JPH0421472B2

JPH0421472B2 -

Info

Publication number: JPH0421472B2
Application number: JP61257997A
Authority: JP
Inventors: Shozo Inoe; Shuji Iwai; Yoshinori Myamoto; Toshiji Ooba; Noriaki Chiba; Toshuki Kikuchi
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1986-10-28
Filing date: 1986-10-28
Publication date: 1992-04-10
Also published as: JPS63109772A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、植物の細胞や組織を大量に効率よく
培養する方法に関する。

（従来の技術）植物の細胞や組織から、医薬などの有用な物質
が得られることがあり、このような有用な物質を
恒常的に得るべく、植物の細胞や組織を工業的に
培養することが試みられている。植物の細胞等は
培養槽農で液内培養することが、大量培養し得る
ため、工業的には好適である。このため、従来
は、培養槽を大型化することにより、大量に培養
するという方法が試みられていた。しかし、培養
槽の大型化に伴い、植物細胞は水頭圧や重力等に
より物理化学的な損傷を受けやすくなると共に、
培養条件の制御（二酸化炭素濃度、PH値、細胞の
撹拌速度等の制御）が困難になる、という欠点を
生じるものであつた。このため、培養槽を大型化
することによる培養効率の向上が図れなかつた。

そこで、一定の条件化で連続的に培養する連続
培養を用い、細胞の培養速度を向上させる方法が
試みられている。理論的には、連続培養による培
養が最も生産効率に優れているが、植物細胞を無
菌的にかつ連続的に収穫することが技術的に困難
である。しかも、連続培養を行うための装置は、
その連続培養に最も適した条件にて設計、製作し
なければならず、また運転条件の決定も非常に困
難であり、連続培養を用いて、植物細胞等を工業
的に培養することは、実用化されていないのが現
状である。

一方、連続培養に対し、植物の細胞等を一定量
と培地内にて培養する回分培養も行われている。
第６図に、従来の回分培養装置の一例を示す。こ
の図に基づいて回分培養を説明すると、まず、植
物細胞等を、フラスコ５１にて振とう培養する。
次に、調整・殺菌された培地を仕込んだ前培養槽
５２に振とう培養された植物細胞を移植し、植物
細胞を増殖させる。他方、前培養槽５２による前
培養と平行して、主培養槽５３では主培養に備え
て、培地の調整・細菌、および前培養槽５２から
主培養槽５３に連通する移送管５４の殺菌を行
う。主培養槽５３が大容量の場合には、培地殺菌
は連続殺菌装置によつて別に行い、その培地は、
殺菌された主培養槽へ連続的に仕込まれる。

次いで、雑菌汚染いを防ぐために、主培養槽５
３を通気加圧しつつ培養温度に冷却後、前培養槽
５２から前培養した植物細胞を、移送管５４にて
主培養槽５３へ移植し、該主培養槽５３内にて主
培養が行われる。主培養槽５３による培養中は、
該主培養５３内の温度・PHを設定値に制御し、好
気培養の場合には撹拌翼５３ａにより撹拌を行う
と共に、空気供給管５５より送給される無菌空気
にて通気する。そして、このような主培養によ
り、植物細胞が所定濃度に達した時点で培養は終
了する。培養終了後、所定濃度の植物細胞を含む
培養液は、主培養槽５３の収穫口５３ｂから生産
物回収工程へと移され、主培養槽５３は、次の培
養のために、洗浄・殺菌が行われる。以上の工程
で、保存植物細胞から出発して、大量培養による
植物細胞の生産が行われる。

このような主培養槽５３を中心にした回分培養
では、培養層の準備時間（洗浄・培地調整・殺
菌・冷却等に要する時間）、培養時間（接種時間
も含む）、の培養液の排出時間の和が、１回の回
分培養に要する時間となる。

このように、回分培養では、主培養槽５３によ
る生産段階の前に、数段の“種（seed）”培養段
階の前培養が必要である。主培養は前培養の約10
倍の規模となるため、前培養の過程を多段階にし
なければならず、また前培養槽５２自体の容量も
大きくしなければならない。従つて、回分培養で
は、設備効率が悪く、また大量生産ができないた
めに、工業的には不向きである。回分培養では、
種培養段階である前培養を不要にした反復回分培
養もあるが、このような反復回分培養も生産効率
が悪く、収穫量そのものは増大しない。

