JPH04166090A

JPH04166090A - ビタミンｄ類の生物学的製造方法

Info

Publication number: JPH04166090A
Application number: JP2334283A
Authority: JP
Inventors: Koji Takeda; 耕治武田; Kiyoshi Kimura; 木村　喜善; Kazuhiko Okamura; 和彦岡村; Rokuro Okamoto; 岡本　六郎; Jiyouji Sasaki; 冗二佐々木; Takashi Adachi; 孝安達; Sadafumi Omura; 大村　貞文
Original assignee: Mercian Corp; Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mercian Corp; Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1992-06-11
Anticipated expiration: 2016-08-20
Also published as: EP0461921A3; TW234147B; EP0461921A2; KR920000934A; ES2079573T3; KR100190412B1; DE69112716D1; ATE127523T1; CA2044550A1; EP0461921B1; CA2044550C; JP3201411B2; US5474923A; DE69112716T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】「産業上の利用分野］本発明はビタミンＤ類より２５−ヒｌ＜’　ｏキシビタ
ミンＤ類および１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ類
を生物学的に製造する方法に関する。

「発明の背景」ビタミンＤ類は体内でのカルシウムの吸収、骨のカルシ
ウム代謝促進に関係する重要なビタミンであり、その活
性は肝臓で２５位、腎臓で１α位に水酸化を受けて発揮
されることが知られている（エイチ・エフ・デル力およ
びエイチ・ケー・ジョーンズ：アニュアル　レビュー　
オブ　バイオケミストリー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、）、第５２巻。

４１１頁（１９８３年））。ところが、２５−ヒドロキ
シビタミンＤ３は肝機能障害を持つ患者では、生体内で
の生成量が不足している。従って、この様な患者に対す
る２５−ヒドロキンビタミンＤ３の授与は、生体内での
不足分を補うという観点から有効である。また、１α、
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は特に活性が強く、」
二部と同様な意味で腎不全患者には著効を表わす。１α
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は２５＝ヒドロキン
ビタミンＤ３を原料として微生物、酵素化学的に変換　
　。

生成されることが知られている（特開平２−４６９号お
よび特開平２−２３１０８９号）。従って、２５−ヒド
ロキシビタミンＤ３および１α、２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ３の安価な製造法は工業上極めて有益である。

［従来の技術］ビタミンＤ類の１α位および／または２５位に水酸基を
直接導入する有機化学的合成方法は知られていない。

動物臓器を用いた方法（バイオケミカル　アンド　バイ
オフィジカル　リサーチ　コミュニケ−ジョン（Ｂｊｏ
ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕ
ｎ、）、第３６巻、２５１−頁（１９６９年））は知ら
れていたが工業的に実用的な方法ではなかった。最近、
微生物を用いた酵素化学的方法によりビタミンＤ類の１
、α位および／または２５位を水酸化する方法が開示さ
れた（特開平２−４６９号および特開平２−２３１．０
８９号）。

［発明が解決しようとする課題］しかし、」二部微生物を用いた酵素化学的方法によるビ
タミンＤ類からの２５位水酸化ビタミンＤ類および１−
α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ類の製造は、開示さ
れた方法（特開平２−４６９号および特開平２−２３１
０８９号）によれば、例えば基質ビタミンＤ３から２５
−ヒドロキシビタミンＤ３、あるいはビタミンＤ３から
１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３への変換率は十
分なものではなかった。さらに基質の仕込み濃度が低く
、従って目的物の生成量のわりには、大きな製造設備を
要するなと工業的製造法として解決すべき問題があった
。

従って、本発明は従来の微生物あるいは酵素を用いた生
物学的な方法を改善し、ビタミンＤ類か、ら２５−ヒド
ロキシビタミンＤ類、あるいは１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ類への変換効率を飛躍的
に増大させる製造方法を提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］本発明者らは、微生物を用いたビタミンＤ類から２５−
ヒドロキシビタミンＤ類、あるいは］−α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ類への変換において、そ
の変換効率を増大させることを目的として鋭意研究を重
ねた結果、反応液中にシクロデキストリン類を共存させ
ることにより変換効率が飛躍的に増大することを見出し
本発明を完成した。

すなわち、本発明はビタミンＤ類の２５位および１α位
を水酸化し得る微生物または酵素を含有する反応液中に
、従来法と比較して数倍の濃度のビタミンＤ類およびシ
クロデキストリン類を加えてビタミンＤ類の２５位およ
び１α位の水酸化効率を飛躍的に増大させた２５−ヒド
ロキシビタミンＤ類および」−α、２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ類の生物学的製造方法である。

本発明に用□いられるビタミンＤ類の水酸化能を有する
微生物としては、例えは特開平２−４６９号および特開
平２−２３Ｊ、０８９号に挙けられているノカルデイア
・オウｌ−１−ｏヒカ　Ｎ−１０２（Ｎｏｃａｒｄｉａ
ａｕｔｏＬｒｏｐｈｉｃａ　Ｎ−１０２）、ストレプ）
・マイセス。

ロゼオスポラス　Ａ　−５７９７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓΔ−３７９７）　、スト
レプトマイセス・スクレロチアラス　Ｔ−Ｊ　Ｓ　Ｉ　
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｃｌｅｒｏｔｉａｌｕｓ
　Ｔ−ＪＳＩ）　、アミコラータ・ザツルネア　　Ｆ　
Ｅ　ＲＭ　　　Ｂ　Ｐ　−２３０７（Ａｍｙｃｏｌａｔ
ａ　　ｓａｔｕｒｎｅａＰＥＲＭ　ｌ３Ｐ−２３０７）
が挙げられる。

