JPH04229197A - アルカリ性フォスファタ−ゼの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えばＥＩＡ（エンザ
イムイムノアッセイ）等の、酵素を指標として試料中の
特定物質を測定する方法において頻繁に使用されるアル
カリ性フォスファタ−ゼ（ＡＬＰ、ＥＣ．１．３．１）
の発光法による検出方法を提供するものである。

【０００２】また、例えばＥＩＡ等の手法においては、
検出されるべきＡＬＰの量はすなわち試料中の特定物質
の量に相関している。従って本発明は更に、ＡＬＰの発
光法による検出工程を含む試料中の特定物質の検出方法
をも提供するものである。

【０００３】

【従来の技術】ＥＩＡ等の酵素を指標として試料中の特
定物質を検出する方法においては、安定性が良い、比活
性が高い、タ−ンオ−バ−数が高い（検出感度が高い）
といった理由からＡＬＰが頻繁に使用されている。

【０００４】ＡＬＰの検出は、従来パラニトロフェニル
フォスフェ−ト等を使用する比色方法（Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ　　ｏｆ　　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ、１９７６年、ｐ１５１−１
６０、Ｍａｒｃｅｌｌ　　Ｄｅｃｋｋｅｒ　　Ｉｎｃ．
Ｎ．Ｙ．）、４−メチルウンベリフェリルフォスフェ−
トを使用する蛍光方法（前記文献を参照）等により行わ
れている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ＥＩＡにおいては、い
かに微量のＡＬＰを検出し得るかということ、即ち検出
感度が結果に大きく影響する。例えば検出感度が低い場
合には、試料中に存在する、微量ではあるが重要な物質
を検出することが出来ず、臨床的に重大な過診を引き起
こすことになりかねない。

【０００６】ＡＬＰのような酵素を検出する方法におい
ては、一般的に蛍光方法では比色方法の１００倍程度の
感度を達成することが可能であり、更に発光法では蛍光
方法の１００倍程度の感度を達成することが可能である
と言われている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．３
、３１６−３２２、１９８９年、Ｉ．Ｂｒｏｎｓｔｅｉ
ｎとＬ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ）。

【０００７】従ってより高感度にＡＬＰを検出するため
には、現段階では発光法は比色方法や蛍光方法に比較し
て好ましい検出方法であると考えられるが、更に高感度
の検出方法が要求されていないということではなく、よ
り高感度な発光検出方法が望まれているのである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】このような状況に鑑みて
、本発明者らはより高感度にＡＬＰを検出し得る方法に
ついて鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至っ
た。

【０００９】即ち本発明は、検出されるべきアルカリ性
フォスファタ−ゼ（ＡＬＰ）にアスコルビン酸−２−リ
ン酸エステルを接触させてアスコルビン酸を生じさせる
工程、生じたアルコルビン酸にルシゲニンを接触させて
光を生じさせる工程及び生じた光を測定する工程を含む
ＡＬＰの検出方法において、少なくとも前記光を生じさ
せる工程を１又はそれ以上の増感剤及び／又は１又はそ
れ以上の増感助剤の存在下で行うＡＬＰの検出方法を提
供するものである。

【００１０】また前述した様に、ＡＬＰの検出は例えば
血液等の試料中の特定蛋白質（特定抗原）や特定の塩基
配列を有するＤＮＡの検出といった、試料中の特定物質
の検出のための操作の一部分として実施されることがあ
る。

【００１１】従って本発明は、少なくとも特定物質、特
定物質に対して親和性を有する物質及び検出されるべき
ＡＬＰからなる複合体を形成させる工程、複合体を形成
していない検出されるべきＡＬＰを分離する工程、複合
体を形成しているか又は複合体を形成していないＡＬＰ
のいずれかあるいは両方にアスコルビン酸−２−リン酸
エステルを接触させてアスコルビン酸を生じさせる工程
、生じたアスコルビン酸にルシゲニンを接触させて光を
生じさせる工程及び生じた光を測定する工程を含む試料
中の測定物質の検出方法であって、少なくとも前記光を
生じさせる工程を１又はそれ以上の増感剤及び／又は１
又はそれ以上の増感助剤の存在下で行う特定物質の検出
方法を提供するものであり、又は特定物質又は特定物質
に対して親和性を有する物質との結合において特定物質
と同等の能力を有する物質と検出されるべきＡＬＰから
形成される既知量の複合体を特定物質に対して親和性を
有する物質に対して競合的に結合させる工程、特定物質
に対して親和性を有する物質と結合しなかった、特定物
質又は特定物質に対して親和性を有する物質との結合に
おいて特定物質と同等の能力を有する物質と検出される
べきＡＬＰから形成された複合体を分離する工程、特定
物質に対して親和性を有する物質を含む複合体中のＡＬ
Ｐ又は分離された複合体中のＡＬＰのいずれか一方又は
両方にアスコルビン酸−２−リン酸エステルを接触させ
てアスコルビン酸を生じさせる工程、生じたアスコルビ
ン酸にルシゲニンを接触させて光を生じさせる工程及び
生じた光を測定する工程を含む試料中の特定物質の検出
方法であって、少なくとも前記光を生じさせる工程を１
又はそれ以上の増感剤及び／又は１又はそれ以上の増感
助剤の存在下で行う特定物質の検出方法を提供するもの
である。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１２】本発明は、アスコルビン酸−２−リン酸エ
ステルをＡＬＰの酵素基質として使用し、生じるアスコ
ルビン酸とルシゲニンが接触して生じる発光の光量を増
感剤及び／又は増感助剤の存在下で測定してＡＬＰを検
出するものである。

