JPH04253991A - 新規ガラクトピラノシド、その製法、該化合物からなるβ−ガラクトシダーゼ基質及びβ−ガラクトシダーゼ活性の定量方法及びそのための試薬 - Google Patents

新規ガラクトピラノシド、その製法、該化合物からなるβ−ガラクトシダーゼ基質及びβ−ガラクトシダーゼ活性の定量方法及びそのための試薬

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JPH04253991A
JPH04253991A JP3161356A JP16135691A JPH04253991A JP H04253991 A JPH04253991 A JP H04253991A JP 3161356 A JP3161356 A JP 3161356A JP 16135691 A JP16135691 A JP 16135691A JP H04253991 A JPH04253991 A JP H04253991A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規ガラクトピラノシド
、その製法、該化合物からなるβ−ガラクトシダーゼ基
質及びＣＥＤＩＡ−システムを用いて試料溶液中の被分
析物を検出するための方法及び試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】体液、例えば血液、血清又は尿中の低濃
度被分析物の測定は、例えばイムノアッセイにより提供
されるような高度に敏感なテスト法を必要とする。一定
の免疫テストの検出システムは、検出工程においてマー
カー酵素β−ガラクトシダーゼと色原体酵素基質との反
応が生じるということに基づく。次いで、遊離した染料
の吸光は検出すべき被分析物の量の直接の指示である。 高い感度を達成するためには、その酵素的分解に関して
も、遊離する発色団のスペクトル特性においてもテスト
特異的要求を満たす敏感な酵素基質の使用が必要である
。
【０００３】ＣＥＤＩＡは２つの酵素的に不活性なβ−
ガラクトシダーゼ−フラグメントが１つの活性な全酵素
に会合することに基づく。これら両方のフラグメント、
いわゆる酵素供与体及び酵素受容体は遺伝子操作法によ
り製造可能である。ＣＥＤＩＡに好適な供与体及び受容
体は米国特許第４７０８９２９号明細書に開示されてい
る。
【０００４】このＣＥＤＩＡは、酵素フラグメントの１
つの活性酵素への自然に起こる再会合が阻止されないよ
うな方法で、ハプテンは酵素供与体に共有結合するとい
うことに基づく。しかしながら、ハプテン及び酵素供与
体からなる複合体へのハプテン特異性抗体の結合の際、
酵素供与体と酵素受容体との補体結合は阻止される。こ
うして、ハプテン特異性抗体は生じる活性β−ガラクト
シダーゼの量を制御する。これは相応する色原体基質の
加水分解により測光法で定量的に測定される。ＣＥＤＩ
Ａ−システム及びその可能な使用の十分な記載はカンナ
及びウェルシー（Ｋｈａｎｎａ及びＷｅｒｔｈｙ；Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，１９８９年１０月）の論文からわかる。
【０００５】ＣＥＤＩＡのための色原体基質の品質に関
する基準は動力学的測定範囲について表現され、この測
定範囲は２つのキャリブレーターより生じた検量線の傾
斜により表わされる。このためには基質が（ａ）高い吸
光係数及び（ｂ）β−ガラクトシダーゼによる高い酵素
切断速度を示すことが重要である。
【０００６】米国特許第４７０８９２９号明細書はＣＥ
ＤＩＡのための色原体酵素基質として２−ニトロフエニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを開示している。しか
しながら、この基質の著しい欠点はその僅かな感度であ
る。従って、溶液中の低濃度の被分析物を測定するため
には改良された色原体基質を造り出すという要求があっ
た。
【０００７】改良されたβ−ガラクトシダーゼ基質とし
てはヨーロッパ特許公開第０２９２１６９号明細書中に
２−ハロゲン−４−ニトロフエニルガラクトシドが記載
されている。しかしながら、ＣＥＤＩＡ中での使用のた
めにはこの基質は考慮されない。
【０００８】
【発明が解決しょうとする課題】本発明の課題は、改良
されたβ−ガラクトシダーゼ基質を、特にＣＥＤＩＡ中
での使用のために開発することである。
【０００９】改良されたβ−ガラクトシダーゼ基質とし
て一般式Ｉ
【００１０】
【化５】
【００１１】〔式中、ＲはＣＦ３又はＣＮを表わす〕の
化合物が提供される。本発明による化合物を２−トリフ
ルオロメチル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシドもしくは２−シアノ−４−ニトロフエニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドと言い表わす。
【００１２】更に本発明の課題は本発明による化合物の
製法である。一般式
【００１３】
【化６】
【００１４】〔式中、ＲはＣＦ３又はＣＮを表わす〕の