さらに、特開平２−２３１０８９号に挙げられている「
アミコラータに属する微生物」として、アミコラータ・
サツルネア　Ｉ　Ｆ　Ｏ１，４４９９（Δｍｙｃｏｌａ
ｔａｓａｔｕｒｎｅａ　ＩＰｏ　１．４４９９）、アミ
コラータ・オウトトロヒカ　Ａ　Ｔ　ＣＣ１９７２７（
八ｍｙｃｏｌａｔａ　ａｕＬｏ−１ｒｏｐｈｉｃａΔＴ
ＣＣＪ、９７２７）、アミコラータ・オウトトロヒカ　
Ａ　Ｔ　ＣＣ１，３１８１（Δｍｙｃｏ＋ａｔａ　ａｕ
ｔｏ−ｔｒｏｐｈｉｃａ　ＡＴＣＣＩ：Ｈ８Ｊ）、アミ
コラータ・オウト）・ロヒカ　Ａ　Ｔ　ＣＣ３３７９４
（八ｍｙｃｏ＋ａｔａ　ａｕｔｏ−ｔｒｏｐｈｊｃａ　
ＡＴＣＣ３３７９４）、アミコラータ・オウトトロヒカ
　Ａ　Ｔ　ＣＣ３３７９５（Ａｍｙｃｏｌａｔａ　ａｕ
ｔｏ−ｔｒｏｐｈｊｃａ　ＡＴＣＣ３３７９５）、アミ
コラータ・オウトトロヒカ　ＡＴＣＣ３３７９６（Ａｍ
ｙｃｏｌａＬａ　ａｕｔｏ７ｔｒｏｐｈｊｃａ　ＡＴＣ
Ｃ３３７９Ｂ）、アミコラータ・オウトトロヒカ　Ａ　
Ｔ　ＣＣ３３７９７（Ａｍｙｃｏｌａｔａ　ａｕＬｏ−
ｔｒｏｐｈｉｃａ　八ＴＣＣ３３７９７）、アミコラー
タ・オウトトロヒカ　Ｊ　ＣＭ　４０１０（Ａｍｙｃｏ
ｌａＬａ　ａｕＬｏｔｒｏｐｈｊｃａＪＣＭ　４０１．
０）　、アミコラータ・ヒドロカルボンオキシダンス　
Ｉ　Ｆ　Ｏ１４４９８（ＡｍｙｃｏｌａＬａ　ｈｙｄｒ
ｏ−ｃａｒｂｏｎｏｘｊｄａｎｓ　ＩＰＯ１４４９８）
などが挙げられる。

本発明で用いられるシクロデキストリン類にはα−シク
ロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロ
デキストリン、β−ジメチルシクロデキストリン、β−
トリメチルシクロデキストリン、部分メチル化シクロデ
キストリン（以下、ＰＭＣＤと略記することがある。）
、分枝シクロデキストリンなどがある。これらのシフロ
ブキストリン類は単独で用いてもよいし、あるいは２種
以」二を混合したものを用いてもよい。

本発明では、シクロデキストリン類と同時に界面活性剤
を共存させることが有効な手段である。

界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤としてポリ
オキシエチレン・ソルビタン脂肪酸エステル（例えはＴ
ｗｅｅｎ　８０　（シグマ社製））、ソルビタン脂肪酸
エステル（例えば５ｐａｎ８５（シグマ社製））、ポリ
オキシエチレンエーテル（例えばＢｒ１ｊ９６（シグマ
社製））やＴｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１Ｏ０（シグマ社製
）、ノニルフェノール（例えばノニポール４５（三洋化
成工業■）製）、酸化エチレン−酸化プロピレンのブロ
ック共重合物（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ　　Ｌ　−６１
（旭電化工業株）製）、および陰イオン性界面活性剤と
してダイレックス（日本油脂■製）、トラックス（日本
油脂■製）などを用いることができる。

本発明で微生物学的水酸化の対象となるビタミンＤ類と
は、２５位または１α位と２５位に水素原子を有するビ
タミンＤ化合物、例えば、ビタミンＤ　誘導体、ビタミ
ンＤ３誘導体、ビタミンＤ　誘導体、ビタミンＤ５誘導
体、ビタミンＤ６誘導体、ビタミンＤ化合物体をいい、
それらの１７位側鎖の水素原子、または水酸基がフッ素
等のハロゲン原子、水酸基、低級アルキル基などで置換
されているものでもよい。

