＮＡを添加によ
る６８℃，一昼夜のハイブリダイゼーションを行なう（
振盪下）。バッグから膜を取り出し、過剰の標識ＤＮＡ
を除去するため洗浄操作を行なう。

【００２２】まず、室温で膜１００ｃｍ２　当たり５０
ｍｌの２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用いて５分、２回
洗浄する。続いて、６８℃，で０．１×ＳＳＣ，０．１
％ＳＤＳを用いて１５分、２回洗浄する。洗浄した膜は
１％ブロッキング試薬を含むＢｕｆｆｅｒ−１により３
７℃，６０分のブロッキングを行なう（振盪下）。

【００２３】免疫学的検出 Ｄｉｇ標識ＤＮＡでハイブリダイズされた膜は、抗Ｄｉ
ｇ抗体−アルカリホスファターゼ複合体（抗Ｄｉｇ−Ａ
ＬＰ）との反応を行なう。膜１００ｃｍ２当たり４μｌ
の抗Ｄｉｇ−ＡＬＰ（ベーリンガー・マンハイム社製）
を含む２０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ−１に膜を浸け、３０分
間振盪する。ＡＬＰ標識された膜は、過剰の抗Ｄｉｇ−
ＡＬＰを除去するため５０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ−１にて
、１５分、３回の洗浄を行なう（振盪下）。続いて、膜
は２０ｍｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ
　　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　，ｐＨ９．５
のＢｕｆｆｅｒ−２に浸して２分間平衡化を行なった後
、膜をハイブリダイゼーション・バッグに入れ２０ｍｌ
の発色液を加え、アルミホイルに包み静置する。発色液
の組成は４５μｌ　　ＢＣＩＰ溶液、３５μｌ　　ＮＢ
Ｔ溶液（いずれもベーリンガー・マンハイム社製）をＢ
ｕｆｆｅｒ−２の１０ｍｌに溶かす。スポットあるいは
バンドが検出された時点で、膜をバッグから取り出し５
０ｍｌの１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ，ｐＨ８．０からなるＢｕｆｆｅｒに浸けること
により反応を停止する。発色反応により濃い紫色の沈澱
物が検出される。

【００２４】結果は湿った膜をコピーするか、あるいは
写真によって記録する。別にデンシトメーターにより標
準曲線から定量する。最高検出感度を測定した結果、０
．１ｐｇを検出し、放射能法に匹敵もしくはそれを越え
る検出感度を記録した。又、膜は８０℃，６０分の加熱
により保存が可能である。

【００２５】（実施例２）サザン・ブロット法標準曲線
用ＤＮＡとしてｐＢＲ３２８（制限酵素　　ＥｃｏＲｌ
，Ｂｇｌｌ，Ｈｉｎｆｌで別々に酵素分解したもの；断
片の組成（大きさ）は４９０７，２１７６，１７６６，
１２３０，１０３３，６５３，５１７，４５３，３９４
，２９８×２，２３４×２，２２０，１５４×２の塩基
対から成る）を用いて希釈用バッファーＴＥにより該Ｄ
ＮＡ濃度の希釈系列を作成する。担体とするＰＶＤＦ膜
は使用前にメチルアルコールに２０秒間浸け、その後、
０．３Ｎ　　ＮａＯＨに浸けておく。

【００２６】希釈した標準ＤＮＡ又はサンプルＤＮＡは
アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離する。 エチジウム・ブロマイド染色により、アガロ−スゲル上
でのＤＮＡ断片の分離を確認し、ポラロイドカメラによ
り写真撮影後、アガロ−スゲルは０．３Ｎ　　ＮａＯＨ
溶液に浸しＤＮＡを１本鎖化する。キャピラリー法によ
りアガロースゲルからＰＶＤＦ膜にＤＮＡ断片を移す。 展開溶媒は０．３Ｎ　　ＮａＯＨを使用して、室温で一
昼夜行なう。ＤＮＡが転写された膜は２×ＳＳＣで３回
洗浄による中和後、風乾し、８０℃，６０分の加熱しＤ
ＮＡをより強固にＰＶＤＦ膜に固定する。続いて、膜を
５×ＳＳＣ，１％ＳＤＳで５５℃，６０分振盪下、洗浄
する。洗浄後、膜はＢｕｆｆｅｒ−１に浸しておく。

【００２７】以下、ＤＮＡの標識、ハイブリダイゼーシ
ョン及び免疫学的検出については実施例１と同様に行っ
た。

【００２８】サザン・ブロット法における最高検出感度
を検討した結果、全ＤＮＡ断片の添加における検出量は
２．５ｐｇを検出した。この結果は知見の１００〜１０
００倍に相当する。断片では４９０７，２１７６，１７
６６，１２３０，１０３３のバンドが検出されているが
これは個個のバンドにおいて最高０．１８ｐｇを検出し
たことに相当する。