【００１３】アスコルビン酸−２−リン酸エステルは、
例えば特公昭５２−１８１９１号公報、特公昭５９−４
４３８号公報、特公昭６３−２１４１９０号公報、昭和
６３年度農芸化学会講演要旨集第４８頁、平成２年度農
芸化学会講演要旨集第１３７頁等の記載から合成するこ
とが可能である。

【００１４】アスコルビン酸−２−リン酸エステルとＡ
ＬＰはＡＬＰが酵素活性を発現し得るｐＨの範囲で接触
させれば良く、その際の反応液の組成等に制限はない。 ＡＬＰは、ｐＨ９−１１程度で酵素活性を発現し得る。

【００１５】以上の工程により生じるアスコルビン酸を
アルカリ条件下、好ましくは強アルカリ条件下でルシゲ
ニンと接触させることで、光を生じさせることが出来る
。この工程は、前記したアスコルビン酸を生じさせる工
程と同時に行うことが可能である。即ち、ｐＨ１１程度
の緩衝液中にアスコルビン酸−２−リン酸エステル、Ａ
ＬＰ及びルシゲニンを添加することで、以上の全ての工
程を終了することも可能である。

【００１６】本発明は、少なくとも光を生じさせる工程
を、増感剤の１又は２種以上及び／又は増感助剤の１種
又は２種以上の存在下で行うものである。従って本発明
においては、増感剤や増感助剤をアスコルビン酸とルシ
ゲニンを接触させる工程において添加しても、その前の
工程、即ちアスコルビン酸−２−リン酸エステルとＡＬ
Ｐを接触させる工程で添加しても良いのである。

【００１７】更に好ましくは、増感剤及び／又は増感助
剤、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、ＡＬＰ及び
ルシゲニンを適当な緩衝液に添加しておくことで、本発
明を実施することが可能である。

【００１８】しかし、前述したようにルシゲニンに光を
生じさせるには、出来る限り強アルカリ条件下でアスコ
ルビン酸とルシゲニンを接触させることが好ましい。従
って本発明は、アスコルビン酸−２−リン酸エステルを
含むｐＨ１１以下の第１反応液及びルシゲニン、増感剤
及び／又は増感助剤を含む強アルカリ性の第２反応液を
別途調製し、第１反応液にＡＬＰを添加して反応を行わ
せた後、これを第２反応液に添加すること等を除外する
ものではない。

【００１９】本発明で増感剤として使用されるのは、例
えばロ−ダミン、エオシン、フルオレセイン等の蛍光色
素や、これらの蛍光色素の水溶性の誘導体である。なか
でも後の実施例で示されるようにルシゲニンからの光を
うけて効率良く２次的蛍光を発するフルオレセインは好
ましい増感剤として例示できる。

【００２０】一方、本発明において増感助剤として使用
されるのは、例えばシクロデキストリン等や、ドデシル
トリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメ
チルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリミチルア
ンモニウムブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニ
ウムブロミド、ヘキサデシルエチルジメチルアンモニウ
ムブロミド、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド
、ヘキサデシルピリジニウムクロリド、テトラデシルベ
ンザルコニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウ
ムブロジド、セチルエチルジメチルアンモニウムブロミ
ド等に代表される界面活性剤等の両親媒性物質が例示で
きるが、なかでもシクロデキストリンが好ましい増感助
剤として例示できる。