出発物質から出発するのが有利である。この化合物ＩＩ
中にニトロ基を芳香環のヒドロキシ基に対してｐ−位で
導入すると、一般式
【００１５】
【化７】
【００１６】の化合物が得られる。引き続き、化合物Ｉ
ＩＩを酸化銀及びアセトブロムガラクトースと反応させ
ると、アセチル化β−Ｄ−ガラクトピラノシドが生じる
。 アセチル基の切断により最終生成物Ｉが得られる。
【００１７】２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの製造のためにはま
ず２−トリフルオロメチルフエノールを濃硝酸でニトロ
化し、生じた２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエ
ノールを獲得する。これを酸化銀及びアセトブロムガラ
クトースと反応させる。この反応によりアセチル化生成
物が生じ、これをアルカリ（例えばナトリウムメチラー
ト）で処理することによりアセチル基の切断下に最終生
成物に導びくことができる。
【００１８】２−シアノ−４−ニトロフエニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドは同様な方法により得られる。こ
のためには２−ヒドロキシ−ベンゾニトリルから出発し
、濃硫酸及び硝酸からなる混合物と反応させて２−ヒド
ロキシ−５−ニトロ−ベンゾニトリルにする。生じた生
成物を再び酸化銀及びアセトブロムガラクトースと反応
させ、この際アセチル化中間生成物が生じる。これから
再び最終生成物がアセチル基切断により得られる。
【００１９】本発明による化合物は特にβ−ガラクトシ
ダーゼ基質として使用するために好適である。β−ガラ
クトシダーゼが会合においてのみ酵素的に活性であり、
単独ではほぼ全く酵素的活性を有さない２つのポリペプ
チドフラグメントからなる場合が、この際特に有利であ
る。「ほぼ全く酵素的活性を有さない」とは個々のβ−
ガラクトシダーゼフラグメントの酵素的残留活性がＣＥ
ＤＩＡとの干渉のために小さすぎることを意味する。こ
の種のβ−ガラクトシダーゼ−供与体フラグメント及び
β−ガラクトシダーゼ−受容体フラグメントは米国特許
第４７０８９２９号明細書中に開示されている。本発明
による化合物をＣＥＤＩＡ−システム中のβ−ガラクト
シダーゼ基質として使用することが最も有利である。こ
の際、最適な結果がＴ４−ＣＥＤＩＡ−テスト中で生じ
るが、この際チロキシンＴ４を酵素供与体に共有結合し
たハプテンとして使用する（米国特許第４７０８９２９
号明細書）。
【００２０】本発明のもう１つの課題は更にＣＥＤＩＡ
−システムを用いる試料溶液中の被分析物の検出法であ
り、この際検出酵素としてβ−ガラクトシダーゼを、か
つβ−ガラクトシダーゼ基質として２−トリフルオロメ
チル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド又は／及び２−シアノ−４−ニトロフエニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドを使用する。
【００２１】更に、本発明はＣＥＤＩＡ−システムを用
いる被分析物の測定用試薬も包含し、この際β−ガラク
トシダーゼ基質として２−トリフルオロメチル−４−ニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド又は／及び
２−シアノ−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドを使用する。
【００２２】本発明による新規基質をＣＥＤＩＡ中で従
来使用したＯ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドと比較すると、本発明による基質はその酵素的切
断速度及び感度に関して公知技術の基質に対して明らか
に優れていることが判明した。
【００２３】更に、本発明による基質はヨーロッパ特許
公開第０２９２１６９号広報による２−クロル−４−ニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドよりも優れ
ていることが確認された。
【００２４】
【実施例】次に実施例につき本発明を更に詳細に説明す
る。
【００２５】例１ ２−シアノ−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドの製造 １）２−ヒドロキシ−５−ニトロ−ベンゾニトリル水２
０ｍｌ中の２−ヒドロキシ−ベンゾニトリル２４ｇ（０
．２ｍｏｌ）に４０％硝酸７０ｍｌ及び濃硫酸１０ｍｌ
からなる溶液を１０℃で１時間かけて滴加する。引き続
き２０℃で２４時間撹拌し、次いで酢酸エチル１００ｍ
ｌで振出する。有機溶剤を蒸発濃縮させた後、固体残分
を更に２回沸騰ｎ−ヘキサン各５００ｍｌで抽出する。 精製をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより
行なう（シリカゲル６０；溶離剤、酢酸エチル）。
【００２６】溶剤の蒸発及び酢酸エチル／トルオールか