【００２９】ミリポア社の“Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　　Ｔ
ｅｃｈ　　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ”においてＩｍｍｏｂｉｌ
ｏｎ−Ｐ（ＰＶＤＦ，ＰはＰｒｏｔｅｉｎの意）の核酸
の検出に利用したデータが示されている。放射能法によ
るＰＶＤＦ膜とナイロン膜（Ｇｅｎｅ　　Ｓｃｒｅｅｎ
　　Ｐｌｕｓ）との比較において両者２．５ｎｇの検出
感度で差がないことを示している。非放射能法の比較に
おいては、ＰＶＤＦ膜は０．５ｎｇを検出してナイロン
膜より優れていることを示している。（ビオチン−スト
レプトアビジン・ＡＬＰ検出系）。このデータから非放
射能法は放射能法に比して５倍高い検出感度を示してい
ることがわかる。これらに比し、本法ではジゴキシゲニ
ン標識による抗ジゴキシゲニン・ＡＬＰ検出系とＰＶＤ
Ｆ膜の組み合わせにおいて、２．５ｐｇを検出しており
放射能法に対しては１０００倍、非放射能法に対しては
２００倍の高い検出感度を有するといえる。

【００３０】（実施例３）放射能法による規格試験で検
定したサンプルを用いてＤＮＡ分析を行った。

【００３１】ドット・ブロット法 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原産生細胞ＣＨＯより産生され
た表面抗原を含む培養液を集め、数々の精製工程を経て
精製された表面抗原（ワクチンになる）のバルク（製剤
の前の状態）溶液０．５ｍｌ（表面、抗原として２００
μｇ）をサンプルＤＮＡとして用いる。

【００３２】標準曲線用のＤＮＡとして、ＣＨＯ細胞由
来のＤＮＡを用いる。細胞を集め（約１０８　個）０．
５％ＳＤＳを含む５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０
ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を加えて細胞を破壊し、１０
０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ｋ（シグマ社製
）を加えて、６８℃，３時間のインキュベーションによ
り細胞由来蛋白質を分解する。次いで、フェノール処理
、エタノール沈澱によりＤＮＡ、ＲＮＡ混合物を抽出す
る。 ＤＮＡを取得するためＤＮａｓｅｓ（ＤＮＡ分解酵素）
を含まないＲＮａｓｅｓ（ＲＮＡ分解酵素）によりＲＮ
Ａを分解する。ＲＮＡを取得する場合はこの逆の操作を
行なう。再度、フェノール処理、エタノール沈澱により
精製ＤＮＡを得る。これを用いて、希釈用緩衝液ＴＥに
より適当な希釈系列を作成する。

【００３３】以下、実施例１と同様に処理し、ＰＶＤＦ
膜への担持を行う。

【００３４】ＤＮＡの標識 前述精製ＤＮＡ　　１μｇを５分間、超音波処理により
断片化し、実施例１と同様にして、プライマー伸長法に
より、　　Ｄｉｇ−ｄＵＴＰを取り込ませる。

【００３５】以下、ハイブリダイゼーション及び免疫学
的検出については、実施例１と同様に行った。その結果
、ＣＨＯ−ＤＮＡによるドット・ブロットはＤＮＡ濃度
に依存して着色を呈した。最高検出感度１．２５ｐｇの
スポットを容易に確認でき、それ以上の感度の検出が可
能なことを示唆した。又この感度は、放射能法と同等で
あった。規格試験法に要求される検出感度は１０ｐｇ以
下であり本法はこれをクリアーしている。この結果は、
非放射能法への転換の可能なことを示すものである。本
法によるサンプル中のＣＨＯ由来のＤＮＡの測定では紫
色のスポットは示さなかった（放射能法と同結果）。よ
って、精製表面抗原２００μｇサンプル中（投与量の１
０倍量）にはＣＨＯ由来のＤＮＡは許容量以下であるこ
とを確認した。

【００３６】

【発明の効果】本発明方法によれば、放射性標識を用い
なうため、経費及び使用上の制約がなく、また、操作時
間も短縮し、目的とするＤＮＡ及びＲＮＡを検出するこ
とができる。本発明方法は、遺伝子診断、生物製剤規格
試験、法医学面等、いろいろな分野で有用である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　検出しようとするＤＮＡ又はＲＮＡを
   鋳型として、（１）ジゴキシゲニンで標識されたｄ−Ｘ
   １　ＴＰ（式中、Ｘ１　はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵで表わ
   されるデオキシリボヌクレオチドを表わす。）、（２）
   Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵから選ばれるＸ１　以外の３種の
   デオキシリボヌクレオチド、（３）ＤＮＡポリメラーゼ
   又は逆転写酵素及び（４）ランダム・プライマーの存在
   下に合成して得られる標識された相補的なＤＮＡ鎖と、
   ポリビニリデンジハライドから成る担体に担持された試
   料中の１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡとをアニールさせた後、
   該相補的なＤＮＡ鎖中のジゴキシゲニンを免疫化学的手
   法により検出することを特徴とするＤＮＡ又はＲＮＡの
   検出方法。