【００２１】本発明においては、増感剤か増感助剤のど
ちらか一方のみを使用することによりより高感度のＡＬ
Ｐの検出が可能となる。しかしながら、増感剤と増感助
剤の両方を使用することが好ましい。特に、後の実施例
で示されるように、フルオレセインとシクロデキストリ
ンを組み合わせてしようすることを好ましく例示できる
。

【００２２】これら増感剤及び／又は増感助剤の使用濃
度については、実施者が実際の実施に先立ち、後の実施
例等を参照して簡単な試験を行うことで随時決定するこ
とが可能である。

【００２３】生じた光は、通常のルミノメ−タ−等を使
用して、光を生じる反応を起こしてから一定時間の間の
光を積算する等の通常の測定法に従って行えば良いが、
場合によっては一定時間後の瞬間的な光強度を測定する
のみでも良い。

【００２４】測定結果からＡＬＰの量を判断するには、
既知量のＡＬＰを使用して前もって実験した結果から作
成される標準曲線と未知のＡＬＰを含む試料からの結果
を比較するなどすれば良い。

【００２５】以上に説明したＡＬＰの検出方法は、ＡＬ
Ｐが単独で試料中に存在している場合はもちろん、ＡＬ
Ｐが例えば核酸、抗原、抗体、アビジン、リガンド又は
レセプタ−等と結合している場合であっても、その結合
により酵素活性が阻害されていない限り適用し得、更に
これらを介して他の蛋白質、核酸等と複合体を形成して
いても良い。

【００２６】本発明が提供するＡＬＰの検出方法は、前
述の通り試料中の特定物質を検出する場合の一部分をな
すものである。以下に、本発明のＡＬＰの検出方法を一
部分とする試料中の特定物質の検出方法について説明す
る。

【００２７】本発明でいう特定物質とは、例えば抗原、
抗体、アビジン、リガンド、レセプタ−又は核酸等の、
血液や細胞抽出液等の生体試料等に、天然に又は何等か
の疾患やウイルス感染等に起因して観察される物質を意
味する。

【００２８】本発明で提供される試料中の特定物質の検
出方法は、前述したＡＬＰの検出方法の工程に先立ちＡ
ＬＰと特定物質とで複合体を形成させ、後に前述のよう
な方法でＡＬＰを検出することでこの特定物質の試料中
の量を知ろうとするものであり、大きく分けてサンドイ
ッチ法と競争法からなる。

【００２９】まずサンドイッチ法について説明するが、
一部の説明は競争法についても適用し得ることは言うま
でもない。この方法では、まず少なくとも特定物質、特
定物質に対して親和性を有する物質及び検出されるべき
ＡＬＰからなる複合体を形成させるが、ＡＬＰを特定物
質に対して親和性を有する物質と直接又は間接的に結合
させておくことで、特定物質−特定物質に対して親和性
を有する物質−ＡＬＰからなる複合体は形成されるので
ある。

【００３０】ここでＡＬＰと特定物質に対して親和性を
有する物質を直接的に結合させるには、例えばピリジル
ジスルフィド法（石川栄治　　他編、酵素免疫測定法、
医学書院、１９８７年、ｐ７５−）等によれば良い。一
方これらを間接的に結合させるには、ＡＬＰを、特定物
質に対して親和性を有する物質に対して親和性を有する
物質に結合させておき、この物質を介して結合させれば
良い。

【００３１】特定物質に対して親和性を有する物質とは
、例えば特定物質が蛋白質性の物質である場合には抗体
が例示でき、特に特定物質が抗体である場合には抗原及
び抗体が例示できる。また、特定物質が核酸である場合
には当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核
酸が例示できる。また例えば特定物質がサイトカインで
ある場合には、そのレセプタ−が例示でき、特定物質が
薬物や酵素である場合には阻害作用を有する化学物質や
低分子蛋白等のリガンドが例示できる。

【００３２】このようにして、特定物質の量と相関する
量のＡＬＰが形成された複合体中に含まれることになる
。従って、続いて複合体に含まれないＡＬＰの除去を行
う。

【００３３】このためには、複合体中に含まれる特定物
質に対して親和性を有する物質とは異なる部位で特定物
質と結合する、第２の特定物質に対して親和性を有する
物質を使用することが例示できる。例えば、複合体を形
成させる反応を生じさせる反応容器の内壁等にこのよう
な第２の特定物質に対して親和性を有する物質を固定化
しておけば、最終的には、ＡＬＰ−特定物質に対して親
和性を有する物質−特定物質−第２の特定物質に対して
親和性を有する物質−内壁、という具合にＡＬＰを含む
複合体を固定化することとなり、後に反応容器を洗浄す
るなどすれば複合体に含まれないＡＬＰ（ＡＬＰと特定
物質に対して親和性を有する物質が直接又は間接的に結
合したもの）を分離、除去することが可能となるのであ
る。