ら結晶後、生成物２ｇが白色結晶として得られる。
【００２７】ＤＣ（シリカゲル６０；酢酸エチル）：Ｒ
Ｆ＝０．１１ ＵＶ−スペクトル（０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７．０中）：λｍａｘ＝３７６ｎｍ（ε＝１５７００　
　ｌ／ｍｏｌｃｍ） ２）２−シアノ−４−ニトロフエニル２，３，４，６−
テトラ−０−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド無
水アセトニトリル２００ｍｌ中の２−ヒドロキシ−５−
ニトロ−ベンゾニトリル１ｇ（６．１ｍｍｏｌ）からな
る溶液に酸化銀１．５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を混合し、
２０℃で３時間撹拌する。引き続き、同じ温度で無水ア
セトニトリル８０ｍｌ中のアセトブロムガラクトース２
．７ｇ（６．６ｍｍｏｌ）の溶液を加え、かつ室温で１
６時間撹拌する。銀塩をザイツフィルター（Ｓｅｉｔｚ
ｆｉｌｔｅｒ）を介して濾別し、濾液を蒸発乾固する。 粗生成物をアセトン／水から再結晶する。
【００２８】収量：２．９ｇ（９６％）ＤＣ（シリカゲ
ル６０；トルオール／酢酸エチル＝２／１）：ＲＦ＝０
．２７。
【００２９】３）２−シアノ−４−ニトロフエニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド ２）からのアセチル化生成物２．９ｇ（５．８ｍｍｏｌ
）を無水メタノール１０ｍｌ中に溶かし、飽和ナトリウ
ムメチラート溶液４ｍｌを加える。２０℃で完全な変換
まで（約１時間、ＤＣ−管理）撹拌し、沈殿を濾別し、
少量の冷メタノールで洗浄し、かつ４０℃で真空乾燥す
る。
【００３０】収量：１．０ｇ（５３％）ＤＣ（シリカゲ
ル６０；クロロホルム／メタノール＝３／１）：ＲＦ＝
０．３５。
【００３１】１Ｈ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−
ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝８．７０（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ；１
Ｈ）、８．４９（ｄｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，９Ｈｚ；１Ｈ）、
７．５５（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ；１Ｈ）、５．３６〜５．２
６（ｍ；２Ｈ）、４．９４（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ；１Ｈ）、
４．７０〜４．６０（ｍ；２Ｈ）、３．７５〜３．４０
（ｍ，６Ｈ）。
【００３２】質量分析：ｍ／ｅ＝３２６（ｎｅｇ．ＦＡ
Ｂ）。
【００３３】例２ ２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドの製造 １）２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエノール水
３０ｍｌ中の２−トリフルオロメチルフエノール１０ｇ
（０．０６ｍｏｌ）からなる懸濁液に、４０％硝酸水溶
液２０ｍｌ（０．１８ｍｏｌ）を１時間かけて氷冷下に
加える。２０℃で更に２時間撹拌し、引き続き酢酸エチ
ル１００ｍｌで振出する。硫酸ナトリウム上で有機相を
乾燥させた後、溶剤を回転蒸発装置で蒸留し、生成物を
カラムクロマトグラフィーによりシリカゲル上で精製す
る（シリカゲル６０；溶離剤、酢酸エチル／石油エーテ
ル＝１／３）。
【００３４】ＤＣ（シリカゲル６０；酢酸エチル／トル
オール＝１／２）：ＲＦ＝０．４４。
【００３５】このフラクションを集め、かつ回転蒸発装
置で真空下に濃縮する。更なる精製及び結晶化のために
は生成物を水１００ｍｌ中に溶かし、かつ１ＮＨＣｌで
ｐＨ２に調節する。４℃で２４時間後、生じた結晶を濾
別し、少量の冷水で洗浄し、４０℃真空下に乾燥する。
【００３６】収量：２．３ｇ（１９％）ＤＣ：（シリカ
ゲル６０：酢酸エチル）：ＲＦ＝０．１１ ＵＶ−スペクトル（０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ７
．０中）：λｍａｘ＝３８４ｎｍ（ε＝１８８００　　
ｌ／ｍｏｌ　ｃｍ）。
【００３７】２）２−トリフルオロメチル−４−ニトロ
フエニル２，３，４，６−テトラ−０−アセチル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド 製造は２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエノール
２ｇ（９．７ｍｍｏｌ）アセトブロムガラクトース４．
１１ｇ（１０ｍｍｏｌ）及び酸化銀２．３２ｇ（１０ｍ
ｍｏｌ）から例１．２．と同様にして行なわれる。
【００３８】収量：２ｇ（３８％）。
【００３９】ＤＣ（シリカゲル６０、トルオール／酢酸