（発明が解決しようとする問題点）本発明は上記従来の問題を解決するものであ
り、その目的は、前培養を行う前培養槽を主培養
を行う主培養槽とを用いて、植物細胞等の生産効
率を著しく向上させることができる培養方法を提
供することにある。

（問題点を解決するための手段）本発明は植物細胞等の培養方法は、種培養を行
う主培養槽と、該主培養槽の前段にて前培養を行
う前培養槽とにより、植物の細胞や組織等を培養
する方法であり、前培養槽にて植物細胞等を所定
濃度にまで培養する工程と、該前培養槽にて植物
等が所定濃度にまで培養された培養液を主培養槽
へ送給し、該主培養槽にて植物細胞等を所定濃度
にまでさらに培養する工程と、主培養槽におい
て、植物細胞等が所定濃度にまで培養された該培
養液を培地にて希釈する工程と、希釈された該培
養液の一部を前培養槽へ送給して、該前培養槽に
て植物細胞等が所定濃度になるまで培養する工程
と、植物細胞等が所定濃度にまで培養された前培
養槽内の該培養液を前培養槽から取り出す工程
と、を包含し、そのことにより上記目的が達成さ
れる。

（実施例）以下に本発明を実施例について説明する。

本発明の培養方法は、例えば第１図に示すよう
に、前培養を行う前培養槽１１と、主培養を行う
主培養槽１２とにより、植物の細胞や組織の培養
が行われる。前培養槽１１の下部は主培養槽１２
の上部に、移送管１３を介して連通している。ま
た、該前培養槽１１の下部は収穫口１６にも連通
している。主培養槽１２の下部は、循環路１４を
介して前培養層１１の上部に連通している。前培
養槽１１の下部および主培養槽１２の下部には、
無菌空気の供給管１５の排出口がそれぞれ配設さ
れている。前培養槽１１内および主培養槽１２に
は、それぞれ撹拌翼１１ａおよび１２ａが配設さ
れている。

このような培養装置による本発明方法を説明す
ると、まず、植物細胞をフラスコ１７内にて振と
う培養し増殖させる。次に、調整・殺菌された培
地を前培養槽１１に仕込んでおき、該前培養槽１
１内の培地内へ、振とう培養により増殖された植
物細胞を移植する。そして、該前培養槽１１にて
植物細胞を前培養する。

この前培養の間に、主培養槽１２内での主培養
に備えて、培地の調整・殺菌および移送管１３の
殺菌を行う。主培養槽１２が大容量の場合には、
培地殺菌は培地調整槽あるいは連続培地殺菌装置
によつて別に行われ、殺菌された培地が主培養槽
１２へ連続的に仕込まれる。

次いで雑菌汚染を防止するために、主培養槽１
２を、供給管１５からの無菌空気により通気加圧
しつつ培養温度に冷却後、前培養槽１１にて前培
養した植物細胞を、移送管１３から主培養槽１２
内へ移植して、主培養が開始される。

主培養槽１２内での主培養中は、温度・PHを設
定値に制御し、また、好気培養の場合には供給管
１５から種培養槽１２内へ無菌空気を通気しつつ
撹拌翼１２ａにて撹拌する。植物細胞が所定濃度
に達すると、主培養は終了する。

主培養槽１２内における主培養が終了した時点
で、前培養槽１１内で培地を調整・殺菌し、該培
地を加圧した状態で移送管１３から主培養槽１２
へ送給する。培地調整槽あるいは連続培地殺菌装
置が配設される場合には、新鮮培地を必要量だけ
主培養槽１２内へ送給する。

主培養槽１２内へ送給された培地は、所定濃度
の植物細胞を有する培養液と共に撹拌・混合され
て、該培養液は希釈される。主培養槽１２内で、
培養液は十分に撹拌されて、植物細胞が均一に分
散される。次いで、主培養槽１２の内圧は、供給
管１５から送給される無菌空気にて、前培養槽１
１の内圧と培養液圧との和以上の圧力とされ、希
釈された培養液は、殺菌された循環路１４を通つ
て、前培養槽１１内へ送給される。これにより、
前培養槽１１内および主培養槽１２内には、植物
細胞の濃度、培地成分等が等しい培養液が仕込ま
れた状態となる。