【００３４】前記の例では、第２の特定物質に対して親
和性を有する物質を反応容器の内壁に固定化する例を示
したが、内壁ではなく、別途調製されたビ−ス等を使用
することもできる。このようなビ−ズに、例えば磁性物
質を混入しておけば、複合体を形成させ、当該ビ−ズに
固定化する反応の際に反応液を簡単に攪拌することもで
きる。このようなビ−ズは、従来のＥＩＡにおいて公知
である。

【００３５】一方、複合体に含まれないＡＬＰの分離、
除去は、前記したような固定化された第２の特定物質に
対して親和性を有する物質を使用することなく実施する
ことも可能である。即ち、複合体に含まれるＡＬＰと、
複合体に含まれていないＡＬＰでは見掛けの分子量が異
なることから、例えば高速液体クロマトグラフィ−等に
供することでこれを分離できるのである。

【００３６】以上のようにして、複合体に含まれるＡＬ
Ｐと複合体に含まれないＡＬＰを分離した後、前述した
ＡＬＰの検出方法に従っていずれかのＡＬＰの検出を行
うことで、試料中の特定物質の量を知ることができる。 ここで、複合体に含まれるＡＬＰの量は特定物質の量に
相関しているためこれを検出することが好ましいが、既
知量のＡＬＰ（ＡＬＰと特定物質に対して親和性を有す
る物質が直接又は間接的に結合したもの）を使用した場
合には分離、除去されたＡＬＰの量を検出することによ
っても試料中の特定物質の量を知ることができる。

【００３７】次に競争法について説明する。競争法にお
いても、特定物質に対して親和性を有する物質を使用す
る。また、この特定物質に対して親和性を有する物質と
の結合において、特定物と同等の能力を有する物質をも
使用する。このような特定物質と同等の能力を有する物
質としては、予め調製された特定物質そのもの、特定物
質中に存在する親和性を有する物質により認識される部
分等がある。

【００３８】このような特定物質と同等の能力を有する
物質とＡＬＰを予め直接又は間接的に結合させた複合体
を、試料中の特定物と共に特定物質に対して親和性を有
する物質に対して競争的に結合させてＡＬＰ−特定物質
と同等の能力を有する物質−特定物質に対して親和性を
有する物質からなる複合体を形成させ、後にこのような
複合体を形成していないＡＬＰ−特定物質と同等の能力
を有する物質からなる複合体を分離する。

【００３９】競争法においては、既知量のＡＬＰ−特定
物質と同等の能力を有する物質からなる複合体を特定物
質と共に特定物質に対して親和性を有する物質に対して
結合させる点が特徴的である。

【００４０】ＡＬＰ−特定物質と同等の能力を有する物
質からなる複合体を分離するには、サンドイッチ法にお
ける複合体を形成していないＡＬＰを分離、除去するの
と同様に、特定物質に対して親和性を有する物質を反応
容器の内壁やビ−ズ等に固定化しておき洗浄したり、あ
るいは液体クロマトグラフィ−等を実施すれば良い。

【００４１】競争法においては、分離された成分のＡＬ
Ｐを検出しても良いし、ＡＬＰ−特定物質と同等の能力
を有する物質−特定物質に対して親和性を有する物質と
の複合体中のＡＬＰを検出しても良い。

【００４２】なお、競争法における特定物質、特定物質
に対して親和性を有する物質等はサンドイッチ法におけ
るそれと同様の意味である。また、サンドイッチ法及び
競争法の基本的な原理については、例えばＥ．Ｉｓｈｉ
ｋａｗａら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８、７
、１９７８年等の記載を参照することができる。

【００４３】更に本発明は、以上のようなＡＬＰの検出
方法、ＡＬＰの検出方法をその一部とする試料中の特定
物質の検出方法を実施するための検出キットを提供する
ものである。具体的には少なくともアスコルビン酸−２
−リン酸エステル、ルシゲニン、増感剤及び／又は増感
助剤を含むものである。これらの薬品に加えて、例えば
試料中の特定物質を検出するため、特定物質に対して親
和性を有する物質等が加えられていても良い。これらは
、例えば凍結乾燥等の処理を施しておけば、長期の保存
にも適したものとなる。