エチル＝２／１）：ＲＦ＝０．３５。
【００４０】３）２−トリフルオロメチル−４−ニトロ
フエノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド２）からのア
セチル化化合物２．０ｇ（３．７ｍｍｏｌ）を無水メタ
ノール１０ｍｌ中に溶かし、飽和ナトリウムメチラート
溶液４ｍｌと混合する。２０℃で１時間撹拌し、酸性イ
オン交換体（Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ８、Ｈ＋）で中和し、
真空中で蒸発乾固する。精製をシリカゲルでカラムクロ
マトグラフィーにより行なう（溶離剤：クロロホルム／
メタノール＝３／１） 収量：０．２５ｇ（１８％）。
【００４１】ＤＣ（シリカゲル６０；クロロホルム／メ
タノール＝３／１）：ＲＦ＝０．５。１Ｈ−ＮＭＲ（１
００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝８．５
０（ｄｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，９Ｈｚ；１Ｈ）、８．３９（ｄ
，Ｊ＝３Ｈｚ；１Ｈ）、７．５８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ；１
Ｈ）、５．３０〜５．０５（ｍ；２Ｈ）、５．０３〜４
．８３（ｍ；１Ｈ）、４．８０〜４．５５（ｍ；２Ｈ）
、３．８２〜３．４０（ｍ；６Ｈ）。
【００４２】例３ 本発明による基質、２−シアノ−４−ニトロフエニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２−ＣＮ−４−ＮＰＧ）
、２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（２−ＣＦ３−４−ＮＰＧ）と
従来公知の基質２−クロル−４−ニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（２−Ｃｌ−４−ＮＰＧ）及び
２−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｏ
ＮＰＧ）との比較 １．色素の吸光最大値の波長及びこれに属する吸光係数
（ε） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　第　　１　　表色素　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　λｍａｘ（ｎｍ）　
　　　　　ε（ｌ／ｍｏｌ　ｃｍ）２−Ｃｌ−４−ニト
ロフエノール　　　　４０５　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１６６００２−ＣＮ−４−ニトロフエノー
ル　　　　３７６　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１５７００２−ＣＦ３−４−ニトロフエノール　　　
３８４　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８８０
０２−ニトロフエノール　　　　　　　　　　　　　　
４０８　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
４０　　０．１ｍｏｌ／ｌ　燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７．０中で色素の吸光最大値で測定。
【００４３】２．基質の感度比較もしくは酵素的切断速
度の比較 酵素β−ガラクトシダーゼの同一の量を用いて各々の色
素の吸光最大値（第１表参照）の範囲で１分あたりの吸
光変化（ｍＥ／分）を調べたが、正確な条件は例４のＩ
Ｉ）ａ）及びｂ）に記載されている。
【００４４】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　第　　２　　表基質　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＥ／ｍｉｎ　　　
　　　　　　　　　測定波長（ｎｍ）２−Ｃｌ−４−Ｎ
ＰＧ　　　　　　　　　　０．０８５　　　　　　　　
　　　　　　　　４０５２−ＣＮ−４−ＮＰＧ　　　　
　　　　　　０．１５０　　　　　　　　　　　　　　
　　３７６２−ＣＦ３−４−ＮＰＧ　　　　　　　　　
０．１０９　　　　　　　　　　　　　　　　３８４ｏ
ＮＰＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．０２４　　　　　　　　　　　　　　　　４０８３
．Ｔ４／ＣＥＤＩＡにおける評価（ハプテンとしてチロ
キシンＴ４及びチロキシンＴ４に対するモノクローナル
抗体を有するＣＥＤＩＡ） テスト条件を例４、Ｉ）ａ）及びｂ）におけるようにし
た。個々の基質の評価のための基準は検量線の傾斜であ
った。これを例４、ＩＩＩ）ａ）に記載されているよう
に調べた。