本発明で基質となり得るものは、具体的には、ビタミン
Ｄ　１ビタミンＤ３、ビタミンＤ４、ビタミンＤ　１ビ
タミンＤ６、ビタミンＤ７．２４一オキソビタミンＤ３
．１α−ヒドロキシビタミンＤ　　、１α−ヒドロキシ
ビタミンＤ３．１α−ヒドロキシビタミンＤ４．１α−
ヒドロキシビタミンＤ　　、１α−ヒドロキシビタミン
Ｄ　　、１α一ヒドロキシビタミンＤ７．１α−ヒドロ
キシ−２４−オキソビタミンＤ３．１α、２４−ジヒド
ロキシビタミンＤ８．２４−ヒドロキシビタミンＤ３．
２３−ヒドロキシビタミンＤ３．２３−ヒドロキシビタ
ミンＤ４．１α、２３−ジヒドロキシビタミンＤ３．１
α、２３−ジヒドロキシビタミンＤ　１２６−ヒドロキ
シビタミンＤ２．２６−ヒドロキシビタミンＤ３．２６
−ヒドロキシビタミンＤ４．１α、２６−ジヒドロキシ
ビタミンＤ２．１α、２６−ジヒ１舶キシビタミンＤ３
．１−α、２６−シヒドロキンビタミンＤ４．２３゜２
４−ジヒドロキシビタミンＤ３．２３，２６−ジヒ１−
ｊｏキシビタミンＤ３．２３，２６−ジヒドロキシビタ
ミンＤ４、ビタミンＤ３２６．２３−ラクトン、］、］
α−ヒドロキシビタミンＤ３２６２３−ラクトン、２４
．２４−ジフルオロビタミンＤ　　　２４．２４−ジク
ロロビタミンＤ３．２６，２６，２６，２７，２７．２
７−へキザフルオロビタミンＤ３．２４．２４−ジフル
オロ−２５−ヒドロキシ−２６，２７−シメチルビタミ
ンＤ３．２５−ヒドロキシビタミンＤ２．２５−ヒドロ
キシビタミンＤ３．２５−ヒドロキシビタミンＤ４．２
５−ヒドロキシビタミンＤ５．２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ６．２５−ヒドロキシビタミンＤ７．２４−オキソ
−２５−ヒドロキシビタミンＤ３．２４．２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ　　　２３．２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ、２３．２５−ジヒドロキシビタミンＤ４、２５
．２６−ジヒドロキシビタミンＤ２．２５゜２６−ジヒ
ドロキシビタミンＤ３．２５．２６−ジヒドロキシビタ
ミンＤ４．２５−ヒドロキシビタミンＤ３−２６．２３
−ラフ）・ンなどがある。

本発明の方法は微生物の菌体または酵素を含有する溶液
中でシクロデキストリン類またはシクロデキストリン類
と界面活性剤を共存させることによりその反応速度、反
応効率を−１−げる方法であり、当該能力のある微生物
を培養する培地は主として液体培地を用い、炭素源とし
てグルコース、マルト−ス、シュークロース、デキスト
リン、澱粉、アラビノース、キシロース、グリセリド、
植物油脂、動物油脂を単独もしくは混合して用いる。窒
素源としては大豆粉、綿実粕、グルテンミール、カゼイ
ン、ペプトン、カザミノ酸、酵母、エキス、肉エキス、
コーンスチープリカー等を単独または　。

混合して用いる。その他生前に必要な、あるいは２５位
および］−α位水酸化酵素の生産を促進する有機物及び
無機物を必要に応じて添加することが＝　　１１　− できる。

培養方法は振盪培養、通気撹拌培養などの好気培養が適
している。

培養温度は２０〜３３°Ｃ１好ましくは２５〜３０°Ｃ
で行い、培養１２〜９６時間後、好ましくは２４〜４８
時間後に基質となるビタミンＤ類とシクロデキストリン
類、および所望により界面活性剤を添加する。ビタミン
Ｄ類の添加量は培地中１０〜４０００μｇ／ｍｌ、好ま
しくは５０〜５００μｇ／ｍｌが好適であり、シクロテ
キストリン類の添加量は０．１〜１５重量％（ビタミン
Ｄ類１モルに対してコール４０００モル）、好ましくは
０．１〜２重量％（ビタミンＤ類１モルに対して５〜１
４０モル）が好適である。培養のｐＨは５〜９、好まし
くは６〜８が好適である。

界面活性剤の添加量は、培地中Ｏ５旧〜５重量％、好ま
しくは００５〜０５重量％が好適である。

本発明の製造方法では、培養液中あるいは培養菌体ある
いは酵素を含有する溶液中で振盪あるいは通気撹拌する
ことが適しており、基質であるビタミンＤ類、シクロデ
キストリン類、および所望により界面活性剤を添加後１
〜１３０時間好気的に撹拌を行う。好気的条件を得るた
めに培養器内の圧力を」二げたり酸素気流下で反応を行
うことも有効である。

シクロデキストリン類および界面活性剤の添加方法は、
基質であるビタミンＤ類と予め混合しておく方法、ビタ
ミンＤ類を先に添加し、つづいてシクロデキストリン類
と界面活性剤を添加する方法、シクロデキストリン類と
界面活性剤を先に添加しておき、後からビタミンＤ類を
添加する方法のいずれでも可能である。

これらの反応により製造されたビタミンＤ類を単離する
には有機溶剤による抽出、カラムクロマトグラフィー等
の方法か採られる。例えは反応終了後、反応液を塩化メ
チレンにより抽出し濃縮、乾固する。これを２−プロパ
ツール、ローヘキサン等の適当な溶媒に溶解し、ろ過、
遠心分離などにより不溶物を除いた後シリカゲルカラム
、例えばゾルパックス５ＩＬ（米国デュポン社製）、ン
ムパック○ＤＳ（島原製作所製）等を用いた高速液体ク
ロマ）・グラフィー（ＨＰＬＣ）を行なうことにより２
５−ヒドロキシビタミンＤ類および］−α、２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ類の単離を行なうことができる。

［発明の効果］本発明の方法により微生物菌体またはその生産する酵素
を用いて、ビタミンＤ類の活性型である２５−ヒドロキ
シビタミンＤ類および１−α、２５−ジヒドロキシビタ
ミン類を高効率で製造することができる。