前培養槽１１内に送給された培養液は、植物細
胞が所定濃度になるまで培養され、植物細胞が所
定濃度になると前培養槽１１内の培養は終了す
る。そして、該前培養槽１１内の培養液は収穫口
１６より収穫される。主培養槽１２内では、前培
養槽１１内にて培養が行われている間も培養が行
われる。

培養液が収穫された前培養槽１１内では、引き
続き、培地を調整・殺菌し、その培地は移送管１
４から主培養槽１２内へ送給される。この場合、
前述のように、培地調整槽あるいは連続培地殺菌
装置が配設されていれば、培地調整槽あるいは連
続培地殺菌装置から新鮮培地が主培養槽１２内へ
送給される。そして、前培養層１１における培養
の間に、主培養槽１２内にて植物細胞が培養され
た培養液は、送給される培地により希釈される。

以後、前述したように、希釈された培養液の一
部が前培養槽１１へ送給されて培養され、植物細
胞が所定濃度になれば収穫口１６から収穫され
る。

第２図は、連結された前培養槽１１および主培
養槽１２を２組並設した培養装置を示す。各前培
養槽１１および１１、主培養槽１２および１２に
は、無菌空気の供給管１５から無菌空気が供給さ
れる。この培養装置による培養方法は、それぞれ
が連結された各前培養槽１１および主培養槽１２
において、第１図に示す培養装置の培養方法と同
様の方法にて培養が行われる。その結果、この培
養装置では第１図に示す培養装置の２倍の収穫量
が得られる。

第３図は、２つの主培養槽１２および１２を配
設した培養装置を示す。各主培養槽１２および１
２は、移送管１３および１３にて前培養槽１１に
連通している。該培養装置では、各主培養槽１２
および１２にて、並行して主培養が行われる以外
は、第１図に示す培養装置による培養方法と同様
であるので説明を省略する。

第４図は、本発明方法の実施に使用する装置の
別の実施例を示す模式図である。この実施例で
は、主培養槽１２における主培養の前段階である
前培養を、２すの前培養槽１１および１１′で行
うようになつている。このような装置では、主培
養槽１２にて植物細胞が所定濃度にまで培養され
た培養液を、培地で希釈して、各前培養槽１１お
よび１１′で再び植物細胞が所定濃度になるまで
培養し、各前培養槽１１および１１′の収穫口１
６および１６′から植物細胞が収穫される。

植物の細胞等は、微生物とは異なり、体外（培
地）に生長阻外物を作らないために、本発明方法
のように、新鮮培地と酸素、さらには適当な空間
を与えれば効率よく生長する。

本発明方法による生産量と、従来の回分培養に
よる生産量とを簡単なモデルにより比較する。
今、30日間の回分培養で、濃度（WET）が３％
から30％に生長する植物細胞を考える。通常、誘
導期間として３〜５日程度考えられるが、比増殖
速度（μ）が一定であり、常に対数増殖するとす
れば、比増殖速度（μ）は、通常、(1)式で表され
る。

μ＝1n（ｘ／x₀）／Δt ……(1) ただし Δt：時間（日数） x₀：カルスの初期濃度ｘ：Δt後のカルスの濃度上記モデルをこの(1)式に当てはめると、比増殖
速度μは、 μ＝1n（0.3／0.03）／30＝0.0767〔day^-1〕 ……(1)′ となる。

１年間の収穫量Ｙは、Ｙ＝〔収穫時のカルス濃度（％）〕・〔主培養槽（）〕・〔１年間の培養回数〕 ……(2) で表されるので、主培養槽の容量を100とする
と、従来の回分培養による１年間の収穫量Ｙは、Ｙ＝［0.3］・［100］・［360／30］＝360（Kg／year） ……(2)′ （ただし主培養槽の洗浄時間は含まれない）とな
る。