【００４５】 基質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　比上昇　　　　　　　　　　　　　　　　　
　測定波長（ｎｍ）２−Ｃｌ−４−ＮＰＧ　　　　　　
　　　　　　４９４　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　４１５２−ＣＮ−４−ＮＰＧ　　　　　　　　
　　　　５６１　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　３７６２−ＣＦ３−４−ＮＰＧ　　　　　　　　　
　　５２８　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
３７６ｏＮＰＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　４１５例４ ＣＥＤＩＡテスト用の基質類似物の試験方法２種のテス
ト法を使用した。
【００４６】１）Ｔ４／ＣＥＤＩＡ−テスト中での活性
２）β−ガラクトシダーゼのための基質としての効力Ｉ
）Ｔ４／ＣＥＤＩＡ−テストの実施 （定義：ＥＡ＝酵素受容体；ＥＤ＝酵素供与体；ＥＡ２
２＝ＣＥＤＩＡのためのクローン化酵素受容体；ＥＤ４
＝ＣＥＤＩＡのためのクローン化酵素供与体）概念ＥＡ
２２及びＥＤ４は米国特許第４７０８９２９号明細書に
より使用されている。そこではこのポリペプチドのアミ
ノ酸配列も開示されている。
【００４７】ａ）試薬 １）ＥＡ緩衝液：ＮａＨ２ＰＯ４（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
、Ｎａ２ＨＰＯ４（３０ｍｍｏｌ／ｌ）、〔エチレンビ
ス（オキシエチレンニトリロ）〕四酢酸（ＥＧＴＡ）（
１８ｍｍｏｌ／ｌ）、蔗糖（２５ｍｍｏｌ／ｌ）、Ｍｇ
（ＯＡｃ）２（９．６７ｍｍｏｌ／ｌ）、４−モルホリ
ンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（１５０ｍｍｏｌ／
ｌ）、ＮａＣｌ（４００ｍｍｏｌ／ｌ）、Ｌ−メチオニ
ン（１０ｍｍｏｌ／ｌ）、プルロニックＬ−１０１（０
．０５％）、ツウィーン２０（０．０５％）ｍ、ヒドロ
キシプロピル−β−シクロデキストリン（０．２％）、
ジチオトライトール（ＤＴＴ）（０．０５ｍｍｏｌ／ｌ
）、ＮａＮ３（２３ｍｍｏｌ／ｌ）ｐＨ７．４。
【００４８】２）ＥＤ緩衝液：ＮａＨ２ＰＯ４（４２ｍ
ｍｏｌ／ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（８ｍｍｏｌ／ｌ）、Ｎ
ａＣｌ（４００ｍｍｏｌ／ｌ）、ＭＯＰＳ（０．０２ｍ
ｍｏｌ／ｌ）、ＥＧＴＡ（１０ｍｍｏｌ／ｌ）、ツウィ
ーン２０（０．０５％）、プルロニックＬ−１０１（０
．０５％）、Ｎ−ラウリルザルコシン（０．０３％）、
ＤＴＴ（０．０５ｍｍｏｌ／ｌ）、ＮａＮ３（２３ｍｍ
ｏｌ／ｌ）、ｐＨ６．５。
【００４９】３）ＥＡ試薬：ＥＡ緩衝液中でＥＡ２２５
４６Ｕ／ｍｌ、モノクローナル抗体〈Ｔ４〉６３ｎｍｏ
ｌ／ｌ（例えばＷｅｓｔｅｒｎ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｃｏｒｐ．、Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃ
ｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡより市販されている、米国特許
第４７０８９２９号明細書参照）及びＡＮＳ（８−アニ
リノナフタリン−１−スルホン酸、アンモニウム塩）８
００μｍｏｌ／ｌを使用する。
【００５０】４）ＥＤ試薬：ＥＤ緩衝液中で電解質とし
てＥＤ４−チロキシンＴ４複合体１１５ｎｍｏｌ／ｌ（
米国特許第４７０８９２９号明細書によるＥＤ−チロキ
シン複合体に相応して製造）、及びそれぞれ試験したβ
−ガラクトシダーゼ基質（１ｍｇ／ｍｌ）を使用する。
【００５１】ｂ）方法 Ｔ４／ＣＥＤＩＡを日立７０４自動分析機により次の試
薬量を用いて、かつ記載された条件下に実施した：試料
容量　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　：１２μｌ試薬１（ＥＤ４−複合体＋基
質）　　　　　　　　　：２３５μｌ試薬２（ＥＡ２２
＋ＭＡＫ）　　　　　　　　　　　　　　：１３５μｌ
総容積　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　：３８２μｌ測定波長　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
：３７６／４１５ｎｍ 温度　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　：３７℃△Ｅ／分は９〜１０分
の間隔で測定した。
【００５２】ＩＩ）酵素活性 ａ）試薬 １）０．０５Ｍ燐酸カリウム−緩衝液、ｐＨ７．０２）
１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウム−溶液３）６９．８