［実施例］以下実施例により本発明の詳細な説明するがこれによっ
て本発明が限定されるものではない。

なお、下記の例中の％は特にことわらないかぎり重量基
準による。

実施例１バクトソイトンンスチープリカ−０．５％、クルコース１．５％、Ｎａ
Ｃρ　０５％、Ｃ　ａ　Ｃ　Ｏｓ　　０．２％（ｐＨ７
．２）からなる培地（ＢＧ培地）１００ｍｌを５００ｍ
ｌ容三角フラスコに入れ１２０°Ｃ、２０分間加圧滅菌
する。これにノカルデイア・オウトトロヒカ　Ｎ−１　
０　２　（ＰＥＲＭ　ＢＰ−Ｊ−５７３）を−白金耳接
種し２８℃、２　３　Ｏ　ｒｐｍで振盪培養する。一方
、ビタミンＤ３２５ｍｇを０１５％の部分メチル化シク
ロデキスＩ・リン（ＰＭＣＤ）を含むＯ．０１Ｍリン酸
バッファー（ｐＨ　７．０）　５０ｍｌに加え（ビタミ
ンＤ３１モルに対してＰＭＣＤ１７モルの割合）、よく
撹拌した後、不溶物をろ過により除去し、その］Ｏｍｌ
を先の培養液（４８時間培養）に加え、さらに４８時間
培養を続ける。この培養液１ｍｌを共栓付き遠心沈澱管
にとり、メタノール２ｍｌ、クロロホルム１ｍｌを加え
１０分間撹拌し、さらにクロロホルム１ｍｌおよび蒸留
水１　ｍｍ加え撹拌する。これを３　、　ＯＯＯｒｐｍ
、５分間遠心分離し下層をとる。」二層はもう１度クロ
ロホルム１５ｍｌを加え抽出する。クロロホルム層を合
併し、エタノール０．］、ｍｍを加えて減圧下にて濃縮
乾固した後、ｎ−ヘキサン＝２ープロパツール（８６　
：１４）の溶媒２００μΩに溶解し、ＨＰＬＣの試料液
とする。ＨＰＬＣはゾルパックスＳ　Ｉ　Ｌ　（４．８
　ｍｍＸ　２　５ｃｍ）のカラムラ用い、ｎ−ヘキザン
＝２ープロパツール（８６：１４）を移動層として流速
］．５　ｍｌ／ｍｉｎで分析を行なった。

検出は２６５ｒ＋ｍの吸収を計ることによって行なった
。その結果、２５−ヒ１舶キシビタミンＤ３は２５．７
μｇ／ｍｌ生成しており原料からの変換率は５１、４％
であった。

実施例２実施例１で用いたＢＧ培地（１　０　０ｍ１．／　５　
０　０ｍ１容三角フラスコ）にてノカルデイア・オウト
トロヒカ　Ｎ−１−　０　２を２８°Ｃ、４８時間好気
培養し、この培養液中に５％ＰＭＣＤ溶液（０旧ト）リ
ン酸バッファー、ｐＨ　７．０）　１．　０ｍｌおよび
２％ビタミンＤ３のエタノール溶液１ｍｌ（ビタミンＤ
３コ，モルに対してＰＭＣＤ７モルの割合）を添加する
。さらに培養を続け、２４時間、４８時間、７２時間、
９６時間、１２０時間の各時期における２５−ヒ１舶キ
シビタミンＤ３の量を実施例１−の方法で調べ、それぞ
れ２１．５μｇ／ｍｌ，　５７．６μｇ／ｍｌ、７９、
２μｇ／ｍｌ、９２０μｇ／ｍｌ、コ−２５μｇ／ｍｌ
（変換率６２、５％）の値を得た。なお、このときＰＭ
ＣＤ無添加の実験区では９６時間で僅か１、６９℃ｇ／
ｍｌ　（変換率６、８％）の２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ３が生成したのみであった。

実施例３実施例１て用いたＢＧ培地（１　０　０＋ｎｌ／　５　
０　０ｍｌｍｌ用フラスコ）にてノカルデイア・オウト
トロヒカ　Ｎ−１０２を２８℃、４８時間好気培養し、
この培養液中に５％ＰＭＣＤ溶液（０．Ｏｌ．Ｍリン酸
バッファー、ｐＨ　７．０）　１０ｍｌおよび２％ビタ
ミンＤ３のエタノール溶液を１ｍｌ加え（ビタミンＤ３
１モルに対してＰＭＣＤ７モルの割合）さらに９６時間
培養を続けた。培養終了後、フラスコに塩化メチレン２
００ｍｌを加え抽出を行なった。

塩化メチレン層を減圧上濃縮し乾固後直ちに２−プロパ
ツール：１１−ヘキサン（１−・９）の混合溶媒３ｍｌ
に溶解し一２０℃で２時間放置し、生じた不溶成分を遠
心分離によって除去した。この」二澄液を減圧上濃縮し
ＨＰＬＣ（カラムはゾルパックスＳ　Ｉ　Ｌ　（４，６
ｍｍＸ　２５ｃｍ）　、移動層はｎ−ヘキサン：２−プ
ロパツール（８６：１４）　、流速は］、５　ｍｌ／ｍ
１ｎ）を行ない、３．８分のピークの両分を集めた。こ
れを４０°Ｃ以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固
した。このものは市販の２５−ヒドロキシビタミンＤｓ
（デュファー社製、オランダ）の標品と比較することに
よりＩ（ＰＬＣの保持時間、紫外部吸収スペクトル、マ
ススペクトル開裂パターンが完全に一致することを認め
た。