【００４４】先に説明したように、ＡＬＰの検出におい
ては、ＡＬＰとアスコルビン酸−２−リン酸エステルを
接触させる工程と生じたアスコルビン酸とルシゲニンを
接触させる際の好適なｐＨが微妙にずれているため、例
えば前記の検出キットは、ＡＬＰとアスコルビン酸−２
−リン酸エステルを接触させる工程のためのキットとア
スコルビン酸とルシゲニンを接触させる工程のためのキ
ットを包括するものであっても良い。

【００４５】このような検出キットに、未知量のＡＬＰ
を含む、例えば純粋なＡＬＰ試料や先に説明したような
試料中の特定物質の量に相関して形成された複合体に含
まれたＡＬＰを添加することで、ＡＬＰの量を検出し強
いては試料中の特定物質の量を知ることができる。

【００４６】

【実施例】以下に本発明を詳細に説明するために実施例
を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。

【００４７】実施例１ １．４×１０−１１　ＭのＡＬＰ溶液１００マイクロｌ
に、１０ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸エステル、
１ｍＭのＭｇＣｌ２　、０．０１％のＢＳＡを含む１０
０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９．８）を加え、
室温で３０分間インキュベ−トした。

【００４８】インキュベ−トの後、前記溶液のうち１０
０マイクロｌを取得し、０．１ＭのＫＯＨ、６×１０４
　％のルシゲニン及び増感剤として０．１％のシクロデ
キストリン（ベ−タ型）と０．００２％のフルオレセイ
ンを含む溶液（ｐＨ１１．５）の５００マイクロｌを添
加した。

【００４９】ルミノメ−タ−（アロカ社製、ＢＬＲ−２
０１型）を使用して、溶液を添加後１秒の時点から３０
０秒間の光（発光）の強度を検出した。

【００５０】結果を図１に示す。図１によれば、後の増
感剤等を添加しなかった場合についての比較例の結果と
比較した場合、最大で約１５０倍の光強度が得られるた
ことが分かる。

【００５１】実施例２インキュベ−トの後、溶液１００
マイクロｌに対して０．１ＭのＫＯＨ、６×１０４　％
のルシゲニン及び増感剤として０．１％のシクロデキス
トリン（ベ−タ型）と０．００２％のエオシンＹを含む
溶液の５００マイクロｌを添加した以外は実施例１と同
様の操作を行った。

【００５２】結果を図２に示す。図２によれば、後の増
感剤等を添加しなかった場合についての比較例の結果と
比較した場合、最大で約５０倍の光強度が得られたこと
が分かる。

【００５３】実施例３ インキュベ−トの後、溶液１００マイクロｌに対して０
．１ＭのＫＯＨ、６×１０４　％のルシゲニン及び増感
剤として０．１％のシクロデキストリン（ベ−タ型）と
０．００１％のロ−ダミンＢを含む溶液の５００マイク
ロｌを添加した以外は実施例１と同様の操作を行った。

【００５４】結果を図３に示す。図３によれば、後の増
感剤等を添加しなかった場合についての比較例の結果と
比較した場合、最大で約６０倍の光強度が得られたこと
が分かる。

【００５５】比較例１ インキュベ−トの後、溶液１００マイクロｌに対して０
．１ＭのＫＯＨ、６×１０４　％のルシゲニンのみから
なる溶液の５００マイクロｌを添加した以外は実施例１
と同様の操作を行った。

【００５６】結果を図４に示す。図４によれば、先の増
感剤等を添加した場合に比較して、増感剤等を添加しな
い場合には測定開始後短い時間に小さな発光しか得られ
ず、しかも光強度の増加、減少の割合の変化が激しいこ
とが分かる。

【００５７】

【発明の効果】本発明は、アスコルビン酸−２−リン酸
エステルとルシゲニンに、増感剤及び／又は増感助剤を
併用することでより高感度のＡＬＰの検出方法を提供し
ようとするものである。

【００５８】アスコルビン酸−２−リン酸エステルや増
感剤、増感助剤等は安定性が高く、かつ簡単に合成又は
入手し得るものである。従って本発明は低コストにて実
施できるという特徴を有する。

【００５９】一般に比色方法、蛍光方法にてＡＬＰを検
出するのに対し、本発明のような発光法にてＡＬＰを検
出する場合には、それぞれ約１万倍（対比色方法）、１
００倍（対蛍光方法）の感度を達成し得ると言われてい
るが、ある感度を達成し得れば、例えばＥＩＡ等には十
分である、というものではなく、常により高感度の検出
方法が要望されている。