％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノール溶液４）β−ガラク
トシダーゼ（ベーリンガーマンハイムＧｍｂＨ、製造Ｎ
ｏ．１０５０３１）、溶液ａ）中０．３Ｕ／ｍｌ ５）基質、溶液ａ）中５．９ｍｇ／ｍｌｂ）方法 前恒温保持：次の基質をプラスチック製キュベット中に
ピペットで入れる： 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　空値　　　　　　　　
　　　　　　　　試料　　　　緩衝液　　　　　　　　
　　　　　　　　（１）　　　　　　１１００μｌ　　
　　　　　　　　１１００μｌ　　　　ＭｇＣｌ２　　
　　　　　　　　　　　（２）　　　　　　　　１５０
μｌ　　　　　　　　　　　　１５０μｌ　　　　基質
　　　　　　　　　　　　　　　　　　（５）　　　　
　　　　２００μｌ　　　　　　　　　　　　２００μ
ｌ　　　　メルカプトエタノール　　（３）　　　　　
　　　１５μｌ　　　　　　　　　　　　　　１５μｌ
　　混合後、反応を開始した： 　　緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　（１
）　　　　　　　　２５μｌ　　　　　　　　　　　　
　　−−　　β−ガラクトシダーゼ　　　　（４）　　
　　　　　　−−　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２５μｌ△Ｅ／分を直線範囲から計算した。
【００５３】ＩＩＩ）テスト結果の評価ａ）ＣＥＤＩＡ
−テスト すべての基質のために検量線を作ったこの曲線から傾斜
を比較した。
【００５４】傾斜＝（ハイ・キャリブレーター・レイト
）−（ロウ・キャリブレーター・レイト）／（コンク・
ハイ・キャリブレーター）−（コンク・ロウ・キャリブ
レーター）［（Ｈｉｇｈ　Ｋａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｒａ
ｔｅ）−（ＬｏｗＫａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｒａｔｅ）／
（Ｋｏｎｚ．ＨｉｇｈＫａｌｉｂｒａｔｏｒ）−（ｋｏ
ｎｚ．Ｌｏｗ　Ｋａｌｉｂｒａｔｏｒ）］傾斜はＴ４／
ＣＥＤＩＡのための２−ニトロフエニル−β−ガラクト
シド（＝１００％）のパーセンテージとして表わされる
。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　一般式 【化１】 〔式中、ＲはＣＦ３又はＣＮを表わす〕の新規ガラクド
    ピラノシド
  2. 【請求項２】　　一般式 【化２】 〔式中、ＲはＣＦ３又はＣＮを表わす〕の出発化合物を
    芳香環でニトロ化し、一般式 【化３】 の化合物とし、この生じた化合物ＩＩＩを酸化銀及びア
    セトブロムガラストースと反応させ、かつアセチル基切
    断により最終生成物 【化４】 を獲得することを特徴とする請求項１記載の新規ガラク
    トピラノシドの製法。
  3. 【請求項３】　　請求項１記載の新規ガラクトピラノシ
    ドからなるβ−ガラクトシダーゼ基質。
  4. 【請求項４】　　検出酵素としてβ−ガラクトシダーゼ
    を使用するＣＥＤＩＡ−システムを用いて試料溶液中の
    被分析物を検出するための方法において、β−ガラクト
    シダーゼ基質として２−トリフルオロメチル−４−ニト
    ロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド又は／及び２
    −シアノ−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
    ノシドを使用することを特徴とするＣＥＤＩＡ−システ
    ムを用いて試料溶液中の被分析物を検出するための方法
    。
  5. 【請求項５】　　検出酵素がβ−ガラクトシダーゼであ
    るＣＥＤＩＡ−システムを用いて試料溶液中の被分析物
    を検出するための試薬において、β−ガラクトシダーゼ
    基質として２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエニ
    ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド又は／及び２−シアノ
    −４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを
    含有することを特徴とするＣＥＤＩＡ−システムを用い
    て試料溶液中の被分析物を検出するための試薬。
JP3161356A 1990-07-03 1991-07-02 新規ガラクトピラノシド、その製法、該化合物からなるβ−ガラクトシダーゼ基質及びβ−ガラクトシダーゼ活性の定量方法及びそのための試薬 Expired - Fee Related JPH0737475B2 (ja)

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