紫外部最大吸収：λｍａｘ　＝　２６５ｎｍ（エタノー
ル）マススペクトル：４００（Ｍ）、３８２　（Ｍ　　−Ｈ２Ｏ）、２７１．２５３．１３６．１１８．５９゜実施例４実施例コ、で用いたＢＧ培地（１００ｍｌ／　５００ｍ
１容三角フラスコ）にてノカルデイア・オウトトロヒカ
　Ｎ−１０２を２８°Ｃ１４８時間好気培養し、この培
養液中に５％ＰＭＣＤ溶液（０，０１Ｍリン酸バッファ
ー、ｐ　Ｈ７，０）　］−００ｍおよび２％ビタミンＤ
　のエタノール溶液１＋１１１（ビタミンＤ２１モルに
対してＰＭＣＤ７モルの割合）を添加する。さらに培養
を続け、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１
２０時間の各時期における２５−ヒドロキシビタミンＤ
２の量を実施例１で述べた方法により抽出分析し、それ
ぞれ０．５μｇ／ｍｌ、５５．６μｇ／ｍｌ、８４２μ
ｇ／ｍｌ、９３．０μｇ／ｍｌ、１２８．５　μｇ／ｍ
ｌ　（変換率６４％）の値を得た。なお、このときＰＭ
ＣＤ無添加の実、験区では９６時間で僅か１．８μｇ／
ｍｌ　（変換率０９％）の２５−ヒドロキシビタミンＤ
２が生成したのみてあった。２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ２のＨＰＬＣ保持時間は３７分である。

実施例５実施例１で用いたＢＧ培地（１００ｍｌ／　５００ｍ１
容三角フラスコ）にてノカルデイア・オウトｌ・ロヒカ
　Ｎ−１０２を２８°Ｃ１４８時間好気培養し、この培
養液中に５％ＰＭＣＤ溶液（０，０ＬＭリン酸バッファ
ー、ｐＨ７，０）　１０ｍ１および０．１％の１α−ヒ
ドロキシビタミンＤ３のエタノール溶液１ｍ１（：Ｉ−
α−ヒドロキシビタミンＤ３１モルに対してＰＭＣＤ１
４０モルの割合）を添加する。

さらに培養を２時間行なった後フラスコに塩化メチレン
を加え、実施例３に示した方法により分析を行なった。

保持時間１２分のピークの両分を集め４０°Ｃ以下で減
圧濃縮し、ゾルパックス０ＤＳ（米国デュポン社製）を
用いたＨＰＬＣを行なった。移動層として水：メタノー
ル（１・９）を用い、流速１．０　ｍｌ／ｍ１ｎで行な
った。溶出後保持時間５．６分のピークの画分を集め４
０°Ｃ以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固し、１
α、２５−ヒドロキシビタミンＤ３を６５０μｇ（変換
率６５％）得た。ＰＭＣＤを添加しない場合には収得量
は３５０μｇ（変換率３５％）であった。

実施例６ノカルデイア・オウトトロヒカ　Ｎ−１０２を実施例１
−で用いたＢＧ培地（：１．００ｍｌ／　５００ｍｌｍ
ｌ用フラスコ）にて２８°Ｃ１７２時間振盪培養した。

培養液を遠心分離し菌体を集めｐＨ７，４の０、ＯＬＭ
　トリス酢酸バッファー（２ｍＭ　　酢酸マグネシウム
、７ｍＭ　　２−メルカプ）・エタノール、２０％グリ
セリン含有）で１回洗浄後、同じバッファ１００ｍ１に
懸濁した。この懸濁液を超音波（２０ｋｌｌｚ　、５０
Ｗ、２分間）破砕し、遠心分離（１，０，（］ＯＯｘｇ
、１５分間）して」二澄液を得た。この」二澄液にポリ
エチレングリコール６０００を最終濃度２５％になるよ
うに少しずつ加えて溶解した後、４℃で１０分間放置し
た。遠心分離により粗酵素沈澱物を得た。この粗酵素沈
澱物の湿重量１ｇをｐＨ７，４のトリス酢酸バッファー
（７０ｍＭ　　ニコチンアミド、２ｍＭ　　酢酸マグネ
シウム、１００ｍＭＮＡＤＰ、５ｍＭ　　ＡＴＰ、６ｍ
ｔ４　　グルコース−６＝リン酸を含む）１０ｍｌに懸
濁し、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ　５ユ
ニット、２０ｍｇ／ｍｌのビタミンＤ３エタノール溶液
０．１ｍｌおよび５％ＰＭＣＤ溶液１ｍ１（ビタミンＤ
３１モルに対してＰＭＣＤ７モルの割合）を加え２８°
Ｃで１時間撹拌、振盪して酵素反応を行なった。対照と
して５％ＰＭＣＤ溶液を添加しないで同じ操作を行なっ
た。反応終了後メタノール２０ｍ１、クロロホルム１０
ｍ１を加え実施例１−と同じ方法で２５−ヒドロキシビ
タミンＤ３を定量した。その結果ＰＭＣＤ添加区では反
応液中に２５−ヒドロキンビタミンＤ３が２１．、Ｏμ
ｇ／ｍｌ　（変換率１０．５％）生成しており、ＰＭＣ
Ｄ無添加区では７．６μｇ／ｍｌ（変換率３．８％）生
成していた。