【００６０】このような状況にあって、本発明は、単に
アスコルビン酸−２−リン酸エステルとルシゲニンを使
用するＡＬＰの検出方法に比較して、約１００倍以上の
感度を達成し得る検出方法を提供するものである。特に
フルオレセインとシクロデキストリンを併用した場合に
は、実施例で示されたようにこれらを使用しない場合と
比較して約１５０倍の発光強度が得られる検出方法を提
供することが可能である。

【００６１】より高感度の検出方法が提供されるのであ
れば、ＡＬＰを標識試薬として使用したＥＩＡ等により
、従来は疾患、ウイルス感染等の診断をし得なかったも
のについてより早期にその症状を察知し、適切な治療を
行う等の行為が可能となるであろう。また従来は、例え
ば癌等の特定の疾患に起因して血液中に抗体等が出現す
ることが予測されていたものの、当該抗体等が微量であ
り、検出感度が低すぎるために臨床診断等に利用されて
いなかったものも利用可能となり、より多種多様の疾患
を早期に発見し得るようにもなると予想される。

【００６２】本発明の検出方法においては、実施例によ
り明確に示されたように、より強い発光を生じさせる効
果（より高感度の検出を実現するという効果）と共に、
アスコルビン酸とルシゲニンが接触してから最強強度の
発光が生じるまでに、通常の発光法と比較して長い時間
が得られるという効果も有している。

【００６３】このことは例えば、アスコルビン酸とルシ
ゲンを増感剤及び／又は増感助剤の存在下で接触させた
後にいくばくかの余裕をもって光強度の測定を実施し得
ることを意味している。更には、このような検出を全自
動で実施する装置を構成する場合に、少なくともアスコ
ルビン酸とルシゲニンを増感剤及び／又は増感助剤の存
在下で接触させるための反応ポ−トと光強度の測定のた
めのポ−トを分離した位置に設置することが容易になる
のである。

【００６４】通常、光強度測定のためのポ−トは、外部
からの入射光によるノイズを低減するために暗室化する
必要があり、一方、反応ポ−トは装置のメンテナンスや
クリ−ニングのために容易に内部まで手が届くように構
成しなければならないが、これらを離れた位置に別個に
設置することが可能であれば、それぞれを目的に沿った
最高の機能を発揮するようにデザインすることが可能と
なるであろう。

【００６５】発光反応の開始から測定までに余裕がある
場合には、完全に分離して設置された反応ポ−トから測
定ポ−トまで反応容器を移送する等の操作が可能である
が、仮に、ルシゲニンや増感剤及び／又は増感助剤の分
注（添加）から光強度の測定までに余裕がないとすると
、反応ポ−トと光強度測定ポ−トの機能を合せ持つポ−
トを構成するか、あるいは非常に近い位置にこれらを設
置しなければならないことになり、込み入った、複雑な
装置であって、しかも機能的に中途半端な装置になるか
、あるいは非常に高価な装置となってしまう。

【００６６】しかも、例えば試薬と反応液の温度差が化
学反応に影響を与えたり、添加された試薬が反応液に拡
散するまでに多少の時間を要したりする結果、発光反応
を開始させた直後では発光強度が不安定なことがある。 このような状況では、反応開始から光強度の測定までに
十分な時間が取れない場合には前記した理由により正確
な光強度の測定が不可能であるが、本発明の検出方法の
ように発光反応の開始から光強度の測定の間に十分な余
裕があれば、より正確な検出が可能である。

【００６７】本発明の方法によれば、更には実施例によ
り明白にされたように生じる光強度の増加、減少の割合
の変化が小さいという効果も得られる。ＡＬＰの検出が
最終的には既知量のＡＬＰに対して本発明を実施して作
成される標準曲線から計算されることを考慮した時、例
えば光強度の増加、減少の割合の変化が急激である場合
には、少なくともアスコルビン酸とルシゲニンを増感剤
及び／又は増感助剤の存在下で接触させて発光反応を開
始した時点からの光強度の測定までの時間のわずかな違
いが測定結果の差となり、最終的な検出結果に重大な影
響を与えることも予想されるが、本発明ではその差を極
力排除し得るのである。

【００６８】本発明のＡＬＰの検出方法は、以上に説明
したように高感度化、光強度測定までの長期化、光強度
の増加、減少の割合の変化の低減化という３つの効果を
有している。

【００６９】従って、例えば、少なくともアスコルビン
酸とルシゲニンを増感剤及び／又は増感助剤の存在下で
接触させて発光反応を開始させた後、一定時間後の光強
度の値のみからＡＬＰの検出を行う場合においては、前
述した温度の違いや試薬の拡散等の物理的要因の差、厳
密な意味での反応開始から測定までの時間の差により生
じる測定結果の差を極力低減し得る高感度の検出が実現
できる。