このような植物細胞を本発明方法により培養し
た場合を考える。ただし、本発明方法では、濃度
が30％に増殖した植物細胞を、一旦、27％まで培
地により希釈し、その後に前培養槽にて30％まで
増殖させて収穫するものとする。(1)′式より、該
植物細胞の比増殖速度μが0.0767（day^-1）である
ことから、植物細胞が27％から30％までに増殖す
る時間Δtは、(1)式より Δt＝1n（0.3／0.27）／0.0767＝1.4（day）となる。収穫時のロスタイムを考慮して、1.5
（day）に１回収穫するものと、１年間の収穫量
Ｙは、(2)式から次のようになる。ただし、本発明
方法によれば、植物細胞を３％から30％まで増殖
し、その後、一旦27％に希釈した後30％に増殖さ
せるものであるため、３％から30％まで増殖する
当初の30日間は収穫されない。従つて、Ｙ＝（0.3−0.27）・（100）・［360−30／1.5］＋30 ＝690（Kg／year）となる。

この式は、主培養槽と前培養槽とを合わせた全
体100の濃度の増加は、30％−27％＝３％であ
るから、全体でこの濃度の増加分30％−27％＝３
％分を収穫していることを意味する。

このように、本発明方法によれば、１年間に植
物細胞が従来の回分培養の約２倍収穫することが
できる。

（実験例）第１図に示す装置を用い、容量140の前培養
槽に、80の培地を仕込み、また、容量600の
主培養槽に400の培地を仕込んで、オタネニン
ジンを通気・撹拌培養した。培地としてはB5培
地を使用し、培養温度を25℃、通気空気量を0.1
〜0.4VVMとした。当初の１か月間は収穫できな
いが、１か月経過後４日ごとに前培養槽から植物
細胞を収穫した。従来の回分培養では、28日間の
培養で80Kg（WET）の細胞が得られ、６か月で
は480Kgの細胞が得られるが、本発明方法では、
６か月間に770Kg（従来より60％増）の植物細胞
が得られた。第３図にその結果を示す。

同様の条件で、第２図に示す培養装置により、
オタネニンジンの培養を行つたところ、６か月間
での収穫量は、第１図に示す培養装置の２倍
（770Kg×２＝1560Kg）となつた。

さらに、同様の条件で、第３図に示す培養装置
によりオタネニンジンの培養を行つたところ、６
か月間の収穫量は、1500Kgであつた。

（発明の効果）本発明方法は、このように、主培養槽内の植物
細胞等の濃度を、常に、収穫時の所定濃度付近の
高濃度に意地でき、容量の小さい前培養槽内にて
所定濃度にまで培養して収穫するものであるか
ら、植物細胞等を高効率に収穫できる。当初、前
培養槽に種培養された植物細胞を主培養槽に移植
すれば、その後の種培養に不要になり操作が簡略
化される。従来の回分培養の装置に対して、無菌
フイルタを用いて循環路を配設すればよく、従つ
て、既設設備を利用して収穫量を増大させること
ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の実施に使用する装置の一
例を示す模式図、第２図〜第４図は、それぞれそ
の別の例を示す模式図、第５図は本発明方法によ
る収穫量を示すグラフ、第６図は従来の回分培養
装置の一例を示す模式図である。１１，１１′……前培養槽、１２……主培養槽、
１３……移送管、１４……循環路、１５……供給
管、１６，１６′……収穫口。

Claims

【特許請求の範囲】１主培養を行う主培養槽と、該主培養槽の前段
にて前培養を行う前培養槽とにより、植物の細胞
や組織等を培養する方法であり、前培養槽にて植物細胞等を所定濃度にまで培養
する工程と、該前培養槽にて植物等が所定濃度にまで培養さ
れた培養液を主培養槽へ送給し、該主培養槽にて
植物細胞等を所定濃度にまでさらに培養する工程
と、主培養槽において、植物細胞等が所定濃度にま
で培養された該培養液を培地にて希釈する工程
と、希釈された該培養液の一部を前培養槽へ送給し
て、該前培養槽にて植物細胞等が所定濃度になる
まで培養する工程と、植物細胞等が所定濃度にまで培養された前培養
槽内の該培養液を前培養槽から取り出す工程と、を包含する植物細胞等の培養方法。