実施例７バクＩ・ソイトン（デイフコ社製）１．５％、コーンス
チープリカ−０５％、グルコース１，５％、ＮａＣρ　
０５％、Ｃａ　ＣＯ３’　０．２％（ｐＨ７，２）から
なる培地（ＢＧ培地）１００ｍｌを５００ｍ１容三角フ
ラスコに入れ１２０°Ｃｌ２Ｏ分間加圧滅菌する。これ
にノカルデイア・オウトトロヒカ　Ｎ−１０２（ＰＥＲ
Ｍ　Ｔ３Ｐ−１５７３）を−白金耳接種し２８°Ｃ１２
３Ｏｒｐｍで振盪培養する。培養４８時間後、５％のβ
−シクロデキストリン水溶液１０ｍ１、およびビタミン
Ｄ３２％を含む２０％　Ｔｗｅｅｎ　８０のエタノール
溶液を添加し、さらに４８時間培養を続ける。この培養
液」。ｍｌを共栓イマ］き遠心沈澱管にとり、メタノー
ル２ｍｌ、クロロホルム１ｍｌを加え１０分間撹拌し、
さらにクロロホルム］−ｍ１および蒸留水１　ｍｌ加え
撹拌する。これを３．００Ｏｒｐｍ、５分間遠心分離し
下層をとる。」二層はもう１−度クロロホルム］、、５
ｍｌを加え抽出する。クロロホルム層を合併し、エタノ
ール０．１ｍｌを加えて減圧下にて濃縮乾固した後、ｎ
−ヘキサン：２−プロパツール（８６・］−４）の溶媒
２００μｇに溶解し、ＨＰＬＣの試料液とする。ＨＰ　
Ｌ　ＣはゾルパックスＳ　Ｉ　Ｌ　（４，６ｍｍＸ　２
５ｃｍ）のカラムを用い、ｎ−ヘキサン：２−プロパツ
ール（８６：１４）を移動層として流速Ｌ５　ｍｌ／ｍ
１ｎて分析を行なった。

検出は２６５ｎｍの吸収を計ることによって行なった。

その結果、２５−ヒドロキシビタミンＤ３は５４．８μ
ｇ／ｍｌ生成しており原料からの変換率は約２７％であ
った。

この培養終了液１００　ｍｌに塩化メチレン２００ｍ１
を加え抽出を行なった。塩化メチレン層を減圧下濃縮し
乾固後直ちに２−プロパツール・ｎ−へキザン（１・９
）の混合溶媒３ｍｌに溶解し一２０°Ｃで２時間放置し
、生じた不溶成分を遠心分離によって除去した。この」
二澄液を減圧下濃縮しＨＰＬＣ（カラムはゾルパックス
Ｓ　Ｉ　Ｌ　（４，６ｍｍＸ２５ｃｍ）、移動層はｎ−
ヘキザン＝２−プロパツール（８６・１４）、流速は１
．５　ｍｌ／ｍ１ｎ）を行ない、３８分のピークの画分
を集めた。これを４０’Ｃ以下で窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固した。このものは市販の２５−ヒドロキシ
ビタミンＤ３　（デイフコ社製、オランダ）の標品と比
較することによりＨＰＬＣの保持時間、紫外部吸収スペ
ク）・ル、マススペクトル開裂パターンか完全に一致す
ることを認めた。

紫外部最大吸収：λｍａｘ　＝　２６５ｎｍ（エタノー
ル）マススペクトル＋４００（Ｍ）、３８２　（Ｍ　　−Ｈ２Ｏ）、２７１．２５３．１３６．１１８．５９゜実施例８ −　２４　　＝実施例１て用いたＢＧ培地を用いて、ノカルデイア・オ
ウトトロヒカ　Ｎ　−１０２（ＰＥｒｌＭ　ＢＰ−Ｊ、
５７３）を実施例１と同様に４８時間培養した後、５％
のα−シクロテキストリン水溶液１０ｍ１およびビタミ
ンＤ３２％を含む２０％　Ｔｗｅｅｎ　８０のエタノー
ル溶液１ｍｌを添加し、さらに４８時間培養を行なった
。この培養液１ｍｌを共栓例き遠心沈澱管にとり、実施
例１と同じ方法で２５−ヒドロキシビタミンＤ３を定量
したところ５１．５μｇ／ｍｌ（変換率２５．８％）が
得られた。

実施例９実施例１で用いたβ−シクロデキストリンの代わりにβ
−ジメチルシクロデキストリン、β−トリメチルシクロ
デキストリン（以」二、東進ケミカル社製）、分枝β−
シクロデキストリン（日研化学社製）、部分メチル化シ
クロデキストリン（メルシャン■製）、あるいはγ＝シ
クロデキストリンを用い、Ｔｗｅｅｎ　８００．２重量
％を含む培養液中で、ビタミンＤ３から２５−ヒドロキ
シビタミンＤ３への変換を行なったところ、第１表に示
す結果か得られた。

第１表実施例１０実施例７におけるビタミンＤ３から２５−ヒドロキシビ
タミンＤ３への変換反応において、Ｔｗｅｅｎ　８０の
代わりにＰｌｕｒｏｎｉｃ　　Ｌ　−６２（旭電化■製
）を用いて実施した結果、２５−ヒドロキシビタミンＤ
３が５１．５μｇ／ｍ１．　（変換率２５８％）か得ら
れた。

実施例１１実施例７におけるビタミンＤ３から２５−ヒドロキシビ
タミンＤ３への変換反応において、Ｔｗｅｅｎ　８０の
代わりにダイレックス（日本油脂■製）を用いて実施し
た結果、２５−ヒドロキシビタミンＤ３か４２．５μｇ
／ｍｌ　（変換率２１．２％）が得られた。