【００７０】一方、例えば発光反応を開始させた後、一
定期間の光強度を積算してその値からＡＬＰの検出を行
う場合においても温度の違いや試薬の拡散等の物理的要
因の差、厳密な意味での反応開始から測定までの時間の
差により生じる測定結果の差を極力低減し得ることは勿
論、特に光強度の減少の割合の変化が小さいことから測
定を行って積算を行う期間を長くすることでよりいっそ
う大きな測定結果を得ることが可能な高感度の検出が実
現できる。

【００７１】本発明のＡＬＰの検出方法は、試料中の特
定物質の検出方法の一部としても実施できることは先に
説明した通りであるが、特に血液や血清等の生体試料中
の特定物質の量や濃度を知るためのＥＩＡの一部として
有用である。この場合、ＡＬＰを含む複合体を形成させ
るまでの工程は、従来公知のサンドイッチ法や競争法に
従って実施することが可能である。特に標識酵素として
ＡＬＰを使用している検出方法では、その基本的な部分
を変えることなしに増感剤及び／又は増感助剤を添加す
る工程又は予めそれらを添加する工程を追加するのみで
、本発明を実施することが可能である。

【００７２】このように、試料中の特定物質の検出方法
に本発明の検出方法を採用した場合にも、当然に本発明
により達成される高感度化、光強度の測定までの長期化
、光強度の増加、減少の割合の変化の低減化という３つ
の効果を享受し得、これまで説明したようなより正確で
高感度な検出を実現することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１の結果を示すものである。その
横軸は、ＡＬＰとアスコルビン酸−２−リン酸エステル
の接触で生じさせたアスコルビン酸とルシゲニンを接触
させてからの時間を０とした時の経過時間を示し、縦軸
は光強度、ＫＣＰＭ（Ｋｉｒｏ　　ｃｏｕｎｔ　　ｐｅ
ｒ　　ｍｉｎ、１分間当たり検出器に入光した光子の数
×１０−３）を示すものである。なお実際の光強度の測
定は、ＡＬＰとアスコルビン酸−２−リン酸エステルの
接触により生じたアスコルビン酸を含む溶液を、ルシゲ
ニン等を含む反応液に添加して発光反応を開始した後１
秒から３００秒まで行ったが、測定開始時点で得られた
光強度の値を便宜的に反応開始時点（横軸０秒の位置）
に記載した。増感剤等の不存在下でアスコルビン酸とル
シゲニンを接触させた比較例１の結果では最大約１．６
ＫＣＰＭが約１００秒後に認められた（図４参照）が、
実施例１の結果では、本図に示すように最大約２５０Ｋ
ＣＰＭの値が約１５０秒後に認められた。また、０−３
００秒までの間、光強度はなだらかに増加し又は減少し
た。

【図２】図２は実施例２の結果を示すものである。その
縦軸、横軸及び時間０秒での光強度の値については図１
と同様の意味である。増感剤等の不存在下でアスコルビ
ン酸とルシゲニンを接触させた比較例１の結果では最大
約１．６ＫＣＰＭが約１００秒後に認められた（図４参
照）が、実施例２の結果では、本図に示すように最大約
８０ＫＣＰＭの値が約２００秒後に認められた。また、
０−３００秒までの間、光強度はなだらかに増加し又は
減少した。

【図３】図３は実施例３の結果を示すものである。その
縦軸、横軸及び時間０秒での光強度の値については図１
と同様の意味である。増感剤等の不存在下でアスコルビ
ン酸とルシゲニンを接触させた比較例１の結果では最大
約１．６ＫＣＰＭが約１００秒後に認められた（図４参
照）が、実施例２の結果では、本図に示すように最大約
１００ＫＣＰＭの値が約３００秒後に認められた。また
、０−３００秒までの間、光強度はなだらかに増加した
。