実施例１２実施例１で用いたＢＧ培地（１００ｍＩ／　５００ｍｌ
ｍｌ用フラスコ）にてノカルデイア・オウｌ−１−ロヒ
カ　Ｎ−１０２を２８°Ｃ１４８時間好気培養し、この
培養液中に５％　β−ンツクデキストリン水溶液１０ｍ
１および２％ビタミンＤ２の２０％Ｔｗｅｅｎ　８０工
タノール溶液１ｍｌを添加し、さらに４８時間培養を続
けた。培養終了後、２５−ヒドロキシビタミンＤ２の量
を実施例１で述べた方法により抽出、分析した結果、５
５．８μｇ／ｍｌ　（変換率２７．９％）であった。な
お、β−シクロデキストリンおよびＴｗｅｅｎ　８０の
無添加培養では２５−ヒドロキシビタミンＤ２は１．８
　μｇ／ｍｌ　（変換率０，９％）であった。２５−ヒ
ドロキシビタミンＤ２　のＨＰＬＣ保持時間は３７分で
ある。

実施例１３実施例１−で用いたＢＧ培地（１００ｍｌ／　５００ｍ
１容三角フラスコ）にてノカルデイア・オウトトロヒカ
　Ｎ−１０２を２８℃、４８時間好気培養し、この培養
液中に５％　β−シクロデキストリン溶液（０，０１Ｍ
リン酸バッファー、ｐＨ７，０）１０ｍ１および０．１
％の１α−ヒドロキシビタミンＤ３のエタノール溶液１
ｍ１．（１α−ヒドロキシビタミンＤ３１モルに対して
β−シクロデキストリン１４０モルの割合）および２０
％　Ｔｗｅｅｎ　８０のエタノール溶液１ｍｌを添加す
る。さらに培養を２時間行なった後フラスコに塩化メチ
レンを加え、実施例１に示した方法により分析を行なっ
た。保持時間１２分のピークの両分を集め４０°Ｃ以下
で減圧濃縮し、ゾルパックスＯＤＳ　（米国デュポン社
製）を用いたＨＰＬＣを行なった。移動層として水：メ
タノール（１・９）を用い、流速１．、Ｏｍｌ／ｍｉｎ
で行なった。溶出後保持時間５，６分のピークの両分を
集あ４０°Ｃ以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固
し、１α、２５−ヒドロキシビタミンＤ３を６４５μｇ
（変換率６４．５％）得た。β−シクロデキストリンを
添加しない場合には収得量は３５０μｇ（変換率３５％
）であった。

実施例１４ノカルデイア・オウ）・トロヒカ　Ｎ−１０２を実施例
１で用いたＢＧ培地（１００ｍｌ／　５００ｍｌｍｌ用
フラスコ）にて２８°Ｃ１７２時間振盪培養した。培養
液を遠心分離し菌体を集めｐ　Ｈ７，４の０．０ＬＭ　
トリス酢酸バッファー（２ｍＭ　　酢酸マグネシウム、
７ｍＭ　　２−メルカプＩ・エタノール、２０％グリセ
リン含有）で１回洗浄後、同じバッファ１００ｍ１に懸
濁した。この懸濁液を超音波（２０ｋｌｌｚ、５０Ｗ、
２分間）破砕し、遠心分離（１０，０ＯＯＸ　９．１５
分間）して」二澄液を得た。この上澄液にポリエチレン
グリコール６０００を最終濃度２５％になるように少し
ずつ加えて溶解した後、４℃で１０分間放置した。遠心
分離により粗酵素沈澱物を得た。この粗酵素沈澱物の湿
重量１ｇをｐＨ７，４のトリス酢酸バッファー（７０ｍ
Ｍ　　ニコチンアミド、２ｍＭ　　酢酸マグネシウム、
１００ｍＭＮＡＤＰ、５ｍＭ　　ＡＴＰ、６ｍＭ　　グ
ルコース−６−リン酸を含む）１０ｍｌに懸濁し、グル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ　５ユニット、２
０ｍｇ／ｍＩのビタミンＤ３エタノール溶液０−１ｍ１
および５％　β−シクロデキストリン溶液１ｍ１（ビタ
ミンＤ３１モルに対してβ−シクロデキストリン７モル
の割合）および２０％　Ｔｗｅｅｎ　８０のエタノール
溶液］。ｍｌを加え２８°Ｃで１時間撹拌、振盪して酵
素反応を行なった。対照として５％　β−シクロデキス
トリン溶液を添加しないで同じ操作を行なった。反応終
了後メタノール２０ｍ１、クロロホルム１０ｍ１を加え
実施例１と同じ方法で２５−ヒドロキシビタミンＤ３を
定量した。その結果、β−シクロデキストリン添加区で
は反応液中に２５−ヒドロキシビタミンＤ３が２１．０
μｇ／ｍｌ　（変換率１０．５％）生成しており、β−
シクロデキストリン無添加区では７．６μｇ／ｍｌ（変
換率３，８％）生成していた。

実施例１５実施例１で用いたＢＧ培地にて、ノルカデイア・オウト
トロヒカ　Ｎ−１０２（ＰＥＲＭ　ＢＰ−１５７３）を
生育させ、その１ｍｌをＴＭ−１−培地（グルコース２
％、酵母エキス０．２％、ペプトン（極東製薬工業■製
）０．５％、コーンスチープリカ−（粉末）０５％、脱
脂大豆粉１，０％、Ｋ　　ＨＰＯ４０，０４％、ＮａＣ
ρ０．４％、ｐ　Ｈ７，０）　２５ｍｌを入れた２５０
ｍ１容三角フラスコに植菌し、２８°Ｃで４８時間培養
した。このフラスコ中に２％　ビタミンＤ３のエタノー
ル溶液０．２５ｍ１、および界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉ
ｃ　　Ｌ　−６２および５％　シクロデキストリン類１
５〜Ｌ、Ｏｍｌを加え、さらに９０時間振盪培養を行な
い、培養液中に生成した１α、２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３を実施例５に示した方法で分析し、第２表に示
す結果を得た。

第２表実施例］、６アミコラータ・オウトｌ・ロヒカ　ＡＴＣＣ１９７２７
、Ａ　Ｔ　ＣＣ１，３１１Ｎ、ＡＴＣＣ３３７９４、Ａ
ＴＣＣ３３７９５、ＡＴＣＣ３３７９Ｂ、ＡＴＣＣ３３
７９７、ＪＭＣ４０１０、アミコラータ・ヒドロカルボ
ンオキシダンス　Ｉ　Ｆ　ＯＪ、４４９８、アミコラー
タ・ザッルネア　Ｆ　Ｅ　ＲＭ　　Ｂ　Ｐ−２３０７お
よびＩ　Ｆ　０１４４９９をそれぞれ実施例１５で用い
たＴＭ−１培地（５０ｍｌ／　５００ｍｌｍｌ用フラス
コ）にて２８°Ｃで４８時間培養した。このフラスコ中
に２％ビタミンＤ３のエタノール溶液０．５ｍｌ、およ
び界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｊｃ　　Ｌ−６２および５％
β−シクロデキストリン１．、Ｏｍｌを加え、さらに７
２時間振盪培養を行なった。培養液中に生成した、２５
−ヒドロキシビタミンＤ３および１α、２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ３を実施例１および５に示した方法で分
析し、第３表に示す結果を得た。

なお、対照群（シクロデキストリン無添加群）の結果を
第４表に挙げる。

第３表第４表　３６　一実施例１７アミコラータ・オウトトロヒカ　ＡＴＣＣ３３７９７を
実施例１５で用いたＴＭ−１培地（５０ｍｌ／１００ｍ
１容三角フラスコ）にて２８°Ｃ１４８時間培養した。

このフラスコ中に２％ビタミンＤ３のエタノール溶液０
５ｍ１、および界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　　Ｌ　−
６２および５％シクロデキス）・リン類の単独または混
合したものを１゜、０〜２．０　ｍｌ加え、さらに９６
時間振盪培養を行なった。培養液中に生成した、２５−
ヒドロキシビタミンＤ３および１α、２５−ジヒドロキ
ンビタミンＤ８を実施例１および５に示した方法で分析
し、第５表に示す結果を得た。

第５表 β−ＣＤ　　・　　β−シクロデキストリン（添加ＮＯ
１２％）γ−ＣＤ　：　　γ−シクロデキストリン（添
加＝　０．２％）β−ＤＣＤ　　　　β−ジメチルシク
ロデキストリン（添加量０２％）β−ＣＤ＋γ−ＣＤ　
　　　　β−ンツクデキストリンとγ−シクロデキスト
リンの混合物（添加１各０２％） β−ＣＤ十β−ＤＣＤ：　　　β−シクロデキストリン
とβ−ジメチルシクロデキストリン手続補正書（眩）平成３年１月１６１］

Claims

【特許請求の範囲】１）ビタミンＤ類を水酸化する微生物菌体またはその産
生する酵素を含有する溶液中に、２５位に水素原子を有
するビタミンＤ類とシクロデキストリン類とを共存させ
、ビタミンＤ類の２５位の水素原子を水酸基に変換する
ことを特徴とする２５−ヒドロキシビタミンＤ類の生物
学的製造方法。２）ビタミンＤ類を水酸化する微生物菌体またはその産
生する酵素を含有する溶液中に、１α位および２５位に
水素原子を有するビタミンＤ類とシクロデキストリン類
とを共存させ、ビタミンＤ類の１α位および２５位の水
素原子を水酸基に変換することを特徴とする１α、２５
−ジヒドロキシビタミンＤ類の生物学的製造方法。３）シクロデキストリン類溶液とビタミンＤ類を混合し
た後、これを基質としてビタミンＤ類を水酸化する微生
物菌体またはその産生する酵素を含有する溶液中に加え
る請求項第１項または第２項記載の製造方法。４）ビタミンＤ類の生物学的変換反応の開始前、開始時
または開始後にシクロデキストリン類を反応液に加える
請求項第１項または第２項記載の製造方法。５）シクロデキストリン類がシクロデキストリンの混合
物である請求項第４項に記載の製造方法。６）ビタミンＤ類の生物学的反応液中に界面活性剤を共
存させる請求項第１項または第２項記載の製造方法。７）ビタミンＤ類の生物学的反応液中に共存させるシク
ロデキストリン類の量が、ビタミンＤ類１モルに対して
１〜１０００モルである請求項第１項または第２項記載
の製造方法。８）ビタミンＤ類の生物学的反応液中に共存させる界面
活性剤が培地中０．０１〜５重量％である請求項第１項
または第２項記載の製造方法。９）ビタミンＤ類としてビタミンＤ＿３を使用し、２５
−ヒドロキシビタミンＤ＿３を得る請求項第１項ないし
第８項のいずれかの項に記載の製造方法。１０）ビタミンＤ類としてビタミンＤ＿３を使用し、１
α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３を得る請求項第
２項ないし第８項のいずれかの項に記載の製造方法。