【図４】図４は増感剤等の不存在下でアスコルビン酸と
ルシゲニンを接触させた比較例１の結果を示すものであ
り、その縦軸、横軸及び時間０秒での光強度の値につい
ては図１と同様の意味である。本図によれば、この場合
には約１００秒後と短い時間の後に、約１．６ＫＣＰＭ
という小さな値を示している。また、０−３００秒まで
の間、光強度は不規則に増加、減少した。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】検出されるべきアルカリ性フォスファタ−
   ゼ（ＡＬＰ）にアスコルビン酸−２−リン酸エステルを
   接触させてアスコルビン酸を生じさせる工程、生じたア
   ルコルビン酸にルシゲニンを接触させて光を生じさせる
   工程及び生じた光を測定する工程を含むＡＬＰの検出方
   法において、少なくとも前記光を生じさせる工程を１又
   はそれ以上の増感剤及び／又は１又はそれ以上の増感助
   剤の存在下で行うＡＬＰの検出方法。
2. 【請求項２】測定されるべきＡＬＰにアスコルビン酸−
   ２−リン酸エステルを接触させてアスコルビン酸を生じ
   させる工程、生じたアルコルビン酸にルシゲニンを接触
   させて光を生じさせる工程及び生じた光を測定する工程
   の全ての工程を少なくとも測定されるべきＡＬＰ、アス
   コルビン酸−２−リン酸エステル、ルシゲニン及び増感
   剤及び／又は増感助剤の存在下で行うことを特徴とする
   ＡＬＰの検出方法。
3. 【請求項３】増感剤と増感助剤を共存させることを特徴
   とする請求項１又は２に記載のＡＬＰの検出方法。
4. 【請求項４】測定されるべきＡＬＰが、核酸、抗原、抗
   体、アビジン、リガンド又はレセプタ−と結合している
   ことを特徴とする請求項１〜３いずれかの項に記載のＡ
   ＬＰの測定方法。
5. 【請求項５】少なくとも特定物質、特定物質に対して親
   和性を有する物質及び検出されるべきＡＬＰからなる複
   合体を形成させる工程、複合体を形成していない検出さ
   れるべきＡＬＰを分離する工程、複合体を形成している
   か又は複合体を形成していないＡＬＰのいずれかあるい
   は両方にアスコルビン酸−２−リン酸エステルを接触さ
   せてアスコルビン酸を生じさせる工程、生じたアスコル
   ビン酸にルシゲニンを接触させて光を生じさせる工程及
   び生じた光を測定する工程を含む試料中の測定物質の検
   出方法であって、少なくとも前記光を生じさせる工程を
   １又はそれ以上の増感剤及び／又は１又はそれ以上の増
   感助剤の存在下で行う特定物質の検出方法。
6. 【請求項６】検出されるべきＡＬＰが特定物質に対して
   親和性を有する物質と直接又は間接的に結合しており、
   複合体を形成しているＡＬＰと複合体を形成していない
   ＡＬＰの分離が特定物質に対して親和性を有する物質と
   は異なる部位で特定物質と結合する物質であり水に不溶
   化されているものによって達成されることを特徴とする
   請求項５に記載の特定物質の検出方法。
7. 【請求項７】特定物質又は特定物質に対して親和性を有
   する物質との結合において特定物質と同等の能力を有す
   る物質と検出されるべきＡＬＰから形成される既知量の
   複合体を特定物質に対して親和性を有する物質に対して
   競合的に結合させる工程、特定物質に対して親和性を有
   する物質と結合しなかった、特定物質又は特定物質に対
   して親和性を有する物質との結合において特定物質と同
   等の能力を有する物質と検出されるべきＡＬＰから形成
   された複合体を分離する工程、特定物質に対して親和性
   を有する物質を含む複合体中のＡＬＰ又は分離された複
   合体中のＡＬＰのいずれか一方又は両方にアスコルビン
   酸−２−リン酸エステルを接触させてアスコルビン酸を
   生じさせる工程、生じたアスコルビン酸にルシゲニンを
   接触させて光を生じさせる工程及び生じた光を測定する
   工程を含む試料中の特定物質の検出方法であって、少な
   くとも前記光を生じさせる工程を１又はそれ以上の増感
   剤及び／又は１又はそれ以上の増感助剤の存在下で行う
   特定物質の検出方法。
8. 【請求項８】特定物質に対して親和性を有する物質と結
   合しなかった、特定物質又は特定物質に対して親和性を
   有する物質との結合において特定物質と同等の能力を有
   する物質と検出されるべきＡＬＰから形成された複合体
   を分離する工程が固定化された特定物質に対して親和性
   を有する物質により達成されることを特徴とする請求項
   ７に記載の特定物質の検出方法。
9. 【請求項９】増感剤と増感助剤を共存させることを特徴
   とする請求項５又は７に記載の試料中の特定物質の検出
   方法。
10. 【請求項１０】特定物質に対して親和性を有する物質が
    、核酸、抗原、抗体、アビジン、リガンド又はレセプタ
    −であることを特徴とする請求項５〜７いずれかの項に
    記載の試料中の特定物質の検出方法。
11. 【請求項１１】請求項１、５又は７に記載の検出を行う
    ための検出キット。